Manual de Procedimientos de Hematóloga
Manual de Procedimientos de Hematóloga
Manual de Procedimientos de Hematóloga
Mercedes Paita
MANUAL DE
PROCEDIMIENTOS
EN EL REA DE
HEMATOLOGA
REVISADO POR
APROBADO POR
Nombres y Apellidos :
Nombres y Apellidos:
Cargo:
Firma:
Cargo:
Firma:
DE
P ROCEDIMIENTOS
DE
L ABORATORIO
EN
T CNICAS B SICAS
DE
H EMATOLOGA
Presentacin ..................................................................................................... 7
Introduccin ...................................................................................................... 9
SECCIN 1: GENERALIDADES .......................................................................... 11
1.1 Objetivo ........................................................................................................ 11
1.2 Campo de aplicacin .................................................................................. 11
1.3 Responsabilidades .................................................................................... 11
1.4 Documentos de referencia ........................................................................ 12
SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD ......................................................
13
SECCIN 3: OBTENCIN DE MUESTRAS SANGUNEAS ................................
14
3.1 Objetivo ........................................................................................................ 14
3.2 Obtencin de sangre venosa con jeringa ................................................. 14
3.3 Obtencin de sangre venosa en tubos al vaco ....................................... 16
3.4 Obtencin de sangre de la vena yugular externa ..................................... 18
3.5 Obtencin de sangre capilar ...................................................................... 19
SECCIN 4: ANTICOAGULANTES .....................................................................
22
4.1 Caractersticas bsicas de los anticoagulantes ms usados
en hematologa ........................................................................................... 22
4.2 Anticoagulantes slidos ............................................................................. 22
4.3 Anticoagulantes lquidos ............................................................................ 24
SECCIN 5: REALIZACIN Y TINCIN DEL FROTIS SANGUNEO ..................
25
5.1 Mtodo de los dos portaobjetos ................................................................ 25
5.2 Coloraciones usadas ................................................................................. 26
5.3 Tincin con colorante de Wright ................................................................ 27
SECCIN 6: HEMOGRAMA- HEMOGLOBINA- HEMATOCRITO .......................
29
6.1 Recuento leucocitario ................................................................................. 29
6.2 Recuento de globules rojos .......................................................................
33
DE
P ROCEDIMIENTOS
DE
L ABORATORIO
EN
T CNICAS B SICAS
DE
H EMATOLOGA
Tiempo
Tiempo
Tiempo
Tiempo
de
de
de
de
I NSTITUTO N ACIONAL
DE
S ALUD
DE
P ROCEDIMIENTOS
DE
L ABORATORIO
EN
T CNICAS B SICAS
DE
H EMATOLOGA
I NSTITUTO N ACIONAL
DE
S ALUD
DE
P ROCEDIMIENTOS
DE
L ABORATORIO
EN
T CNICAS B SICAS
DE
H EMATOLOGA
PRESENTACIN
Con el propsito de uniformizar los procedimientos hematolgicos que se
realizan en los diversos laboratorios clnicos, el area de hematologa del
Hospital Niestra Seora de las Mercedes de Paita, pone a disposicin dell
Manual de Procedimientos de Laboratorio en Tcnicas Bsicas de
Hematologa, en el cual se incluyen todos los mtodos empleados en el
campo hematolgico bsico. De este modo se contribuye a mejorar la calidad
de diagnstico en los laboratorios de los servicios de salud.
El laboratorio de hematologa cuenta con dos reas bsicas: rea de
Hematimetra (hemograma, VSE, recuento de plaquetas, etc.) y rea de
Hemostasia. Partiendo de esta estructura, en este manual nos referiremos a
las tcnicas bsicas empleadas en estas reas partiendo de la toma de muestra hasta la realizacin de las pruebas respectivas.
Es necesario enfatizar que para obtener resultados ms confiables es importante, pero no imprescindible, automatizar el laboratorio, debido a que ello
evitar el posible error humano, sobre todo en lo referente a recuentos celulares, valores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estas
variables se trabaja con cantidades exactas de sangre, hecho que es muy
difcil de lograr cuando se usan los mtodos manuales, lo mismo sucede al
tratarse de las pruebas de hemostasia.
Esperamos que este manual constituya una herramienta de consulta y una
gua para el personal de laboratorio.
El presente manual ha sido elaborado en forma simple, didctica y eminentemente prctica para que su contenido sea fcil de entender por el personal
que labora en el laboratorio de hematologa.
Se divide en tres partes:
1. En la primera parte se presentan los aspectos ms importantes de la
bioseguridad en el laboratorio.
2. En la segunda parte se exponen las principales tcnicas bsicas del laboratorio de hematologa.
3. En la tercera parte se detallan las alteraciones ms frecuentes de la serie
roja y de la serie blanca de un hemograma.
El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientos
hematolgicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautas
de control de calidad preanaltica) hasta el procesamiento de sta (fase analtica) en la determinacin correspondiente, y por ltimo, en la emisin de los
resultados (fase postanaltica). Debemos recalcar que cuando se realizan
pruebas de hemostasia debe tenerse en consideracin los cuidados comunes a toda prueba de laboratorio, es decir, las muestras deben obtenerse en
condiciones apropiadas y rotularse debidamente. Esperamos que el presente manual sirva de gua efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevos
aportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad.
SECCIN 1
GENERALIDADES
1.1 OBJETIVO
Establecer y estandarizar los procedimientos bsicos de un examen de
hemograma, hemoglobina, hematocrito, recuento de plaquetas, velocidad de
sedimentacin y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnstica al
clnico.
1.2
CAMPO
APLICACIN
DE
1.3 RESPONSABILIDADES
1.3.1 Los directores del Hospital es elresponsables de autorizar, proporcionar
los recursos necesarios, y designar al personal responsable para la
aplicacin de las disposiciones contenidas en el presente manual.
1.3.2 El encargado del area de hematologa es responsable de planificar las
acciones, organizar, controlar y capacitar al personal para cumplir las
disposiciones contenidas en el presente manual.
1.3.3 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el control
interno de la calidad, la idoneidad del personal, equipos, materiales,
reactivos e instalaciones.
1.3.4 El personal mdico, profesional y tcnico, es responsable de seguir las
especificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientos especficos indicados.
1.4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
1.4.1 Manual de Procedimientos de laboratorio en tecnicas basicas de hematologia. Instituto
Nacional de Salud. Serie Normas tecnicas N 40.
1.4.2 Manual de normas de bioseguridad. Instituto Nacional de Salud. Serie de
Normas Tcnicas N 18. 2. ed., 1997.
SECCIN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
2.1 Para la obtencin de muestras, el personal involucrado en los diferentes
procesos para los exmenes hematolgicos debe aplicar las medidas de
bioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad. Serie de Normas Tcnicas N 18.
2.2 Se debe controlar sobre todo:
2.2.1 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologa.
2.2.2 El proceso de coloracin en el que se debe aplicar las medidas de
bioseguridad correspondientes al uso y manipulacin de sustancias
txicas o cancergenas.
2.2.3 Ver lo referente a medidas de proteccin en caso de accidentes por
inoculacin.
SECCIN 3
Anticoagulante.
3.3.1.5 Agujas con dispositivo para extraccin de sangre al vaco:
- N 21 para adultos.
- N 22 para nios y neonatos.
De preferencia, ambas de bisel corto para evitar la coagulacin.
3.3.2 Obtencin de la muestra
3.2.2.1 Verificar que los elementos por utilizar estn listos, y que el
paciente se sienta cmodo.
3.2.2.2 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la
flexin del codo o a 10 cm del codo, sujetar con un medio nudo (Fig. 1).
3.2.2.3 Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado, en un rea de 2
pulgadas (Fig. 2).
3.2.2.4 El paciente deber abrir y cerrar la mano durante unos segundos y
despus la mantendr cerrada, esto ayudar a visualizar las venas
superficiales (Fig. 3).
3.3.2.2 Se retira el estuche protector de la aguja y ste se enrosca al dispositivo
Para extraccin de sangre al vaco.
3.3.2.3
Una vez escogida la vena, lim piar con una pieza de algodn
embebido en etanol al 70%.
PROCEDIMIENTO
Fig. 1
Fig. 2
Fig. 3
Fig. 4
Fig. 6
Fig. 5
Fig. 7
SECCIN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extrada la sangre, sta puede conservarse coagulada o mantenida
incoagulable mediante la adicin de un anticoagulante.
No producir hemlisis.
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible, incluso mantenida bajo refrigeracin (4 C) si no pasan de las 2 horas. El tiempo
mximo entre la extraccin de la sangre y su procesamiento depende del
coagulante de eleccin y no debe ser ms de 4 horas, a excepcin del
anticoagulante EDTA (etilendiaminotetractico) que puede ser hasta 24 horas
(en refrigeracin a 4 C).
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma slida o lquida. Los primeros estn indicados para la determinacin de los parmetros hematolgicos,
ya que no producen, como los anticoagulantes lquidos, dilucin de la sangre.
4.2
SLIDOS
ANTICOAGULANTES
4.2.1 EDTA
Es la sal disdica o tripotsica del cido etilendiaminotetractico. La sal
disdica (Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotsica (K 3EDTA). Estos
compuestos realizan su accin a travs de un efecto quelante sobre el calcio,
al fijarlo impiden su activacin y, por ende, la coagulacin sangunea.
4.2.1.1 Ventajas
Al inhibir la aglutinacin de las plaquetas, facilita su recuento o su expresin semicuantitativa a partir del frotis.
4.2.1.2 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos, a los cuales les
produce encogimiento y cambios en su forma, por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante.
4.2.2 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio. Acta por precipitacin del
calcio, es fcil de preparar. Se emplea en forma de polvo en proporcin de 2 de
oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio. La cantidad recomendada es
de 2 mg x mL de sangre. Este anticoagulante no afecta el volumen globular
medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina, hematocrito y
recuento globular, pero para los extendidos queda limitada a los primeros
minutos, tampoco es til para el recuento plaquetario porque produce formacin de agregados plaquetarios.
4.2.3 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar, que significa hgado, ya que
fue aislado por primera vez de las clulas de este tejido. Es un
mucopolisacrido cido. Presenta el inconveniente de que si no se agita
rpidamente con la sangre despus de extrada pueden formarse
microcogulos, aunque no alte- ra el volumen eritrocitario ni la morfologa de
los leucocitos. No es recomenda- ble para el frotis sanguneo porque
produce un fondo azul en la lmina.
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma slida o lquida, en proporcin de 0,1 - 0,2 mg de heparina por 1 mL de sangre.
4.3
LQUIDOS
ANTICOAGULANTES
SECCIN 5
5.1
MTODO
PORTAOBJETOS
DE
LOS
DOS
5.1.1 Materiales
-
Alcohol al 70%.
Algodn.
Lanceta descartable.
5.1.2 Fundamento
Consiste en la extensin de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75),
empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensin (Fig. 12).
5.1.3 Procedimiento
5.1.3.1 Una vez extrada la sangre con cualquiera de las metodologas, se
coloca una pequea gota de sangre (5mL) (aprox. 3 mm de dimetro)
sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos.
5.1.3.2 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficie
del primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)
formando un ngulo de 45.
5.1.3.4 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre el
otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien
extendida sobre la superficie del primer portaobjeto. El grosor del
frotis sanguneo puede variar segn sea el ngulo que formen entre
s ambos portaobjetos. As, si es superior a 45, la extensin obtenida
ser gruesa y corta, si es inferior a 45 ser larga y fina. El secado del
frotis es a temperatura ambiente y en posicin horizontal.
Fig. 12
EXTENDIDO DE SANGRE
5.2
USADAS
COLORACIONES
5.3 TINCIN
WRIGHT
CON
COLORANTE
DE
5.3.1 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar la
sangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y
tamao de los eritrocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiedades de
coloracin. La informacin obtenida de un frotis de sangre perifrica depende
en gran parte de la calidad del extendido y la coloracin.
5.3.2 Materiales
5.3.2.1 Colorante de Wright (Anexo A).
5.3.2.2 Frasco gotero.
5.3.2.3 Solucin amortiguada tamponada (Anexo A).
5.3.3 Procedimiento
5.3.3.1 Una vez obtenido el frotis sanguneo, se le dejar secar entre 15 y 20
minutos.
5.3.3.2 Luego se coloca la preparacin en un soporte y se cubre con el colorante de Wright, dejndolo por espacio de 5 minutos.
5.3.3.3 Posteriormente se aade solucin amortiguada tamponada en partes
iguales hasta obtener un brillo metlico, dejando 6 minutos adicionales.
5.3.3.4 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar.
5.3.3.5 Se coloca en el microscopio y, con pequeo aumento, se revisa la
calidad de la coloracin, la cantidad aproximada de glbulos blancos
y se escoge el sitio para iniciar el recuento. Se coloca una gota de
aceite de inmersin y se enfoca a un aumento de 100x
La forma de los glbulos rojos se examinar detenidamente observando adems del color (cantidad de hemoglobina), presencia de
plaquetas, su agrupacin y distribucin.
5.3.3.6 Posteriormente, se hace el recuento diferencial de glbulos blancos
en 100 clulas, para lo cual se deber conocer las diferencias entre
neutrfilos, eosinfilos, linfocitos y monocitos.
Una extensin de sangre bien teida debe caracterizarse por una
buena diferenciacin de las estructuras subcelulares en los leucocitos,
una coloracin rosada de los hemates y la ausencia de precipitados.
Los defectos ms frecuentes observados en la tincin del frotis sanguneo son:
Coloracin excesivamente azul, debido a:
Lavado insuficiente
Presencia de precipitados:
Obedecen a una accin excesiva del colorante. Esto se puede
evitar con la filtracin.
SECCIN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exmenes de laboratorio ms
usados en el campo de la hematologa. Comprende las siguientes pruebas:
6.1 RECUENTO
LEUCOCITARIO Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un lquido que permite evidenciar los
leucocitos, mantenindolos visibles, mientras que los eritrocitos son
hemolizados. El recuento del nmero de leucocitos o glbulos blancos se expresa por mm3 (milmetro cbico).
6.1.1 Equipos
-
Microscopio.
LECTURA
Fig. 13
6.1.4 Resultados
N de leucocitos x mm3
Reemplazando
x dilucin
rea
X/1
= N leucocitos contados x 50
4/200
Microscopio.
LECTURA
CMARA DE NEUBAUER
Acercamiento de la cuadrcula
para el conteo de eritrocitos.
Fig. 14
6.2.4 Resultados
N de hemates x mm3
altura
Reemplazando
dilucin
X rea
Mujeres
Nios (4 aos)
Lactantes (1 - 6 meses)
Recin nacidos
6.3
DETERMINACIN
(Hematocrito)
DEL
VOLUMEN
GLOBULAR
Mide la fraccin que comprende a los glbulos rojos (masa globular), respecto al volumen total de la muestra de sangre venosa. Puede expresarse en
porcentaje o como valor decimal.
Hto
Plastilina.
Procedimiento:
Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejo del dedo, o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosa
con anticoagulante de Wintrobe o EDTA. Debe llenarse aproximadamente
70% - 80% del capilar.
Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina.
Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centrfuga de
microhematocrito, con el extremo ocluido adherido al reborde externo de la
plataforma.
Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm.
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio.
Uso de la escala:
Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columna
de eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismo
nivel de la lnea horizontal correspondiente al cero.
Desplace el tubo a travs de la escala hasta que la lnea marcada con el
nmero 1,0 quede al nivel del tope de la columna de plasma. Vigile que el
fondo de la columna de eritrocitos contine sobre la lnea cero. El tubo
debe encontrarse completamente en posicin vertical.
La lnea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicar la
fraccin de volumen de stos.
Valores de referencia:
Hombres
40% - 50%
Mujeres
38% - 44%
Nios (5 aos)
38% - 44%
Lactantes (3 meses)
37% - 42%
Recin nacidos
50% - 58%
6.4 DOSAJE DE
HEMOGLOBINA Principio
La sangre se diluye en lquido de Drabkin, el cual hemoliza los hemates y
convierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina).
La solucin que se produce se lee por medio de un espectrofotmetro o
fotocolormetro. Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad de
hemoglobina que contenga la sangre.
6.4.1 Materiales y reactivos
6.4.1.1 Un colormetro fotoelctrico o un espectrofotmetro.
6.4.1.2 Pipetas:
Una pipeta automatica de fija de20 ul..
Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL.
6.4.1.3 Tubos de ensayo.
6.4.1.4 Reactivo de Drabkin para dilucin.
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1
litro de agua destilada. Si se dispone de una balanza analtica la preparacin se puede hacer en el laboratorio. Esta solucin se puede
conservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro. Deschese si
se enturbia.
El lquido de Drabkin no debe enfriarse demasiado, pues puede causar una decoloracin con reduccin del ferrocianuro.
Referencia para cianometahemoglobina (estandarizada):
Esta solucin se puede adquirir en el comercio o en un laboratorio de
referencia.
En las soluciones de referencia comerciales casi siempre indica la
concentracin en miligramos por 100 mL (generalmente en mg%).
Se preparan diluciones con reactivo de Drabkin de tal manera que los
patrones contengan concentraciones de 60 mg, 40 mg, 20 mg de CNHi.
Leer los tubos en absorbancia con filtro verde a 540 nm, llevando el
fotmetro a cero con el reactivo de Drabkin.
10 g/100 mL
20 mg
5 g/100 mL
Nios de 1 ao
Mujeres
Hombres
6.5
FROTIS
PERIFRICA
DE
SANGRE
6.5.2 Eritrocitos
Se estudia su tamao, forma, color y si existen inclusiones o elementos extraos
como se ver ms adelante.
6.5.3 Plaquetas
las
de
de
de
Por ejemplo:
Si se tiene 60% de neutrfilos segmentados y el recuento total de leucocitos
total es de 20 000, entonces la cifra absoluta de neutrfilos segmentados sera:
60/100 x 20 000 = 12 000 (valor absoluto)
Valores de referencia absolutos de neutrfilos segmentados = 3000 - 5000
Conclusin: Los valores relativos slo nos sirven cuando los valores totales de
leucocitos se encuentran dentro del valor normal. En caso contrario
(leucocitosis o leucopenia) se debe emplear la frmula para obtener el valor real, y
as determinar que elemento celular se encuentra fuera del rango nor- mal, sea
elevado o disminuido.
6.6.1 Procedimiento
6.6.1.1 Se examina la lmina a pequeo aumento para comprobar si los
elementos celulares estn bien distribuidos.
6.6.1.2 Si es favorable se examina con el objetivo de inmersin. La parte ideal
para visualizar clulas para la frmula leucocitaria es en la parte final del cuerpo y
comienzos de la cola, recorriendo la lmina de izquierda a derecha o de arriba
hacia abajo hasta contar 100 leucocitos incluidos los agranulocitos y granulocitos.
Aqu no se incluyen los elementos inmaduros de sangre roja.
Neutrfilos segmentados
55-65
3000-5000
Neutrfilos abastonados
3-5
150-400
0,5-4,0
20-350
0-0,5
10-60
Eosinfilos
Basfilos
Monocitos
4-8
100-500
Linfocitos
25-35
1500-4000
SECCIN 7
VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN
La velocidad de sedimentacin es un examen hematolgico que no est incluido en el desarrollo de un hemograma; sin embargo, es una prueba muy
importante por su gran sensibilidad, pues resulta normal en las enfermedades funcionales, as como en los procesos inactivos o estrictamente locales.
7.1 MTODO DE
WESTERGREN Fundamento
Este examen mide la tendencia de los eritrocitos a sedimentar, al colocar sangre
anticoagulada en un tubo en posicin vertical. Se lee macroscpicamente la
columna de plasma al cabo de una hora de reposo.
Materiales
-
Tubos de Westergren.
Procedimiento
En un tubo que contiene 0,5 ml de anticoagulante citrato de sodio al 3,8% se
extrae sangre venosa, se mezcla mediante movimientos rotatorios sobre una
superficie lisa.
Se vierte mediante una pipeta Pasteur o una jeringa de metal en el tubo de
Westergren, el cual tiene una graduacin de 0 a 200 mm de arriba hacia abajo
y presenta ambos extremos abiertos.
La sangre debe llenarse hasta la marca cero, se coloca en posicin vertical
sobre una gradilla especial que obtura ambos extremos.
7.1.2 Resultados
Medir los milmetros descendidos de glbulos rojos mediante la columna de
plasma por encima del paquete globular.
7.1.3 Valores de referencia
Hombres
1 - 10 mm de altura/hora
Mujeres
3 - 14 mm de altura/hora
7.2 MTODO DE
WINTROBE Fundamento
Al igual que el mtodo de Westergren, este mtodo mide la tendencia de los
eritrocitos a la sedimentacin al colocar sangre anticoagulada en un tubo
pequeo. Se lee la columna de plasma al cabo de una hora de reposo.
7.2.1 Procedimiento
El mismo que para el mtodo de Westergren.
7.2.3 Resultados
Medir los milmetros descendidos de glbulos rojos mediante la columna de
plasma por encima del paquete globular.
0 - 5 mm/hora
Mujeres
0 - 10 mm/hora
SECCIN 8
PERFIL DE HEMOSTASIA
8.1 PRINCIPIOS GENERALES
Cuando se realizan pruebas de hemostasia se debe considerar los cuidados
comunes a toda prueba de laboratorio. Entre estos tenemos:
8.1.1
El material de vidrio debe lavarse tres veces con detergente y luego ser
puesto en mezcla sulfocrmica por lo menos durante seis horas, luego
debe enjuagarse con agua destilada varias veces.
8.1.5 Las pruebas deben realizarse lo antes posible y, si hay demora, las
muestras se podrn en congelacin a 4 C.
8.1.6 Las pruebas se realizan siempre en duplicado y usando controles. Las
muestras controles sern obtenidas usando la misma tcnica empleada para obtener las muestras problema (pool de plasmas) o en forma
comercial.
8.3.2 Disolucin
reactivos
conservacin
de
los
8.4
OBTENCIN
PLASMA
DEL
A una parte de citrato trisdico estril 0,1 mol/L se le aade nueve partes de
sangre (1/10). La puncin debe ser directa en la vena. No debe aspirarse
violentamente para evitar la formacin de espuma y con ello la existencia de un
cierto grado de hemlisis, lo que hara inservible el plasma para la realizacin
de las diferentes pruebas.
Una vez extrada la sangre, se centrifuga durante 15 minutos a 3500 rpm. El
plasma sobrenadante se trasvasa cuidadosamente a otro tubo de hemlisis
y puede conservarse hasta cuatro horas a 4 C antes de su utilizacin.
8.4.1 Tiempo de incubacin
El tiempo de incubacin del plasma con los reactivos correspondientes debe
ser muy exacto y la temperatura siempre a 37 C. Cuando no se empleen
mtodos automatizados, el tiempo se medir mediante un cronmetro, el cual
debe dispararse simultneamente con la adicin del reactivo y pararse en el
instante en que se inicia la coagulacin.
8.4.2 Causas de error
8.4.2.1 En la obtencin del plasma
Conservacin prolongada del plasma antes de realizar la prueba. Ello conduce a un descenso de la actividad de los factores lbiles (V y VIII) y, por tanto, el
plasma debe ser analizado dentro de las dos o cuatro horas de practicada la
extraccin.
Errores de pipeteo.
Limitaciones
Si existe trombocitopenia menor de 50 000/mm3 el tiempo debe ser prolongado.
Debe tenerse cuidado de que el paciente no haya ingerido medicamentos
que interfieran la funcin plaquetaria, como aspirina u otros, hasta 7 a 8
das antes de la prueba.
Interpretacin
El tiempo de sangra por este mtodo es la mejor valoracin de la funcin
plaquetaria. La prolongacin del tiempo en esta prueba se encuentra en
trombocitopenias o las enfermedades de alteracin funcional de las plaquetas,
como son la enfermedad de Von Willebrand, la tromboastenia de Glasmann,
el Sndrome de Bernard-Soulier, la enfermedad de Storage Pool y otras. Mide
in vivo la adhesin, la agregacin y la liberacin plaquetaria como respuesta
del organismo a la lesin vascular.
Al realizar esta prueba, debe tenerse siempre en cuenta que la ingesta previa
de cido acetilsaliclico puede alterar los resultados.
8.5.2 Mtodo de Duke
Con una lanceta se hace una pequea incisin en el lbulo de la oreja. La
sangre fluye por esta incisin y se mide el tiempo que transcurre hasta que se
detiene el sangrado.
Este ensayo se lleva a cabo:
Para diagnosticar ciertos padecimientos hemorrgicos.
Antes de realizar operaciones quirrgicas.
Antes de efectuar una puncin en el hgado o el bazo.
Materiales
Una lanceta estril.
ter.
Filtro de papel (o papel secante).
Si es posible, un cronmetro o, en su lugar, un reloj con segundero.
Fig. 1
Mtodo
5. Cuando las gotas de sangre dejen de fluir, detener el cronmetro (o anote el tiempo transcurrido segn el reloj, o contar el nmero de gotas recogidas en el
papel secante y multiplicarlo por
30 segundos) (Fig. 6).
Resultados
Comunique el tiempo de sangrado redondendolo al medio minuto ms
cercano.
Observaciones
Si el tiempo de sangrado se prolonga examine una extensin de sangre
teida segn el mtodo de Romanowski para observar si las plaquetas
son escasas.
Interpretacin del resultado
El valor de referencia del tiempo de sangra segn este mtodo es de 1 a 4
segundos.
Fig. 1
Mtodo
1. Mediante una jeringa de material
plstico extraiga poco ms de 3 mL
de sangre venosa, puncione la
vena rpidamente, de la manera
adecuada. Cronometrar el tiempo
desde el momento que la sangre
entre a la jeringa (Fig. 2).
Interpretacin
Segn la relacin:
INR
En la que R =
RISI
Tiempo de Quick muestra
Tiempo de Quick testigo
Interpretacin
El tiempo de protrombina es expresado en segundos con el valor del control
(cada cual es la media de pruebas duplicadas). El valor del control (y paciente)
depende de la tromboplastina y de la concentracin del citrato y hematocrito.
Un tiempo de protrombina prolongado indica deficiencia de los factores II, V,
VII o X tambin est prolongado en la hipofibrinogenemia y heparinemia.
El tiempo de protrombina es utilizado como una prueba de despistaje y tambin como control para pacientes anticoagulados con drogas antagonistas de
la vitamina K.
Valores de referencia
12 a 14 segundos.
SECCIN 9
DE
Reticulocitos/L
Observacin
En la actualidad existe la posibilidad de hacer el recuento rutinario de forma
automtica, mediante aparatos especficamente diseados al respecto, bien
a travs de adaptaciones de los clsicos autoanalizadores para hemogramas.
En estos casos se puede conocer, adems, las distintas proporciones de
reticulocitos segn su grado de maduracin, su volumen medio y el ndice de
maduracin.
Valores de referencia
Adultos
0,5 - 1,5%
Al nacer
2,5 - 6,0%
Causas de aumento
El nmero de reticulocitos aumenta en todas las circunstancias en las que
existe un incremento de la eritropoyesis, tales como en la hemlisis, como
respuesta a sangrados o tras el inicio de un tratamiento antianmico que ha
resultado eficaz.
Causas de disminucin
Como la produccin de reticulocitos es necesaria para compensar las prdidas fisiolgicas de glbulos rojos maduros, una disminucin de su nmero
es la expresin de un estado arregenerativo o hiporregenerativo de la serie
roja. Esta circunstancia es tpica de anemias aplsicas, anemias carenciales
y enfermedades inflamatorias y neoplsicas.
9.2 RECUENTO DE
PLAQUETAS Principio
El recuento de plaquetas se realiza directamente en un microscopio de contraste de fases, previa lisis de los hemates, o tambin se puede observar en
un microscopio convencional.
Recuento en cmara
Materiales
Hemocitmetro o cmara de Neubauer.
Solucin de procana (Anexo A).
Pipetas automticas de 100 a 1000 mL y 0 a 100 mL.
Cmara hmeda.
Tubos de plstico de 12 x 75.
Microscopio convencional.
Mtodo
Mezclar bien la muestra de sangre obtenida con EDTA.
Hacer una dilucin de 20 uL de sangre total con 380 uL de solucin de
procana en un tubo de plstico de 12 x 75 (dilucin 1/20).
Dejar en reposo por 15 minutos en una gradilla.
De esta dilucin, llenar en cmara de Neubauer.
Dejar en reposo por 15 minutos en cmara hmeda.
Enfocar con objetivo de 45x y contar las plaquetas en el retculo central de
1 mm2 cuadrado.
Resultados
Se aplica la siguiente formula:
N de plaquetas x mm3
Reemplazando
Valores de referencia
150 000 - 450 000 plaquetas/mm3
Recuento en lmina
Se cuentan 10 campos con objetivo de 100x y se multiplica por 1000 que es la
frmula convencional para recuento de plaquetas.
Valores de referencia
150 000 - 450 000 plaquetas/mm3
Causas de aumento (trombocitosis)
La trombocitosis puede ser secundaria a un estmulo medular inespecfico (posthemorrgica o tras una crisis hemoltica), paraneoplsica o
posquirrgica. Es especialmente importante la que se produce tras la
esplenectoma.
La trombocitopenia esencial aislada es muy rara, pero puede aparecer
asociada a trastornos mieloproliferativos. En estos casos, las plaquetas
pueden ser funcionalmente inoperantes y cursar, paradjicamente, con
hemorragias.
Causas de disminucin (Trombopenia)
Es fundamental descartar que no se haya producido un error de lectura
como consecuencia de una agregacin parcial de las plaquetas en la muestra estudiada. Especialmente llamativos son los casos en los que existe
una agregacin precisamente en presencia de EDTA, que es el
anticoagulante utilizado para mantener incoagulable la muestra de sangre
en la que se ha de realizar la lectura.
Las verdaderas trombopenias pueden obedecer a una causa central (generalmente asociada a leucopenia y anemia), perifrica (inmunolgica,
secuestro, consumo) o mixta (vrica). La prpura trombocitopnica idioptica
es relativamente frecuente.
SECCIN 10
LEUCOGRAMA
Los leucocitos de dividen en:
10.1 GRANULOCITOS
Aquellos que tienen grnulos especficos: neutrfilos, eosinfilos y basfilos.
Los grnulos observados en extendido estn cargados de lisosomas y
enzimas hidrosolubles que son agentes antibacterianos necesarios para la
digestin de partculas fagocitarias. Aqu tenemos:
10.1.1 Neutrfilos
Neutrfilos abastonados (Fig.
1)
Es el granulocito en banda. Mide de 10m a 14m, ncleo condensado que
puede presentar una dos constricciones, pero no tiene puente de cromatina.
El citoplasma presenta grnulos especficos e inespecficos, membrana celular lisa, citoplasma de color ligeramente rosado dependiendo de la coloracin.
Neutrfilos segmentados (Fig.
2)
Mide igualmente de 10m a 14m, ncleo que presenta mayor condensacin
y est formado por varios lbulos (hasta 4) unidos por puentes de cromatina. El
citoplasma est cargado de grnulos.
Alteraciones leucocitarias de los neutrfilos
Granulaciones txicas
Son grnulos basfilos ms oscuros que lo normal y se observan durante
el transcurso de infecciones severas y estadios txicos.
5)
Polisegmentacin (Fig. 7)
Desviacin a la izquierda
Significa el aumento de las formas inmaduras (en banda o cayado, y juveniles) dentro de los neutrfilos. Constituye un importante valor diagnstico
y pronstico. Puede observarse en: infecciones e intoxicaciones.
Desviacin a la derecha
Corresponde a la hipersegmentacin nuclear. La mayora de PMN presentan ms de 5 lobulaciones. Ocurre en:
Anemia perniciosa.
Hipersegmentacin constitucional hereditaria.
Reacciones mieloides de la sepsis.
Afecciones hepticas.
Leucemia mieloide.
En la agona.
Existe disminucin (neutropenia) en:
Aplasia medular
Mieloptisis de la mdula sea
Agentes citotxicos
Granulopoyesis inefectiva (anemias megaloblsticas).
10.1.2 Eosinfilos (Fig.
8)
Son parecidos a los neutrfilos, pero son algo mayores. Generalmente el
ncleo es bilobulado y lo que ms caracteriza a esta clula es la presencia de
grnulos color naranja-marrn vistos claramente, muchas veces estos grnulos hacen que se pierda la membrana celular por el rompimiento de sta, ya
que estas clulas son muy frgiles.
Patologa: Existe aumento en:
Infecciones parasitarias.
Reacciones alrgicas.
Enfermedades cutneas.
Neoplasias.
Linfocitos grandes.
Linfocitos pequeos.
11b)
Tuberculosis.
Endocarditis bacteriana.
10.3.2
10.3.3
No olvidar que el ejercicio produce leucocitosis fisiolgica de consideracin, de all que el recuento debe hacerse en condiciones basales.
10.3.4
Fig. 1.
Fig. 2. Neutrfilos
segmentados
Neutrfilo abastonado y
neutrfilo segmentado
Fig. 7. Polisegmentacin
Fig. 8. Tres
eosinfilos, una clula
basfila y un linfocito
Fig. 9. Monocitos
Fig. 6. Palillo de
SECCIN 11
ALTERACIONES ERITROCITARIAS
Aqu se encuentran incluidas las clulas progenitoras de la serie roja que
normalmente se encuentra en la mdula sea, pero cuando stas pasan a
sangre perifrica antes de su maduracin en normocitos o hemates pueden
indicar alguna patologa como leucemias, anemias u otras alteraciones celulares. Aqu tenemos:
PRONORMOBLASTO
1a)
(Fig.
NORMOBLASTO
1b)
BASFILO
(Fig.
NORMOBLASTO
1d)
ORTOCROMTICO
(Fig.
69
I NSTITUTO N ACIONAL
10/05/2005, 14:12
DE
S ALUD
MANUAL
DE
PROCEDIMIEN T OS
DE
LABORATORIO
EN
TCNICAS B SICAS
DE
H EMATOLOGA
como una bola maciza. Este normoblasto ya no se divide, sino que pierde su
ncleo por un mecanismo de expulsin y se convierten en:
RETICULOCITOS
2)
(Fig.
Estos todava presentan en su citoplasma restos de ARN y protoporfirina resultados de la conversin del normoblasto ortocromtico a reticulocito y solo
se pueden observar con coloraciones especiales. En sangre perifrica se les
puede observar como elementos macrocticos y policromatfilos.
Alteraciones en la forma
Codocitos (Fig. 7): Llamados tambin dianocitos. En la regin central pre- sentan
un rea con mayor contenido hemoglobnico (zona densa). La interfase entre la
membrana celular y el centro es transparente. Se encuentran en
hemoglobinopatas, talacemias, anemia ferropnica y en algunas hepatopatas
crnicas con aumento de colesterol y fosfolpidos.
Drepanocitos (Fig. 8): Son hemates cuya membrana hemtica se altera y se hace
falciforme (forma de hoz o media luna). Su apariencia es propia del estado
homocigoto de la hemoglobina S. Su enfermedad se conoce como drepanocitosis
hereditaria.
Eliptocito (Fig. 9): Los hemates son alargados (ovalocitos). Se encuentran en la
enfermedad llamada ovalocitosis hereditaria. Su presencia se debe a una
alteracin congnita de la membrana del hemate, aunque puede ser adquirida en
caso de una anemia megaloblstica, ferropnica o arregenerativa.
Crenocitos (Fig. 10): Son aquellos que presentan membrana ondulante e irregular.
Se encuentran en algunas anemias hemolticas. Este fenmeno puede ser
inducido in vitro exponiendo los hemates a una solucin hipertnica. Cuando la
caracterstica es muy notable puede emplearse el trmino equinocito.
Equinocitos (Fig. 11): Tambin llamados acantocitos. Las prominencias de la
membrana eritrocitaria son ms aguzadas (alargadas) y distribuidas
irregularmente. Se encuentran en la acantocitosis que se caracteri- zan por la
ausencia de lipoprotenas plasmticas.
Dacriocitos (Fig. 12): Son hemates en forma de lgrima. Se encuentran en la
anemia ferropnica, anemia megaloblstica y talasemia.
Esquistocitos (Fig. 13): Son fragmentos hemticos. Se encuentran en anemias
hemolticas, microangiopatas, quemaduras y con ms eviden- cias en individuos
esplenectomizados.
Estomatocitos (Fig. 14): Son hemates que en lugar de una deplecin central
clara tienen una banda plida central que les da un aspecto de boca. Se hereda
como carcter autosmico dominante. Esta enfermedad es causada por
anormalidad hereditaria de la membrana eritrocitaria.
Selenocitos (Fig. 15): Son eritrocitos alterados que adoptan forma semilunar.
Es un artificio de tcnica que aparece especialmente en frotices sanguneos
de pacientes anmicos.
Excentrocitos: Son hemates con distribucin irregular de la hemoglobina. Su
tamao es inferior al normal y se caracteriza por poseer contornos parcialmente
arrugados, pero adems se observa una distribucin irre- gular de la hemoglobina
que aparece desplegada de la parte interna ha- cia uno de los extremos.
Qnizocito: Son hemates que presentan un estoma o boca en la regin central
completamente coloreada y lo dems incoloro. Morfolgicamente es todo lo
contrario a las caractersticas del estomatocito. Se encuentran en algunas
anemias como las ferropnicas.
Alteraciones de color
Hipercroma (Fig. 17): Son hemates vidos de hemoglobina. Pueden encontrarse en caso de enfermedades como la policitemia vera o la
policitemia fisiolgica y esferocitosis hereditaria.
Policromatofilia (Fig. 18): Presencia de hemates con tonalidad (azul y rojo)
morada. Se le relaciona con inmadurez celular, clulas nucleadas, presencia
de reticulocitos, macrocitos, etc. Esto debido a su elevada cantidad de ARN.
Anisocroma: Diferentes tonalidades de color como hemates
hipocrmicos, hipercrmicos, normocrmicos y policromatfilos. Se encuentran en ciertas anemias refractarias.
Inclusiones anormales
Punteado basfilo (Fig. 19): Son grnulos basfilos presentes en el citoplasma de los hemates. Puede tratarse de un reticulocito por su elevado
contenido de ARN. Se encuentra en una intoxicacin por plomo llamada
saturnismo.
Cuerpos de Heinz (Fig. 20): Son formaciones redondeadas de hasta 3m de
dimetro localizadas habitualmente en la periferia de la clula. Se observan
con colorantes para reticulocitos. Estos cuerpos son abundantes en sujetos
esplenectomizados.
Anillos de Cabot (Fig. 21): Se cree que sean restos de membrana nuclear
eritroblstica o restos despus de una mitosis anormal. Se observan en forma
de anillo u ocho invertido. Pueden ser precipitados de ARN o protena carente
de importancia diagnstica.
Cuerpos de Howel-Jolly (Fig. 22): Son restos de cromatina nuclear, resultados de la prdida del ncleo por parte del normoblasto ortocromtico hasta la
conversin del hemate. Se les considera signos de regeneracin celular. Se
observan en pacientes esplenectomizados.
Siderocitos (Fig. 23): Son hemates con contenido de hierro libre no
hemoglobnico de color verde azulado.
Grnulos de Shuffner: Son grnulos que presentan algunos hemates en
caso de parasitismo por plasmodium vivax.
Grnulos de Maurer: Son grnulos de color violeta oscuro que se encuentran en pacientes con parasitismo por plasmodium falciparum.
Granulacion azurfila: Son pequeas granulaciones eritrocitarias color
violeta prpura y corresponden a restos de normoblastos ortocromticos
producto de la cariorrexis y del paso de un elemento inmaduro a otro
maduro. Se observa tanto en sndromes diseritropoyticos congnitos o
adquiridos.
Fig. 2.
Reticulocitos
Fig. 3.
Hemates normales
Fig. 5. Microcitos
Fig. 7. Dianocitos.
Fig. 8. Drepanocitos.
Fig. 9. Eliptocito.
Alteraciones de color
Fig. 16. Hipocroma
Inclusiones anormales
Fig. 19. Punteado basfilo
BIBLIOGRAFA
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2. Bauer J. Anlisis clnicos. Mtodos clnicos e interpretacin. 1 ed. Barcelona: Editorial Revert S.A., 1986.
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5. Ministerio de Salud del Per - Instituto Nacional de Salud. Manual de
procedimientos de laboratorio para la obtencin y envo de muestras. Lima:
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6. Pagana K, Pagana T. Gua de pruebas diagnsticas y de laboratorio. 2 ed.
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13. Vives J, Aguilar J. Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa. Barcelona: Salvat editores, 1990.
14. Ministerio de Salud del Per - Instituto Nacional de Salud. Manual de
normas de bioseguridad. Lima: MINSA - INS. Serie de Normas Tcnicas N
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15. Balcels A. La clnica y el laboratorio. Interpretacin de anlisis y
pruebas funcionales. 18 ed. Barcelona: Editorial Masson, 2001.
16. Ministerio de Salud del Per - Instituto Nacional de Salud.
Manual de procedimientos para el diagnstico de anemia por
hemoglobinmetro. Lima: MINSA - INS, Serie de Normas Tcnicas N 25,
1997
17. Lovesio C, Miroli A. Hemorragias y trombosis en clnica y ciruga. 2
edi- cin. Argentina. Editorial Librera "El Ateneo", 1990.
ANEXO A
SOLUCIN DE GOWER
A.1.1
Reactivos
A.1.2
Sulfato de sodio
12,5 g
33,3 mL
200 mL
Procedimiento
A.1.2.1 Disolver el sulfato de sodio y el cido actico glacial en el agua destilada. Guardar en lugar fresco.
A.2
SOLUCIN DE HAYEM
A.2.1
Reactivos
A.2.2
Bicloruro de mercurio
0,5 g
Sulfato de sodio
5,0 g
Cloruro de sodio
1,0 g
Agua destilada
200 mL
Procedimiento
A.3
0,9% A.3.1
A.3.2
Reactivos
Cloruro de sodio
0,9 g
100 mL
Procedimiento
Mezclar el cloruro de sodio en el agua destilada. Guardar en
lugar fresco.
A.4
SOLUCIN DE
TURK A.4.1
Reactivos
A.4.2
1,0 mL
100 mL
Procedimiento
Mezclar los reactivos y guardar en frasco mbar en lugar fresco.
A.5
REACTIVO DE DRABKIN
A.5.1
Reactivos
A.5.2
Bicarbonato de sodio
1,0 g
50 mg
200 mg
1000 mL
Procedimiento
Mezclar todo y guardar en frasco oscuro protegido de la luz. Es estable
un mes.
A.6
SOLUCIN AMORTIGUADORA
TAMPONADA A.6.1
Reactivos
2H 0)
3,76 g
2.10 g
1000 cc
Procedimiento
Mezclar todos los reactivos y guardar en frasco de vidrio en lugar fresco.
A.7
COLORANTE DE
GIEMSA A.7.1
A.7.2
Reactivos
1,0
66,0 mL
Glycerol
66,0 mL
Procedimiento
A.8
COLORANTE DE
LEISHMAN A.8.1
Reactivos
Colorante de Leishman
OH)
Metanol (CH3
A.8.2
1,5 g
100 mL.
Procedimiento
A.9
COLORANTE DE
WRIGHT A.9.1
A.9.2
Reactivos
Colorante de Wright
OH)
Metanol (CH3
0,3 g
97,0 mL
Glycerol
3,0 mL
Procedimiento
A.10
COLORANTE DE MAY-
0,3 g
100 mL
A.10.2 Procedimiento
A.10.2.1 Calentar la mezcla a 56C hasta la disolucin completa del colorante.
Dejar enfriar en nevera a 4C durante 24 horas, agitando de vez en
cuando. Filtrar antes de su empleo.
A.11
COLORANTE DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA
A.11.1
Es el resultado de combinar el colorante de Giemsa con la de MayGrunwald y se le conoce con el nombre de tincin panptica. En esta
coloracin resalta especialmente las granulaciones de los neutrfilos,
eosinfilos y basfilos.
A.12
SOLUCIN DE PROCANA
A.12.1 Reactivos
Procana (polvo)
3g
Cloruro de sodio
200 mg
1000 mL
A.12.2 Procedimiento
A.12.2.1 Mezclar los reactivos en agua destilada y completar hasta llegar a un
litro. Guardar en refrigeracin a 4C.
ANEXO B
PREPARACIN DE
ANTICOAGULANTES
B.1
ANTICOAGULANTE DE
WINTROBE B.1.1
Reactivos
H2O)
B.1.2
1,2 g (3 partes)
Oxalato de Potasio (K C O H O)
2 2 4
2
0,8 g (2 partes)
Agua destilada
100 mL
c.s.p.
Procedimiento
B.2
3,8% B.2.1
B.2.2
Reactivos
Citrato de Sodio
3,8 g
100 mL
Procedimiento
B.3
DEXTROSA) B.3.1
Reactivos
8g
22 g
Dextrosa
25 g
1000 mL
Procedimiento
OBSERVACIONES
: