Control de Calidad en La Producción Del Bioetanol SEMINARIO de PROCESOS 2013

Control de Calidad en la produccin de Bioetanol a partir de material lignocelulsico 2014
0

2014
Natalia A. Monje Pinilla
Claudia Elizabeth Llanos

Control de Calidad en la
produccin de Bioetanol a
partir de material
lignocelulsico
Prof: Dra.Mabel Snchez
Natalia A. Monje Pinilla
Claudia Elizabeth Llanos

Seminario de Procesos

1

Universidad Nacional del Sur
Seminario de Procesos

Profesor: Dra. Mabel Snchez

Alumnas:
Natalia Andrea Monje Pinilla
Llanos Claudia Elizabeth


2

ndice general
Introduccin 4
1. Caracterstica de la Materia Prima 6
Caractersticas generales del bagazo de la caa de azcar
1.1 Composicin Fsica 7
1.2 Composicin Morfolgica 8
1.3 Composicin Qumica 8
1.4 Celulosa 10
1.5 Hemicelulosa 11
1.6 Lignina 12
1.7 Aspectos Generales del Etanol 13
1.8 Bioetanol en Argentina 15
2. Proceso Productivo 16
Descripcin del Proceso Productivo
2.1 Etapas del proceso 17
2.2 Pretratamiento 19
2.3 Pre hidrlisis 19
2.3.1 cidos orgnicos 20
2.3.2 Compuestos fenlicos 21
2.3.3 Compuestos furanos 21
2.4 Detoxificacin 21
2.5 Hidrlisis enzimtica 22
2.6 Fermentacin 25
2.7 Destilacin y Deshidratacin del producto 27
3. Control de calidad 28
CONTROL DE CALIDAD EN LA PRODUCCIN DEL BIOETANOL A PARTIR DE BAGAZO
3.1 Calidad 29
3.2 Puntos Crticos de Control (PCC) 29
3.3 Identificacin de puntos de Control 30
3.4 Variables de procesos involucradas en PCC 33
3.4.1 Punto Crtico 1: Materia Prima 33
3.4.1.1 Celulosa 33
3.4.1.2 Hemicelulosa 34
3.4.1.3 Lignina 35
3.4.1.4 Tamao de partcula 35
3.4.2 Punto Crtico 2: Pre hidrlisis 36
3.4.3 Punto Crtico 3 : Fermentacin 37
3.5 Determinaciones Analticas 38
3.5.1 Mediciones en lnea 38
3.5.2 Cuadro de clasificacin de mediciones directa (en lnea) e indirecta (laboratorio) 38
3.5.3 Caracterizacin de la materia prima 40
3.5.4 Caracterizacin del material pretratado. 40
3.5.5 Caracterizacin en la pre hidrlisis 40
3.5.6 Determinaciones a realizar en el detoxificador 41
3.5.7 Determinaciones en la Hidrolisis enzimtica 41
3.5.8 Determinaciones en Fermentador 41
3.5.9 Caracterizacin del producto final 41
4. Conclusin 43
5 .Bibliografa 44
ANEXOS 47

3

Anexo I 48
Anexo II 67

LISTA DE ANEXOS
ANEXO I Determinaciones Analticas
1.DETERMINACIN FSICO-QUMICA 48
Determinacin de extractos 48
Determinacin de slidos totales 48
Determinacin de cenizas 49
Determinacin de carbohidratos estructurales 49
Determinacin del contenido de holocelulosa 51
Determinacin de celulosa y hemicelulosa 51
Determinacin de cenizas 52
2. DETERMINACIN DE TAMAO 52
3.DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE MATERIA SECA Y HUMEDAD 53
4. DETERMINACIN DE LOS PRODUCTOS DE DEGRADACIN 53
5. DETERMINACIN DE ART (MTODO DNS) (EIO) 54
6. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA 54
7. DETERMINACIN DE ETANOL 55
8. CONTROL DE LA VIABILIDAD DE LAS ZYMOMONA 55
9. CONTROL DE CALIDAD DEL BIOETANOL 55
1.Importancia de cada propiedad 55
2.Caracterizacin del alcohol etlico anhidro combustible (AEAC) 57
Anexo II Datos experimentales
1. Descripcin de la Metodologa del ensayo 68
2. Control de la Fermentacin 68
3. Resultados del ensayo 70
4. Conclusiones 70

4

Introduccin
Los combustibles fsiles son la fuente primaria de energa en el mundo. Sin embargo, factores como
el carcter no renovable de los mismos, el agotamiento previsto de las reservas de hidrocarburos, el
constante aumento del precio del petrleo y la necesidad de preservar el medio ambiente han
impulsado la bsqueda de fuentes de energas alternativas basadas en recursos naturales renovables
y menos contaminantes.
Desde que se produjo la primera crisis del petrleo en 1973, se ha considerado la biomasa como una
fuente de energa alternativa al combustible fsil cuyo uso ha sido fomentado, en algunos pases con
mayor xito (Brasil). A nivel mundial en las ltimas dcadas se han promovido polticas de
preservacin y cuidado del medio ambiente, entre las leyes impulsadas con este fin se encuentra el
corte de combustibles fsiles con un porcentaje entre el 5% y 10% de biocombustibles.
Los biocombustibles se clasificaron como de primera, segunda y tercera generacin segn la materia
prima que se emplea para su produccin, que pueden ser plantaciones de especies comestibles (por
ejemplo: el maz, la soja o el girasol), especies no comestibles y desechos industriales
respectivamente. En la Unin Europea se ha prohibido la produccin de combustibles de primera
generacin por desestabilizar el mercado alimentario y los desarrollos se han tornado a la bsqueda
de biocombustibles de tercera generacin.
Las biomasas ms estudiadas como materia prima para la produccin de biocombustibles son la
paja, bagazo de caa de azcar, RAC y residuos procedentes de las agroindustrias. Algunas ventajas
que presentan, frente al uso de los combustibles fsiles, son su fcil consecucin, bajo costo y bajo
impacto ambiental. Ejemplos claros de estas iniciativas son las de los biocombustibles de origen
agrcola como el etanol y el biodiesel provenientes de recursos renovables (propuesta
medioambiental apta) que presentan una oportunidad para el crecimiento econmico y social de las
zonas en las cuales su produccin es factible.

5

En Argentina, la Resolucin 56/2012 promulga la importancia que conlleva la insercin de los
biocombustibles al esquema energtico nacional, para hacer frente a los desafos de abastecimiento
de energa en el marco de una economa en crecimiento. Actualmente se encuentran inscriptas 208
empresas elaboradoras de biocombustibles que producen bioetanol o biodiesel (Secretara de
Energa-Ministerio de Planificacin Federal Inversin pblica y Servicio) estas empresas cuentan a su
favor con promociones otorgadas por el gobierno y la ley de corte de combustibles, por la cual los
combustibles deben contener un 5% de biocombustibles. Cabe destacar que nuestro pas ocupa el
primer lugar en la exportacin de biodiesel, el cual proviene en gran parte del aceite de soja.
Uno de los principales biocombustibles lquidos producidos es el etanol, ste se puede producir con
una gran variedad de materias primas y su uso no est limitado en lo absoluto porque se puede usar
de forma pura o en mezclas con combustibles fsiles. La mayor parte del bioetanol se produce a
partir de jugos azucarados o melazas de ingenio azucareros, estos procesos generan efluentes con
elevada carga orgnica y actualmente no se cuenta con un tratamiento adecuado para la remocin
de dicha carga. Es por esto que la produccin a partir de materiales lignocelulsico se presenta como
una gran oportunidad para la obtencin de etanol.
El bagazo ha sido utilizado histricamente como combustible en la industria azucarera, y an cuando
su valor calrico es relativamente bajo (1.850 kCal/kg), al ser comparado con otros combustibles
fsiles tradicionales, no hay duda de que constituye un valioso potencial energtico, sobre todo, para
aquellos pases que no tienen disponibilidades significativas de combustible, y a la vez son grandes
productores de azcar de caa.
En el pasado los esquemas de produccin de azcar se calculaban energticamente, de manera tal
que el bagazo sirviera de combustible para la generacin de la potencia y el calor necesario en la
industria, con el mnimo o ningn sobrante, es decir con 0 bagazo residual. En la actualidad se
buscan esquemas energticos y de procesos que aseguren la mayor cantidad de bagazo sobrante
para la produccin de derivados y, sobre todo para generar electricidad que se aporta a la red,
sustituyendo fuel-oil y asegurando la venta de crditos de carbono con un material renovable en
cada zafra. En este sentido, se ha demostrado la posibilidad de satisfacer las demandas energticas
de un central con casi la mitad del bagazo que se genera, por lo que el sobrante puede ser utilizado
como materia prima para otras producciones.
Por otra parte, la existencia cada vez menor de materiales fibrosos para ser empleados como materia
prima en la industria de derivados, y su carcter renovable, han estimulado tambin en las ltimas
dcadas un desarrollo acelerado de la utilizacin del bagazo en producciones de derivados [ICIDCA,
2000] siendo el de mayor inters el bioetanol.
Teniendo en cuenta las consideraciones antes descriptas este trabajo est orientado a establecer un
proceso estndar para la obtencin de bioetanol a partir de bagazo de caa de azcar y determinar
los puntos crticos en el proceso para realizar un control de calidad en la produccin.


6

1. Caractersticas de la materia prima


7

CARACTERSTICAS GENERALES DEL BAGAZO DE LA CAA DE AZCAR

La biomasa lignocelulsica contiene valores medios de 38-50% de celulosa, 23-32% de hemicelulosa
y 15-30% de lignina y otros componentes extrables (Sierra y col, 2008). La utilizacin eficaz de estos
tres componentes es clave en la viabilidad econmica del proceso de transformacin de celulosa a
etanol (Vishnu Menon y Mala Rao, 2012).
El bagazo es el residuo lignocelulsico fibroso remanente de los tallos de caa, obtenido a la salida
del ltimo molino del tndem azucarero, constituyendo un conjunto heterogneo de partculas de
diferentes tamaos que oscilan entre 1 y 25 mm, presentando una fraccin promedio de
aproximadamente 20 mm y una humedad entorno al 50%.

1.1 Composicin Fsica

Desde el punto de vista fsico el bagazo se constituye por fibra, slidos solubles e insolubles. En la
tabla 1.1 se presenta la composicin para el bagazo.

Tabla 1.1 Composicin promedio del bagazo de caa de azcar
Composicin Porcentaje
Fibra o bagazo 45
Slidos insolubles 2-3
Slidos solubles 2-3
Agua 49-51

Se designa como fibra a la fraccin slida orgnica insoluble en el agua, presente en el tallo de la
caa de azcar y que se caracteriza por su heterogeneidad desde el punto de vista qumico y
morfolgico. Esta fraccin es la portadora de elementos estructurales que permiten el uso del
bagazo en la industria del papel.
Los slidos inorgnicos estn compuestos fundamentalmente por tierra, piedras y otras materias
extraas, las caractersticas de la cosecha influyen en esta pequea fraccin. Los slidos solubles
forman la fraccin que se disuelve en agua, se compone bsicamente de sacarosa y otras sustancias
qumicas por lo que depende exclusivamente de la calidad de la materia prima.
El bagazo retiene agua a travs de mecanismos de adsorcin y capilaridad, este fenmeno
desempea un papel importante en algunos procesos tecnolgicos a los que se somete el bagazo
para su aprovechamiento como materia prima. La humedad del bagazo est en relacin directa con
el alto nivel higroscpico de la mdula, as como el alto nivel de porosidad en las partculas. De ah su
gran capacidad de adsorcin, entre 70 y 80% de humedad, sin agua libre.

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1.2 Composicin Morfolgica

En primer lugar encontramos la epidermis, que es la capa fina que recubre todo el tallo y que lo
protege, abundan componentes no fundamentales de la caa de azcar y que luego se clasifican en
el bagazo como extractivos.
Luego sigue la corteza, que se compone fundamentalmente de fibras de alto contenido de lignina.
Sus caractersticas principales son su ancha pared celular, longitud y rigidez, propiedades que la
hacen adecuadas para proteger el tallo de los efectos mecnicos y exteriores a la planta.
A continuacin, se encuentra el rea interior del tallo, compuesto principalmente de tejido
parenquimatoso, cuya funcin es la de almacenar jugo azucarado. La estructura del bagazo semeja la
forma de un tubo interno, lo que permite un rpido transporte del agua.
Las caractersticas, que se describieron anteriormente, favorecen la reaccin de hidrlisis qumica, ya
que la presencia de este tipo de estructuras, facilita la difusin de agentes hidrolizantes.

1.3 Composicin Qumica

El bagazo, al igual que todos los materiales lignocelulsicos, se compone de celulosa, hemicelulosa y
lignina como principales polmeros naturales. La celulosa y hemicelulosa componen la fraccin de
carbohidratos del bagazo, la cual se designa como holocelulosa. La lignina se diferencia por ser un
polmero heterogneo de carcter fenlico con diferentes grupos y enlaces qumicos. En la figura 1.1
se observa de forma esquemtica, la relacin que existe entre estos tres compuestos y en la tabla 1.2
se presenta la composicin para diferentes tipos de maderas y se incluyen ciertos residuos de la
industria como el bagazo mismo, la cascarilla de arroz, tallos de maz, papel peridico entre otros.

Figura 1.1 Representacin de la pared celular de los materiales lignocelulsicos.


9

La pared celular de las plantas est constituida por dos fases: la fase primaria o fibrilar formada
principalmente por celulosa que es un polisacrido cuyas molculas son cadenas lineales de glucosa
(unidas por enlaces 1-4) que pueden alcanzar 4 m de longitud. Le sigue la fase amorfa o
secundaria que est compuesta principalmente por las hemicelulosas y en tercer lugar est la
pectina. La pared celular secundaria tambin contiene lignina, que se une a la hemicelulosa mediante
enlaces de ster. Los diseos formados por las microfibrillas son muy variables. En la pared primaria
las fibrillas estn entrelazadas, dispuestas aparentemente al azar (Figura 1.2 a); en la pared
secundaria estn dispuestas paralelamente (Figura 1.2 b).

Figura 1.2 Pared celular del bagazo. a) Pared celular primaria y b) Pared celular secundaria

En la pared primaria dominan la matriz amorfa, formada por hemicelulosas y polisacridos no
celulsicos. La fase fibrilar est reducida al 8-25%. En la pared secundaria domina la fase fibrilar
(celulosa, 60%) y la matriz amorfa est formada por hemicelulosas y lignina (30%), los compuestos
pcticos y las protenas prcticamente desaparecen.
Las hemicelulosas revisten las fibrillas de celulosa y cristalizan con ella, unindolas. Los muclagos de
la pared celular (por ejemplo del episperma de Linum) son especialmente ricos en polisacridos no
celulsicos. Los compuestos pcticos estn formados por molculas de cido pctico unidas entre s
mediante puentes de Ca++. Las protenas de la pared son ricas en los aminocidos serina e
hidroxiprolina, y estn ligadas con azcares como arabinosa, glucosa y galactosa. Se cree que dichas
glucoprotenas actan como elementos estructurales, porque forman cadenas que pueden ligar
entre s otros componentes.
La diferencia en el porcentaje de cada polmero entre un material y otro, depende del tipo de
madera al que pertenezca, de la edad de la planta y en menor medida de la variedad de cada
material. El contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina permite seleccionar la materia prima que
resulte ms conveniente para cada proceso.


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Tabla 1.2 Composicin qumica de materiales lignocelulsicos
Material Lignocelulsico
Composicin (%)
Celulosa Hemicelulosa Lignina
Algodn (semillas) 89.0 5.0 0.0
Paja de arroz 32.6 19.2 8.5
Paja de trigo 46.3 27.0 14.2
Tallos de maz 38.0 26.0 11.0
Bagazo de caa de azcar 46.6 25.2 20.7
Papel peridico 45-55 25-40 18-30
Residuos de la industria del papel 60-70 10-20 5-10

Con relacin a los dems componentes del bagazo, que en conjunto representan el 10%, se
encuentran los compuestos solubles en solventes orgnicos, tales como resinas, ceras, grasas, cidos
grasos, flaconas y fenoles entre otros. El contenido de cenizas en el bagazo es del orden de 23%.
Tambin se encuentran los compuestos solubles en agua como sacarosa y otros azucares.

1.4 Celulosa
La celulosa es la sustancia qumica ms importante y el componente principal de la pared celular
(Fase fibrilar o primaria), es un homopolmero lineal de unidades de anhidro - (+) anhidro D-
glucopiranosa con uniones - 1- 4 glicosidica. La fibra de la celulosa tiene una estructura muy firme y
poco sensible a la degradacin .Se encuentra dentro del grupo de carbohidratos de alto peso
molecular. Es insoluble en agua y en solventes orgnicos. Presenta resistencia apreciable al efecto de
agentes oxidantes, lo cual la diferencia del resto de los componentes qumicos de la madera.
Qumicamente la celulosa se define como un homopolmero de la D-glucosa. Su peso molecular
promedio est en el intervalo de 150 000 a 300 000. Segn la tabla 1.2, la celulosa es el compuesto
con mayor porcentaje en el bagazo, al encontrarse en un intervalo del 38.0 49.9% y en general se
considera como el compuesto biolgico de naturaleza polimrica ms abundante de la naturaleza.
Sin embargo, solo una pequea proporcin de ste material se explota con fines comerciales, debido
a problemas tcnicos que derivan de la estructura y caractersticas de la celulosa. En la figura 1.3 se
destaca la organizacin interna de la celulosa, la cual est formada por microfibrillas. La unidad
organizativa ms simple es la protofibrilla, que a su vez se agrupan y originan la macrofibrilla.
Las fibras de celulosa presentan caractersticas comunes como:
Las cadenas polimricas de la celulosa muestran diferentes grados de ordenamiento unas con
respecto a otras.
La fraccin con menor grado de ordenamiento no muestra ninguna regularidad y se conoce como
regin amorfa. Esta regin presenta mayor facilidad de ataque qumico o enzimtico.

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La fraccin con mayor grado de ordenamiento se conoce como regin cristalina y es muy resistente
a la penetracin de solventes, enzimas y reactivos.

Figura 1.3 a) Composicin de la celulosa y su posicin en la pared celular ,b) detalle de la celulosa y sus
principales constituyentes

La diferenciacin de la celulosa en estas dos regiones permite reconocer la necesidad de realizar un
pretratamiento al bagazo con el objetivo de desestabilizar la regin cristalina y lograr mayor grado de
hidrlisis. La molcula de celulosa presenta a lo largo de la cadena, molculas de glucosa que
establecen un arreglo en donde los planos de los anillos de glucosa forman ngulos de 10
aproximadamente, con respecto a la horizontal. Adems, el arreglo en zigzag coloca al grupo
hidroxilo sobre el carbono 3, tan cerca del oxgeno de la glucosa vecina que se forman enlaces de
hidrgeno. As se origina un anillo adicional que contribuye a impedir la rotacin mutua de los
residuos de glucosa contiguos.
Una fibra elemental con una seccin de 35 x 35 , contiene 40 molculas aproximadamente. La
misma estructura reticular se encuentra tanto en fibras de celulosa de algodn y madera, como en
las paredes celulares de algas marinas.

1.5 Hemicelulosa
Las Hemicelulosas son polisacridos no celulsicos [xilana, glucana, galactana, manana, fructana],
compuestos pcticos y glucoprotenas que pueden lignificarse. Revisten las fibrillas de celulosa y
cristalizan con ella, unindolas. Poseen un conjunto de caractersticas comunes:
Solubilidad en solventes orgnicos.
Reactividad frente a los cidos.
Descomposicin en azcares y furfural.

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Las hemicelulosas, al igual que la celulosa, sirven como material de soporte de la pared celular de las
plantas. Estn constituidos fundamentalmente por azcares del tipo pentosa y hexosa como se
muestra en la Figura 1.4, que polimerizan entre s y forman polisacridos heterogneos. Son
generalmente insolubles en agua, solubles en lcali y ms fcilmente hidrolizables en cido que la
celulosa. Estructuralmente se diferencian de la celulosa en que no son fibras, estn ramificadas y
tienen masas moleculares ms bajas, la mayora tienen un grado de polimerizacin de 200.

Figura 1.4 Componentes de las hemicelulosas
Debido a la ausencia de cristalinidad, su bajo peso molecular y su configuracin ramificada e irregular
absorben agua con facilidad. Esta cualidad contribuye para la movilidad interna y el aumento de
flexibilidad de las fibras, una reduccin en el tiempo y energa requeridos para la refinacin de la
pasta celulsica; y un aumento del rea especfica o de unin de las fibras.
Las hemicelulosas que ms abundan en el bagazo son del tipo de las D-xilanas, pero tambin
contienen azcares tales como las L-arabinosa, D-galactosa, Lgalactosa, D-manosa, L-ramnosa, L-
fructosa. Las cadenas polimricas son cortas, el peso molecular promedio se encuentra en el
intervalo de 10 000 a 20 000. La facilidad que presentan las hemicelulosas al ataque qumico con
respecto a la celulosa, las convierten en un factor de inters para la hidrlisis.

1.6 Lignina

La lignina es el tercer componente de importancia cuantitativa presente en el bagazo; es un polmero
aromtico, heterogneo, ramificado, de alta masa molecular, compuesta por unidades de
fenilpropano enlazadas en tres dimensiones. La unidad de fenilpropano consta bsicamente de un
anillo aromtico y de una parte aliftica de tres tomos de carbono denominados , y (alfa, beta y
gama), que contiene grupos fenlicos, grupos carbonilos, hidroxilos, carboxilos y grupos metoxilos.
En el mundo, cada ao se generan por fotosntesis 1011 1012 Ton de lignina. La lignina imparte
rigidez a la pared molecular, forma una estructura resistente a los impactos y a la compresin,
proporciona la impermeabilidad necesaria para conducir agua y sales minerales a la planta. Protege a

13

la celulosa y hemicelulosa del ataque enzimtico microbiano, por ende, proporciona vida ms larga a
los tejidos.

Figura 1.5 Componentes De La Lignina.
Los diferentes grupos se encuentran entrelazados por enlaces altamente estables, entre los cuales se
encuentran los enlaces carbono carbono, enlaces del tipo alquil aril y enlaces ter, entre otros. La
lignina no es un material de inters para la produccin de azcares, por lo cual debe retirarse
mediante la aplicacin del pretratamiento al bagazo de la caa, sin embargo, al ser esta un
subproducto del proceso puede ser utilizada como combustible o comercializarse como materia
prima para la produccin de poliuretano.

1.7 Aspectos Generales del Etanol

De frmula C
2
H
5
OH, es un lquido transparente e incoloro, con sabor a quemado y un olor agradable
caracterstico. Normalmente el etanol se concentra por destilacin de soluciones diluidas. El de uso
comercial contiene 95% en volumen de etanol y 5% de agua. Ciertos agentes deshidratantes extraen
el agua residual y producen etanol absoluto.
Desde la antigedad, el etanol se ha obtenido por fermentacin de azcares. Todas las bebidas con
etanol y casi la mitad del etanol industrial an se fabrican mediante este proceso. La reaccin de la
fermentacin, est representada por la siguiente ecuacin:

Dicho compuesto qumico suele utilizarse como combustible, puro o como aditivo de la nafta en
diferentes proporciones, y su uso se ha extendido principalmente para reemplazar el consumo de
derivados del petrleo, mezcla que es conocida como gasohol o alconafta. Dos mezclas comunes son

14

E10 y E85, con contenidos de etanol del 10% y 85%, respectivamente y que son comercializadas en
algunos pases de Europa, Estados Unidos y Sudamrica para vehculos flexibles.
El alcohol se usa con frecuencia en el sector farmacutico (excipiente de cosmticos y
medicamentos) esto es gracias a que no slo es un buen disolvente, sino que tambin es un potente
desinfectante. Por otro lado, es empleado como combustible a nivel industrial y domstico. De forma
general a nivel industrial, no solo se quema para obtener energa, sino que tambin es un reactivo de
varias reacciones de inters. Sus principales propiedades se presentan en la tabla 1.3. Algunas de sus
ventajas y desventajas son:
Ventajas
o Puede ser producido a partir de fuentes renovables
o Es un combustible lquido que puede ser manejado fcilmente al igual que las naftas
o Presenta un alto ndice de octanos
o Su combustin produce menos CO
2
que la nafta
o Genera menos CO cuando se lo utiliza como aditivo en las naftas
o Posee baja toxicidad
o Resulta menos inflamable que los combustibles derivados del petrleo
Desventajas
o Presenta una menor densidad de energa que las naftas, tiene una capacidad energtica igual
a 2/3 que la de las naftas
o Se incrementan las emisiones de xidos de nitrgeno y aldehdos
o Presenta dificultades para encender en climas muy fros

Tabla 1.3 Propiedades del Etanol
Parmetro Valor
Peso molecular 46.07
Punto de ebullicin a 1 atm 78.3 C
Punto de congelacin -114 C
Temperatura Crtica 243.1 C
Presin crtica 63 atm
Calor especfico (vapor) 1.128
Calor de solucin -2.3*10
5
J/kg
Calor de combustin -268.8* 10
5
J/kg
Calor de vaporizacin latente 8.37*10
5
j/kg
Presin de vapor 43 mm Hg
Peso especfico (15.56 C) 0.816


15

1.8 Bioetanol en Argentina

En la actualidad, cada litro de nafta sper o premium contiene entre un 4% y un 6% del
biocombustible. La intencin del Poder Ejecutivo Nacional es elevar ese porcentaje para reducir las
importaciones de naftas que se realizan en el pas y que deterioran el equilibrio de la balanza
comercial. Por esto se apunta a reemplazar parcialmente la importacin de naftas, a travs de un
mayor consumo de bioetanol procesado en el pas.
Se estiman que en el 2014 habr volumen disponible para cortar las naftas al 10%, un 3,5% ms que
el porcentaje actual, lo que implicar una demanda de 58.000 m
3
/mes del carburante orgnico,
segn las proyecciones de la Secretara de Energa-Ministerio de Planificacin Federal Inversin
pblica y Servicio. En el ao 2010 hubo un gran crecimiento para el mercado de los biocombustibles y
Argentina se convirti en el principal exportador de Biocombustibles. Sin embargo, en este buen
momento del rubro, se presentan algunos condicionamientos coyunturales que obstaculizan la
participacin en el mercado interno ya que todava no se ha logrado acuerdo entre las compaas
petroleras y la Asociacin de Fabricantes de Automotores (AdeFA), sobre el contenido de oxgeno del
bioetanol para implementar E10.
El tndem petrolero-automotriz alega que es inviable (la idea que est analizando el Gobierno
Nacional), desde un punto de vista tcnico, inyectar un 10% de bioetanol para formar la mezcla. Por
su alto contenido de oxgeno, naftas con un elevado porcentaje de Etil-Terbutil-Eter (ETBE) y
bioetanol, distorsionara el proceso de carburacin. No obstante, a nivel mundial, la utilizacin de
ETBE se ha reducido en los ltimos aos debido a denuncias sobre sus presuntos efectos
cancergenos, esto hara crecer la utilizacin de etanol para aumentar el octanaje de las naftas de
orgenes fsil como substituto del ETBE y de cierto modo obligara a las empresas petroleras y
automotrices a utilizarlo.
Adems de nueve ingenios radicados en el norte del pas, se cuenta con tres destileras a base de
cereales, fundamentalmente maz, y se est planificando la apertura de dos plantas para el 2014. La
proyeccin es que en menos de una dcada, la Argentina estar en condiciones de abastecer un
programa de corte del 20%, que resulta muy necesario dado el crecimiento que ha tenido el
consumo de combustibles lquidos en las estaciones de servicio.


16

2. Proceso Productivo


17

DESCRIPCIN DEL PROCESO PRODUCTIVO

La produccin de bioetanol a partir de materiales lignocelulsico es un proceso en el cual se
involucran biomasa, microorganismos, enzimas y equipos para dar como resultado el producto
deseado y otros compuestos qumicos. Las reacciones que se presentan en este proceso son de
origen qumico y biolgico y las condiciones bajo las cuales se efecta cada una de ellas debern ser
controladas.
Por ser un proceso novedoso se est estudiando cada etapa que lo compone para determinar el
camino ptimo que dar la mxima produccin de alcohol anhdrido y el mejor rendimiento de la
biomasa. Las etapas en las que se generan situaciones de compromiso y a las que se debe prestar
especial atencin son: pre tratamiento, pre hidrlisis, hidrlisis enzimtica y fermentacin.
El bagazo de caa de azcar es un material ligno-celulsico, obtenido en las centrales azucareras
como desecho, representando el 25% del total de la caa de azcar procesada. Se han desarrollado
muchos tratamientos para hacer este material ms susceptible a la sacarificacin, que incluyen los
tratamientos fsicos, qumicos y enzimticos.
Las etapas que conforman el proceso se desarrollaran a continuacin junto con la seleccin de las
condiciones de operacin de cada equipo.
2.1 Etapas del proceso

1. Pretratamiento, cuya funcin es hacer ms susceptible y accesible el material para la etapa
posterior.
2. Prehidrlisis, que permite liberar las hemicelulosas que contiene el material.
3. Detoxificacin, elimina inhibidores de la fermentacin.
4. Hidrlisis enzimtica, que libera la glucosa presente en los materiales lignocelulsicos.
5. Fermentacin de las hexosas y pentosas para obtener etanol.
6. Separacin y concentracin del etanol.
En la figura 2.1 se presenta el diagrama completo del proceso con las etapas que lo componen.
Uno de los principales problemas vinculados a la produccin de etanol, a partir de biomasas
lignocelulsicas, es el pretratamiento e hidrlisis de la materia prima. De su efectividad depender
que se obtengan altos rendimientos durante la conversin de los azcares a etanol.
La fermentacin se llevar a cabo con una cepa modificada del gnero de las Zymomonas, sta
fermenta pentosas y hexosas lo cual permite un mayor rendimiento de alcohol.
En el prximo captulo se analizaran los puntos crticos de este proceso. Estos puntos comprometan
la obtencin de azucares fermentecibles y por ende la produccin de bioetanol.

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19

2.2 Pretratamiento

El bagazo proveniente de los trapiches debe ser acondicionado para su uso en la obtencin de
bioetanol. La materia prima se somete a una molienda hmeda con la cual se aumenta la superficie
de contacto con reactivos y enzimas. Adems favorece la hidrlisis enzimtica de la celulosa aun
cuando la molienda disminuye el ndice de cristalinidad y el grado de polimerizacin de la celulosa.
El rango ptimo de tamao necesario para aumentar la eficiencia de la siguiente etapa debe estar
entre 0,1 y 4 mm. Investigaciones han demostrado que el molino de bolas vibratorio causa un
incremento importante en la velocidad de hidrlisis cida y enzimtica de sustratos celulsicos
(Ferrer J.R et al, 2002) con lo cual el primer paso del proceso de produccin es la molienda de la
materia hmeda utilizando este molino, omitindose as el paso de pre-secado del bagazo.

2.3 Pre hidrlisis

Luego de la molienda el bagazo pasa a la segunda etapa, esta permite que los rendimientos en la
hidrlisis de celulosa aumenten de menos del 20% de los rendimientos tericos a valores mayores al
90% (Sanchz Toro O., 2008). Para el pre-tratamiento de la biomasa se han propuesto y desarrollado
diferentes mtodos, uno de ellos es la pre-hidrlisis con cido sulfrico diluido a altas temperaturas
que solubiliza y degrada la hemicelulosa en los azcares que la componen. Simultneamente puede
ocurrir la solubilizacin de una pequea parte de la celulosa y tambin de la lignina.
Los principales productos de la hidrlisis en un medio cido son de la celulosa: la celobiosa y glucosa,
mientras que de la hemicelulosa la xilosa. Las reacciones generadas en la hidrlisis cida son muy
complejas, pues el sustrato est en fase slida y el catalizador en fase liquida. Uno de los modelo que
se propone en la literatura est basado en reacciones de pseudo-primer orden irreversibles
homogneas para la sacarificacin o hidrlisis con H
2
SO
4
(Aguilar Rivera , 2010).
El grado de hidrlisis y la velocidad del proceso dependen de muchos factores, entre otros del pH,
temperatura, concentracin del cido, concentracin de la biomasa hidroltica, tipo de materia
orgnica y tamao de la partcula. La constante promedio est en la funcin de los primeros tres
factores que debern controlarse para lograr un buen rendimiento de esta etapa.
Para la optimizacin del proceso el pre-tratamiento con cido diluido se lleva a cabo en un batch en
el cual se introduce tanto la biomasa como el acido sulfrico en una relacin de cido 1% y de
biomasa 10% w/w a una temperatura de 160C por un tiempo de 60 minutos (tabla 2.1).
Una de las principales desventajas de los procesos con cido diluido son la degradacin de los
azcares durante las reacciones y la formacin de subproductos indeseables, por ejemplo cido
actico, hidroximetilfurfural (HMF). Estos no slo disminuyen el rendimiento global sino que,
tambin, actan como inhibidores de la formacin de etanol durante la fermentacin, por lo que
debern ser retirados o disminuidos hasta valores que no repercutan sobre el microorganismo
encargado de la fermentacin.

20

Tabla 2.1 Condiciones Operativas de la pre-hidrlisis.
Pre-Hidrlisis
Temperatura 160 C
Tiempo 60 min
Concentracin de cido 1 %
Concentracin de masa 10 % w/w

Fig 2.2 Reacciones secundarias

2.3.1 cidos orgnicos

En el mtodo de hidrlisis con cido diluido se genera un gran nmero de cidos alifticos que son
originados por los extrables del bagazo, la degradacin de la lignina y la degradacin del azcar
desde la hemicelulosa. El cido actico es el que se encuentra en mayor porcentaje, el cual se
produce por la degradacin del grupo acetil en los polisacridos; en cambio el cido levulnico y el
cido frmico son productos de la degradacin de azcares como manosa, galactosa y fructosa.
Se producen tambin algunos tipos de cidos grasos como cido hexadecanoico, cido 9,12-
octadecadienoico, cido oleico y cido octadecanoico que en su mayora provienen desde los
extrables de la madera. Adems, se tienen cidos alifticos como cido 2-metil-2-hidroxibutanoico,
cido metilpropanodioico y cido metilbutanodioico. En trminos de concentracin estos ltimos
cidos son menos importantes, ya que no afectan considerablemente a la levadura en la
fermentacin alcohlica.

21

2.3.2 Compuestos fenlicos
Entre los compuestos fenlicos reconocidos se encuentran 3-metoxi-4-hidroxibezaldehido, cido 4-
hidroxiacetofenona, vanillina, acetovanilina, cido ferlico, cido vanilnico y cido 4-hidroxibezoico.
Hay compuestos que son liberados mayormente por la degradacin de la lignina. Estos son los
aldehdos fenlicos, el cual se reconoce como el mayor inhibidor de la fermentacin.

2.3.3 Compuestos furanos
Furfural y 5-hidroximetil furfural (HMF) son productos de la descomposicin de pentosas y hexosas,
res-pectivamente (ver Figura 2.2). Se ha reportado que el furfural es un fuerte inhibidor de las
levaduras. Una concentracin de furfural de 1 g/l puede disminuir significativamente la tasa de
crecimiento (libera-cin) de CO
2
y el nmero de clulas totales en la fase de fermentacin.
HMF afecta la fermentacin de forma similar que el furfural. Estudios reportan que la adicin de 4
g/L de HMF disminuye en un 32% la tasa de produccin CO
2
, la produccin de etanol disminuye en un
40% y la tasa especfica de crecimiento disminuye en un 70%. Cabe sealar que el efecto inhibidor
del HMF es menor que el furfural. Por otro lado, la tasa de conversin del furfural es mucho ms
rpida que la del HMF, dado que la primera viene desde las pentosas y el segundo desde las hexosas.

2.4 Detoxificacin

La detoxificacin es la etapa que tiene como fin eliminar o disminuir la cantidad de agentes txicos
presentes en la fraccin liquida resultante de la pre-hidrolisis. En esta etapa es necesario determinar
la concentracin de cada uno de los compuestos al inicio de la etapa y al final de la misma. Tiene
como defecto que no solo se reducen los txicos sino tambin algunos azucares fermentecibles,
reducindose el rendimiento de alcohol obtenido (C.A. Cardona et al., 2010).
Existen varios mtodos para la remocin de compuestos inhibidores como neutralizacin, overliming
con Ca(OH)
2
, carbn activado, resinas de intercambio inico y detoxificacin enzimtica. Solo
algunos de estos mtodos pueden remover todas las sustancias txicas.
El overliming es un mtodo de detoxificacin que remueve parcialmente los txicos inhibidores como
furfural e hidroximetilfurfural (HMF), no obstante los cidos orgnicos no ven afectada su
concentracin. ste mtodo consiste en elevar el pH de la suspensin al rango de 10-12 y mantener
esas condiciones por un perodo de tiempo superior a los 15 minutos (Puwardi et. al, 2004).
Se han propuesto diferentes modelos cinticos para describir la degradacin de los azcares y
furanos, el ms efectico considera la reaccin de los Ca
2+
con los reactivos para formar complejos que
se convierten en productos o retornan a su forma original. El mecanismo de la reaccin que describe
este modelo es el siguiente:

22

Dnde:
A reactivo (azcar, HMF o furfural)
Z el catin Ca2+
{ZA} es el ion complejo

Los complejos que se forman estn indirectamente limitados por el pH del medio, pues a mayor pH
se tienen mayores prdidas de azucares y formacin de complejos (Martinez et al, 2000). En este
paso se genera una relacin de compromiso y se deber optimizar para saber cul es la cantidad
apropiada de Ca(OH)
2
a agregar.
La remocin de los txicos que se obtiene con este tratamiento puede observarse en la siguiente
tabla 2.2.

Tabla 2.2 Remociones por Overliming
Agente Tratamiento previo Remocin
Overliming con
Ca(OH)
2

Hidrlisis
cida
Furfural (51%)
HMF (51%)
Comp. Fenlicos
(41%)
Furanos (45.8%)
Fenoles (35.87 %)
Ac. Actico (0%)

Las condiciones de trabajo en la detoxificacin pueden observarse en la siguiente tabla.

Tabla 2.3 Condiciones operativas en el Detoxificador
Variables Detoxificacin
Temperatura 30 C
pH 11
Tiempo 40 min

El pH luego debe ser ajustado a 5.5-6.5 con H
2
SO
4
o HCl para ingresar al fermentador junto con el
lquido proveniente de la hidrlisis enzimtica.

2.5 Hidrlisis enzimtica

La celulosa obtenida del pretratamiento debe ser reducida a monmeros de glucosa (sacarificacin)
para su posterior fermentacin, esto puedo lograrse tratando al polisacrido con agentes qumicos
(hidrolisis cida) o enzimas. La reaccin de descomposicin de la celulosa puede observarse a
continuacin, esta reaccin tiene un rendimiento terico de reaccin de 1.1 glucosa/g celulosa.

23

Al emplear cidos inorgnicos a temperaturas entre 200 y 240 C y 1.5% de H
2
SO
4
o HCl, es inevitable
la formacin de productos indeseables. Por esta razn, la hidrolisis de la celulosa se lleva a cabo
empleando enzimas denominadas genricamente celulasas logrndose mejores rendimientos en la
fermentacin, no hay degradacin de glucosa, aunque el proceso se torne ms lento.
Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aerbicos o anaerbicos,
mesfilos o termfilos, que son los mayores descomponedores del planeta. Estas protenas actan
sobre los enlaces beta 1-4 de la celulosa dando como resultado monmeros de glucosa. Las ms
estudiadas son de origen fngico, las cuales son segregadas como complejo celuloltico de hongos
que actan sinrgicamente (Sanchez Toro, 2010). El sistema enzimtico tiene tres diferentes tipos de
actividad que son:
1. Endo--glucanasas
- (1,4)-glucanglucanohidrolasa
2. Exo--glucanasas.
a. -(1,4)-glucancelobiohidrolasas
Celobiohidrolasa (CBH)
b. -(1,4)-glucanglucanohidrolasas
Glucohidrolasa (GGH)
3. - glucosidasa


24

Fig 2.3 Sistema enzimtico de la celulasa

Las endoglucanasas representan el 20 % del total de protenas del complejo. Estas actan al azar en
el interior de la celulosa que ha sido previamente tratada, hidrolizando enlaces-(1,4) y generando
nuevos finales de cadena no reductores, no puede actuar sobre la celulosa cristalina, es por esto que
es necesario un buen pretratamiento que ataque la estructura del polmero.
La celobiohidrolasa acta sobre los extremos no reductores de la cadena generados por la
endoglucanasa, liberando molculas de celobiosa. Esta enzima tiene actividad sobre celulosa
cristalina y amorfa, y sobre celodextrinas, pero no acta sobre derivados sustituidos ni sobre
celobiosa. La CBH constituye del 50-80% del complejo celuloltico y por ltimo la glucohidrolasa se
encuentra en pequea proporcin y acta sobre los extremos no reductores liberando unidades de
glucosa. Tiene actividad sobre celulosa amorfa, celo-oligosacridos y CMC.
La -glucosidasa hidroliza celobiosa y oligosacridos de pequeo tamao, y es absolutamente
necesaria para evitar la fuerte inhibicin que sobre las endo y exoglucanasas producira la celobiosa
si se acumulara en el medio de reaccin.
Las condiciones de trabajo del reactor enzimtico presentan en la tabla 2.4


25

Tabla 2.4 Condiciones Operativas de la hidrlisis enzimtica
Reactor enzimtico
Concentracin de enzima 10 FPU*
tiempo 36hr
Temperatura 45 C
pH 4,8
rpm >100

2.6 Fermentacin

La fermentacin alcohlica es un proceso biolgico en plena ausencia de oxgeno originado por la
actividad microorganismos que procesan los hidratos de carbono para obtener como productos
finales: alcohol en forma de etanol, dixido de carbono (CO
2
) en forma de gas y molculas de ATP
que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico (fig
2.4).
En esta etapa los monosacridos obtenidos en la hidrlisis y prehidrlisis son transformados en
etanol. Los microorganismos comnmente empleados para la transformacin de los azcares
presentes en los hidrolizados son la E. Coli, ZymomonasMobilis, Sacharomyses Cerevisiae y
Pichiastipitis.
El proceso descripto emplea Zymomonas Mobilis ZM4-(pZB5) y sigue la va metablica que puede
observarse en la figura 2.4. Esta cepa presenta como principal ventaja la cofermentacin de pentosas
y hexosas, con lo cual tiene mayor rendimiento en la produccin de alcohol que la S. Cerevisiae y
como principal desventaja que al ser una cepa mutada su reproduccin celular da cada vez menores
cantidades de ZM4 por lo que disminuye su capacidad de fermentar pentosas.


26

Fig 2.4. Metabolismo propuesto de la ruta pentosa fosfato y E-D en la recombinante Z. mobilis CP4pZB5

Otras ventajas que posee esta cepa en comparacin con las levaduras, a nivel de laboratorio y planta
piloto, en fermentaciones por lotes son las siguientes:
Mayor captacin de azcar y mayor produccin de etanol. Por poseer un transporte de fcil
difusin de azcar, que se acopla con los genes codificantes de las enzimas piruvato de
carboxilasa y alcohol deshidrogenasa (Dimarco and Romano, 1985)
Menor produccin de biomasa. Mientras las levaduras producen 2 moles de
adenosintrifosfato (ATP) por cada mol de glucosa a travs de la va Embden Meyherhoff
Parnas, las Z. Mobilis fermenta glucosa a travs de la va Entner Doudoroff y produce solo 1
mol de ATP por cada mol de glucosa figura 2.4.
Mayor tolerancia al etanol. Esta bacteria puede logran concentraciones de etanol superiores
al 12% p/v en fermentaciones con glucosa. Esto se debe a los cidos grasos como el cido
mirstico, palmtico y cisvacnico, presentes en mayor proporcin las tpicas bacterias Gram
(-). Entre los fosfolpidos, el fosfotidiletanolamina es el ms abundante en Zymomonas, as
como la presencia de hopanoides, cuya estructura es muy similar a la de los esteroles y que
juegan un papel muy importante para la estabilidad de las membranas enlas levaduras
(Gunasekaran and Chandra, 1999).
Mayor manipulacin gentica. Al ser una procariota, el genoma de la Zymomona mobilis
presenta menores complicaciones si se compara con levaduras.

De datos experimentales se observa que para las zymomonas el metabolito de preferencia es la
glucosa, en la Fig 2.3.1 se observa que al partir de una concentracin de 10 g/l de ambos sustratos la
fermentacin se completa en 15 horas para la glucosa, mientras que en ese perodo la xilosa logra
una conversin prxima al 40% (anexo II).
Las condiciones de fermentacin para la cepa recombinante (Joachimsthalet al.,2000) pueden
observarse en la siguiente tabla:
Tabla 2.5 Condiciones operativas del fermentador

27

Reactor enzimtico
Concentracin 65 g/l de glucosa
65 g/l de xilosa
Temperatura 30 C
pH 5.0 - 5.5
Rpm 200
Tiempo 24-48 hr

Los rendimientos tericos dan resultados del 92-94%, los resultados experimentales al trabajar en
estas condiciones dan rendimientos de 64 g/l de etanol.

2.7 Destilacin y Deshidratacin del producto

La ltima etapa de la obtencin de bioetanol es la purificacin del mismo. El etanol forma con el
agua un azetropo binario de mnimo punto de ebullicin a 78,17 C (1 atm) con un contenido en
peso de 95,6 %. La destilacin ordinaria del mismo no conduce a la obtencin del etanol absoluto,
pues su punto de ebullicin es 78,4 C superior al del azetropo.
La destilacin es la operacin de separar, mediante calor, los diferentes componentes lquidos de
una mezcla (etanol/agua). Una forma de destilacin, conocida desde la antigedad, es la obtencin
de alcohol aplicando calor a una mezcla fermentada.
El primer paso en la purificacin del producto proveniente de la fermentacin es el retiro de dixido
de carbono. Esto se realiza mediante absorcin en una torre de venteo (25 etapas, 48% ef.), la
corriente de tope est formada por CO2, agua y un poco de etanol. Luego se somete a la mezcla a
una separacin flash, donde los fondos estn compuestos por una mezcla acuosa de celulosa y la
hemicelulosa que no fue hidrolizada y los azucares que no se fermentaron, esta corriente recibe el
nombre de vinazas y son enviadas al sistema de tratamiento de agua; el 99,5% del etanol se retira en
la corriente de tope del flash en una mezcla gaseosa del 20,4 % m/m de etanol y se alimenta al
sistema de destilacin.
La destilacin se realiza en dos torres que trabajan a presin menor de 110 kPa.La primera es la Torre
Fraccionadora (6 etapas, 48% ef.), con el alimento ingresando por el plato 3. Se utiliza un
condensador total y el destilado es una solucin de etanol al 55% m/m. La corriente de fondo es agua
que puede ser reutilizada en el proceso. El destilado es alimentado a la Torre Rectificadora (48
etapas, 59% ef.) con el alimento ingresando por el plato 22. Se utiliza un condensador con reflujo
total y el destilado tiene una pureza del 94,5% m/m de etanol. La corriente de fondo es agua que
puede ser reutilizada en el proceso. El destilado en fase vapor es alimentado al sistema de
deshidratacin con tamices moleculares.
Para obtener el etanol con una pureza de 99,5% , requerida para la utilizacin del etanol como
combustible se utiliza un tamiz molecular. Las especificaciones de las condiciones de operacin del
tamiz son propiedad del fabricante, pero el proceso es el siguiente: el vapor procedente de la

28

columna de rectificacin se sobrecalienta a 115C y se pasa por el tamiz molecular que opera en
adsorcin, las molculas de agua son ms pequeas que las de etanol y quedan retenidas en los
poros de la resina mientras el etanol fluye a travs de la misma. El vapor obtenido tiene una pureza
del 99,5% que es la requerida para utilizarse como combustible. Para regenerar el tamiz, se recircula
a vaco una pequea corriente de etanol puro que arrastra el agua retenida, el producto de sta
regeneracin es una corriente que contiene cerca del 28% en agua, que se recircula a la Torre
rectificadora. Esta tecnologa es llamada Pressure Swing Adsorption (PSA), y utiliza dos lechos
gemelos: mientras uno est adsorbiendo, el otro se va regenerando. Se escogi sta tecnologa
puesto que en el trabajo de Cardona et al. se establece como la mejor entre las analizadas.


29

4. Control de calidad


30

CONTROL DE CALIDAD EN LA PRODUCCIN DEL BIOETANOL A PARTIR DE BAGAZO

La produccin de Bioetanol presentan varias dificultades para su monitoreo y control. La falta de
robustez de los sensores en lnea para medir variables claves, tales como la biomasa o la
concentracin de producto, se han considerado como una seria desventaja para la implementacin
de algoritmos de control y optimizacin. Si bien se utilizan diversas tcnicas para medir las
concentraciones de biomasa y productos de manera directa, estas mediciones son an caras y poco
robustas para procesos en gran escala. Adems las mediciones de laboratorio tienen una frecuencia
de muestreo baja y su retraso compromete la eficacia del control.

3.1 Calidad

Existen diferentes definiciones de la calidad, girando todas ellas alrededor de un punto fundamental,
que es la aptitud del producto para el uso o servicio, desde el punto de vista del cliente.
La American Society for Quality Control ASQC toma el concepto de la calidad como: la totalidad de
requisitos y caractersticas de un producto o servicio que determinan su capacidad de satisfacer
determinadas necesidades.
El control de calidad es el proceso de regulacin a travs del cual se puede medir la calidad real,
compararla con las normas o las especificaciones y actuar sobre la diferencia. Este concepto engloba
las acciones que se realizan para asegurar que el producto cumpla con los requisitos especificados, la
produccin del mismo sea ptima y la materia prima que se emplee sea la mnima posible.
El control de calidad no solo se refiere a proceso y producto sino tambin a la gestin, como pilar
fundamental, para la implementacin de tareas. Algunas ventajas de establecer procesos de control
de calidad son:

Muestra el orden, la importancia y la interrelacin de los distintos procesos de la empresa.
Se realiza un seguimiento ms detallado de las operaciones.
Se detectan los problemas antes y se corrigen ms fcilmente.

3.2 Puntos Crticos de Control (PCC)

La determinacin de los puntos crticos de control, segn la FAO, constituye un principio del Anlisis
de Peligro y Puntos Crticos de Control (APPCC) y se define como: la fase en la que puede aplicarse un
control y que es esencial para prevenir o eliminar un peligro relacionado con la inocuidad de los
alimentos o para reducirlo a un nivel aceptable. Si bien este concepto est orientado a la calidad
alimentaria que un producto debe tener, igualmente es til para todo proceso que tiene como
objetivo producir productos que deben cumplir ndices de calidad estrictos para su posterior
comercializacin.

31

Generalizando el concepto se podra decir que un PCC es la fase en la que puede aplicarse un control
y que es esencial para prevenir o eliminar un peligro relacionado con las caractersticas del producto
final.
Para poder determinar los PCC se precisa un modo de proceder lgico y sistematizado, como el uso
de un rbol de decisiones, el cual es una secuencia de preguntas hechas para determinar si un punto
de control es PCC o no lo es. En cada una de las etapas, el rbol de decisiones, se debe aplicar a cada
uno de los peligros identificados y a sus medidas preventivas. Si se determina la existencia de un
peligro en una fase y no existe ninguna otra medida preventiva que permita controlarlo, debe
realizarse una modificacin del producto o proceso que permita incluir la correspondiente medida
preventiva.
Este rbol de decisiones se aplicar con flexibilidad y sentido comn, sin perder la visin del conjunto
del proceso de fabricacin.

Fig 3.1. rbol de decisiones de Puntos Crticos de Control

3.3 Identificacin de puntos de Control

La determinacin de los puntos crticos del proceso se llev a cabo teniendo en cuenta la bibliografa
y comprobndolos en el rbol de decisin. Niklitschek (2010) menciona los factores crticos que

32

afectan la produccin de bioetanol, y seala que los ms importantes son: la materia prima a utilizar,
el tipo de pretratamiento aplicado y la estrategia de fermentacin adoptada.
En primer lugar, el tipo de materia prima especifica la proporcin de celulosa y hemicelulosa que la
componen (PCC 1). Los sensores desarrollados para medir propiedades de la biomasa no son muy
robustos, por lo que la mayora de las caractersticas de la biomasa se hacen fuera de lnea y con una
frecuencia baja, lo que entorpece el control. Esta primera informacin define cules son los azcares
tericos mximos que en la fermentacin pueden convertirse en alcohol y permiten analizar la
eficiencia global del proceso.
En segundo lugar, el tipo de pretratamiento (PCC 2) define, en un principio, los azcares efectivos
que estarn disponibles para la posterior fermentacin. As, el principal objetivo que tiene la etapa es
la de aumentar el rea de exposicin de las fibras de celulosa para una posterior hidrlisis enzimtica
de estos polisacridos.
Finalmente, la estrategia de fermentacin (PCC 3) define cmo los azcares disponibles en el
material pretratado son generados y asimilados por el microorganismo escogido para producir
etanol. El microorganismo seleccionado influye en la concentracin de alcohol obtenido, pues este
variar segn la tolerancia del mismo a ese producto, su capacidad de fermentar pentosas o
hexosas, o ambas.
Estas tres etapas dependen de la cantidad inicial de celulosa y hemicelulosa presente en la materia
prima, de las extraccin de los azucares fermentecibles, y por ltimo de la conversin de estos a
alcohol, todas estas etapas influyen en las caractersticas del producto final.
En la siguiente figura se puede observar la localizacin de los PCC y las etapas que se comprometen
al no obtener los rendimientos esperados en algunos de estas. As, una mala molienda influir en el
rea de contacto que tendr la celulosa con los agentes qumicos y luego con las enzimas, por lo que
la cantidad extrables de monmeros de glucosa disminuir y con esto la produccin de alcohol. Este
anlisis se realizar de manera ms detalla en la seccin 3.4.


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3.4 Variables de procesos involucradas en PCC
Los puntos crticos definen variables sobre las cuales se deber tener un control estricto para lograr
la mxima eficiencia global del proceso. Muchas de esas variables se relacionan con el rendimiento
de otras etapas del proceso, teniendo en cuenta esto se analiza la influencia de las variables
correspondiente a puntos crticos en las etapas del proceso.

3.4.1 Punto Crtico 1

Caracterizacin fsico qumica

Con los datos provenientes de la caracterizacin se puede tener una idea de la calidad de la materia
prima con la que se cuenta. La proporcin de la celulosa y hemicelulosa se determina para tener una
cuantificacin terica de los ART que ingresarn al fermentador. A su vez el porcentaje de lignina
que conforma la materia prima guarda relacin con el contenido de fenoles, los cuales disminuyen el
rendimiento de la fermentacin.

Variables: celulosa, hemicelulosa y lignina

3.4.1.1Celulosa

Por el contrario, una baja proporcin de celulosa implica una disminucin de glucosa en la entrada lo
que dar una menor produccin de alcohol.
Celulosa Aumento
Pretratamiento no influye
Detoxificacin
disminuye el caudal de ingreso
Hidrolisis
Enzimatica
contenido C
6
O
6
H
12
concentracin de enzimas
para la hidrolisis
Fermentacin
los ART: controlar la relacin
glu/l
%et : controlar para evitar
inhibiciones
Mayor produccin de
alcohol


35

3.4.1.2 Hemicelulosa

El aumento de hemicelulosa produce un aumento en la proporcin de xilosas que son fermentables
por una va metablica ms extensa que las glucosas.
An cuando el microorganismo puede fermentar ambos sustratos tendr preferencia por las
hexosas. Esto puede observarse en las curvas de concentracin del Anexo II, donde se aprecia que la
glucosa es consumida en las primeras horas y la xilosa no termina de consumirse hasta acabado el
ensayo.
Por lo que se concluye que la produccin de alcohol disminuir cuando aumente la proporcin de
hemicelulosa.

Hemicelulosa Aumento
Pretratamiento
hidrolizada en esta etapa
% de txicos
Detoxificacin
caudal de ingreso
Hidrolisis
Enzimatica
contenido C
6
O
6
H
12

enzimas necesarias
Fermentacin
los azucares de C5
Menor produccin
de alcohol?


36

3.4.1.3 Lignina

La disminucin de la lignina implica un mayor contenido de azcares para la fermentacin.
Para la seleccin de materia prima se tiene en cuenta el anlisis de los componentes
constitucionales, pues siempre convendr aquella que tenga el mximo contenido de celulosa y
mnimo de lignina.
El aumento de lignina no solo implica una disminucin de los azcares reductores sino tambin
menor accesibilidad de la enzima a la celulosa.

3.4.1.4 Tamao de partcula

Al disminuir el tamao aumenta del rea de contacto con reactivos y enzimas lo que da mejores
rendimientos en las etapas de pre hidrlisis e hidrlisis enzimtica, por esto al bagazo proveniente de
los trapiches azucareros se lo somete a la molienda en el molino a bolas.

Variable: tamao de partcula
Lignina
Aumento
Pretratamiento Concentracin de fenoles
Detoxificacin
Txicos a la entrada.
Hidrolisis
Enzimatica
ms solidos que dificultan la hidrolisis enzimtica
Rendiminto de la etapa
Fermentacin
ART
Menor produccin de
alcohol


37


Prehidrlisis

En la etapa de la pre hidrlisis debemos tener mayor cuidado en que se mantengan las medidas de la
temperatura y concentracin de cido, ya que la variacin de las mismos influyen altamente en la
formacin de compuestos inhibidores y el rendimiento de la etapa

Variable: temperatura y concentracin de cido

Las dos variables analizadas tienen el mismo efecto sobre las etapas por lo que se analizara una de
manera indistinta.
Tamao de
partcula
de tamao
Pretratamiento
mejor rendimiento por
mayor rea de contacto
Detoxificacin
Hidrolisis
Enzimatica
facilidad para el contacto enzima-
celulosa
mejor rendimiento de la etapa
Fermentacin
ART ms % de et
Mayor produccin
de alcohol


38

La disminucin de la temperatura y concentracin de cido provoca una disminucin en el
rendimiento de la prehidrlisis pues en la materia prima no se generan sitios para que la enzima
hidrolice al polmero. En estas condiciones las etapas de prehidrlisis e hidrlisis enzimtica
disminuyen su eficiencia por lo que los azucares que llegan a la fermentacin son menores. Con esto
queda demostrado que se genera una situacin de compromiso, la cual se deber optimizar para
buscar las condiciones ptimas de trabajo.


Fermentacin

Variables: temperatura, pH, %etanol, % ART a la entrada y salida

Temperatura y pH : se deben trabajar en los adecuados para la bacteria, de no ser asi los
rendimientos de esta etapa disminuirn por lo que se obtendr menor cantidad de etanol
% Azcar (entrada-salida): A la entrada se debe controlar para q no lise a la bacteria, y a la
salida para asegurar la mxima conversin de este a etanol.
% Etanol: se debe controlar para no superar los lmites de tolerancia del microorganismo

A partir del anlisis realizado se plantean cuales son las determinaciones necesarias a realizar para
tener un control del proceso a partir de los cambios que estas variables puedan tener. Algunas
pueden realizarse en lnea lo cual permite un mejor control del proceso, mientras que las que se
realizan en laboratorio tienen un tiempo de retraso en la devolucin de la informacin con lo cual
comprometen la eficacia del control.
Temperatura
Concentracion Ac.
Pretratamiento
inhibidores
Detoxificacin
Caudal de
entrada
% de inhibidores
Hidrlisis
Enzimatica
celulosa ms accesible para
la enzima
Fermentacin

concentracin de glucosa y xilosa
ac. orgnicos
rendimiento x inhibicin de las
bacterias ( inhibidores)
Menor
produccin de
alcohol


39

3.5 Determinaciones Analticas
El anlisis qumico juega un papel muy importante, tanto en el establecimiento y mantenimiento de
la calidad de los productos, como en la industria. Los mtodos o tcnicas utilizadas pueden variar de
acuerdo al estado de la materia que se analiza. Es importante sealar que el anlisis nos lleva a
determinar la calidad de un producto, por lo que es necesario conocer las tcnicas y mtodos que
permiten cuantificar las caractersticas del material analizado.

3.5.1 Mediciones en lnea

Las mediciones en lnea permiten tener un control estricto de las variables de inters, con estas se
puede hacer un seguimiento continuo del producto a lo largo del proceso. Las medidas se comparan
con los valores deseados (set point) alcanzndose as un proceso controlado con un producto final
que cumple con los ndices de calidad requerido. Adems las mediciones permiten inferior variables
que se miden peridicamente y detectar tempranamente una falla, de manera de poder tomar
acciones correctivas sobre estos antes de que salga de la empresa.

3.4.2 Cuadro de clasificacin de mediciones directa (en lnea) e indirecta (laboratorio).

Como se ha comentado las determinaciones se pueden realizar directamente sobre el proceso
aplicando instrumentos de medicin como termocuplas, ph-chmetros, sensores de concentracin de
azcar o en laboratorio. A continuacin se presenta una tabla en la que se clasifican las
determinaciones a realizar

Tabla 3.1 Determinaciones analticas para el control del proceso
Determinaciones en
laboratorio
Determinaciones on-line
Humedad Sensor de humedad
Caracterizacin fisico-qumica pH: reactores, detoxificador
Tamao de partculas Temperatura en distintos
puntos del proceso
Composicin de HC (celulosa,
hemicelulosa, lignina)
Presin en la etapa de
destilacin
Azucares Reductores Totales
(DNS)
Grados Brix:
Caracterizacin del producto
final
Sensor de etanol : % etanol

Las tcnicas utilizadas para las mediciones en laboratorio se encuentran en el ANEXO I. En la
siguiente figura pueden observarse las determinaciones que se realizan.

40

D
e
p
s
i
t
o

d
e

c
i
d
o
T
,

p
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%
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H
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3

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o
n
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l
a
r


41

3.5.3 Caracterizacin de la materia prima

Al bagazo proveniente del ingenio se le realizan las determinaciones que pueden observarse en el
siguiente esquema

Fig 3.4. Determinaciones a realizar en la materia prima

Las metodologas para realizar los anlisis pueden observarse en el Anexo 1. Las determinaciones
del esquema se harn en el laboratorio con una cierta periodicidad o cuando el encargado de
proceso lo disponga por distintas razones, por ejemplo haber cambiado el campo del que se extrajo
la caa de azcar o que el ingenio haya hecho una modificacin en la extraccin del jugo azucarado.
La determinacin de azucares reductores totales nos permitir estimar la concentracin terica de
alcohol obtenida despus de la fermentacin.

3.5.4 Caracterizacin del material pretratado.

El material pre-tratado es el material obtenido a la salida del molino a bolas. La determinacin del
tamao de partcula forma parte del primer punto crtico al igual que la humedad de la materia
prima. Para la determinacin del tamao de partcula se utiliza una torre de tamices en la que se
coloca la muestra previamente secada. La determinacin de la humedad se realiza en lnea para
saber el caudal de agua y de cido sulfrico que debe ingresa al tanque y lograr la relacin
establecida de masa de bagazo/agua.

3.5.5 Caracterizacin en la prehidrlisis

La prehidrlisis es el segundo punto crtico del proceso, en este se debe tener un control estricto
sobre la concentracin de cido y temperatura de la suspensin para evitar la formacin de
inhibidores de la fermentacin y no reducir los azucares fermentecibles.
La determinacin que se realizan en laboratorio es la concentracin de slido (humedad) para
comprobar que se cumple la relacin 10 % w/w, esta determinacin lleva un tiempo aproximado de
24 horas.
Materia Prima
Biomasa
Pretratada
Hidrolizado
H. cida en 2
fases
Fracc. Lquida
HPLC
Az. C5 yC6
Celulosa
Hemicelulosa
ART
Fraccin
Slida
Secado 105 C
Lignina cido
insoluble
Cen. Totales
Calcinac a
550C

42

Las variables que se miden en lnea son: temperatura, pH, rpm y ART para evaluar la eficiencia en
este paso del proceso (los ART se determinan despus de la filtracin como la suma de las corrientes
de entrada al detoxificador y a la hidrolisis enzimtica).

3.5.6 Determinaciones a realizar en el detoxificador

La metodologa de detoxificacin propuesta reduce la concentracin de HMF y furanos, no as la de
cidos orgnicos. Por esto solo se determinan los cidos orgnicos a la entrada del detoxificador de
manera de asegurarse que la concentracin de estos est por debajo del nivel permitido para no
inhibir la fermentacin. Los HMF y furanos se miden a la entrada y salida del detoxificador, al igual
que los ART. Adems se utiliza un sensor de pH ya que en esta etapa se eleva el mismo a 12 y
despus debe retornarse al pH original.

3.5.7 Determinaciones en la Hidrolisis enzimtica

La actividad enzimtica es una determinacin que se hace en laboratorio, si bien las enzimas que se
utilizan son comerciales, esta determinacin se lleva a cabo para asegurar el correcto
funcionamiento de las mismas. La concentracin de enzima est directamente relacionada con el
contenido de celulosa de la muestra, al determinar la celulosa queda fijada la cantidad de enzima
que se necesita para la hidrolisis enzimtica. En lnea se realizan los controles de pH y temperatura y
azucares a la entrada y salida.

3.5.8 Determinaciones en Fermentador

El fermentador constituye el tercer punto crtico de control, en esta etapa del proceso es
fundamental controlar la concentracin de %ART al inicio (suma de las corrientes que ingresan) y al
final para determinar el rendimiento de la fermentacin. Adems se realiza control de la viabilidad
de las zymomonas y de las condiciones aptas para el desarrollo y produccin de etanol, para esto se
realizan los siguientes controles en lnea durante la fermentacin: pH y temperatura, % etanol. La
viabilidad de la bacteria se realiza comparando los rendimientos obtenidos por lote con el
rendimiento ptimo de la etapa.

3.5.9 Caracterizacin del producto final

La Secretara de Energa en la Resolucin 1295/2008 determina las
especificaciones de calidad que deber cumplir el bioetanol, de conformidad
con el Artculo 3, Inciso c) del Decreto N 109/07.
El BIOETANOL que deber ser mezclado en un porcentaje del CINCO POR CIENTO (5%), medido
sobre la cantidad total del producto final, con el combustible lquido caracterizado como
Nafta, en los trminos del Artculo 8 de la Ley N 26.093, deber cumplir en su composicin
con las siguientes especificaciones:


43

Tabla 3.2 Especificaciones de combustibles lquido
PROPIEDAD MTODO VALOR
Densidad a 20 c, g/ml, valor
mximo
ASTM D-4052 0,7915
Etanol - ms C3-C5 AS%vol, valor
mnimo
ASTM D-5501-IRAM
14651
99,00
Alcoholes superiores C3-C5%vol,
valor mximo
ASTM D-5501 2,00
Metanol,%vol, valor mximo ASTM D-5501 0,40
Agua,%vol, valor mximo ASTM E203 0,60
Cobre, mg/kg, valor mximo ASTM D-1688 0,10
Acidez Total (como Actico)
mg/litro
ASTM D-1613 30
Azufre, ppm, p/p, valor mximo

ASTM D-5453

10,0
Sulfatos ppm, p/p, valor mximo ASTM D 7318/7319/7328
4,0
Apariencia Visual Lmpido sin materiales
en suspensin
Conductividad Elctrica, uS/m,
valor mximo
ASTM D-1125 500
Gomas Lavadas mg/l, valor mximo ASTM D-
381
50
Benzoato de Denatonio ppm,
Valor mnimo (*)
(Espectrofotometra
UV)
40


44

4. Conclusiones
Existen varias alternativas para realizar cada etapa del proceso las cuales estn siendo investigadas
con el fin de encontrar el proceso ptimo.
Las etapas elegidas se consideran altamente factibles para la produccin de bioetanol a partir de
bagazo de caa de azcar a escala industrial.
Los puntos crticos que afectan la produccin de bioetanol son: la materia prima a utilizar, el tipo de
pretratamiento aplicado y la estrategia de fermentacin adoptada.
El microorganismo seleccionado para la cofermentacin es una cepa mutante de la bacteria
Zymomonas que permite altos rendimientos en la produccin de alcohol.
Al controlar las variables en los puntos crticos descriptos se optimiza la eficiencia de las distintas
etapas de produccin. El efecto de que las variables estn fuera del rango ptimo repercute en la
calidad del producto final y en la viabilidad de los microorganismos empleados en el proceso.
La calidad de la materia prima que estemos utilizando influye en la concentracin de ART que se
tendr en la fermentacin, en los inhibidores generados en la prehidrlisis y en el rendimiento global
del proceso.


45

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48

6. Anexos


49

Anexo I
Determinaciones Analticas

1. DETERMINACIN FSICO-QUMICA

Determinacin de extractos
Los extractivos son aquellas sustancias que se encuentran presentes en las diferentes fibras
vegetales, pero que no son carbohidratos, tales como cidos grasos, terpenos, fenoles y resinas.
Muchos de estos compuestos son solubles en agua o disolventes orgnicos polares como el metanol,
etanol o acetona, por lo que se eliminan rpidamente en procesos de extraccin. La determinacin
de extractos se realiza de acuerdo a la prctica de la NREL Determination of Extractives in Biomass.
Empleando un equipo de extraccin soxhlet, para aproximadamente 7 g de muestra y 190 ml de
solvente. Primero se realiza una extraccin con agua, la cual permite determinar la cantidad de
azcares presentes en este material. Posteriormente se realiza una extraccin con etanol para retirar
los extractos que no son solubles en agua. El solvente obtenido en cada una de las extracciones se
lleva a un rotaevaporador donde este es evaporado hasta obtener los extractos.
Con los datos obtenidos en esta prueba se debe calcular el peso de la biomasa libre de humedad
denominado en las normas como peso seco de horno (ODW), por medio de la ecuacin 1. El
porcentaje de slidos totales (T) se determina a partir de la prctica Determination of Total solids in
Biomass.

Ec. 1
El porcentaje de extrables en una base libre de humedad se calcula con la ecuacin 2.

Ec. 2
Determinacin de slidos totales
Las muestras de material lignocelulsico estn compuestas principalmente por dos fracciones: Los
slidos totales y la humedad. El porcentaje de humedad puede variar de acuerdo a las condiciones
ambientales, haciendo que los resultados en las dems pruebas de caracterizacin se desven de su
valor real. Es por este motivo que es ms adecuado determinar la composicin del bagazo para
materiales libres de humedad. Este procedimiento se realiz a partir del mtodo propuesto por la
ASTM, a partir de la prctica Determination of Total solids in Biomass .
Se toman 0,5 g de la muestra y se ponen en un horno a 105 C por 62 horas. El tiempo de secado
puede variar entre 3 y 72 horas. El material se deja en el horno hasta alcanzar peso constante, punto
en el cual se ha retirado toda la humedad.
El porcentaje en masa de los slidos totales obtenidos por secado a 105C se calcula empleando la
ecuacin 3.
Ec. 3


50

Determinacin de cenizas
Las cenizas son el resultado de la combustin del material, son minerales que prevalecen despus de
la calcinacin y generalmente estn compuestos por potasio, calcio y magnesio. La determinacin de
cenizas se realiza de acuerdo a la prctica Determination of Ash in Biomass de la NERL. Se realiza
con las muestras despus de la extraccin. Se debe calcular el peso seco de horno (ODW) de la
muestra, usando el contenido de slidos totales promedio determinado por el procedimiento
Determination of Total Solids in Biomass. Para lo cual se emplea la ecuacin 4.

Ec. 4

El porcentaje de cenizas se calcula con la ecuacin 5.

Ec. 5

Determinacin de carbohidratos estructurales
Los carbohidratos y la lignina constituyen la mayor porcin de las muestras de biomasa. Los
carbohidratos pueden ser estructurales o no estructurales. Los estructurales estn enlazados en la
matriz de la biomasa, mientras que los no estructurales pueden ser removidos usando extraccin o
lavados. Este procedimiento se realiza de acuerdo a la prctica Determination of Structural
Carbohydrates and Lignin in Biomass de la NERL. Para el material libre de extractos por duplicado,
primero se realiza una hidrlisis cida fuerte (cido sulfrico al 72% en peso, durante 60 minutos a
30C) a una alcuota de 300mg del material, posteriormente se realiza a esta misma muestra una
hidrlisis cida diluida (cido sulfrico al 4%, durante 60 minutos a 121C). El hidrolizado se filtra
obtenindose dos fracciones.
La fraccin slida es llevada a una mufla a 575C, donde es calcinada. A partir de los resultados
obtenidos es posible calcular el porcentaje en peso del residuo insoluble en cido (AIR) y lignina
insoluble en cido (AIL) en base libre de extractos, empleando las ecuaciones 6 y 7. Se debe tener en
cuenta que el slido obtenido despus de la calcinacin tambin contiene las cenizas, por tanto es
necesario descontar esta fraccin.

Ec. 6

Ec. 7
La fraccin liquida es empleada para determinar la lignina soluble en cido, a partir de un
espectrofotmetro UV, midiendo la absorbancia a una longitud de onda adecuada. Los valores de
absorbancia adecuado y su correspondiente absortividad para el bagazo, son presentados en la Tabla
A.1.
Tabla A.1: Longitud de onda recomendada para el bagazo y su correspondiente absortividad.
Material Longitud de onda
recomendada (nm)
Adsortividad a la longitud de onda
recomendada () (L/(g*cm))
Bagazo 240 25


51

Para el clculo de la cantidad de lignina soluble en cido (ASL) sobre la base libre de extractos se
emplea la ecuacin 8.

Ec. 8
Donde

La cantidad total de lignina sobre la base libre de extractos se calcula empleando la ecuacin 9.
Ec. 9

Por medio de la ecuacin 10 se calcula el valor de lignina total incluyendo los extractos.
El cual es denominado en la norma porcentaje de lignina en la muestra como se recibi.
Ec. 10
Dnde:
%Extractos = porcentaje de extractos en la muestra de biomasa preparada, determinado por el
procedimiento Determination of Extractives in Biomass.
La fraccin liquida se emplea tambin para la determinacin de los carbohidratos estructurales. Se
toma una alcuota de 20 mL de la solucin, y se lleva a un pH de 5-6, empleando carbonato de calcio.
Se filtran y se analizan por HPLC para xilosa, arabinosa, glucosa y cido actico.
Para esta prueba es necesario preparar una serie de azcares estndares de recuperacin (SRS), a
los cuales se les realiza tambin una hidrolisis cida. Estos son empleados para corregir las prdidas
debido a la destruccin de los azcares durante la hidrlisis cida diluida del bagazo.
Para los estndares de recuperacin de los azcares (SRS), se calcula la cantidad de cada azcar
recuperado despus de la hidrlisis cida diluida. Se promedian los valores de las replicas (%Razcar)
para cada azcar y se reportan como %Razcar ,prom . Como se presenta en la ecuacin 11.

Ec. 11

Empleando los valores calculados con la ecuacin 11, se corrigen los valores de concentracin de los
azcares obtenidos por HPLC para cada muestra hidrolizada. Como se presenta en la ecuacin 12.
Ec. 12


52

A partir de la ecuacin 13 se calcula la concentracin de los azcares polimricos por medio de la
concentracin de los correspondientes azcares monomricos, usando una correccin anhidra de
0.88 132/150 para los azcares C-5 (Xilosa y arabinosa), una correccin de 0.9 o 162/180 para los
azcares C-6 (Glucosa, galactosa y manosa) y una correccin de 0,983 para el acetato.
Ec. 13

Con la ecuacin 14 se calcula el porcentaje de cada azcar sobre la base libre de extractos.

Ec. 14

Donde:
V
filtrado
=Volumen de filtrado
El porcentaje de cada azcar sobre la base de la biomasa como se recibi, se calcula empleando la
ecuacin 15.

Ec. 15

Determinacin del contenido de holocelulosa.
Se determina usando el mtodo de clorinacin (ASTM D1104). Se usan 2.5 g de muestra libre de
extractivos y se les agregan 80 ml de agua destilada caliente, 0.5 ml de cido actico y 1 g de clorito
de sodio. La mezcla se calienta a 70C durante 60 min, luego de este tiempo se agrega nuevamente
0.5 ml de cido actico y 1 g de clorito de sodio y as sucesivamente cada hora. La adicin de estos
dos reactivos se hace un total de 6 veces incluyendo la inicial. Luego de la adicin final se deja 24 h.
Pasado este tiempo se filtra la holocelulosa y se lava con acetona para posteriormente secarla. El
peso final es la holocelulosa y el porcentaje se define por la ecuacin 16.

Ec. 16

Determinacin de celulosa y hemicelulosa.
El contenido de celulosa se determina usando la norma ASTM 1695-77. Se toman 2 g de holocelulosa
libre de extractivos y se agregan 10 ml de NaOH al 17.5% a una temperatura constante de 20C en un
bao termorregulador. Despus de 2 min se agregan 5 ml de la solucin de NaOH en intervalos de 5
min hasta completar 25 ml de NaOH en total incluyendo la cantidad inicial. Luego de esto se deja la
mezcla a 20C durante 30 min, para un total de 45 min.

53

Pasados los 45 min se agregan 33 ml de agua destilada a 20C y el slido se deja reposar por 1 hora
antes de filtrar. Se usan crisoles GOOCH para llevar a cabo la filtracin, lavando con agua destilada.
Luego a la celulosa recogida en el crisol se le agregan 15 ml de cido actico al 10%. El cido es
retirado pero no en su totalidad, solo para que el slido celulsico quede ligeramente cubierto por 3
min. Posteriormente se retira el cido actico remanente por succin y se efectan lavados hasta
que la concentracin de cido sea la mnima posible.
Posteriormente se seca el crisol con la celulosa. El peso de celulosa se determina como la diferencia
entre el peso del crisol con slidos y el peso del crisol vacio.
La hemicelulosa se determina haciendo la diferencia entre la cantidad inicial de holocelulosa libre de
extractivos y la cantidad de celulosa determinada aplicando la metodologa anterior.

2. DETERMINACIN DE TAMAO

Mtodo de retencin por Tamices: Es uno de los mtodos ms sencillos para medir el tamao y
distribucin de partculas. Consiste en hacer pasar 100g (si el dimetro promedio de partcula esta
entre 500-1000M) del material a travs de una serie de tamices circulares de cerca de 20 cm. de
dimetro y 7 cm de altura; cada uno de diferente tamao de poro organizado desde el ms grande
hasta el ms pequeo de manera que uno encaje en el otro hermticamente para minimizar la
prdida de polvo. Se debe tener en cuenta que los tamices deben quedar alineados en el mismo
plano vertical. Los tamices se someten a vibracin constante durante 10 minutos de manera que el
material pase por todos los tamices y que al final de la prueba el material quede disperso en diversas
fracciones entre los tamices y que no ms del 5% del material quede retenido en el ms grueso y no
ms del 5% pase por el ms pequeo. En general los rangos de tamaos de los tamices utilizados
oscilan entre No. 20 hasta 150. Sin embargo para la prueba se pueden utilizar tamices que se pasen
de este rango siempre y cuando la progresin de incremento de tamaos sea proporcional.

Figura 1. Esquema del funcionamiento de un equipo por el mtodo de tamices.

Su gran desventaja es el posible taponamiento que se puede presentar cuando las muestras tienen
humedades superiores al 5%..
El nmero de tamiz se refiere al nmero de orificios por pulgada lineal que estos posean y stos se
relacionan con los sistemas americanos (ASTM E11) y britnicos (BS410) de clasificacin basados en
la progresin de raz cuarta de dos.


54

3.DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE MATERIA SECA Y HUMEDAD

Se determinara utilizando el mtodo AOAC No. 934,01 (AOAC, 1990). En el cual se somete una
muestra representativa del bagazo a secar en un horno a 60 C para poder determinar la materia
seca inicial a 60 C y posteriormente se coloca en una mufla a calentamiento a 105 C para poder
calcular la materia seca a 105 C. La materia seca analtica del bagazo se consigue multiplicando los
resultados fraccionarios de materia seca a 60 C y 105 C.

4. DETERMINACIN DE LOS PRODUCTOS DE DEGRADACIN

El anlisis cualitativo y cuantitativo de los compuestos vainillina, cido vainllico, alcohol vainllico,
siringaldehdo, cido sirngico, alcohol sirngico, 4-hidroxibenzaldehdo, cido 4-hidroxibenzico,
alcohol benclico, catecol, guayacol, furfural y 5-hidroximetilfurfural (HMF), se realiz mediante
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en un cromatgrafo de lquidos Hewlett Packard (HP)
modelo 1100 con un detector UV de fotodiodos (Diodo Array) HP 1040A. Se utiliz una columna
cromatogrfica Aminex HPX-87H (Sulfonated divinyl benzene styrene copolymer), resina en forma
inica de hidrgeno de 300 mm x 7,8 mm de dimetro interno, (Bio-Rad Labs, CA, USA). La
temperatura de trabajo fue de 55 C. La fase mvil fue una mezcla (v/v) de 82% cido sulfrico 5 mM
y 18% acetonitrilo a un flujo de 0,3 ml/min.
La utilizacin de un detector de fotodiodos permite hacer un barrido total de longitudes de onda,
obtenindose el espectro de absorcin UV completo para cada pico cromatogrfico. Esta tcnica
permite medir absorbancias frente a tiempos de retencin y longitudes de onda simultneamente, lo
que proporciona resultados a diferentes longitudes de onda para cada compuesto contenido en la
muestra, y permite obtener un anlisis cuantitativo para cada compuesto a la longitud de onda de
mxima absorcin. El rango de longitudes de onda en el que han sido realizados los anlisis fue de
200-320 nm.
La determinacin analtica de los cidos actico, levulnico y frmico se realiz mediante un
cromatgrafo de lquidos HPLC, Waters, modelo 590, provisto de un detector de ndice de refraccin,
Waters 410. La separacin cromatogrfica se realiz mediante una columna de acero inoxidable,
Aminex HPX-87H (Bio-Rad Labs, CA, USA) de 300 mm x 7.6 mm de dimetro interno. La fase mvil
utilizada fue cido sulfrico 5 mM, a un flujo de 0,6 ml/min y 65 C de temperatura de columna.

5. DETERMINACIN DE ART (MTODO DNS) (EIO)

Segn este mtodo, el DNS (Figura 14) sufre la reduccin de uno de sus grupos nitro al reaccionar
con los carbohidratos, formando un compuesto rojizo que presenta una fuerte absorcin en los
540nm.


55

Para el procedimiento fueron adicionados 0,5 ml de muestra y 0,5 ml de DNS en un tubo de ensayo.
El medio reaccional permaneci en agua a 95C por exactamente 5 minutos y enseguida fue
enfriado en un bao de hielo y a cada tubo se le adicionaron 3,5 ml de una solucin de tartrato de
sodio y potasio para estabilizar el color. Se hace la lectura en el espectrofotmetro a 540nm. La
cuantificacin de ART fue obtenida a travs de la curva de calibracin obtenida como se explica en el
apartado A1, de este Anexo, utilizando el azcar reductor de inters (glucosa) como patrn. La curva
de calibracin se baso en soluciones patrn que fueron sometidas al mismo procedimiento de las
muestras.

A.1 Construccin de la curva patrn para el mtodo DNS
Para la determinacin de la concentracin de ART (Azcares Reductores Totales) por el mtodo DNS,
es necesario construir una curva patrn que relacione la concentracin de glucosa con la absorbancia
de la muestra en una longitud de onda de 540nm. Por lo tanto debe realizarse una tabla donde se
muestren la concentracin de las soluciones de glucosa y sus respectivas absorbancia despus de
aplicarles el mtodo DNS, con esto se construye una curva patrn la cual es utilizada luego para
determinar la cantidad de ART de la muestra analizada.

6. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

La actividad de la enzima celulasa se determina como actividad de filtro de papel (FPA) y expresada
en unidades de filtro de papel (FPU Filter Paper Units) por volumen de enzima original, como es
recomendado por la IUPAC (Ghose et al. 1987).
Para esto inicialmente se prepara una solucin 1:20, es decir una concentracin de 0.05 de enzima. A
partir de esta solucin se efectuaron 5 diluciones ms en tampn citrato 0,05 mol/L, pH 4,8. Se
utilizan 5 diluciones diferentes para la determinacin de la actividad. Primero se adicionan a 5 tubos
de ensayo 1.0 ml de tampn citrato 0,05 mol/L, pH 4,8, a cada uno se le agrega 50 mg de filtro de
papel, y son llevados a bao termostatico a 50C. Despus se adicionan 0.5 ml de la enzima
previamente diluida incubados por 60 minutos. Despus de este tiempo se sacan los tubos y se les
agrega 1.5 ml del reactivo DNS y se lleva a 95 C por 5 minutos y luego se transfieren a un bao de
hielo. Al final, se adicionan 10,5 mL de estabilizante se espera a que la pulpa se sedimente para leer
el color formado en el espectrofotmetro.
Despus de las lecturas de las absorbancia, se traza una curva donde se relaciona la dilucin de la
enzima con la concentracin de glucosa liberada por 0.5 mL de enzima y se determina la actividad de
la enzima teniendo en cuenta que la unidad FPU se basa en la liberacin de exactamente 2,0 mg de
glucosa siendo esto equivalente a 2,0/0,18016 mol de 50 mg de filtro de papel por 0,5 mL de
enzima diluida en 60 minutos de reaccin.
Segn los valores anteriores la actividad de la celulasa queda determinada por la ecuacin 17:

Ec. 17


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7. DETERMINACIN DE ETANOL

El etanol se analiza en un cromatgrafo de gases Hewlett Packard 5890 serie II, equipado con un
inyector automtico Agilent serie 6890, un detector de ionizacin de llama (FID) y una columna
Carbowax 20M (2 m x 1/8 in) a una temperatura de 85 C.

8. CONTROL DE LA VIABILIDAD DE LAS ZYMOMONA

Este control se realiza teniendo en cuenta el rendimiento del lote y comparando ese resultado con
los valores ptimos de fermentacin de la cepa. Las zymomonas, por ser bacterias, no se contabilizan
por tincin, a diferencia de las levaduras, y los ensayos necesarios para su control llevan mucho
tiempo por lo cual se considera que los mismos no son tiles como anlisis rutinarios, es por esto
que con la determinacin de ART al inicio y final de la fermentacin servir para examinar que la
cepa este dando los resultados esperados.

9. CONTROL DE CALIDAD DEL BIOETANOL
Las determinaciones que se realizan sobre el producto final son las citadas en la Resolucin
1295/200, en las que se especifica las caractersticas de calidad que deber cumplir el
bioetanol. En la tabla 3.2 se especifica los mtodos analticos a emplear para la determinacin
de las distintas propiedades y a continuacin se muestran algunas de las propiedades y sus
importancias.
1. Importancia de cada propiedad
El etanol carburante a ser mezclado con la gasolina regular deber ser anhidro, es decir, alcohol
etlico anhidro combustible (AEAC) y deber presentar algunas propiedades que garanticen la
obtencin de un gasohol adecuado para sustituir la gasolina regular.
La importancia de cada propiedad del AEAC, garantizando la calidad del gasohol, puede ser
comprendida considerando los siguientes puntos:
I. Aspecto y color
Representan caractersticas importantes, pues permiten evaluar la presencia de impurezas
provenientes del proceso productivo o del transporte inadecuado, as como la contaminacin con
otros productos o con herrumbre. El oscurecimiento tambin puede ocurrir debido a la oxidacin de
compuestos inestables presentes (alcoholes superiores y aldehdos). La presencia de impurezas
podr tambin reducir la vida til de los filtros de combustible de los vehculos, causar la formacin
de depsitos u obstrucciones en los carburadores de los automviles ms antiguos, o en piezas
movibles de los motores, como las del sistema de inyeccin electrnica de los automviles ms
modernos.

II. Acidez total
Propiedad que debe ser controlada, pues refleja el poder corrosivo del etanol, lo que puede causar
daos a los componentes del automvil. Este parmetro deber ser evaluado, pues si el proceso
fermentativo no es interrumpido adecuadamente despus de la formacin del etanol, ste se oxidar
transformndose en cido actico. Cabe sealar tambin que se adiciona cido sulfrico a la mezcla,

57

a fin de ajustar el pH, para que la fermentacin ocurra. La acidez puede provocar corrosin en el
circuito de combustibles, adems de reflejar un grado de etanol inferior al deseado.

III. Conductividad elctrica
Propiedad directamente relacionada con la cantidad de iones presentes en el etanol.
Cuanto ms iones tenga ms conductor ser el AEAC, que puede ser ms corrosivo y/o agresivo a los
materiales del circuito de distribucin del combustible en el automvil. Muchas veces puede
evidenciar contaminacin con base, usada en la tentativa de neutralizar la acidez del etanol.

IV. Masa especfica
La masa especfica (densidad) es una medida indirecta de la proporcin agua y alcohol existente en el
combustible. Si es elevada, puede indicar gran cantidad de agua; si la masa especfica es muy baja,
indica la presencia de componentes livianos, como metanol y aldehdos, los cuales pueden causar
ms polucin al medio ambiente. Como los motores son ajustados considerando el poder calorfico y,
en consecuencia, el contenido energtico por litro de combustible abastecido, la densidad es una
propiedad que debe ser monitoreada continuamente en diferentes etapas de la distribucin del
producto.

V. Grado alcohlico
Adems de reflejar el grado de pureza del etanol, permite evaluar especialmente la presencia de
agua, que es soluble en el etanol e incolora, pero que presenta elevada densidad.

VI. Grado de hidrocarburos
Refleja el grado de contaminantes orgnicos no oxigenados, principalmente la gasolina o los
solventes petroqumicos que pueden contaminar el AEAC durante el manejo, cuando se comparten
equipos, tanques u otros ductos. Ese parmetro garantiza el grado de etanol adecuado en el AEAC.

VII. Grado de etanol
Este ensayo es importante cuando existe la posibilidad de que haya otros alcoholes adems del
etanol. Es un anlisis que se debe realizar en condiciones especiales, por ejemplo, cuando se
sospecha de la presencia de metanol o de alcoholes superiores. No debe ser, por lo tanto, un anlisis
de rutina que es til para la identificacin y cuantificacin de alcoholes, enfocando especialmente el
etanol.

VIII. Grado de iones cloruro, sulfato, hierro, sodio
La presencia de estos iones aumenta la conductividad del AEAC y reflejan el poder corrosivo del
etanol, especialmente el cloruro, que es muy agresivo a los aceros utilizados en los motores y otras
piezas en contacto con el combustible. El ion hierro delata la presencia de xido de hierro, debido a
los procesos corrosivos en equipos y lneas de transporte y almacenamiento, lo que puede causar
obstrucciones en las partes movibles de los motores. El elevado grado de sodio puede indicar el uso
de base (NaOH) para la neutralizacin de la acidez del etanol, cuando se usa, por ejemplo, cido
sulfrico para ajustar el pH en la preparacin de la mezcla de fermentacin.

IX. Grado de los iones de cobre
Este metal tiene especial importancia, dado que muchos equipos de fermentacin y de destilacin
del etanol pueden ser confeccionados en cobre, metal que es fcilmente transportado por el AEAC.

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Cuando es agregado a la gasolina, catalizar las reacciones de oxidacin de la formacin de goma
(producto macromolecular proveniente de la polimerizacin de olefinas), que es un material de
carcter polimrico, capaz de depositarse y obstruir filtros y el circuito de distribucin de
combustible, comprometiendo el funcionamiento de los automviles.

2. Caracterizacin del alcohol etlico anhidro combustible (AEAC)

a) Determinacin de la masa especfica y del grado alcohlico del alcohol etlico y sus mezclas con
agua
Importancia: alta

I. Referencias
NBR 5992, Determinacin de la masa especfica y del grado alcohlico del alcohol etlico y sus
mezclas con agua mtodo de ensayo;
NBR 5994, Termmetro para alcohol y sus mezclas con agua caractersticas;
NBR 5995, Densmetro para alcohol y sus mezclas con agua caractersticas.
II. Definiciones y siglas
Densidad o masa especfica, masa de un lquido por unidad de volumen a 15C y 101.325 kPa
siendo la unidad patrn de medida kg/m3. Otras temperaturas de referencia pueden ser usadas para
algunos productos en ciertos lugares;
Grado alcohlico, cantidad, en gramos, de alcohol absoluto contenido en 100 gramos de mezcla
hidro-alcohlica, expresada en INPM;
INPM, (porcentaje de alcohol en masa o grado alcohlico INMP): cantidad en gramos de alcohol
absoluto contenido en 100 gramos de mezcla hidroalcohlica.

III. Materiales, equipos y preparacin de la muestra
Densmetro de vidrio conforme especificacin NBR 5995;
Termmetro conforme especificacin NBR 5994, escala interna, corto, graduacin 0,5 C, con
lecturas entre -10 y 40 C (250 mm de largo);
Probeta de vidrio con dimetro mnimo de 25 mm superior al del densmetro de vidrio, con
proporciones tales que permitan al densmetro fluctuar libremente sin tocar el fondo o las paredes
de la misma;
Esos materiales estn ilustrados en la siguiente figura:

Fig 2. Ensayo de determinacin de la masa especfica. Densmetro de vidrio (alcohmetro) y probeta con
gasolina


59

El ensayo de densidad (densmetro de vidrio) y Grado Alcohlico debe ser realizado con la muestra
a temperatura ambiente.

IV. Metodologa
Verter la muestra en la probeta limpia y seca; Introducir el termmetro y utilizarlo para
homogeneizar la muestra con movimientos verticales y circulares. Esperar hasta que la temperatura
se estabilice y hacer la lectura. Retirar el termmetro;
Introducir el densmetro de vidrio apropiado, limpio y desengrasado, de modo que quede flotando
libremente sin tocar el fondo o las paredes de la probeta. Dar un leve giro en el densmetro y esperar
la posicin de equilibrio. Una vez alcanzada la posicin de equilibrio, hacer la lectura observando el
menisco inferior de la superficie principal del lquido, que deber coincidir con la escala de densidad;
Introducir el termmetro y leer nuevamente la temperatura de la muestra;
Los valores de la densidad a 15C pueden ser obtenidos utilizando las tablas que acompaan las
normas. Para eso, se deben tener los datos de la temperatura y de la densidad ledas, obtenindose
as la densidad a 15C;
Con el valor de las masas especficas o de las densidades en las temperaturas de afericin del
densmetro, entrar en la tabla especfica y leer el grado alcohlico en INPM (% masa) y GL (%
volumen).

b) Conductividad elctrica
Importancia: alta

I. Referencias
Manual del conductivmetro (en este caso marca DIGIMED, modelo DM31);
NBR 10547, Alcohol etlico determinacin de la conductividad elctrica;
NBR 14340, Agua determinacin de la conductividad y de la resistividad elctrica;
ASTM D 1125, Standard Test Methods for Electrical Conductivity and Resistivity of Water. Mtodos
de prueba estndar para la conductividad elctrica y la resistividad del agua.

Conductancia, propiedad que mide la capacidad de conducir una corriente elctrica y es el inverso
de la resistencia elctrica, se mide en siemens (S);
Conductividad, conductancia medida entre las caras opuestas de un centmetro cbico
(antiguamente conocida como conductancia especfica), se expresa en S cm-1 S m-1.

III. Materiales, equipos y preparacin de las muestras
Solucin patrn de conductividad; Conductmetro equipado con clula de medicin con constante
aproximada de 0,1 cm-1;
Sensor de temperatura;
Agua destilada para limpieza de la clula;
Bquer para lectura de las muestras, con dimetro superior a la clula de medida;
Bquer para descarte.
El ensayo de conductividad debe ser realizado con la muestra a temperatura ambiente.

IV. Metodologa

60

Conectar el conductmetro a la toma con voltaje adecuado verificar previamente el voltaje;
Esperar que se estabilice, como mnimo 30 minutos, antes de realizar el ensayo;
Presionar la tecla ENTRA;
Esperar que aparezca en la pantalla:
Seleccione funcin
Cond. Res. Conc.
Seleccionar COND y presionar ENTRA;
Seleccionar CHECK para proceder a la verificacin de la clula y presionar
ENTRA;
Sumergir la clula conductimtrica y el sensor de temperatura en la solucin patrn de
conductividad y esperar que se estabilice. Si aparece el mensaje la clula est bien, pasar a la
verificacin con el patrn;
Si la verificacin de la clula muestra el mensaje la clula est mal, seleccionar la funcin COND
en la pantalla principal y, luego, LECTURA y despus CALIBRAR, para calibrar la clula. Seguir los
pasos indicados en la pantalla del equipo para insertar la clula en la solucin patrn. Despus de
concluir la calibracin, el equipo estar apto para realizar el ensayo;
Para hacer la verificacin del conductivmetro, sumergir la clula conductimtrica y el sensor de
temperatura en la solucin patrn de conductividad y despus pasar a la lectura de las muestras. Si la
lectura del patrn no est dentro de la banda esperada, ( 2,0 % de la conductividad del patrn,
segn la ASTM D 1125), seleccionar la funcin COND en la pantalla principal y, luego, LECTURA y
despus CALIBRAR, para calibrar la clula. Seguir los pasos indicados en la pantalla del equipo para
insertar la clula en la solucin patrn. Despus de concluir la calibracin el equipo estar apto para
realizar el ensayo;
El factor de correccin de la conductividad elctrica en funcin de la temperatura debe ser de 2,0%
C, basado en la NBR10457.
Lavar la clula de medicin y el sensor de temperatura introducindolos en el bquer con la
muestra.
Descartar el contenido del bquer. Repetir este procedimiento tres veces como mnimo. Llenar
nuevamente el bquer con una cantidad suficiente de muestra para cubrir la clula de medicin.
Esperar como mnimo 2 minutos para que se estabilice.
Efectuar la lectura y anotar el resultado.
Al final del da lavar la clula con agua destilada y dejarla secar.
Para desconectarlo:
Desea desconectar el equipo? S / NO
Seleccionar S y ENTRA.
Para dejar el equipo en el modo STAND-BY presionar ENTRA.
OBS: Procedimientos similares debern ser realizados para conductivmetros de otras marcas.

c) Grado de hidrocarburos en muestras de alcohol
Importancia: baja

I. Referencias
NBR 13993, lcool Etlico Anidro Combustvel (AEAC) - Determinao do teor de Hidrocarbonetos.
Alcohol Etlico Anhidro Combustible (AEAC) -
Determinacin del grado de Hidrocarburos.


61

II. Materiales, equipos y preparacin de las muestras
Solucin acuosa de cloruro de sodio al 10% m/v (preparada disolviendo 100,0 g de NaCl en 1000,0 L
de agua destilada);
Probeta de vidrio calibrada de 100,0 ml, graduada en subdivisiones de 1,0 ml, con boca esmerilada
y tapa;
El ensayo de grado de hidrocarburos debe ser realizado con la muestra a temperatura ambiente.

III. Metodologa
Colocar la muestra en la probeta previamente limpia, desengrasada y seca hasta completar 50,0 ml;
Agregar la solucin de NaCl 10% m/v hasta completar el volumen de 100,0 ml;
Tapar la probeta. Asirla por la parte superior sobre la tapa y por la base, e invertirla 10 veces para
completar la extraccin del alcohol por la fase acuosa, evitando agitar vigorosamente;
Dejar en reposo por 15 minutos, a fin de permitir la separacin completa de las fases;
Observar el volumen final de la camada acuosa, en ml, de acuerdo con la figura 3:

Fig 3. Posicin adecuada para leer el volumen en la probeta

Las probetas deben ser lavadas con agua y detergente neutro, utilizando un cepillo apropiado
despus de realizar cada ensayo. Dejarlas escurrir hasta que se sequen por completo, para ser usadas
nuevamente;
La limpieza de las probetas deber hacerse llenndolas con solucin sulfontrica y dejndolas en
remojo por dos horas;
La solucin sulfontrica se prepara partiendo de una parte de H2SO4 y tres partes de HNO3. sta
debe ser preparada dentro de un bao de hielo, y se deben usar anteojos de seguridad y guantes
nitrlicos.

IV. Resultados
Calcular el grado de hidrocarburos segn la ecuacin:

% hidrocarburos = (2 A) +1 Ec. 18

Donde, A = volumen de la camada de hidrocarburos, en ml
Cuando el volumen de la camada de hidrocarburos sea inferior a 0,5 ml anotar el resultado como
1% vol;
El resultado es obtenido en %. Si es necesario convertir a ml L-1, multiplicar por 10.

62

d) Aspecto y Color
Importancia: alta

I. Materiales, equipos y preparacin de la muestra
Probeta de vidrio de 1 L bquer de 1 L;
El ensayo de aspecto y color visual debe ser realizado con la muestra a temperatura ambiente.

II. Metodologa
Homogeneizar la muestra invirtiendo el frasco tres veces sin agitar vigorosamente;
Colocar la muestra en la probeta, o bquer, y observar la apariencia y el color de la misma.

III. Resultados
Reportar el color de las muestras de alcohol y gasolina, de acuerdo con el cuadro 5:

Tabla 1. Colores de las muestras a ser reportadas

En el tem aspecto, reportar el resultado con una de las siguientes expresiones:
1. lmpido y exento de impurezas
2. lmpido y con impurezas
3. turbio y sin impurezas
4. turbio y con impurezas

e) Densidad automtica
Importancia: alta
Se presentan instrucciones para el uso correcto del densmetro automtico y la determinacin de la
densidad y/o densidad relativa de destilados de petrleo a temperaturas entre 15 y 35 C, y para
AEAC.

I. Referencias
Manual del densmetro automtico (en este caso, marca Anton Paar, modelo DMA 4500);
ASTM D 4052, Density and Relative Density of Liquids by Digital Density Meter. Mtodo de prueba
estndar para la densidad y densidad relativa de lquidos mediante medidor digital.

Densidad o masa especfica, masa de un lquido por unidad de volumen a 15C y 101,325 kPa con la
unidad patrn de medida en kg/m3. Otras temperaturas de referencia pueden ser usadas para
algunos productos en ciertos lugares;
Densidad Relativa, razn entre la masa de un determinado volumen de lquido a una temperatura
especfica y la masa de igual volumen de agua pura a la misma o diferente temperatura. Ambas
temperaturas deben ser explicitadas, por ejemplo: 20/4C.

63

III. Materiales, equipos y preparacin de la muestra
Densmetro automtico conforme especificado en el tem 6.1 de la Norma ASTM D 4052;
Jeringas de capacidad igual o superior a 2 ml, adaptables al equipo, para inyeccin de la muestra;
Jeringa de 2 ml, como mnimo, adaptable al densmetro;
Alcohol y acetona para limpiar la clula;
La figura 4 es una ilustracin del densmetro usado en el ensayo.

Figura 4. Densmetro automtico (marca anton paar) usado para determinar la masa especfica de
combustibles lquidos

Las muestras de gasolina deben ser mantenidas a temperatura igual o inferior a 10C, y el frasco
slo debe ser abierto en el momento de comenzar el ensayo, debiendo ser tapado inmediatamente
despus, para evitar prdidas por evaporacin de los materiales ms voltiles;
Las muestras de alcohol debern estar a temperatura ambiente.

IV. Metodologa
1) Preparacin del equipo
Conectar el densmetro en la toma de voltaje adecuada;
Oprimir el botn localizado en la parte posterior inferior izquierda del equipo;
El aparato deber permanecer conectado para estabilizarse por un mnimo de 30 minutos antes de
iniciar los ensayos;
Verificar si en la pantalla principal aparece la densidad del aire, 0,0011 g ml-1, indicando que la
clula de medicin del densmetro est seca. Si la tela presenta una densidad diferente del valor
indicado arriba, se deber realizar una limpieza. Para esto, es necesario inyectar acetona en la clula
y conectar la manguera de la bomba de aire en el orificio de entrada de muestra del densmetro.
Conectar la bomba presionando la tecla PUMP;
Esperar aproximadamente 2 minutos, desconectar la bomba de aire y presionar nuevamente la
tecla PUMP;
Esperar hasta que aparezca la densidad del aire (0,0011 g ml-1);
Verificar el volumen del frasco de descarte adaptado al equipo. Si est lleno, verter el contenido del
frasco en el galn de descarte apropiado;
Al concluir el anlisis, limpiar el aparato siguiendo las instrucciones anteriores y desconectarlo.
2) Ensayo de Densidad
La muestra debe ser homogeneizada, invirtiendo el frasco tapado, sin agitar vigorosamente, tres
veces;
Certificarse de que el equipo est programado para la temperatura del ensayo;
Utilizando la jeringa, inyectar la muestra en el tubo de muestras limpio y seco;

64

Observar el tubo de muestras cuidadosamente, asegurndose de que no haya burbujas;
Esperar que la temperatura se estabilice;
El resultado del ensayo ser mostrado en la pantalla del equipo;
Anotar el resultado en la hoja de resultados de la muestra;
Cada vez que se cambie el tipo de combustible a ser analizado, limpiar la clula con alcohol y
acetona.

V. Resultados
En el resultado de la densidad, informar la temperatura del ensayo y la unidad.
Por ejemplo: densidad a 20 C = 0,8765 g cm-1 (para gasolina, se usan unidades de g cm-3, en
cambio, el alcohol generalmente se expresa en kg m-3);
En el resultado de la densidad relativa, informar ambas temperaturas: la de referencia y de ensayo.
El resultado queda sin unidad. Ejemplo: densidad relativa 20/20 C = 0,8765;
Reportar el resultado con cuatro decimales.

f) Acidez total
Importancia: media
I. Referencias
NBR 9866, lcool etlico - Verificao da alcalinidade e determinao da acidez total. Alcohol etlico
- Verificacin de la alcalinidad y determinacin de la acidez total.

II. Materiales y equipos
Microbureta de 2 ml, graduacin de 0,01ml;
Pipeta volumtrica de 50 ml;
Erlenmeyer de 250 ml;
Solucin de hidrxido de sodio 0,02 N padronizada;
Solucin indicadora de naftolftalena 0,1 % en alcohol etlico 70% v/v.

III. Metodologa
Colocar 50 ml de agua en el erlenmeyer y agregar 3 gotas del indicador naftolftalena y
neutralizar con solucin de hidrxido de sodio 0,02N;
Pipetar 50ml de la muestra previamente homogeneizada para el erlenmeyer, agitar y observar el
color de la solucin. Considerar la permanencia del color azul como indicacin de alcalinidad en la
muestra;
Titular con solucin de NaOH 0,02N, en caso de que la solucin quede incolora, hasta que aparezca
el color azul claro. Anotar el volumen consumido;
La muestra es considerada alcalina (positiva) si permanece de color azul;
Si la solucin permanece incolora (alcalinidad negativa) la acidez deber calcularse as:

A = 1200 N V Ec.19

Donde:
A = acidez expresada en cido actico, en etanol
N= concentracin del hidrxido de sodio (mol/L)
V= Volumen de la solucin de NaOH (en ml)


65

g) Grado de Cobre
Importancia: media
I. Referencias
NBR 10893, lcool etlico - Determinao do teor de cobre por espectrofotometria de absoro
atmica. Alcohol etlico - Determinacin del grado de cobre por espectrofotometra de absorcin
atmica.

Espectrofotmetro de absorcin atmica con llama a 324,8 nm;
Lmpara de ctodo hueco de cobre;
Balanza analtica con sensibilidad de 0,1 mg;
Pipetador automtico 25 L;
Balones volumtricos de 100 ml, 500 ml y 1000 ml;
Pipeta volumtrica de 100 ml;
Bastn de vidrio y piseta;
Cobre metlico p.a., alcohol etlico p.a., agua tipo II, agua destilada con conductividad elctrica
inferior a 1,0 S/cm.

III. Metodologa
Construir una curva de calibracin con soluciones-patrn de cobre;
Determinar la concentracin de cobre presente en la muestra por medio de la lectura directa del
grfico de la absorbancia de la misma. Para este fin, la muestra es aspirada y transformada en
aerosol por un nebulizador neumtico y posteriormente atomizada en una llama de aire/acetileno,
donde incide un eje de energa radiante emitido por una lmina de ctodo hueco de cobre;
Calcular el grado de cobre utilizando la siguiente ecuacin:

C= A /d x 1000 Ec.20
Donde:
C= grado de cobre en la muestra en mg/kg.
A= grado de cobre en la muestra obtenido en la grfica, en mg/L.
d= masa especfica de la muestra a temperatura del ensayo, en kg/m3, determinada de acuerdo con
NBR 5992 (Determinacin de la masa especfica y del grado alcohlico del alcohol etlico y sus
mezclas con agua)

h) Grado de cloruro y sulfato
Importancia: baja

I. Referencias
NBR 10894, lcool Etlico - Determinao dos ons Cloreto e Sulfato por Cromatografia Inica,
Alcohol Etlico - Determinacin de los Iones Cloruro y Sulfato por Cromatografia Inica.

Cromatgrafo inico con detector conductivimtrico, pre-columna de 50 mm de largo, con un
dimetro interno de 4,0 mm y columna aninica con grupo amonio cuaternario (HPIC-AS3, Dionex,
USA) de 250 mm de largo y un dimetro interno de 4,0 mm;
Balanza analtica con capacidad de 200 g;

66

Balones volumtricos de 100 y 1000 ml, dos balones de rota vapor (100 ml), pipetas volumtricas
de 20 y 50 ml;
Dos membranas de filtracin con porosidad de 0,45 m y 47 mm de dimetro, un pre-filtro de 22
mm de dimetro.

III. Metodologa
Este mtodo tiene un lmite de deteccin de 0,1 mg/kg con banda linear de hasta 100 mg/kg;
Se preparan soluciones patrn del ion cloruro partiendo de cloruro de sodio y soluciones patrn del
ion sulfato partiendo del sulfato de sodio;
La cuantificacin de los iones cloruro y sulfato se hace por comparacin directa de las reas de los
picos de los iones cloruro y sulfato en el cromatograma del patrn y de la muestra, segn la
ecuacin:

Ca = Cp . Aa / Ap x f Ec 21

Donde:
Ca = concentracin de cloruro o sulfato en la muestra (mg/kg).
Cp = concentracin de cloruro o sulfato en el patrn (mg/kg).
Aa = rea del pico en la muestra (mm2).
Ap = rea del pico en el patrn (mm2).
f = factor de dilucin de la muestra

i) Grado de Sodio
Importancia: media

I. Referencias
NBR 10422, lcool etlico - Determinao do teor de sdio por fotometria de chama. Alcohol etlico
- Determinacin del grado de sodio por fotometra de llama.
ii) Materiales y equipos
Fotmetro de llama o espectrofotmetro de llama ajustado para 589 nm
Estufa a 110 C;
Balanza analtica con precisin de 0,1 mg;
Bquer de 50 ml;
Balones Volumtricos de 100 y 500 ml, pipetas volumtricas de 5, 10, 15, 20 y
25 ml, frasco de polietileno de 500 ml;
Cloruro de sodio p.a., alcohol etlico hidratado, aproximadamente 94 INPM, con grado de sodio
inferior a 0,1 mg/kg y alcohol etlico anhidro, aproximadamente 99,8 INPM, con grado de sodio
inferior a 0,1 mg/kg.

II. Metodologa
Pesar aproximadamente 0,1017 g de Na Cl previamente secado a 110 C por 12 horas, disolver en
bquer de 50 ml. con 10 ml. de agua desionizada.
Transferir a un baln volumtrico de 100 ml., completar el volumen con alcohol etlico anhidro,
homogeneizar y almacenar en frasco de polietileno;
Pipetar 10 ml de la solucin almacenada para baln volumtrico de 100 ml, ompletar con alcohol
anhidro. Pipetar 5, 10, 15, 20, 25 ml de esa solucin para balones volumtricos de 100 ml, completar

67

el volumen con etanol y homogeneizar. Estos corresponden a los patrones de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5
mg/kg de sodio en etanol;
Ajustar el aparato, determinar la transmitancia de las soluciones patrn, graficar en las abscisas los
grados de sodio de las soluciones patrn (mg/kg) y en las ordenadas, las transmitancias (%). Trazar la
recta o curva de ajuste;
Determinar la transmitancia de la muestra, repetir por triplicado y sacar el valor promedio;
Determinar el grado de sodio en el alcohol valindose de la curva patrn, utilizando el valor
promedio y la curva de calibracin;
El grado de sodio en el alcohol est expresado en mg/kg. Esta metodologa se aplica a las muestras
con grados superiores a 0,2 mg/kg. Para muestras con grados de sodio inferiores a este lmite se
deber usar la tcnica de absorcin atmica.


68

ANEXO II
DATOS EXPERIMENTALES

Los siguientes datos experimentales fueron tomados del trabajo: "Influence of Furfural on the
Recombinant Zymomonas mobilis Strain CP4 (pZB5) for Ethanol Production" de la Universidad de
Colorado y sirvieron de justificativo para algunas conclusiones de esta monografa.

1. Descripcin de la Metodologa del ensayo
El ensayo se realizo por duplicado durante 40 horas con concentraciones iniciales de glucosa y xilosa
de 10 g/l en fermentadores de 500 ml, con volumen til del 40 % y temperatura de 30 C.
El medio fue enriquecido con (NH
4
)
2
SO
4
(1 g/l en un medio que contenia 10 g/l glucosa y 10 g/l
xilosa); KH
2
PO
4
(2 g/l); MgSO
4
.7H
2
O (1 g/l); extracto de levadura (10 g/l). Tambin se esterilizo en
autoclave a 121C ( 2 atmosferas de presin) por 15 minutes. Despus de la esterilizacin se agrego
tetraciclina 10 mg/l , en condiciones aspticas.
Para este ensayo se realizo un blanco, el cual no contena furfural (fig 1) y estuvo expuesto a las
mismas condiciones fsicas que los fermentadores que posean el txico.
Las muestras se tomaron en intervalos regulares para la medicin de OD (absorbancia) y filtradas
(Whatman Syringe filters, Fisher Scientific, pore size 0.2 m, Nylon) para los anlisis de xilosa,
glucosa, etanol y furfural.
La evolucin de las concentracin de la biomasa se realizo con espectrofotmetro a 600 nm y
llevadas a la curva de calibracin para referirlas a peso seco celular (DCW) (Gutierrez-Padilla et al,
2005).

2. Control de la Fermentacin
En la figura 1 se observan los reactivos y productos principales de la fermentacin (eje principal)
adems se observa la biomasa cuando no hay furfural en el medio (blanco) . En las Fig 2 y Fig 3 se
presentan la evolucin de la fermentacin para dos concentraciones de furfural.
Los puntos corresponden a datos experimentales mientras que las lneas a modelos propuestos que
simulan la cintica de conversin de reactivos a producto o biomasa.

69

Fig 1. Blanco de cofermentacin de glucosa y xilosa

Fig 2. Cofermentacin con 0.45 g/l de furfural

Fig 3. Cofermentacin con 1.9 g/L de furfural

En la Fig 4 se observa la produccin de biomasa a tres concentraciones de furfural diferentes. Se
observa que a concentraciones de 0.475 g/l inhibe el crecimiento de la biomasa en el tanque de
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25
B
i
o
m
a
s
s
,

F
u
r
f
u
r
a
l

(
g
L
-
1
)
G
l
u
c
o
s
e
,

X
i
l
o
s
e
,

E
t
h
a
n
o
l

(
g
L
-
1
)
Time (h)
Control Fermentation
Glucose
Xylose
Ethanol
Biomass
Furfural
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25
B
i
o
m
a
s
s
,

F
u
r
f
u
r
a

(
g
L
-
1
)
G
l
u
c
o
s
e
,

X
i
l
o
s
e
,

E
t
h
a
n
o
l

(
g
L
-
1
)
Time (h)
Fermentation (Furfural: 0.475 gL
-1
)
Glucose
Xylose
Ethanol
Biomass
Furfural
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25
B
i
o
m
a
s
s
,

F
u
r
f
u
r
a
l

(
g
L
-
1
)
G
l
u
c
o
s
e
,

X
i
l
o
s
e
,

E
t
h
a
n
o
l

(
g
L
-
1
)
Time (h)
Fermentation (Furfural: 1.9 gL
-1
)
Glucose
Xylose
Ethanol
Biomass
Furfural

70

fermentacin (fig 2.3.4) lo cual provoca una disminucin en la produccin de bioetanol, esto puede
observarse en las siguientes figuras que contiene datos experimentales de la cofermentacin de
pentosas y hexosas.

Fig 4. Produccin de biomasa
3. Resultados del ensayo
Los resultados que se obtuvieron de este ensayo se presentan en la tabla 1.

Tabla 1. Disminucin de los rendimientos de etanol y biomasa.
Variables de seguimiento
Concentracin de Furfural [g/]
0.45 1.9
Biomasa (w/v) -30 % -60%
Produccin de etanol (v/v) -19 % -76%

4. Conclusiones
La bacteria consume a mayor velocidad la glucosa que la xilosa.
La concentracin de biomasa es la ms afectada por el inhibidor.
La concentracin de biomasa y produccin de etanol se ven disminuidas por la presencia de
furfural.
La concentracin de furfural disminuye en la fermentacin, por lo que este podra estar
degradndose en estas condiciones del proceso

0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 5 10 15 20 25 30
B
i
o
m
a
s
s

(
g
L
-
1
)
Time(h)
Biomass Production
Biomass (Furfural: 0 gL-1)
Biomass (Furfural: 0.475 gL-1)
Biomass (Furfural 1.9 gL-1)

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