Scribd Logo
Cargar

¡Te damos la bienvenida a Scribd!

  • 82 vistas

    Guia Lab 8 Extraccion y Cuantificacion de Proteinas

    Cargado por

    Gisel Rojas Cordova
    Este documento describe los protocolos para la extracción y cuantificación de proteínas solubles a partir de tejidos. Inicialmente, los tejidos son homogeneizados mecánicamente para romper las membranas celulares y liberar el contenido celular, incluidas las proteínas. Luego, las proteínas son solubilizadas en un buffer y cuantificadas usando el método de Bradford, el cual mide el cambio de color del reactivo de Bradford al unirse a las proteínas. Finalmente, se construye una curva de calibración con alb

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Descargue como DOC, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd

    Guia Lab 8 Extraccion y Cuantificacion de Proteinas

    Cargado por

    Gisel Rojas Cordova
    82 vistas4 páginas
    Este documento describe los protocolos para la extracción y cuantificación de proteínas solubles a partir de tejidos. Inicialmente, los tejidos son homogeneizados mecánicamente para romper las membranas celulares y liberar el contenido celular, incluidas las proteínas. Luego, las proteínas son solubilizadas en un buffer y cuantificadas usando el método de Bradford, el cual mide el cambio de color del reactivo de Bradford al unirse a las proteínas. Finalmente, se construye una curva de calibración con alb

    Descripción original:

    Extracción de frotis

    Derechos de autor

    © © All Rights Reserved

    Formatos disponibles

    DOC, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd

    ¿Le pareció útil este documento?

    ¿Este contenido es inapropiado?

    Este documento describe los protocolos para la extracción y cuantificación de proteínas solubles a partir de tejidos. Inicialmente, los tejidos son homogeneizados mecánicamente para romper las membranas celulares y liberar el contenido celular, incluidas las proteínas. Luego, las proteínas son solubilizadas en un buffer y cuantificadas usando el método de Bradford, el cual mide el cambio de color del reactivo de Bradford al unirse a las proteínas. Finalmente, se construye una curva de calibración con alb

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Descargue como DOC, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd
    Descargar como doc, pdf o txt
    82 vistas4 páginas

    Guia Lab 8 Extraccion y Cuantificacion de Proteinas

    Cargado por

    Gisel Rojas Cordova
    Este documento describe los protocolos para la extracción y cuantificación de proteínas solubles a partir de tejidos. Inicialmente, los tejidos son homogeneizados mecánicamente para romper las membranas celulares y liberar el contenido celular, incluidas las proteínas. Luego, las proteínas son solubilizadas en un buffer y cuantificadas usando el método de Bradford, el cual mide el cambio de color del reactivo de Bradford al unirse a las proteínas. Finalmente, se construye una curva de calibración con alb

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Descargue como DOC, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd
    Descargar como doc, pdf o txt
    de 4

    Pontificia Universidad Catlica de Valparaso

    Facultad de Ciencias
    Instituto de Biologa

    EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS SOLUBLES


    Los tejidos son ricos en protenas que cumplen diferentes funciones y por lo
    tanto, con diferentes caractersticas , y segn stas es posible solubilizarlas, separarlas
    y purificarlas mediante diversos mtodos.
    El primer paso en la extraccin de la mayora de las protenas y estructuras
    subcelulares es la rotura de los tejidos o de las clulas para obtener un lisado celular en
    el que la protena, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en
    condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos
    mecnicos suaves conocidos generalmente como homogenizacin. Estos mtodos
    producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el
    contenido celular, dentro de los que se encuentran: shock osmtico, mortero (friccin) y
    sonicacin.
    Las protenas obtenidas deben ser solubilizadas en buffer para ayudar a
    extraerlas de las clulas y adems mantenerlas para su posterior utilizacin.
    El objetivo de
    este prctico es realizar un protocolo para la homogenizacin
    de tejido y
    obtencin
    de protenas totales, para su posterior cuantificacin y
    caracterizacin
    Objetivos
    Establecer criterios para la elaboracin de un protocolo
    Conocer la funcin de los componentes de los buffer
    Aplicar los conocimientos de los componentes para la elaboracin de los buffer
    Actividades
    Realizacin de un protocolo para la homogenizacin de tejido y solubilizacin de
    protenas
    Preparacin de buffer a utilizar y determinar la funcin de sus componentes
    Homogenizacin de tejido
    Materiales:
    Mortero de porcelana
    Tubos Falcon 15 y 50 ml.
    Tubos eppendorff.
    Esptula.
    Inhibidor de proteasas (PMSF)
    Buffer Lisis (para 20 ml)
    18 ml. de Tris HCl (20 mM)

    Tris
    Triton.
    Vortex
    Centrifuga

    2 ml. de NaCl (1 M)
    10 l Tritn x-100
    Cada un ml. de la preparacin anterior:
    10 l de EDTA (0,5M).
    50 l de PMSF (100 mM)
    Procedimiento:
    1)
    2)
    3)
    4)
    5)
    6)
    7)

    Pese y prepare el buffer de lisis en la cantidad necesaria y molaridad indicada


    Poner su muestra en un mortero y homogenizar
    Mezclar con el buffer en un tubo falcn en una relacin 1:5
    Homogenizar con vortex de forma horizontal
    Centrifugar a 11000 rpm por 30 minutos
    Rescatar sobrenadante.
    Conservar a -20C

    CUANTIFICACIN DE PROTENAS
    MTODO DE BRADFORD
    Se han descrito muchos mtodos diferentes para la determinacin cuantitativa
    de protenas. Estos mtodos difieren entre s en cuanto a su sensibilidad, exactitud,
    precisin, interferentes, estabilidad y sencillez. La seleccin del mtodo a utilizar se
    realiza considerando las caractersticas de las muestras que se desean analizar, las
    cuales pueden ser desde extractos crudos de tejidos animales o vegetales, fluidos
    biolgicos de inters en bioqumica clnica (suero, plasma u orina), muestras obtenidas
    desde la purificacin de protenas, fracciones cromatogrficas hasta muestras de una
    protena pura. En general, los mtodos utilizados para la determinacin cuantitativa de
    protenas consisten en la determinacin absorciomtrica directa o ensayos de tipo
    colorimtrico, turbidimtrico o fluoromtrico
    La mayora de las protenas presentan un mximo de absorbancia a 280 nm
    aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos de triptfano y
    tirosina, y en mucha menor proporcin fenilalanina. Los residuos de histidina, cistena y
    cistina, tambin presentan bandas de absorbancia en el ultravioleta cercano, pero se
    encuentran a menores longitudes de onda y son de menor intensidad.
    Mtodo de Bradford
    Este mtodo utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G-250 de
    unirse a las protenas. El colorante libre presenta un mximo de absorcin a 465 nm
    mientras que cuando est unido a protenas ste se encuentra a 595 nm. El ensayo
    estndar posee una sensibilidad desde 0,1 a 1,4 mg/ml. Esta unin se debe a la
    estabilizacin de la forma aninica del colorante mediante interacciones hidrofbicas e
    inicas, causando un cambio visible de color.
    Interferencias: Detergentes y lcalis reducen el color. Se recomienda medir en
    el tiempo asignado, debido a que el color no es estable en el tiempo, ya que la protena y
    el complejo colorante-protena comienza a precipitar debido al medio cido. Este efecto
    es especialmente significativo a las concentraciones de protenas mayores. Por otra

    parte, el complejo protena colorante tiende a unirse a las cubetas tindolas, por lo cual
    se recomienda un lavado final con etanol.
    Este ensayo requiere adems la realizacin de una curva de calibracin para la
    determinacin de la concentracin de protenas de una muestra, utilizndose
    comnmente BSA como protena patrn.
    OBJETIVOS

    Realizar una curva de calibrado utilizando BSA como protena patrn.


    Calcular la concentracin de protenas de una muestra problema mediante el
    mtodo de Bradford.
    Determinar la concentracin de protena total en una muestra considerando los
    factores de dilucin.

    ACTIVIDAD PRCTICA
    Construccin de la curva de calibrado con BSA
    Se preparan 100 l de cada dilucin de acuerdo a la siguiente tabla.
    El stock de BSA utilizado est a 1 g/l.
    Tub
    o
    6
    5
    4
    3
    2
    1

    BSA
    l
    25
    30
    35
    40
    45
    50

    H2O
    l
    75
    70
    65
    60
    55
    50

    ----

    100

    Concentracin BSA
    g/ l
    0.25
    0.30
    0.35
    0.40
    0.45
    0.50
    0
    (Blanco)

    Se transfieren las soluciones a cubetas espectrofotomtricas.


    Se agregan 1000 l de reactivo de Bradford a cada cubeta.
    Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solucin y se deja reaccionar por 3
    minutos.
    Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm. En un espectofotmetro.
    Se construye una regresin lineal graficando Absorbancia v/s Concentracin de
    BSA.
    Determinacin de la concentracin de protena total en la muestra:
    Se pueden realizar diluciones de la muestra problema (Extracto proteico)
    Tub
    o
    1
    2
    3
    4

    Extracto
    proteico
    100
    75
    50
    25

    H2O
    l
    0
    25
    50
    75

    5
    6

    10
    0

    90
    100

    Se agregan 1000 l de reactivo de Bradford.


    Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solucin y se deja reaccionar por 3
    minutos.
    Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm.
    Se calcula la concentracin total de protena, interpolando la absorbancia de la muestra
    en la curva estndar.
    Donde:

    y= absorbancia
    x= concentracin de protena.

    y = mx + n

    Complete la siguiente tabla:


    Tub
    o

    Muestra
    Problem
    a l

    H2O
    l

    1
    2
    3
    4
    5
    6

    100
    75
    50
    25
    10
    0

    0
    25
    50
    75
    90
    100

    Reactiv
    o de
    Bradfor
    d l
    1000
    1000
    1000
    1000
    1000
    1000

    Absorbanci
    a

    Concentraci
    n

    Factor
    de
    diluci
    n

    Concentraci
    n de
    protenas
    real.

    Preparacin del Reactivo de Bradford


    50 mg de Azul de Comassie G 250 se disuelven en 25 ml de etanol al 95%
    Se agrega 50 ml de cido orto-fosfrico al 85%
    Se lleva la solucin a un matraz de aforo de 500 ml y se afora con agua destilada.
    Se filtra la solucin a travs del papel filtro Whatman N1
    REFERENCIAS
    H. Lodish, A. Berk, L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore , J. Darnerll, 2002.
    Biologa Celular y Molecular. Editorial Mdica Panamericana. Madrid-Espaa.
    B. Albert, D. Bray, J. Lewis, 2000. Biologa Molecular de la Clula. Ediciones Omega
    S.A., Barcelona.
    Farmacologa Molecular: Receptores, transduccin de seales y activacin de
    genes, 2000. Marcelo Kazanietz. Ed. Universidad Nacional de Quilmes Argentina.
    J. Kurjan y B. Taylor, 1993. Signal Transduction. Academic Press Inc. N.Y.
    Abbas Abul K., A. H. Lichtman & Pober J. Inmunologa Celular y Molecular. 4
    Edicin, 2002. Ed. McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, Espaa

    También podría gustarte