1) El documento describe la enzima tanasa, la cual cataliza la hidrólisis de enlaces éster en taninos. 2) Se producen principalmente en hongos como Aspergillus spp. mediante fermentación en estado sólido usando ácido tánico como sustrato. 3) La purificación implica diálisis, concentración y cromatografía para aislar la tanasa de otros componentes del cultivo fúngico.
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1) El documento describe la enzima tanasa, la cual cataliza la hidrólisis de enlaces éster en taninos. 2) Se producen principalmente en hongos como Aspergillus spp. mediante fermentación en estado sólido usando ácido tánico como sustrato. 3) La purificación implica diálisis, concentración y cromatografía para aislar la tanasa de otros componentes del cultivo fúngico.
Descripción original:
Recopilación de información sobre la enzima Tanasa
1) El documento describe la enzima tanasa, la cual cataliza la hidrólisis de enlaces éster en taninos. 2) Se producen principalmente en hongos como Aspergillus spp. mediante fermentación en estado sólido usando ácido tánico como sustrato. 3) La purificación implica diálisis, concentración y cromatografía para aislar la tanasa de otros componentes del cultivo fúngico.
1) El documento describe la enzima tanasa, la cual cataliza la hidrólisis de enlaces éster en taninos. 2) Se producen principalmente en hongos como Aspergillus spp. mediante fermentación en estado sólido usando ácido tánico como sustrato. 3) La purificación implica diálisis, concentración y cromatografía para aislar la tanasa de otros componentes del cultivo fúngico.
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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIHUAHUA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
TANASA
Tecnologa de Enzimas
Mnica Alcntar Lechuga
Contenido INTRODUCCIN .............................................................................................................................. 1 MECANISMO DE ACCIN. ............................................................................................................ 1 FUENTES DE OBTENCIN........................................................................................................... 3 EXTRACCIN Y PURIFICACIN ................................................................................................. 4 Fermentacin Lquida Sumergida .............................................................................................. 4 Fermentacin en Estado Slido. ................................................................................................ 4 PURIFICACIN DE LA MUESTRA ............................................................................................... 4 Produccin ..................................................................................................................................... 5 Concentracin y purificacin de la TAH .................................................................................... 5 Dilisis. ........................................................................................................................................... 5 Concentracin. .............................................................................................................................. 5 Cromatografa de filtracin en gel. ............................................................................................. 6 Cromatografa de intercambio inico. ....................................................................................... 6 Determinacin de Km y Vmax .................................................................................................... 6 Parmetros cinticos ................................................................................................................... 6 BASE DE DATOS ............................................................................................................................. 7 INMOVILIZACIN ............................................................................................................................ 8 APLICACIONES Y USOS POTENCIALES .................................................................................. 8 REFERENCIAS ................................................................................................................................ 9
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INTRODUCCIN La tanin acil hidrolasa (TAH), comnmente conocida como tanasa, es la enzima (EC. 3.1.1.20) que cataliza la hidrlisis de los enlaces ster presentes en galotnicos, elagitaninos, taninos complejos y steres del cido glico. Sus principales usos se encuentran en la elaboracin de t helado, licor de bellota y en la produccin de cido glico a partir de fuentes vegetales con alto contenido de taninos. (Rodrguez, Valdivia, Contreras., Rodrguez y Aguilar, 2010). La TAH se utiliza como agente clarificante en la elaboracin de ciertos jugos y bebidas refrescantes con sabor a caf. Adems se ha propuesto tratar desechos agrcolas con tanasa o con algn microorganismo productor de esta enzima, para disminuir el contenido de taninos y as poder utilizarlos en alimentacin animal. (Rodrguez, Rodrguez, Rodrguez, Hernndez, Aguilar, 2007) MECANISMO DE ACCIN.
La TAH cataliza la hidrlisis del cido tnico dando como productos nueve molculas de cido glico y una de glucosa por cada molcula de sustrato (Figura 1). Los compuestos intermediarios en esta reaccin son: 1, 2, 3, 4,6 penta-galoil- glucosa, 2, 3, 4,6 tetra-galoil-glucosa y dos tipos de mono-galoil-glucosa. Cuando el sustrato de la reaccin es un metil-ster del cido glico, la TAH produce cido glico y metanol (Rodrguez y col., 2010). 2
El ms comn de los taninos es el cido tnico, puede o no estar metilado, est compuesto por un mol de glucosa y nueve moles de cido glico. En la Figura 2, se observan las estructuras de una molcula de cido tnico metilado y no metilado, cuando el cido tnico no est metilado, la molcula de glucosa se unir por medio de enlaces de tipo ster a el radical R2 (cido diglico) en los carbonos 1, 2, 3 y 4 y al radical R1 (cido glico) en el carbono 6. Si el cido tnico esta metilado el radical R2 ser reemplazado por R3 (m-digalato metilado).
Se logr detectar dos tipos de actividades enzimticas en el extracto obtenido del cultivo de A. orizae. La deteccin de los dos tipos de actividades permiti el fraccionamiento de dos grupos de isoenzimas, mediante cromatografa de afinidad. El primer grupo se denomin Tanasa I, esta fraccin es responsable de la degradacin de cido tnico que posee grupos metilo y el segundo grupo se llam Tanasa II, present una fuerte afinidad por el cido diglico e hidroliz especficamente derivados poliglicos que tienen enlaces con carbohidratos. Los taninos se fueron fraccionando en tres compuestos; cido tnico, el cual no presenta migracin en los anlisis de cromatografa, pentagaloilglucosa y tetragaloilglucosa. Despus de una incubacin de 12 horas la cantidad del ltimo compuesto se incrementa y empiezan a aparecer cidos glicos y di glico, 3
despus de 24 h de incubacin la cantidad de intermediarios se incrementa; estn presentes digaloilglucosa y trazas de monogaloil glucosa. Hacia el final de la hidrlisis, predominan el cido glico y el digaloil glucosa, quedando finalmente solamente cido glico. Lo anterior podra sugerir que la actividad tanasa es mayor al inicio de la incubacin, con la degradacin de cido tnico y la formacin de cidos glico, diglico e intermediarios. La actividad esterasa se nota a partir de las 24 h de incubacin transformando los intermediarios en cido glico. (Garca E.I.1996) Su actividad podra resumirse de la siguiente forma:
El sitio activo de la tanasa contiene una serina, lo cual la hace una tpica enzima esterasa. FUENTES DE OBTENCIN. Es conocido que la produccin de tanasa y la degradacin de taninos hidrolizables, se da en medios fngicos de especies de Aspergillus, incluyendo A. flavus, A. orizae, A joponicus, A. niger y tambin Penicillium sp. Las bacterias son generalmente consideradas como altamente sensibles a los taninos, pero al aislar algunas se observ que son capaces de sobrevivir en presencia de taninos e incluso degradarlos. La produccin de tanasa fue lograda en Bacillus pumilus, B. polymyxa, Corinebacterium sp y Kleibsiella pneumoniae en extractos de corteza de castao como nica fuente de carbono: la rpida degradacin de la estructura de los taninos fue relacionada con la produccin de tanasa extracelular. El cido glico fue el nico producto de degradacin observado con las cepas de Klebsiella pneumoniae, Corinebacterium sp y Bacillus polymyxa. (Garca E.I 1996) 4
EXTRACCIN Y PURIFICACIN Durante mucho tiempo la produccin industrial de tanasa se llev a cabo exclusivamente en sistemas de Fermentacin Lquida Sumergida (FLS), sin embargo, en los ltimos aos una serie de investigaciones han demostrado las ventajas de la Fermentacin en Estado Slido (FES) para produccin de sta y otras enzimas. (Garca E.I 1996).
Fermentacin Lquida Sumergida La tanasa se encuentra en el micelio de Aspergillus flavus o Nger, crecidos en medio que contiene cido tnico como nica fuente de carbono, en fermentacin en medio lquido. La formacin de la enzima puede ser inducida y es mayor al inicio del crecimiento del microorganismo. Tambin se logr detectar algo de actividad extracelular, lo cual indica que una pequea cantidad de enzima se excreta. Aparentemente la produccin est asociada al crecimiento (Garca E.I 1996).
Fermentacin en Estado Slido. Lenkha y Lonsane en 1994, publicaron un estudio comparativo de la produccin de tanasa en fermentacin slida, sumergida y superficial, mostrando que en fermentacin slida se obtuvo 2.5 y 4.8 veces mayor actividad que en fermentacin superficial y lquida, respectivamente, en aproximadamente la mitad del tiempo de produccin. La enzima producida en medio slido fue completamente extracelular a diferencia de la tanasa producida en medio lquido y superficial que fue intra y extracelular, adems la tanasa extracelular mostr una buena estabilidad a altos valores de temperatura y pH. (Garca E.I 1996).
PURIFICACIN DE LA MUESTRA Existen varios mtodos de purificacin, que varan dependiendo del microorganismo que producir la Tanasa. Se mostrara un ejemplo, donde el organismo de donde extraeremos la enzima ser Aspergillus niger.
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Produccin Para la produccin de la enzima tanasa en FES se utiliz la cepa GH1 de Aspergillus niger perteneciente a la coleccin UAdeC-DIA.
El medio de cultivo para la FES consisti en una solucin acuosa de cido tnico (25 g/L) y las sales del medio Czapek-dox. El medio se inocul con la suspensin de esporas hasta dar una concentracin de 8.57 10 6 esp./mL de medio lquido. Se utilizaron cubos de 0.5 cm de arista de esponja de Poliuretano (PUF) como soporte inerte para la Fermentacin en Estado Slido (FES). Se agreg el medio lquido previamente inoculado hasta obtener una humedad del 70 % y una concentracin de 2 10 7 esporas/g de PUF, se homogeniz el material y se incubo a 35C.
Para determinar las condiciones adecuadas para la produccin de la enzima se realizaron fermentaciones en matraz ajustando el pH inicial del medio a diferentes valores (4, 4.5 y 5). Se monitore el comportamiento de cada fermentacin cada 12 h durante 60 h. Se determin actividad tanasa, protena soluble, azcares totales y fenoles hidrolizables totales con el reactivo Folin-Ciocalteu. Para obtener el extracto enzimtico crudo (EEC) se agreg buffer de cido actico-acetato de sodio (50 mM, pH = 5.0), se homogeniz y se exprimi el lquido con ayuda de una jeringa de plstico de 60 mL. El EEC se filtr primero con papel filtro Watman 40 y luego por membrana de celulosa MILLIPORE de 45 m.
Concentracin y purificacin de la TAH Para obtener el extracto enzimtico para la caracterizacin de la tanasa de A. niger GH1, el EEC fue sometido a un proceso de purificacin. Dilisis. Se dializ el extracto contra Buffer de cido actico-acetato de sodio 50 mM, pH= 5.0 durante 48 h, con agitacin a 4 C, una membrana de celulosa (SIGMA) para 12 kDa cambiando el buffer de dilisis cada 12 h. Concentracin. Se evaluaron tres tcnicas para la concentracin de protena: Precipitacin con sal con solvente inorgnico y concentracin con polietilen-glicol (PEG).
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La precipitacin con sales se consigui con sulfato de amonio ((NH4)2SO4) al 60% de la concentracin de saturacin. Para la concentracin con solvente se utiliz acetona en proporcin 1:1 (v/v). En el mtodo del PEG se utiliz en una membrana de celulosa (SIGMA) para 12 kDa, se cubri con polietilenglicol (PM = 6000) durante 48 h hasta que el volumen del lquido dentro de la membrana se redujo considerablemente al 10% del volumen original del extracto. Cromatografa de filtracin en gel. Se utiliz una mini columna Hi Trap TM Desalting de 5 mL de volumen y un flujo de 1 mL/min. Se equilibr la columna con 15 mL de buffer de cido actico-acetato de sodio 50 mM, pH = 5.0. Se inyectaron 1.5 mL de muestra y se efluy con 16.5 mL de buffer, recuperando 9 fracciones de 2 mL cada una. Cromatografa de intercambio inico. La fraccin de la cromatografa de desalado que present ms actividad fue sometida a una cromatografa de intercambio inico de la siguiente manera: Se probaron dos mini columnas de intercambio anicnico Hi Trap TM de 1 mL de volumen (DEAE-FF y Q-XL). La columna se eluy con un gradiente escalonado de NaCl 0 a 1.0 molar en buffer de acetato. Las fracciones con mayor actividad fueron tomadas como extractos purificados. (Rodrguez y Col., 2007) Determinacin de Km y Vmax Km y Vmax se determinaron mediante una grfica de velocidad frente a la concentracin de sustrato S. Km es igual a S cuando la velocidad inicial (V) es igual a Vmax. Km es una propiedad del complejo ES; que no depende de la concentracin de enzima o sustrato. (Sabu, Kiran, and Pandey, 2005) Parmetros cinticos El efecto de la concentracin de sustrato en la actividad de la tanasa crudo y purificado se determin mediante el uso de diferentes concentraciones de cido tnico, en la mezcla de reaccin y la actividad de la enzima se estim en cada caso X y Y e Y max se determinaron por el trazado de la velocidad de reaccin en contra de la concentracin de cido tnico en el sustrato. (Gayen and Ghosh, 2013)
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BASE DE DATOS Organismo Localizaci n T optima (C) pH optimo Peso molecular (kDa) Km Value Actividad especific a Purificacin Inhibidores Aplicacin Aspergillus oryzae Pared Celular 30 4.5 45000 0.7 14.65 2 isoenzimas 1,4- dihidroxibe nceno Biotecnolo -ga Lactobacillus sp Extracelu -lar 30 5 5000 0.62 7.5 Precipitacin con sulfato de amonio, cromatografa en columna Q-Sepharose, cromatografa en columna de hidroxilapatito y cromatografa en columna Mono-Q 1-Propanol Biotecnolo -ga Verticillium sp. Extracelu -lar 25 5.5 15500 1.05 61.8 Isoenzimas nativos TAH TAH I y II 7,9 veces y 10,5 veces, respectivamente, a la homogeneidad Ag +
Penicillium sp. Intracelu- lar 30 5.5 _ _ _ - Heptano Biotecnolo -ga Aspergillus aculeatus Membra- na 30 5 _ _ _ - NaCl Nutricin Aspergillus Niger Intracelu- lar 30 4 18600 0.41 0.43 Precipitacin con acetona y G25 sephadex gel filtracin 1-Propanol Industria Alimenti- cia 8
INMOVILIZACIN Lainmovilizacindeenzimasesunprocesoenelqueseconfinaolocalizaunaenzimadeun a regin definida (soporte slido), con la finalidad de poder reutilizarla en forma repetida. La tanasaliofilizada (100mg) fue disuelta en una solucin buffer (citrato100mM, pH5, 5), hasta alcanzar una concentracin de 2mg/mL de tanasa la solucin de enzimtica (45 mL) sobre el soporte activado, la mezcla se agit durante 24 horas a temperatura ambiente y a una velocidadde100rpm. La mezcla se pas a travs de una malla de 200 mesh. El catalizador se lav de manera sucesiva con una solucin de cloruro de sodio 2M (50 mL), buffer acetato 0,015M pH6 (75mL) y solucin de cloruro de sodio 2M (50mL). El volumen total de lavados se midi en una probeta. El catalizador preparado se almacen en una solucin de cloruro de sodio0.9%(30mL) a 4C. (Castillo, Acuache, Osorio, Fuertes. (2009)
APLICACIONES Y USOS POTENCIALES Los usos de la tanasa se concentran en las industrias de la piel, farmacutica y de alimentos. Hasta el momento, las principales aplicaciones de la tanasa estn en la elaboracin de t instantneo y licor de bellota, as como en la produccin de cido glico a partir de materiales vegetales con alto contenido de galotaninos. La TAH tambin es utilizada como agente clarificante en jugos y bebidas refrescantes con sabor a caf El cido glico se utiliza en la industria farmacutica como un importante compuesto intermediario en la sntesis del antibitico trimetoprima; en la industria qumica se emplea como sustrato para la sntesis qumica o enzimtica de propil- galato y otros compuestos antioxidantes utilizados en alimentos, cosmticos, productos para el cabello, adhesivos y lubricantes. El cido glico es usado en la elaboracin de semiconductores, tintas y en la revelacin fotogrfica. Diversos estudios han encontrado que el cido glico y compuestos relacionados tienen propiedades teraputicas importantes. (Rodrguez y col., 2010). Los usos de la tanasa en bebidas y alimentos contribuyen a reducir los efectos indeseables de los taninos. En la manufactura del t instantneo la TAH se utiliza para eliminar precipitados insolubles que se forman cuando la bebida se enfra a temperaturas por debajo de los 4 C. Estos precipitados se forman por la polimerizacin de compuestos fenlicos y por su interaccin con la cafena. 9
El tratamiento con TAH rompe los enlaces ster de los polifenoles, evitando su polimerizacin y acomplejamiento con la cafena. Los procesos qumicos para eliminar los precipitados del t pueden eliminar una gran cantidad de compuestos aromticos, en cambio, mediante el tratamiento enzimtico se obtiene un t soluble en agua fra con un alto contenido de compuestos aromticos y un color apropiado (Rodrguez y col., 2010) REFERENCIAS 1. Rodrguez L., Valdivia B., Contreras J., Rodrguez R. y Aguilar C. (2010). Qumica y biotecnologa de la tanasa. Revista Cientfica de la Universidad Autnoma de Coahuila. 2, (4). 2. Garca E.I (1996). Produccin, purificacin y caracterizacin de tanasa producida por aspergillus niger, en fermentacin en medio slido. Tesis de Maestro en Biotecnologa. Universidad Autnoma Metropolitana, D.F., Mxico. 3. Rodrguez L., Rodrguez N., Rodrguez N., Hernndez M., Aguilar C. (2007) Estudio de la Inhibicin de la enzima Tanasa producida por Aspergillus niger GH1 en Fermentacin en Estado Slido (FES). [En lnea] TURevista Digi.U@T Agosto 2009. Vol. 4 Nm. 2 [20-11-13] 4. Gayen S. and Ghosh U. (2013), Purification and Characterization of Tannin Acyl Hydrolase Produced by Mixed Solid State Fermentation of Wheat Bran and Marigold Flower byPenicillium notatum NCIM 923. BioMed Research International. 2013, (596380), 6. 5. Sabu A., Kiran S., and Pandey A. (2005) Purification and Characterization of Tannin Acyl Hydrolase from Aspergillus niger ATCC 16620. Original scientific paper. Biotechnology Division, Regional Research Laboratory. 43 (2) 133138. 6. Castillo A., Acuache K., Osorio A., Fuertes C.(2009). Obtencin de galato de n-propilo mediante transesterificacin enzimtica con tanino, propanoly tanasa inmovilizada en quitina. 7. BRENDA. The Comprehensive Enyme Information System. E.C. 3.1.1.20 Tannase.