Aislamiento purificacin y fusin de protoplastos de

babaco y jigacho
Resumen
En una primera fase se estandarizo protocolos de desinfeccin, induccin a callos friables y
hojas in vitro de babaco y jigacho, material vegetal necesario para el aislamiento, purificacin y
fusin de protoplastos. En la fase de aislamiento se valor la accin de tres soluciones
enzimticas que contenan celulasa Onozuka R-10 (1,5 2,25 y 3% p/v), macerozima R-10 (1,5
2,25 y 3% p/v) y pectoliasa Y-23 (0,2 0,3 y 0,4% p/v) sobre callos y hojas de las dos especies;
dando los mejores resultados en nmero de
protoplastos y tiempo de digestin el coctel que llevo
las concentraciones 3% celulasa-macerozima y 0,4%
pectoliasa, incubadas a 26-28oC por un periodo de
33 horas para hoja y 7 horas para callo. Los
protoplastos
aislados
fueron
exitosamente
purificados usando la tcnica de Jadan (2000) que
consisti en la aplicacin de tres tipos de purificacin
(filtracin, centrifugacin directa y diferencia de
gradientes en dos fases), en esta etapa se us el
medio BH3 adems de sacarosa y manitol como
estandarizadores osmticos. Los protoplastos
purificados de callo de babaco y hoja de jigacho
fueron fusionados utilizando una solucin de PEG
(poli etilenglicol) como agente fusionante y la
solucin para estabilizar la membrana de los
protoplastos obtenidos, el medio BH3 fue usado
posteriormente para realizar una serie de lavados con el fin de eliminar los restos de PEG,
finalmente luego de culminado el proceso de fusin se observ clulas fusionadas de las dos
especies. El siguiente paso sera estandarizar un protocolo para la regeneracin de plantas a
partir de fusionantes.

1. Introduccin
El Babaco (Vasconcellea x heilbornii) es un hbrido natural entre V. pubescens y V. stipulata, es
la papayuela de mayor difusin comercial, especialmente en Ecuador y sur de Colombia,
introducida a Nueva Zelanda, Australia, lsrael, ltalia, Califomia,
Grecia
y
Brasil
(Falcn y Brito, 2006). En el pas se cultiva babaco, sin
embargo,
el
problema principal es la forma de reproduccin de las
plantas. El fruto es partenocarpo, (no produce
semillas) lo que reduce su propagacin a una forma
asexual es decir a la obtencin de clones por estacas
en otras plantas del mismo gnero, lo cual ha
repercutido en la falta de diversidad gentica y la
contaminacin masiva del babaco con varias
enfermedades.
El Jigacho Vasconcellea stipulata es una planta que tiene su origen en Amrica, en pases
como: Panam, Bolivia, Colombia y Ecuador. Se la conoce con diferentes nombres: Chilhualcn
en Per, Papayito de los Andes en Venezuela, Papaya Arequipina en Bolivia, Papaya tierna en
Colombia, Papayo en Chile; en el Ecuador la conocemos como Jigacho, Chichaln, Chiglacn o
Tronche. Es una especie muy utilizada como porta injerto para la produccin de babaco y
presenta mayor resistencia a varias enfermedades
La fusin de protoplastos, es una tcnica muy utilizada en la actualidad para el estudio de
varias tcnicas moleculares como transporte y divisin celular, mutagnesis, morfognesis,
variacin somaclonal y en especial transformacin gentica mediante hibridacin somtica o
fusin, dicha tcnica consiste en fusionar dos clulas de Babaco y Jigacho respectivamente
para obtener un genotipo con caractersticas de los dos progenitores.

Los protoplastos son clulas vegetales que han sido separadas

de su pared celular mediante un tratamiento enzimtico o
mecnico y adoptan forma esfrica en el medio de cultivo
Clula vegetal desprovista de pared celular, por proceso
mecnico o enzimtico.
Membrana plasmtica completamente expuesta

DIAGRAMA DE LA OBTENCIN DE UN PROTOPLASTO

Tiene propiedades y aplicaciones interesantes

Pueden multiplicarse y desarrollar estructuras similares a embriones

Permite clulas en vez de plantas enteras para seleccionar
Las clulas vegetales se pueden hacer crecer en un medio liquido en el laboratorio o en
grandes biorreactores
Pueden fusionarse con protoplastos de otros tipos o especies, obteniendo hbridos
somticos.
1. .-AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS

Mtodo mecnico: Consiste bsicamente en un choque osmtico para producir plasmlisis

celular y ruptura de la pared. Los protoplastos se liberan de las clulas rotas mediante el
restablecimiento de su nivel osmtico.
Mtodo enzimtico: Es la incubacin de las clulas en una mezcla de enzimas que degradan
la pared celular.

2. .-CULTIVO DE PROTOPLASTOS

HIBRIDACIN SOMTICA DE PROTOPLASTOS

Este estudio es el inicio de una investigacin cientfica para la obtencin de nuevos genotipos
de Vasconcellea.
En la ltima dcada cientos de estudios de aislamiento y purificacin de protoplastos en varias
especies han sido publicadas y evaluadas por varios investigadores, sin embargo la mayora
coinciden en que el aislamiento depende de varios factores, entre ellos la complejidad del tejido
utilizado para el aislamiento, su edad, la historia ambiental de la planta, el estado fsico y sobre
todo la composicin de la pared (Hui-Yin,et al., 2007).
Varios estudios reportados en ctricos como la naranja, maracuy y en tubrculos como la papa,
muestran excelentes resultados, aunque no se reportan resultados en Vasconcelleas son varias
tcnicas por las cuales se pueden aislar, purificar y fusionar protoplastos. La metodologa ms
utilizada para la obtencin de clulas desprovistas de pared es la aplicacin de enzimas
digestivas que actan sobre la celulosa y pectinas existentes en la pared celular, los
protoplastos aislados mediante esta tcnica pueden ser purificados y fusionados creando
hbridos somticos, en este artculo se detalla las tcnicas estandarizadas para el aislamiento,
purificacin y fusin de protoplastos en clulas obtenidas de callos friables y hojas in vitro
babaco y jigacho.

2. Materiales y mtodos

 Material vegetal
Plantas saludables de babaco y jigacho fueron obtenidas de Patate-Tungurahua y llevadas a
condiciones de invernadero en la Facultad de Ingeniera en Biotecnologa en la Escuela
Politcnica del Ejrcito. Se las someti a una desinfeccin que consisti en la aplicacin de un
fungicida con principio activo carbendazim (0.5%) y sulfato de cobre pentahidratado (0.24%) en
una solucin al 1% durante 7 das, con lo cual se asegur plantas sanas y viables para la toma
de muestras de yemas y hojas, las mismas que posteriormente fueron inducidas a la formacin
de hojas in vitro y callos de las dos especies.
Tanto hojas como yemas de las dos especies fueron desinfectadas utilizando la tcnica
estandarizada por Rivera y Freire, (2007). Debido a que las dos especies son muy parecidas
fenotpicamente el protocolo estandarizado fue el mismo para babaco y jigacho.
Las yemas desinfectadas fueron colocadas sobre un medio lquido M&S (1962) con vitaminas y
el regulador de crecimiento Brasinolida para la obtencin de hojas in vitro, mientras que las
hojas desinfectadas se cortaron en pedazos de 5mm y fueron sembradas en un medio M&S
semislido con los reguladores de crecimiento BAP (bencil-amino -purina) y AIA (cido-indlactico) en concentraciones 3 mgL-1 y 2 mgL-1 respectivamente..
Despus de 15 das de siembra, se observ la elongacin de las yemas y el inicio de la
formacin de hojas in vitro (Figura 1a). Para callo se observ crecimiento 25 das despus de la
siembra (Figura 1b).

Figura 1 a). Obtencin de hojas in vitro a

partir de jigacho (V. stipulata).

Figura 1 b). Obtencin de callo

friable a partir de babaco (V.
Herlbornii).

3. Aislamiento y purificacin de protoplastos

Los callos friables como las hojas fueron sometidas a un proceso de aislamiento de
protoplastos, que consisti para hoja: se mezcl 3g de hoja finamente picada con 8 ml de
medio BH3 y 5 ml de solucin enzimtica segn la tcnica aplicada por Jadn, se evalu
6

nmero de protoplastos mediante conteo en una cmara de Neubauer desde la hora 24

hasta la hora 34. Para callo, la tcnica consisti en realizar una mezcla de 1g de callo con 2
ml de solucin enzimtica y 3 ml de medio BH3, la mezcla fue incubada y evaluada desde 1
hora hasta las 10 horas. Las concentraciones evaluadas en el coctel se muestran en el tabla
1.
Tabla 1. Cantidad de enzimas digestivas colocadas en cada uno de los tratamientos
probados para la digestin de protoplastos de hoja.
Tratamientos

Celulosa
(mg.mL-1)

Macerozima
(mg.mL-1)

Pectoliasa
(mg.mL-1)

0.015

0.015

0.002

0.0225

0.0225

0.003

0.03

0.03

0.004

Una vez estandarizados tiempos y las mejores concentraciones se procedi a purificar las
soluciones que contenan protoplastos liberados, para lo cual se filtr las soluciones a travs de
una malla de acero de 50 m mesh, para remover el material indigerido, la solucin filtrada que
contena protoplastos se re suspendi en medio BH3 (especfico para protoplastos ) y se
centrifug durante 8 minutos a 500 rpm, el precipitado, fase en donde se encuentran los
protoplastos. Fue sometido a una purificacin en un sistema acuoso en dos fases, con la
aplicacin de 5 ml de solucin de sacarosa al 25% con sales CPW y una 2 ml de solucin de
manitol al 13% con sales CPW, aplicada gota a gota, finalmente se obtuvo un halo de
protoplastos en el medio de las dos fases. Los protoplastos ya purificados fueron resuspendidos
en medio BH3 equivalente a 10 por el volumen de protoplastos.

4. Fusin de protoplastos
Previo a la fusin, los protoplastos purificados fueron mezclados en un tubo falcom en
proporcin 3:1 protoplastos de hoja y callo; se centrifug la solucin durante 5 minutos a 500
rpm y se desech el sobrante. Se coloc de 2-3 gotas de protoplastos de callo y hoja sobre
el centro de una caja petri con 2 gotas de solucin PEG y se esper durante 8 minutos , a
continuacin se coloc 2 gotas ms de PEG y 2 gotas de la solucin A+B encargada de
aumentar la resistencia de las membranas de los protoplastos para que resistan el
proceso de fusin, despus de 15 minutos se aadi 12 gotas de medio BH3 con el fin
mantener hmedos los protoplastos y eliminar los restos de PEG, al cabo de 10 minutos con
la ayuda de una micropipeta se retir el medio de la periferia y se volvi a colocar durante 10
minutos ms el medio BH3. Finalmente se retir nuevamente el medio de la periferia y se
repiti el proceso desde la solucin A+B durante 3 veces. Al cabo de todo el proceso se
observ en un microscopio ptico las clulas fusionadas.

5. Resultados y discusin
Aislamiento y purificacin de protoplastos.
Los mejores parmetros en el aislamiento de protoplastos fueron evaluados de acuerdo al
mayor rendimiento de protoplastos (Figura 2a y b) en tiempo de incubacin con cada
concentracin de enzimas en la solucin, para lo cual se realiz una ANOVA y las respectivas
pruebas de Tukey en los casos de significancia.

En clulas desprovistas de pared a partir de hoja, la primera solucin que contena las
concentraciones ms bajas de enzimas en combinacin 1,5% celulasa-macerozima y 0,2%
pectoliasa no dio buenos resultados, debido a que no se observ disgregacin celular ni
protoplastos hasta la hora 25; con la segunda solucin que contena 2,25% celulasamacerozima y 0,3 pectoliasa se observ protoplastos desde la hora 24, teniendo el mejor
rendimeinto con estas concentraciones a la hora 33 con nmero aproximado de 15*106
protoplastos por ml de solucin; sin embargo los mejores resultados fueron obtenidos con la
solucin enzimtica 3 con 3% celulasa-macerozima y 0,4% pectoliasa, solucin con la que se
obtuvo a las 33 horas de incubacin un nmero de 18*106 protoplastos por ml de solucin
(Figura 3a) . En el aislamento de protoplstos a partir de callo se obtuvo protoplastos con todas
8

las concentraciones, la figura 3b muestra los mejores resultados en el caso de callo, los
mismos que se obtuvieron con la solucin enzimtica 3 a las 6 horas de incubacin con un
nmero de 1*108 protoplastos por ml (Fig. 3 b)

Fusin de protoplastos
Las condiciones en las que se fusionaron los protoplastos aislados y purificados fue exitosa,
obtenindose un porcentaje de fusin aproximado del 30-35%, varios heterocariontes fueron
observados y distinguidos debido a que los protoplastos de hoja presentan una coloracin
verde y los protoplastos de callo presentan una apariencia translcida. De esta forma se
observ clulas en proceso de fusin y clulas ya fusionadas (Fig. 4 a y b).

6. Conclusiones
Se logr estandarizar un exitoso protocolo para el aislamiento de protoplastos con una solucin
que contiene una combinacin de enzimas de 3% celulasa-macerozima y 0,4% de pectoliasa,
esta concentracin mostr los mejores resultados tanto para el aislamiento de protoplastos a
partir de hoja de jigacho as como de callos friables de babaco.
La purificacin de protoplastos mostr buenos resultados al aplicar la tcnica usada por Jadn
(2000), la misma que se corrobor al dar altos porcentajes de purificacin usando una malla
con tamao de poro de 50 m mesh para la filtracin, y las soluciones de sacarosa al 25% y
manitol al 13% con sales CPW para la purificacin en un sistema acuoso en dos fases, seguido
de la centrifugacin directa.
La fusin de protoplastos entre clulas de callo y hoja mostr excelentes resultados
obtenindose de un 30 a 35% de clulas fusionadas, entre homocariontes y heterocariontes.
Por lo cual se puede concluir que el mtodo de fusin mediante la aplicacin de una solucin de
PEG es una alternativa viable para la obtencin de nuevas clulas con variabilidad gentica en
estas especies.

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