Aplicaciones biotecnolgicas del gen afp (Antifungal Protein)

de Aspergillus giganteus para la proteccin de plantas frente

a infeccin por patgenos

Memoria presentada por:

Ana Beatriz Moreno Gonalves
Para optar al grado de doctor en Biotecnologa

Trabajo realizado bajo la direccin de la

Dra. Blanca San Segundo de los Mozos
en el IBMB-CSIC de Barcelona

___________________

__________________

_________________

Dra. Blanca San Segundo

Ana Beatriz Moreno Gonalves

Dra. Montserrat Busquets

Tutora del Dept. de
Bioqumica y Biol. Molecular

Barcelona, 2006

Que el conocimiento y la verdad lleguen a todos

y estn por encima de las creencias difundidas
por intereses polticos y econmicos

Agradecimientos

Sin la ayuda, el apoyo y sobretodo la amistad que recib durante estos aos, habra sido
casi imposible realizar esta tesis. Por eso, quiero agradecer a todos los que hayan
contribuido con su granito de arena, y si me olvido alguien, es que me hago mayor
En primer lugar me gustara agradecer a la Dra. Blanca San Segundo por haberme dado
la oportunidad de pertenecer al laboratorio Rosa, dnde crec mucho estos aos, tanto a
nivel cientfico como personal. Muchas gracias por toda la experiencia transmitida y por
haber estado siempre presente.
Quiero dar las gracias tambin a la Dra. Montserrat Busquets por su tutora en esta tesis.
Gracias a las Dras. Joaquima Messeguer y Gisela Peas por haber producido y cuidado
con tanta dedicacin las plantas de arroz transgnicas en el IRTA de Cabrils. Tambin
quisiera agradecer la colaboracin del Dr. lvaro Martnez del Pozo (Univ. Complutense de
Madrid) con la purificacin de la protena AFP, y de la Dra. Maris Borja (Promiva, Madrid)
con las plantas ornamentales.
Muchsimas gracias a la Dra. Pilar Fontanet y a todo el equipo del invernadero del IBMB
de Barcelona (Alejandro, Eva, Leire, Maika) por haber hecho siempre lo posible y lo
imposible para cuidar las plantas, adems de los buenos momentos compartidos entre
semilla y semilla!
Gracias a Enric Castells por haberme enseado todo lo que s de cmo trabajar con
clulas humanas.
Maite y Luis Que sera del departamento sin vosotros? Muchas gracias por todo! Gracias
tambin a ngel y su constante apoyo informtico, a Mnica de microscopa, a Merc y
Mireia que tantas secuencias de DNA me hicieron y en general a todos los servicios del
Instituto.
A Mina muchas gracias no solo por tu trabajo de hormiguita, casi imperceptible, pero
indispensable, pero tambin por todo el cario, el afecto y los buenos momentos
compartidos.
Al informtico ms eficiente de los ltimos tiempos en el IBMB: Ral Margeli. Gracias por
resolver nuestras averas en tiempo rcord y por dejar los ordenadores perfectos. A parte
de todo eso, y ms importante, gracias por los buenos momentos y por ser tan compaero y
leal.
Gracias a todos los compaeros del arco-iris del Departamento de Gentica Molecular,
siempre dispuestos a ayudar, sin los cuales esta tesis hubiera tardado al menos 10 aos!
All voy: Jaume Martnez, Irma, Jordi Bou, Cline, Salo, Mariana, Marta Boter, Ashraf,
Jumana, Lola, Marga, Carmen Romera, Pau, Marc, Eli, Inma, Blanca, Vctor, Amparo, Hans,
Carles, Matilda, Ana Paula, Alicia, Sami, Cristina, Lorenzo, Eva, Adela, Vicky, Claudia, Dimos,
Cristian, Nuria, Carlos V, Torben, Miriam, Valeria, Silvia, Inma, David, Fatty, Pep, Nstor,
Enric, Cline Loot, Soraya, Cristina, Maida, Juanjo, Paula, Nahuel, Paloma, Sergi y Mariano.
Tambin a los chicos de Torn, a los cucarachos, y a Desi y los fruitis.
Me gustara agradecer de forma especial al lab. Amarillo: a Laura, por todo su apoyo
logstico y amistad, y tambin a Eli, Eva y Maria Jos, por que casi somos dos laboratorios
en uno! Gracias por todo!!!!
Y qu decir del laboratorio Rosa??? Gracias a los que ya no estn, pero no menos
importantes: Laura Vila, por haberme iniciado en el fantstico mundo de Super Magna y
por todos sus sabios consejos, Mar por su increble know how en tcnicas de biologa
molecular y por su compaerismo, Isa que lo sabia todo siempre, Tini por su buen humor
constante (TiniChin nos espera!), Noli por su creatividad, alegra y amistad, y tambin
ngels, Jaume y Cristina C.
A los que estn ahora, casi se puede considerar una familia, y ser imposible olvidar
todo lo que vivimos juntos. Muchas gracias por todos estos aos de altruismo y de ayudas

incondicionales, que me han hecho avanzar como investigadora, y crecer como persona. A
mi Pequea Musiqun, mi media naranja, siempre cmplice en todos los momentos, no hace
falta ni hablar! Muchas gracias por tu amistad y cario! Y nimo que todo va a acabar bien!
Lo mismo le digo a Jordini. Todo llega! A ti gracias por tantos buenos momentos, por tu
amistad y por las clases de cataln! Gracias a Silvia, la despistada por su alegra de vivir y
por estar siempre bien informada de todo. A la dulce Bea, siempre contenta y con sus
saltitos. A Mara gracias por la experiencia y los buenos momentos. Jorge, gracias por tu
felicidad constante, y por tus salidas creativas e inesperadas, capaces de animar a
cualquiera en los peores momentos! A Lidi, gracias por ser tan alegre y divertida, y por
tener el toque de seriedad que creo que hace falta en el lab!! A Eudalilla por ser un
discpulo al mismo tiempo rebelde y obediente! Pero en todo caso eficiente!!! Gracias
tambin por tu cataln! Y a la ltima incorporacin del lab, Emmanuel, te deseo suerte y que
pases tan buenos momentos como yo! Gracias a todos!! (tambin por tanta paciencia en las
comidas!!!)
Quiero agradecer tambin a todos mis amigos que conoc aqu en Barcelona, y tambin a
los que dej en Brasil.
Tambin a mi familia, que me ha apoyado siempre en todos los momentos. A mi madre,
mi padre, mi gori gori, mis hermanos (Laura (y Paulo!), Felipe, Juan, Vctor). Tambin a mis
abuelos, tanto de aqu como mi abuela de Brasil.
Y finalmente, gracias a Patrik, por darme nimo y fuerza cuando ya no saba de dnde
sacarlos, y por estar siempre a mi lado. Gracias por todo!

___

ndice

ndice

Abreviaturas

Resumen general

Introduccin

1- Agricultura: la revolucin verde y la revolucin biotecnolgica

2- El cultivo del arroz

2.1 La piriculariosis

11

3- Plantas ornamentales: el geranio

15

3.1 La podredumbre gris del geranio

16

4- Mecanismos de defensa en plantas

18

4.1 Las protenas PR (Pathogenesis Related Proteins)

22

4.2 Respuestas de defensa sistmicas

30

4.3 Los genes PRms, mpi y ZmPR4 de maz

34

4.4 Otras protenas antimicrobianas de plantas

36

5- Protenas y pptidos con actividad antimicrobiana de origen no vegetal

40

5.1 Protenas antimicrobianas producidas por microorganismos del suelo

45

5.2 La protena AFP (Antifungal Protein) de Aspergillus giganteus

47

6- Plantas transgnicas resistentes a patgenos

49

Objetivos

55

Material y Mtodos

57

I- Material
1- Material Biolgico

57

1.1 Bacterias

57

1.2 Hongos

57

1.3 Plantas

57

1.4 Plsmidos

57

2- Medios de cultivo
2.1 Bacterias

57

2.2 Hongos

58

2.3 Plantas

58

3- Tampones y Soluciones

60

II- Mtodos
1- Relacionados con bacterias y cidos nucleicos
1.1 Preparacin de clulas competentes de Escherichia coli

62

1.2 Transformacin de clulas competentes de E. coli

63

1.3 Extraccin de DNA plasmdico de E. coli a gran escala

63

1.4 Extraccin de DNA plasmdico de E. coli a pequea escala (mini prep)

63

ndice_____________________________________________________________
1.5 Preparacin de clulas competentes de Agrobacterium tumefaciens

64

1.6 Transformacin de clulas competentes de A. tumefaciens

65

1.7 Extraccin de DNA plasmdico de A. tumefaciens a pequea escala

65

1.8 Extraccin de DNA genmico de Oryza sativa y Magnaporthe grisea

65

1.9 Extraccin de RNA total de Oryza sativa

66

1.10 Purificacin de DNA a partir de geles de agarosa

68

1.11 Reacciones de modificacin de DNA: digestin, defosforilacin

y ligacin

68

1.12 Transferencia de DNA (Southern Blot) e hibridacin

con sondas radioactivas

68

1.12.1 Transferencia de DNA a membrana de nylon

68

1.12.2 Marcaje y purificacin de sondas radioactivas

69

1.12.3 Hibridacin

69

1.13 Transferencia de RNA (Nothern Blot) e hibridacin

con sondas radioactivas

70

1.13.1 Electroforesis en gel desnaturalizante de RNA

70

1.13.2 Transferencia de RNA a membrana de nylon

71

1.13.3 Marcaje y purificacin de sondas radioactivas

71

1.13.4 Hibridacin

71

2- Anlisis histoqumico de la actividad -glucuronidasa (gusA)

72

2.1 Protocolo de procesamiento del material vegetal para la deteccin

de la actividad de la -glucuronidasa
3- Obtencin de la protena AFP de Aspergillus giganteus

74
74

4- Estudios con hongos

4.1 Obtencin de esporas de los hongos Magnaporthe grisea
y Botrytis cinerea

74

4.2 Determinacin de la actividad antifngica de la protena AFP in vitro

75

4.3 Tincin con azul de lactofenol

4.3.1 En ensayos in vitro

75

4.3.2 En ensayos in vivo

76

4.4 Determinacin de la actividad antifngica de la protena AFP frente

a Botrytis cinerea in vivo

76

4.5 Ensayo de inhibicin de la germinacin de esporas

76

4.6 Ensayo de determinacin de actividad fungisttica o fungicida de

AFP

77

4.7 Ensayo con los colorantes sytox green y congo red en cultivos de
Hongos

77

iv

___

ndice
4.8 Obtencin de elicitores de hongos

77

4.9 Marcaje de AFP con el fluorocromo Alexa 568

78

4.10 Ensayos de unin de la protena AFP a cidos nucleicos

78

4.11 Actividad ribonuclesica de la protena -sarcina frente a

reticulocitos de conejo

78

4.12 Microscopa electrnica de transmisin

80

5- Estudios con clulas humanas

5.1 Tratamiento de clulas humanas (HeLa) con AFP

81

5.1.1 Conservacin del stock de clulas

81

5.1.2 Mantenimiento de las clulas

82

5.1.3 Tratamiento de clulas HeLa con AFP y tincin con el

colorante sytox green

83

6- Estudios con plantas

6.1 Tratamiento de protoplastos de arroz con AFP

84

6.1.1 Obtencin de protoplastos de arroz

6.1.1.1. Esterilizacin de semillas de arroz

84

6.1.1.2 Obtencin de protoplastos de arroz

84

6.1.2 Tratamiento de protoplastos de arroz con AFP y tincin con el

colorante sytox green

85

6.2 Transformacin de plantas de arroz

6.2.1 Obtencin de callos embriognicos a partir del escutelo del embrin
zigtico maduro

85

6.2.2 Transformacin por Agrobacterium tumefaciens

86

6.2.3 Transformacin por biolstica

88

6.2.4 Medios de cultivo

89

7- Ensayos de resistencia de plantas de arroz transgnicas expresando el

gen afp frente a la infeccin por Magnaporthe grisea

90

7.1 Ensayo en hoja cortada

90

7.2 Ensayo en planta entera

91

Resultados
Captulo I: Activity of the antifungal protein from Aspergillus giganteus
against Botrytis cinerea

93

Captulo II: Pathogen-induced production of the antifungal AFP protein

from Aspergillus giganteus confers resistance to the blast
fungus Magnaporthe grisea

105

Captulo III: Antifungal mechanism of the Aspergillus giganteus AFP

protein against the rice blast fungus Magnaporthe grisea

iii

121

ndice_____________________________________________________________
Discusin

151

Conclusiones

165

Referencias Bibliogrficas

167

iv

Abreviaturas
2-4D

cido diclorofenoxiactico

aa

aminocido

ABA

cido abscsico

AIA

cido indolactico

Amp

ampicilina

BA

benzil-amino-purina

BSA

albmina srica bovina

cv.

cultivar

dCTP

desoxicitosina trifosfato

DNA

cido desoxirribonucleico

D.O.

densidad ptica

EDTA

cido etilendiaminotetractico

Kan.

Kanamicina

kDa

kilodalton

KeV

kilo-electrn-voltio

LB

Luria Bertani

molaridad

Mb

megabases

mM

milimolar

mg

miligramo

mRNA

cido ribonucleico mensajero

normalidad

nt

nucletidos

PCR

reaccin en cadena de la polimerasa

PEG

polietilenglicol

pI

punto isoelctrico

pv.

patovar

RNA

cido ribonucleico

rRNA

cido ribonucleico ribosomal

rpm

revoluciones por minuto

SDS

dodecil sulfato sdico

TMV

virus del mosaico del tabaco

tRNA

cido ribonucleico de transferencia

var.

variedad

Abreviaturas____________________________________________________ ___

vi

__

Resumen general

Las plantas estn constantemente sometidas a diferentes estreses ambientales, ya

sean de tipo abitico, como alteraciones de temperatura o disponibilidad de agua, o de tipo
bitico, como son las agresiones por microorganismos del entorno. Los hongos causan un
gran nmero de enfermedades en las plantas, siendo responsables de grandes prdidas
econmicas en las plantas cultivadas en campo o en invernadero. Actualmente, el control de
las enfermedades causadas por hongos se realiza mediante la utilizacin masiva de
compuestos qumicos, con el impacto negativo que su uso tiene en el medio ambiente, y en
la salud humana y animal.
Una alternativa al control qumico de las enfermedades en plantas es la obtencin de
plantas transgnicas resistentes a hongos fitopatgenos. El rpido desarrollo que se ha
observado en los campos de la biologa y gentica molecular, as como en el cultivo in vitro y
transformacin de especies vegetales, ha permitido generar plantas transgnicas para
diferentes especies de inters agronmico que presentan resistencia frente a hongos. En un
principio, la mayora de los transgenes utilizados para este fin provenan de las propias
plantas, genes que codifican protenas o pptidos antifngicos que participan en sus
respuestas de defensa. Actualmente, y dada la reducida efectividad de esta estrategia, se
est trabajando en la identificacin de genes de defensa de otros organismos, como son
bacterias, insectos, animales e incluso otros hongos, para ser utilizados en la transformacin
de plantas. La utilizacin de un gen de origen bacteriano, el gen Bt de la bacteria del suelo
Bacillus thuringiensis, es uno de los que mejor ilustra la utilidad de este tipo de genes para
la obtencin de resistencia en plantas transgnicas, en este caso de resistencia frente al
ataque por insectos plaga.
En este trabajo se ha evaluado la utilidad de la protena AFP (antifungal protein),
producida por el hongo del suelo Aspergillus giganteus, para actuar como agente antifngico
frente a fitopatgenos de plantas, ms concretamente geranio y arroz. La protena AFP es
una protena pequea con una estructura compacta y muy bsica, que se secreta al espacio
extracelular. Estudios anteriores haban demostrado su actividad antifngica frente a
diversos fitopatgenos (Lacadena et al, 1995; Vila et al, 2001). As, el primer objetivo de
esta tesis fue estudiar si esta protena presentaba actividad antifngica frente al hongo
Botrytis cinerea. Este hongo es el responsable de la enfermedad conocida como
podredumbre gris en muchas plantas, y entre ellas las plantas ornamentales. Los resultados
aqu obtenidos revelan que la protena AFP presenta una fuerte actividad antifngica frente a
cepas de Botrytis cinerea aisladas a partir de plantas de geranio, inhibiendo tanto el
desarrollo de las hifas como la germinacin de las esporas. Cuando se utiliza en combinacin
con la protena cecropina A de lepidptero, se observa un efecto antifngico aditivo entre

Resumen general____________________________________________________
ambas protenas, lo que puede ser de utilidad para el desarrollo de una estrategia de
expresin simultnea de ambos genes, gen afp y gen cecropina A, en plantas transgnicas.
Adems, la AFP inhibe el crecimiento de B. cinerea tanto in vitro como in vivo, en plantas de
geranio.
Por otra parte, el hongo Magnaporthe grisea es el responsable de la enfermedad
conocida como piriculariosis en plantas de arroz. La actividad antifngica de la protena AFP
frente a este fitopatgeno ya se haba descrito anteriormente tanto in vitro como in vivo
(Vila et al, 2001). Se saba tambin que la expresin constitutiva del gen afp en plantas
transgnicas de arroz era capaz de conferir resistencia frente a este patgeno (Coca et al,
2004). En este trabajo se ha desarrollado una estrategia para expresar el gen afp de manera
controlada e inducible, evitando as los posibles efectos negativos de una expresin
constitutiva, tanto a nivel de gasto metablico por parte de la planta, como de su aceptacin
por el consumidor final. Los estudios realizados indicaron que el promotor de un gen de maz
que codifica una protena PR (pathogenesis related), el gen ZmPR4, es funcional e inducible
por el hongo M. grisea en plantas de arroz. Este promotor es capaz de controlar la expresin
del gen afp en niveles suficientemente elevados para conferir resistencia a la infeccin por el
hongo Magnaporthe grisea en plantas transgnicas. Su utilizacin tiene una ventaja
adicional ya que este promotor no es activo en el endospermo de la semilla del arroz
(rgano destinado al consumo), con lo que se evita que el producto del transgn se acumule
en este tejido.
Finalmente, dado el gran potencial del gen afp para aplicacin biotecnolgica, se
haca necesario determinar su mecanismo de accin frente a hongos, as como sus posibles
efectos sobre clulas animales o vegetales. En este sentido, en la ltima parte de esta tesis,
se han realizado diferentes estudios empleando como modelo el hongo M. grisea. Mediante
microscopa confocal utilizando diferentes sistemas de marcaje fluorescente, y microscopa
electrnica de transmisin, se ha podido observar que la protena AFP es capaz de formar
poros en la membrana del hongo. La protena AFP penetra en la clula del hongo y se
acumula en el ncleo. Adems, tiene la propiedad de interaccionar con cidos nucleicos, ya
sea DNA o RNA. Estos resultados llevan a pensar que el mecanismo de accin de esta
protena se basa en una combinacin de actividades, primero por la formacin de poros en la
membrana permitiendo su entrada, seguida de la interaccin con cidos nucleicos, llevando
a la muerte celular. Se realizaron tambin ensayos con clulas vegetales (protoplastos de
arroz) y humanas (clulas HeLa), que han permitido determinar que la protena AFP no
ejerce ningn efecto nocivo significativo en estas clulas.

__

Resumen general

En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo permiten concluir que el gen
afp es un buen candidato para ser utilizado como transgn para la proteccin de plantas de
geranio y de arroz frente a enfermedades producidas por los hongos Botrytis cinerea y
Magnaporthe grisea, respectivamente. El promotor del gen ZmPR4 representa asimismo una
buena opcin para dirigir la expresin de genes antifngicos en plantas transgnicas de
arroz.

Resumen general____________________________________________________

____

Introduccin

1- Agricultura: la revolucin verde y la revolucin biotecnolgica

La utilizacin de las plantas de manera sistemtica y controlada con la finalidad de
obtener alimentos tanto para consumo humano como animal, tuvo su inicio hace unos
10.000 aos. A escala mundial, el 88% de las caloras y el 90% de las protenas de la
alimentacin humana proceden directamente de los vegetales. De stos, los cereales son,
sin duda, el grupo de plantas de mayor importancia (www.jardibotanic.org/utiles).
En los aos 50, surgi en Mjico un movimiento impulsado por el profesor Norman
Borlaug (premio Nbel de la paz en 1970) que ms tarde se propag por todo el mundo.
Este movimiento se denomin Revolucin Verde, y tuvo como principal objetivo aumentar la
produccin agrcola con la finalidad de disminuir el hambre en el mundo. Si a principios de la
dcada de 50 el mundo produca cerca de 14 millones de toneladas de comida, se pas a
144 millones de toneladas en 1990. El gran impulso que tuvo la agricultura durante la
revolucin verde se basaba en cuatro pilares fundamentales: a) la utilizacin de variedades
mejoradas genticamente mediante entrecruzamiento; b) la utilizacin de fertilizantes y
pesticidas; c) la irrigacin; d) el empleo de maquinaria agrcola y no de fuerza humana o
animal (Parks, W. 1998). Como consecuencia de la implantacin de estas tcnicas, la
produccin de alimentos aument de manera muy importante en 30 aos, aunque el hambre
solo logr bajar un 20%. Esto se debi en gran parte a los problemas de distribucin y
almacenamiento de la comida, y a la inaccesibilidad de los pequeos agricultores a las
nuevas tcnicas de cultivo y a los productos qumicos que les permitiran aumentar su
produccin. Aunque la revolucin verde tuvo un impacto importante en la agricultura y en la
produccin de alimentos, tambin vino a generar nuevos problemas, tales como el uso
extensivo de monocultivos, el aumento en los costes de produccin, sin olvidar los efectos
negativos que estas prcticas provocaban en el medio ambiente. Por ejemplo, se produjo
una importante salinizacin de la tierra, erosin del suelo, agotamiento de las fuentes de
agua y de los nutrientes del suelo, y la aparicin de especies resistentes a los pesticidas.
Adems, en la actualidad se observa que mientras la poblacin mundial sigue creciendo, las
tasas de produccin agrcola empiezan a bajar. Se pierden cada vez ms zonas cultivables a
causa de la expansin de las ciudades (Parks, W. 1998).
Al inicio del proceso de domesticacin de las plantas se aplicaban tcnicas de
gentica clsica para la obtencin de nuevas variedades mejoradas genticamente. Hay que
decir que el entrecruzamiento de especies vegetales ha resultado de gran utilidad para la
obtencin de nuevas variedades. De hecho, la mayora de las plantas cultivadas actualmente
son el resultado de varios procesos de entrecruzamiento y seleccin de caractersticas
agronmicas de inters. En este proceso se produce un intercambio de material gentico al
azar entre ambas variedades, lo que permite la obtencin de variedades genticamente

Introduccin _______________________________________________________
nuevas. Sin embargo, ste es un proceso lento y restringido a especies sexualmente
compatibles, y que adems es poco especfico ya que el entrecruzamiento conlleva un
intercambio masivo e incontrolado de material gentico. El desarrollo de tcnicas de cultivo
in vitro para diferentes especies de plantas ha permitido asimismo grandes avances en el
campo de la gentica vegetal (Dale, 1999).
Con la aparicin de la teora de la evolucin de Charles Darwin en 1859 y los estudios
de Gregor Mendel en 1869 sobre la transmisin de caracteres de padres a hijos, el DNA
empez a ganar un papel importante en el mbito de la gentica. La tabla 1 presenta
algunos de los hitos cientficos ms relevantes en esta rea.
Tabla 1: Algunos de los eventos en el campo de la gentica y de la biologa molecular con
mayor impacto en la biotecnologa vegetal. Adaptado de Moore, 2003.
1910

Thomas H. Morgan demuestra que los genes estn en los cromosomas. Aparece el
trmino "Biotecnologa"

1921

M. Molliard cultiva embriones de plantas in vitro

1938

Estudios sobre protenas y DNA por cristalografa de rayos X. Aparece el trmino

"Biologa Molecular"

1946

E. Ball produce la primera planta entera a partir de cultivos de meristemos apicales

1950

Morel obtiene los primeros cultivos in vitro de una monocotilednea utilizando leche de
coco; Edwin Chargaff determina que siempre existe una relacin de 1:1 de adenina y de
timina en el DNA de los diferentes organismos

1953

James Watson y Francis Crick identifican la estructura en doble hlice del DNA

1958

Maheshwari y Rangaswamy regeneran embriones somticos in vitro a partir de ncleos de

vulos de Citrus; Coenberg descubre la DNA polimerasa

1962

Murashige y Skoog desarrollan un medio para el cultivo in vitro de plantas

1965

Vasil y Hidebrant regeneran plantas de tabaco a partir de clulas individuales

1970

Smith descubre la primera endonucleasa de restriccin de Haemophillus influenzae (HindI)

1973

Herbert Boyer y Stanley Cohen insertan un gen de un sapo africano en el DNA plasmdico
de una bacteria: primer organismo recombinante. Empieza la ingeniera gentica

1977

Maxam y Gilbert desarrollan un mtodo para secuenciar el DNA

1979

Marton y colaboradores desarrollan un proceso de cocultivo para transformacin de

protoplastos con Agrobacterium

1983

Kary Mullis desarrolla la idea de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, de

polymerase chain reaction), un proceso de amplificacin qumica de DNA. Marc Van
Montagu y Jeff Shell producen las primeras plantas transgnicas: tabaco resistente a
kanamicina y a methotrexate (una droga usada en el tratamiento del cncer y de la

____

Introduccin

artritis). Transformacin mediante Agrobacterium tumefaciens. En el mismo ao se

producen

tambin

plantas

de

Nicotiana

plumbaginifolia

resistentes

kanamicina

(Framond, A J. y colaboradores); petunia resistente a kanamicina (Fraley, R. T. y

colaboradores); y girasol expresando el gen faseolina de juda (Murai, N. y colaboradores)
1987

Sanford, J. C. y Klein T. M. desarrollan un mtodo transferencia de DNA para

transformacin de plantas basado en el bombardeo de las clulas con partculas de oro o
tungsteno recubiertas de DNA. Barton y colaboradores aslan el gen Bt de Bacillus
thuringiensis. Bytebier y colaboradores transforman por primera vez una monocotilednea
(esprrago) con Agrobacterium tumefaciens.

2000

Se completa la secuenciacin del genoma de Arabidopsis thaliana

2002

Se completa la secuenciacin del genoma del arroz

2003

El 64% de la soja y el 34% del maz que se producen en los EUA son transgnicos

Desde 1983, cuando se obtuvieron por primera vez plantas transgnicas, la ingeniera
gentica vegetal ha progresado continuamente en la lnea de la obtencin de plantas
mejoradas en diversos aspectos. As, se han obtenido logros importantes en la resistencia a
enfermedades y plagas; modificaciones en la maduracin de frutos; modificaciones en el
contenido de grasa, almidn y protena; tolerancia a herbicidas; resistencia a estreses
ambientales (temperatura, sequa y salinidad); alteraciones en el tamao y tiempo de
floracin; aumento en la produccin de vitaminas y minerales; eliminacin de productos
alergnicos, y produccin de frmacos (Grover y Gowthaman, 2003; Rommens et al, 2004;
Dixon, 2005; Ma et al, 2005).
Debido a su enorme potencial, la biotecnologa vegetal ha venido a representar una
segunda revolucin en la agricultura y en la manera de producir alimentos. Entre 1996 y
2004, el rea destinada al cultivo de plantas transgnicas aument de 1,7 a 81 millones de
hectreas (fig.1).

Introduccin _______________________________________________________

Figura 1: rea global de cultivo de plantas transgnicas de 1996 hasta 2004. Tomado de
James, 2004.
Cada vez son ms los pases que cultivan plantas modificadas genticamente.
Adems de los pases industrializados, los pases en vas de desarrollo tambin empiezan a
mostrar un aumento en el cultivo de plantas transgnicas. En la figura 2 se ilustran los 17
pases que actualmente cultivan plantas transgnicas. Se indican tambin los pases donde
estos cultivos han sobrepasado ya las 50.000 hectreas de rea cultivada (en 2003 eran 10
pases, 14 en 2004).

Figura 2: Pases productores de cultivos transgnicos. Tomado de James, 2004

____

Introduccin

La mejora de plantas a travs de biotecnologa presenta una serie de ventajas

fundamentales sobre la mejora gentica clsica: permite introducir un nico gen de funcin
conocida en el genoma de la planta; permite introducir en una planta un gen de cualquier
origen, no necesariamente de una planta de una especie relacionada; requiere mucho
menos tiempo hasta la obtencin de la planta con las caractersticas deseadas.
La utilizacin de cultivos transgnicos presenta mejoras sustanciales en la produccin
y un menor impacto en el medio ambiente. A ello hay que aadir una reduccin de costes de
produccin al prescindir de tratamientos fitosanitarios. Los cuatro cultivos transgnicos de
mayor importancia a nivel mundial son la soja, el maz, el algodn y la canola, en este
orden. Adems de estos cultivos, hay otras plantas modificadas genticamente, como colza,
tabaco, remolacha, achicoria, patata, papaya, tomate, calabaza y arroz, entre otros. La
tolerancia a herbicidas y la resistencia a insectos son las dos principales caractersticas
introducidas.
2- El cultivo del arroz
El arroz es una de las especies cultivadas ms antiguas de la tierra. Tuvo su origen
hace unos 40 millones de aos en Asia, en la regin situada entre el norte de India y el sur
de China (CIRAD, 2002). As como el maz, el trigo y el sorgo, el arroz es una
monocotilednea de la familia de las gramneas capaz de adaptarse a diferentes condiciones
ambientales. Su temperatura ideal de crecimiento es de 30C, estando la mayor parte de los
cultivos en zonas tropicales. As, el cultivo del arroz se distribuye por una amplia franja de
climas, entre los 35 de latitud sur y los 50 de latitud norte (Webster y Gunnell, 1992), y
se cultiva fundamentalmente en tres ecosistemas: irrigacin (55% de la superficie total);
secano, que depende de las lluvias (37-39% de la superficie total); y aguas profundas,
siendo cultivado en lagos y ros (6-8% de la superficie total) (Ortells, 2003). Pertenece al
gnero Oryza y se cultivan dos de las 20 especies conocidas: O. glaberrima y O. sativa
(Webster y Gunnell, 1992). La primera, O. glaberrima, es originaria del delta del ro Nger
en frica, y tiene su cultivo restringido a esa rea debido a su menor productividad. Su
domesticacin por el hombre se remonta a casi 4000 aos. La segunda especie, O. sativa,
es la ms ampliamente cultivada en el mundo. Tiene un genoma diploide 2n=24 y es una
planta anual, aunque en zonas tropicales donde las condiciones climticas son favorables
crece como perenne (Webster y Gunnell, 1992). O. sativa tuvo su origen en Asia, al pie del
Himalaya, y se cree que su domesticacin se realiz hace 9000 aos (CIRAD, 2002).
Morfolgicamente, la especie O. sativa se clasifica en tres subespecies: ndica, japnica y
javnica (Cheng et al, 2003; Ortells, 2003). La subespecie ndica es propia de zonas
tropicales y subtropicales; la subespecie japnica se cultiva en zonas templadas, mientras

Introduccin _______________________________________________________
que la javnica se cultiva en la isla de Java. Esta ltima tambin se denomina japnica
tropical ya que se demostr que pertenecen al mismo grupo varietal (Oka, 1958). En Europa
las variedades ms cultivadas son Senia (Espaa y Grecia), Ariete (Italia y Francia), St.
Andrea, Selenio y Vialone (Italia) que pertenecen a la subespecie japnica. Los 5 pases
productores de arroz ms importantes de Europa son: Italia (contribuye con un 50% del
total), Espaa (con un 25%), Francia, Portugal y Grecia.
El arroz es el tercer cereal ms producido en el mundo despus del maz y del trigo, y
el segundo, despus del trigo, usado en la alimentacin. Representa el 15% de la superficie
cultivada del planeta y ms del 90% de la produccin est en Asia (fig. 3).

Figura 3: Produccin mundial de arroz (valores en toneladas/ao) Tomado de Moneo, 2003.

El consumo medio de arroz es de 65 Kg por persona al ao (CIRAD, 2002). En Asia,
el consumo es superior a los 80 Kg, en regiones subtropicales (frica y Amrica Latina) es
de entre 30 y 60 Kg, y en pases industrializados (Europa y EUA) es de menos de 10 Kg
(Ortells, 2003). El arroz aporta cerca de la mitad de las caloras ingeridas por ms de 3000
millones de personas en Asia, donde representa un 60-70% del total de comida ingerida.
Tomando la totalidad de los pases en desarrollo, el arroz representa un 27% de la energa y
un 20% de las protenas ingeridas (datos de la FAO, 2005). Como cultivo agrcola produce
ms caloras por hectrea que el trigo (Webster y Gunnell, 1992; CIRAD, 2002). Segn el
IRRI (International Rice Research Institute), la produccin mundial de arroz pas de
215.655.000 toneladas en 1961 a 608.000.000 toneladas en 2004, y se estima que en 2012
llegue a 672.000.000 toneladas. Sin embargo, ese aumento en la produccin no se ve
reflejado en un aumento de la superficie cultivada, la cual se mantiene en aproximadamente
152 millones de hectreas, debido en gran parte a la dificultad para aumentar las superficies
irrigables y a la limitacin de las reas destinadas a la agricultura por el crecimiento de las
zonas urbanizadas. Para alcanzar una mayor produccin de arroz, se hace necesario
introducir avances tecnolgicos que permitan producir ms en el mismo espacio disponible.
Durante la Revolucin Verde, se produjo un aumento anual de la produccin de un
2,5% como consecuencia de los cambios y mejoras introducidos en la agricultura en ese

10

____

Introduccin

periodo. Sin embargo, se observa que la produccin desciende progresivamente (cerca de

1,1% anual). Empieza a faltar agua y las tierras cultivables as como la mano de obra son
cada da ms escasas. Por otra parte, las tcnicas de intensificacin de la produccin
arrocera han provocado serios daos al medio ambiente y a los recursos ambientales
relacionados, como consecuencia del uso masivo de herbicidas, abonos inorgnicos y
pesticidas

qumicos.

Ello

ha

sido

la

causa

fundamental

del

aumento

de

la

salinidad/alcalinidad de los suelos, llevando en ltima instancia a producir daos en los

ecosistemas. Todo ello hace necesario el desarrollo de mtodos de cultivo alternativos que
permitan mejorar la productividad y la calidad del arroz. La utilizacin de variedades
genticamente modificadas permite avanzar en esta direccin, por ejemplo, mediante la
obtencin y la utilizacin de variedades resistentes a patgenos y plagas, o de variedades
con mejores propiedades nutricionales (Brookes y Barfoot, 2003).
El arroz, adems de un cultivo de inters agronmico, es considerado actualmente
como la planta modelo para estudios en monocotiledneas, gracias a su reducido genoma
(430Mb) y la disponibilidad de eficientes protocolos de transformacin. Despus de
Arabidopsis, el arroz ha sido la segunda especie vegetal en tener su genoma secuenciado
(Goff et al, 2002; Yu et al, 2002). Adems se han observado grandes similitudes entre el
genoma de arroz y el genoma de otros cereales, como son el trigo, el maz o el sorgo
(colinearidad en las estructuras de sus genomas) (Goff, 1999). Segn el "International
Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications" (UK), para el ao 2012, se habrn
introducido en los cultivos asiticos variedades de arroz resistentes a herbicidas, a infeccin
por hongos y bacterias, a virus, a insectos; ms tolerantes a estreses abiticos como sequa
y salinidad; ms productivas por alteraciones en los niveles y calidad de carbohidratos o por
el mejor desarrollo de la espiga; y con mejor calidad nutricional, como produccin de
vitamina A, hierro, y protenas (Brookes y Barfoot, 2003).
Actualmente, las enfermedades causadas por plagas y patgenos son una de las
causas ms importantes de prdidas en las cosechas de arroz en el mundo, siendo los
hongos los responsables del 20-40% (www.apsnet.org/Education/feature/FoodSecurity).
Esto significa que se pierden anualmente cerca de 40 millones de toneladas.
2.1-La piriculariosis
La piriculariosis, es la enfermedad causada por el hongo Magnaporthe grisea
(Herbert) Barr (estado telomorfo), o Pyricularia grisea (Cooke) Sacc (estado anamorfo). Se
clasifica dentro de la divisin Eumycota, hongos que producen micelio, subdivisin
Deuteromycotina, orden Hyphales, clase Hyphomycetes, gnero Pyricularia (Ou, 1985;
Agrios, 1988).

11

Introduccin _______________________________________________________
El hongo Magnaporthe grisea es el responsable de las mayores prdidas en el cultivo
de arroz a nivel mundial, estando presente en 85 pases. Se estima que cada ao este
patgeno causa prdidas en la productividad de arroz del orden del 11% al 30%,
destruyendo una superficie de este cultivo suficiente para alimentar cerca de 60 millones de
personas (datos de la Nacional Science Foundation; y del Internacional Rice Blast Genome
Consortium, www.riceblast.org). La enfermedad causada por M. grisea se describi por
primera vez en el ao de 1637 en China, con el nombre de enfermedad de la fiebre del
arroz, y actualmente se conoce como piriculariosis (o rice blast).
El desarrollo de esta enfermedad se ve favorecido por las condiciones de humedad
elevada con poco o ningn viento y con temperaturas promedio de 17-23C (noche), y de
25-30C (da). Estas caractersticas se cumplen en la mayor parte de las regiones
productoras de arroz, de ah su amplia distribucin y gran efecto destructivo. Adems, la
utilizacin masiva de fertilizantes en los cultivos intensivos aumenta la cantidad de nitrato
en la tierra, favoreciendo la capacidad infectiva del hongo (Agrios, 1988). M. grisea infecta
las partes areas de la planta, principalmente las hojas, pero se ha visto que tambin tiene
capacidad de infectar races (Dufresne y Osborn, 2001; Sesma y Osborn, 2004). Los
sntomas de la infeccin se caracterizan por lesiones en las hojas que empiezan por
pequeos puntos marrones, evolucionando a manchas de forma elptica o de diamante de
hasta 2 cm de largo y 0,5 cm de ancho, con el centro gris y las extremidades rojoamarillentas o marrones. Sin embargo, el tamao y forma de las lesiones depende de
factores ambientales, as como de la edad de la planta y su grado de susceptibilidad a la
raza del patgeno (RiceBlastDB, 2001) (fig. 4).

Figura 4: Sntomas de infeccin por Magnaporthe grisea en hojas de arroz.

Las esporas (o conidios) de M. grisea se producen en los conidioforos y se dispersan
por el aire o en pequeas gotas de agua provenientes de plantas infectadas. Los conidios

12

____

Introduccin

son piriformes y biseptados, y contienen 3 clulas, una de las cuales presenta un pequeo
apndice, el punto de unin al conidioforo (Howard y Valent, 1996) (fig. 5).

a)

b)

Figura 5: a) Conidios de M. grisea. b) Hifas de M. grisea crecidas en medio lquido.

Barras = 5 m.
Los conidios germinan en condiciones de alta humedad relativa (ms del 90%). El
crecimiento del tubo germinativo a partir de una de las clulas de las extremidades es muy
rpido (Bouret y Howard, 1990). Al tocar la superficie de la hoja de arroz, este tubo
germinativo desarrolla en su zona apical una estructura muy rica en melanina, el apresorio
(Howard y Valent, 1996; Urban et al, 1999). Esta estructura se encuentra en un amplio
rango de especies de hongos, y tambin en Oomicetos, lo que sugiere que la diferenciacin
del apresorio es una adaptacin generalizada entre microorganismos que infectan las plantas
a travs de la penetracin de su pared celular (Xu et al, 1998). La presin que ejerce el
apresorio gracias a la formacin del gancho de penetracin permite atravesar la cutcula de
la planta hasta llegar a las clulas de la epidermis. Una vez dentro de la clula vegetal, este
gancho aumenta de dimetro para formar una hifa primaria, que en seguida se diferencia en
una hifa secundaria ramificada que contina con la proliferacin del micelio por todo el tejido
de la hoja (Heath et al, 1992; Clergeot et al, 2001). Un esquema del ciclo de vida de M.
grisea se puede ver en la figura 6. El patgeno puede llegar a representar un 10% de la
biomasa total de una hoja infectada despus de 3 das (Talbot et al, 1993, 2003). ste es el
tiempo necesrio para que se empiecen a observar las primeras lesiones en la hoja, y
tambin cuando se produce la esporulacin y la formacin de nuevos conidios en la
superficie del tejido infectado. Los conidios se liberan generalmente por la noche y son
dispersados principalmente por el aire infectando as otras partes de la misma planta o
plantas vecinas (RiceBlastDB, 2001).

13

Introduccin _______________________________________________________

Fijacin del
conidio
Esporulacin

Germinacin

Formacin del
apresorio

Crecimiento

Penetracin

Figura 6: Esquema del ciclo de vida de M. grisea. (Adaptado de Dean et al, 2005; y
www.usask.ca/biology/kaminskyj/342/lecture/B342_L15.PPT)
El control de la piriculariosis depende de la aplicacin de fungicidas, en su mayora
txico y caros (probenazole, tricyclazole, pyroquilon y phthalide). La piriculariosis representa
actualmente el mayor mercado mundial de fungicidas.
Por su enorme importancia econmica, la interaccin arroz-M. grisea representa un
sistema modelo en el estudio de las interacciones planta-patgeno, y los mecanismos de
infeccin por este hongo han sido ampliamente estudiados. Recientemente se ha descrito la
protena responsable del inicio del proceso de penetracin del hongo en la hoja, etapa
determinante en el establecimiento de la infeccin. Se trata de una quinasa MAP (Mitogen
Activated-protein), esencial para la formacin del apresorio (Zhao et al, 2005). stas y otras
informaciones sern muy tiles para el desarrollo de estrategias para la obtencin de plantas
resistentes. Se ha obtenido ya la secuencia completa del genoma de M. grisea, con ms de
11.000 genes, culminando los esfuerzos de diversos investigadores de todo el mundo (Dean
et al, 2005). La combinacin de la informacin gentica disponible de este patgeno con la
del ya publicado genoma del arroz (Goff et al, 2002; Yu et al, 2002) permitir el estudio de
esta interaccin planta-patgeno a nivel molecular, ayudando a elucidar los mecanismos de
infeccin del patgeno as como tambin las respuestas metablicas y de defensa de la
planta.

14

____

Introduccin

3- Plantas ornamentales: el geranio

El geranio es una planta ornamental originaria de Sudfrica, introducida en Europa en
el ao de 1710. Se cultiva como planta de temporada, o como planta vivaz en regiones de
clima suave como es el mediterrneo. Sus colores claros y brillantes y su abundante
floracin hacen que sea una de las plantas ms solicitadas en el mercado de plantas
ornamentales, habindose consolidado como una de las de mayor importancia econmica en
Europa. Es una especie tetraploide (4x2n=36) y se clasifica taxonmicamente dentro de la
familia Geraniaceae, gnero Pelargonium, el nico de los 11 gneros de esta familia con
importancia ornamental. Fundamentalmente existen tres variedades de geranios cultivados
con finalidades comerciales, todas resultado de cruces entre diferentes especies del gnero.
La ms importante es el geranio zonal (Pelargonium zonale), con hojas y tallos tomentosos,
seguida de P. peltatum, con un porte colgante y hojas ms carnosas. Por ltimo, est la
variedad Pelargonium grandiflorum o Pelargonium hortorum, con grandes y bellas flores que
slo se producen en primavera y verano.
El cultivo de Pelargonium representa una de las principales producciones de plantas
ornamentales en Europa, con un comercio anual de cerca de 600 millones de plantas
(Infoagro, 2005). La industria del cultivo de plantas ornamentales mantiene una tasa de
crecimiento entorno al 12% que se puede aplicar tanto a Europa como al mercado
americano. El sector de flores y plantas vivas en Espaa contribuye de manera importante a
la balanza comercial, con las exportaciones situndose en los 219 millones de euros en
2002, y 139 millones de euros solamente en el primer semestre de 2003 (datos de la FEPEX,
Federacin Espaola de Asociaciones de Productores Exportadores de Frutas, Hortaliza,
Flores y Plantas vivas).
La variedad P. zonale se multiplica principalmente por propagacin vegetativa a partir
de esquejes (variedades de flor doble), aunque tambin puede hacerse a partir de semillas
de hbridos (variedades de flor simple). La multiplicacin por esquejes es ms rpida, pero
presenta mayores riesgos de infeccin por patgenos, ya que si la planta madre est
infectada, esta contaminacin se extender a toda la descendencia. El mercado de la
propagacin por esquejes en Europa genera cerca de 80 millones de esquejes/ao,
suponiendo un mercado potencial de 240 millones de euros (Alonso y Borja, 2005).
Hasta el momento, la mejora de las plantas ornamentales mediante tcnicas de
cruzamientos clsicos, se ha dirigido a la obtencin de nuevas variantes fenotpicas,
atendiendo principalmente a aspectos de forma y color de las flores y hojas, y del porte de
la planta. La obtencin de variedades resistentes mediante cruzamientos es muy limitada
debido a la escasa disponibilidad de genotipos resistentes. El control de plagas y
enfermedades se realiza mediante la utilizacin de productos qumicos. Las enfermedades

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Introduccin _______________________________________________________
causadas por hongos son responsables de gran parte de las prdidas en la produccin de
geranios, y son las que representan ms gastos en productos fitosanitarios en los cultivos de
invernadero. Sin considerar el impacto ecolgico de la utilizacin de fungicidas, el coste
econmico en la produccin de plantas ornamentales es de 10.000 euros al ao por hectrea
de invernadero (Alonso y Borja, 2005). Entre los hongos que infectan el geranio, se destaca
Botrytis cinerea, que presenta una amplia distribucin mundial y es muy frecuente en los
cultivos de invernadero.
Por otra parte, se dispone ya de mtodos adecuados para el cultivo in vitro de plantas
ornamentales concretas, lo que puede acelerar el desarrollo de nuevas variedades
genticamente modificadas (Tanaka et al, 2005). Algunas plantas ornamentales, como
orqudea, clavel, petunia, tulipn, crisantemo, rosa y geranio han sido ya modificadas
genticamente, siendo la alteracin en el color de las flores la principal caracterstica
manipulada (Courtney-Gutterson et al, 1994; Davies et al, 1998; Tanaka et al, 1998; Aida
et al, 2000; Mol et al, 1999;

Mercuri et al, 2001; Farzad et al, 2002). Tambin se han

descrito modificaciones en vas biosintticas, como en

la de la hormona etileno, con la

finalidad de modular sus niveles y obtener plantas que permanezcan ms tiempo verdes y
con flores vistosas (Chang et al, 2003). Por ultimo, tambin se han descrito alteraciones del
olor de las flores (Vainstein et al, 2001; Verdonk et al, 2003). Adems de la importancia de
manipular caractersticas morfolgicas, una aplicacin evidente de la biotecnologa es el
aumento de la resistencia frente a plagas y patgenos en estas plantas. En este sentido, se
han obtenido ya algunas plantas ornamentales resistentes a virus (Berthom et al, 2000),
artrpodos (Griesbach et al, 2002), bacterias (Kuehnle et al, 2004) y hongos (Marchant et
al, 1998; Bi et al, 1999; Li et al, 2003). La utilizacin de la biotecnologa vegetal en este
sector, tanto para aumentar su valor ornamental como para reducir los costes de produccin
y los impactos medioambientales mediante la obtencin de variedades resistentes a plagas y
patgenos, representa un gran avance para el mercado de las plantas ornamentales.
3.1- La podredumbre gris del geranio
Esta enfermedad es causada por el hongo Botrytis cinerea (estado anamorfo), que se
clasifica en la divisin Eumycota, subdivisin Deuteromycotina, orden Hyphales, clase
Hyphomycetes (Agrios, 1988). El estado telomorfo de B. cinerea, Botryotinia fuckeliana (de
Bary) Whetzel, es raramente observado en la naturaleza (Daughtrey, 1995).
Botrytis cinerea es uno de los patgenos vegetales ms destructivos, siendo capaz de
infectar tanto tejidos vegetativos como flores y frutos. Infecta a ms de 200 especies de
plantas, principalmente dicotiledneas. Se desarrolla de manera ptima en condiciones de
alta humedad y a temperaturas entre 24 y 28C, aunque tiene una gran capacidad de

16

____

Introduccin

adaptacin, pudiendo vivir a temperaturas que van de 0 a 35C. La infeccin causada por
este hongo se caracteriza por manchas marrones grisceas en las partes areas de la
planta, principalmente hojas y flores, aunque tambin infecta el tallo, generalmente
aprovechndose de los cortes producidos en la propagacin vegetativa (fig. 7). En
condiciones ideales para el crecimiento del hongo, las lesiones se pueden ver a las 24h de
infeccin.

Figura 7: Sntomas de infeccin por Botrytis cinerea en hojas y tallo de geranio.

La infeccin se inicia con el desarrollo de hifas provenientes de un tejido infectado
que entra en contacto con una planta sana. Tambin puede iniciarse a partir de conidios
transportados por corrientes de aire o gotas de agua. Los conidios se forman en las clulas
esporognicas del conidioforo (que recuerda un racimo de uva), y tienen una forma ovoidal
o elptica, midiendo aproximadamente 8-14 x 6-9 m (fig. 8). El gran poder de infeccin de
Botrytis cinerea se debe al hecho de que puede sobrevivir como saprfito, a su capacidad de
invadir rpidamente los tejidos vegetales y producir gran cantidad de conidios fcilmente
dispersados por el aire (Agrios, 1988).

b)

a)

Figura 8: a) Conidios de B. cinerea. b) Hifas de B. cinerea crecidas en medio lquido.

Barras = 5 m.

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Introduccin _______________________________________________________
Actualmente, el control de esta enfermedad se hace con la utilizacin de fungicidas
como el benzimidazol y la dicarboximida, que requieren repetidas aplicaciones para ser
efectivos, sobretodo antes de que aparezcan los sntomas (Hausbeck y Moorman, 1996).
Adems del problema ecolgico, la utilizacin de tales productos conlleva a la aparicin en el
hongo de resistencias a los fungicidas, tal y como ya se ha descrito en poblaciones naturales
de este patgeno (Leroux et al, 1999). El intercambio de variedades de geranio entre
diferentes invernaderos facilita la propagacin de estas cepas resistentes, dificultando an
ms su control. Una alternativa al uso de fungicidas es el control biolgico con la utilizacin
de hongos antagonistas, como Trichoderma harzianum Rifai, aunque esta tcnica ha
demostrado ser menos eficiente que la utilizacin de compuestos qumicos. Adems es difcil
sincronizar las poblaciones y se necesita un ambiente perfectamente adecuado dentro de los
invernaderos. La susceptibilidad a B. cinerea vara mucho entre los diferentes cultivares de
geranio, y hasta el momento no se ha identificado ningn gen de resistencia frente a este
hongo, aunque se sabe que las variedades diploides son ms resistentes que los genotipos
tetraploides. De esta manera, la introduccin de genes antifngicos en plantas de geranio
puede representar una buena alternativa para la obtencin de plantas resistentes a B.
cinerea.
4- Mecanismos de defensa en plantas
Las plantas, como otros seres vivos, estn constantemente expuestas a una gran
variedad de situaciones ambientales, en muchas ocasiones adversas, y a agresiones
causadas por organismos de su entorno, a las cuales deben responder y adaptarse para
sobrevivir. Una misma planta puede ser afectada por cientos de diferentes organismos
potencialmente perjudiciales, desde agentes infecciosos (virus, viroides, bacterias, hongos)
hasta organismos consumidores de vegetales (insectos, nemtodos). Cualquiera de estos
organismos es capaz de interferir de una u otra manera en los procesos naturales del
desarrollo, crecimiento o reproduccin de una planta. En la naturaleza, sin embargo, la
situacin ms frecuente es aquella en la que una planta no es husped natural de un
organismo potencialmente patognico, con lo cual no se produce ningn efecto perjudicial.
Cuando se produce el ataque por un patgeno se activan rpidamente una serie de
respuestas de defensa, tanto a nivel local como sistmico (por toda la planta, incluso en
partes que no han sido infectadas) (Hammond-Kosack y Parker, 2003; Veronese et al, 2003;
Dmitriev, 2004). Las plantas presentan una primera lnea de defensa (defensa pasiva)
basada en la existencia de barreras fsicas y/o bioqumicas (Agrios, 1988; Garca-Olmedo et
al, 1998; Heath, 2000; Castro y Fontes, 2005). Las barreras fsicas tienen como objetivo
impedir la entrada del patgeno en el interior de la planta, y estn formadas por las ceras y

18

____

Introduccin

la cutcula de la superficie de las hojas; por la estructura de las paredes celulares

(principalmente de la pared exterior de las clulas de la epidermis); y por el tamao y forma
de los estomas. Las barreras bioqumicas consisten en la acumulacin de compuestos en los
tejidos vegetales que pueden resultar txicos para microorganismos o fitfagos. As, en
muchos rganos (frutos, hojas, tubrculos) se acumulan compuestos fenlicos, taninos y
enzimas hidrolticas en elevadas concentraciones que poseen propiedades antifngicas
frente a fitopatgenos. No est claro, sin embargo, que una planta sea resistente a un
patgeno concreto por el mero hecho de acumular este tipo de compuestos.
Por otro lado, adems de las defensas constitutivas, la mayora de las plantas
tambin responden al ataque de un patgeno activando una serie de respuestas que se
conocen como defensa general o resistencia inducida (Heath, 2000; San Segundo y Coca,
2004; Castro y Fontes, 2005). Estas respuestas estn asociadas a cambios importantes en
la expresin gnica y son inducidas por la presencia del patgeno. La respuesta de defensa
inducida tambin va acompaada de cambios estructurales y bioqumicos. Entre las
alteraciones estructurales ms importantes se observa un reforzamiento de la pared celular,
lignificacin y deposicin de callosa, as como acumulacin de protenas estructurales de
pared (protenas ricas en hidroxiprolina, glicina y prolina) y deposicin de resina en los
espacios intercelulares. Todas estas alteraciones ocurren en la proximidad del punto de
infeccin con el objetivo de aislar el patgeno y de impedir el flujo de nutrientes y agua
provenientes de las clulas vecinas.
Las alteraciones bioqumicas se basan en la sntesis de compuestos antimicrobianos
de naturaleza muy diversa que poseen un efecto nocivo directo sobre el patgeno. En el
proceso que va desde el reconocimiento del patgeno hasta la produccin de estos
compuestos con actividad antimicrobiana se pueden diferenciar las siguientes etapas:
1) Reconocimiento entre la planta y el patgeno. Para que un patgeno sea capaz de
infectar una planta, ste tiene que reconocerla como husped. Esto ocurre a travs de
molculas o estructuras especficas que existen en la superficie de la planta (factores de
reconocimiento). Si no se produce este reconocimiento, el patgeno no es capaz de
adherirse a su superficie y no produce las sustancias (enzimas hidrolticas, toxinas) o
estructuras (apresorio, gancho de penetracin, haustorio) necesarias para que ocurra la
infeccin (Castro y Fontes, 2005). Por otro lado, para que haya una respuesta de defensa
efectiva por parte de la planta, sta tambin debe detectar y reconocer el patgeno de
manera rpida para que se pueda desencadenar una respuesta adecuada en el menor
tiempo posible. En la mayora de los casos, la respuesta que se desencadena por parte de la
planta es de tipo general e inespecfica. De hecho, en la naturaleza la mayor parte de las
veces las interacciones planta-microorganismo que se producen no son especficas. Este tipo
de interaccin desencadena una respuesta conocida como nonhost resistance o resistencia

19

Introduccin _______________________________________________________
general inducida. En este caso, el reconocimiento del patgeno por la planta se hace a
travs de molculas conocidas como elicitores generales. El reconocimiento de estos
elicitores generales o pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) provenientes del
patgeno es la base de las respuestas de la inmunidad innata tanto de plantas como de
animales, y permite reconocer y diferenciar sus propios componentes celulares de los de
otros organismos (Jones y Takemoto, 2004; Myrose y Ryu, 2004; Nrnberger y Lipka,
2005). Estos PAMPs son reconocidos por receptores en la membrana plasmtica llevando a
la activacin de vas de transduccin de seal que culminan en la activacin de la expresin
de genes implicados en la defensa. Estas molculas son de estructura y naturaleza diversa,
y estn muy conservadas (Navarro et al, 2004). Algunos ejemplos son los componentes de
las

paredes

celulares

de

bacterias

hongos,

como

flagelina,

lipopolisacridos,

peptidoglucanos, glicoprotenas y carbohidratos (Heath, 2000; Veronese et al, 2003;

Nrnberger et al, 2004). Estos elicitores generales actan activando las respuestas de
defensa de la planta, pero no necesariamente llevando a la resistencia. Esta caracterstica,
juntamente con la amplia distribucin de las PAMPs entre los fitopatgenos, distingue
claramente estas molculas de los productos de los genes de avirulencia avr de los
patgenos, que confieren resistencia mediante un reconocimiento especfico del producto del
gen avr con el producto de un gen R de resistencia correspondiente de la planta (ver ms
adelante) (Dangl y Jones, 2001; Brunner et al, 2002). A pesar de la existencia de una gran
variedad de protenas antimicrobianas vegetales, se pueden desarrollar enfermedades en las
plantas. Esto ocurre bien porque el patgeno no es reconocido por la planta, o bien porque
aunque sea reconocido y se desencadene una respuesta de defensa, el patgeno consigue
neutralizar de alguna manera la accin de las protenas antimicrobianas producidas por la
planta. La planta a su vez, slo es capaz de impedir una infeccin si el reconocimiento del
patgeno y la accin antimicrobiana de sus protenas de defensa son efectivos (Veronese et
al, 2003).
2) Transmisin de la seal hasta el ncleo. Como resultado del reconocimiento del patgeno
por la planta, se activan una serie de reacciones que llevan a la activacin transcripcional de
los genes de defensa. Lo primero que se observa son alteraciones en los niveles
intracelulares de iones, con la entrada de Ca2+ y H+, y la salida de K+ y Cl , un aumento en
los niveles de xido ntrico (NO), y la produccin y acumulacin de especies reactivas de
oxgeno (ROS), que tienen la doble funcin de atacar directamente el patgeno y de actuar
como molculas sealizadoras en la respuesta defensiva (Chen et al, 1993). Se observan
asimismo procesos de fosforilacin/defosforilacin de protenas que tienen como objetivo
final activar la trascripcin de los genes de defensa cuyos productos actuarn directamente
sobre el patgeno.

20

____

Introduccin

3) Acumulacin de compuestos antimicrobianos. Como consecuencia de la activacin de la

respuesta de defensa, se acumulan en la clula vegetal diversos compuestos con actividad
antimicrobiana. Entre ellos podemos destacar las fitoalexinas, compuestos fenlicos que se
producen en las clulas adyacentes a la clula infectada y daada, como respuesta a seales
que difunden de stas. La mayora de las fitoalexinas son txicas e inhiben el crecimiento de
hongos, aunque hay algunas txicas tambin a bacterias, nemtodos y virus. Otro
importante grupo de protenas que se sintetizan en la respuesta de defensa son las
clasificadas de forma genrica como protenas asociadas a la patognesis, o protenas PR
(de Pathogenesis Related Proteins) (ver ms adelante).
En

determinados

casos,

la

interaccin

planta-patgeno

est

condicionada

genticamente y se basa en la teora gen-a-gen propuesta por Flor (Flor, 1956, 1971). sta
desencadena una respuesta conocida como host resistance. Estas resistencias presentan una
gran especificidad en lo que se refiere a los genotipos de ambas partes (variedad de la
planta husped y raza del patgeno). En este caso la resistencia est determinada por la
interaccin entre los productos de los genes de resistencia vegetales (R) y los de
avirulencia del patgeno (avr). Este modelo propone que para cada gen R que confiere
resistencia a una planta existe un complementario gen avr que confiere la virulencia del
patgeno, de manera que cada gen R solamente puede reconocer su complementario gen
avr. Para que se establezca una respuesta de defensa capaz de conferir resistencia, ambos
genes han de tener carcter dominante (interaccin incompatible). En el caso de que uno
de los dos, o ambos genes sean recesivos, el patgeno no es reconocido por la planta y es
capaz de causar la infeccin (interaccin compatible). Cuando el patgeno es reconocido
por la planta y no causa la enfermedad, se denomina avirulento, mientras que cuando no es
reconocido y es capaz de infectar la planta husped se denomina virulento (Agrios, 1988).
Las interacciones incompatibles (resistencia) se manifiestan frecuentemente con una
respuesta de la planta conocida como reaccin hipersensible (HR). La HR se caracteriza
por la disminucin del turgor debido a la rpida prdida de integridad de la membrana
plasmtica, por un aumento en la respiracin y en las especies reactivas de oxgeno, por la
acumulacin de compuestos fenlicos y por la produccin de fitoalexinas. El resultado es el
colapso y muerte de las clulas infectadas y de las adyacentes, lo cual contribuye a aislar el
patgeno y frenar as su avance por la planta (Agrios, 1988; Hammond-Kosack y Jones,
1996; Baker et al, 1997; Glazebrook et al, 1997; Agrawal et al, 1999). Por todas las
similitudes que presentan, se ha sugerido que la HR es un tipo de muerte celular
programada, e incluso se compara a la apoptosis que ocurre en los animales (Mittler et al,
1995; Alvarez et al, 1998; Heath, 1998; Xie y Chen, 2000).
La utilizacin de genes de resistencia R es contemplada como una estrategia a utilizar
en programas de mejora y proteccin frente a enfermedades. Sin embargo, en el caso de la

21

Introduccin _______________________________________________________
piriculariosis esta estrategia ha demostrado no ser efectiva debido a la gran variabilidad en
la patogenicidad de los aislados de M. grisea (Valent y Chumley, 1994). La resistencia que
presentan muchos cultivares es por lo tanto poco duradera en campo. Una posible solucin
sera la introduccin de varios genes R simultneamente en un determinado cultivar. Sin
embargo, y a pesar de que la interaccin arroz/M. grisea representa un sistema modelo en
el campo de las interacciones planta/patgeno, nicamente se han identificado y
caracterizado dos genes de resistencia para la piriculariosis, el gen Pib (Wang Z-X et al,
1999) y Pita (Bryan et al, 2000). Por otra parte, se han clonado 4 genes avr, PWL1, AvrPita, Avr1-CO39, and ACE1 (Kang et al, 1995; Jia et al, 2000; Chauhan et al, 2002; Bhnert
et al, 2004). En el caso de geranio, no se han descrito cultivares resistentes a B. cinerea.
4.1- Las protenas PR (Pathogenesis Related Proteins)
Las protenas PR son protenas que se sintetizan y acumulan en tejidos de la planta
en situaciones de patognesis (infeccin por diferentes tipos de patgenos como virus,
viroides, bacterias y hongos) o en situaciones relacionadas, como herida (asociadas al
ataque por depredadores) o tratamiento con agentes qumicos (Agrawal et al, 1999; van
Loon, 1999; Dangl y Jones, 2001; Nimchuk et al, 2003). Se identificaron por primera vez
como protenas sintetizadas de novo en plantas de tabaco infectadas con el virus del
mosaico del tabaco (TMV) (interaccin incompatible) (van Loon y van Kammen, 1970).
Desde entonces, se ha podido comprobar que adems de los virus, la infeccin por hongos y
bacterias o el ataque por insectos tambin inducen la acumulacin de protenas PR (van
Loon, 1999). Las protenas PR se acumulan localmente, esto es, en el sitio de infeccin, y
tambin sistmicamente, en partes de la planta distantes del punto de infeccin. Adems de
su inducibilidad en situaciones relacionadas con la defensa, algunos genes PR presentan una
expresin ligada al desarrollo de la planta. As, se pueden encontrar en rganos asociados a
la reproduccin como flores y semillas, y tambin en tubrculos (van Loon, 1999). En
tabaco, se ha visto que algunas protenas PR que se expresan de una manera regulada por
el desarrollo pueden ser inducidas en respuesta a infecciones, tanto en el mismo rgano,
como en rganos diferentes (van Loon, 1999). La mayora de las protenas PR que presentan
este patrn de expresin, son protenas bsicas, y susceptibles de regulacin tanto por
condiciones de estrs como por hormonas. Una posible funcin de estas protenas sera la
rpida generacin de seales internas especficas, que pueden actuar como seales
morfognicas en el desarrollo de la planta, a la vez que contribuyen a generar seales para
la puesta en marcha de las respuestas de defensa, por ejemplo a travs de la degradacin
de componentes de la pared celular de los patgenos. De esta manera, un nivel basal
existente de estas protenas tambin podra tener la funcin de acelerar y amplificar los

22

____

Introduccin

procesos de defensa. Tambin se ha visto que en muchos tejidos florales se encuentran

protenas PR que se acumulan de manera constitutiva, no dependiente de infeccin. Su
presencia puede representar una buena estrategia de defensa de la planta, principalmente
cuando se trata de rganos responsables de la reproduccin y consolidacin de la especie,
como son las flores y las semillas (van Loon, 1999).
Se

pueden

distinguir

dos

tipos

de

protenas

PR:

las

cidas,

localizadas

predominantemente en el espacio extracelular, y las bsicas que se localizan principalmente

en la vacuola (Dmitriev, 2004). Actualmente, las PRs se clasifican en 17 familias segn sus
secuencias nucleotdicas o proteicas, relaciones serolgicas y funcin (tabla 2) (van Loon y
van Strien, 1999; http://www.bio.uu.nl/fytopath).
Tabla 2: Familias de protenas PR. Tomado de van Loon, 2005.

Familia

Miembro tipo

Propiedad

PR-1

PR-1a de tabaco

Antifngica ?

PR-2

PR-2 de tabaco

-1,3 glucanasa

PR-3

P, Q de tabaco

quitinasa de tipo I, II, IV, V, VI, VII

PR-4

"R" de tabaco

quitinasa de tipo I, II

PR-5

S de tabaco

tipo taumatina

PR-6

inhibidor I de tomate

inhibidor de proteasas

PR-7

P69 de tomate

endoproteinasa

PR-8

quitinasa de pepino

quitinasa de tipo III

PR-9

"peroxidasa productora de lignina" de tabaco

peroxidasa

PR-10

PR-1 de perejil

tipo ribonucleasa

PR-11

quitinasa de clase V de tabaco

quitinasa de tipo I

PR-12

Rs-AFP3 de rbano

defensina

PR-13

THI2.1 de Arabidopsis

tionina

PR-14

LTP4 de cebada

protena transferidora de lpidos

PR-15

OxOa (germin) de cebada

oxalato oxidasa

PR-16

OxOLP de cebada

tipo oxalato oxidasa

PR-17

PRp27 de tabaco

desconocida

Las protenas de la familia PR-1 fueron las primeras en ser identificadas en la

interaccin tabaco/virus TMV, y son las que se acumulan en mayor cantidad en el tejido
infectado (Buchel y Linthorst, 1999). A pesar de ser muy abundantes, no se conoce con
exactitud su funcin, aunque se ha descrito que algunos miembros presentan actividad

23

Introduccin _______________________________________________________
antifngica. En esta familia se encuentran tanto protenas cidas como bsicas. Son
protenas de un peso molecular de aproximadamente 14-17 kDa
En la familia PR-2 se encuentran las protenas con actividad -1,3 glucanasa. Las
glucanasas de clase I son protenas bsicas y vacuolares, mientras que las de clase II y III
son cidas y extracelulares. El modo de accin relacionado con la defensa se basa en su
capacidad de hidrolizar los -1,3 glucanos presentes en la pared celular de los hongos. Como
resultado de su actividad hidroltica se pueden liberar fragmentos de pared del hongo que
son reconocidos por la planta y funcionan como elicitores de la respuesta general inducida.
Adems de participar en la defensa vegetal, las -1,3 glucanasas participan tambin en
procesos de desarrollo normal de las plantas, como la germinacin del polen, fertilizacin,
embriognesis, maduracin del fruto, germinacin de las semillas, y en la movilizacin de las
reservas del endospermo en cereales (Leubner-Metzer y Meins, 1999).
Las quitinasas son protenas PR que pertenecen a las familias PR-3, PR-4, PR-8 y
PR-11. Son protenas cidas o bsicas, con pesos moleculares entre 26 y 43 kDa, que se
agrupan en 5 clases con base en sus caractersticas estructurales y funcionales. La familia
PR-8 incluye las quitinasas que tienen tambin actividad lisozima. Al igual que las -1,3
glucanasas, las quitinasas tambin pueden encontrarse en tejidos vegetales de manera
independiente de la infeccin.

Estn ampliamente distribuidas en la naturaleza, y se

encuentran en bacterias, hongos, animales y plantas (Neuhaus, 1999; Kasprzewska, 2003).

Su mecanismo de accin se basa en la hidrlisis de los enlaces -1,4 entre los residuos de
N-acetilglucosamina de la quitina, principal componente de la pared celular de muchos
hongos y del exoesqueleto de invertebrados. Se cree que las quitinasas y las -1,3
glucanasas actan de manera conjunta frente al ataque de patgenos. Se piensa que las
formas cidas que son secretadas al espacio extracelular son responsables de la liberacin
de elicitores de la pared del hongo induciendo de esta manera las respuestas de defensa de
la planta. Las formas bsicas acumuladas en la vacuola representan la segunda lnea de
defensa, de manera que una vez el patgeno hubiera conseguido penetrar en la clula
vegetal se producira su liberacin localmente a concentraciones importantes (Neuhaus,
1999; Kasprzewska, 2003).
La familia PR-5 se compone de protenas denominadas thaumatin like debido a la
gran similitud de secuencia que presentan con la protena taumatina del arbusto
Thaumatococcus daniellii. Al igual que las protenas PR-1, se identificaron por primera vez
en la interaccin tabaco/TMV. Se trata de un grupo de protenas con un tamao de
aproximadamente 25 kDa, puntos isoelctricos muy variados, y una estructura muy
compacta con 8 puentes disulfuro que les proporciona gran estabilidad y resistencia a la
degradacin por calor o proteasas. La expresin de las protenas de esta familia se induce

24

____

Introduccin

por infeccin viral y fngica, as como en respuesta a estrs osmtico y herida (Velazhahan
et al, 1999).
Los inhibidores de proteasas componen la familia PR-6. Estas protenas se acumulan
de forma natural en rganos de reserva como semillas y tubrculos, y tambin se inducen
en respuesta a herida, ya sea herida mecnica o por el ataque de insectos fitfagos. Actan
inhibiendo las actividades proteolticas del sistema digestivo de larvas de insectos. Ello
disminuye la calidad nutricional del tejido del que se alimenta la larva. En algunos casos el
insecto deja de alimentarse de la planta. Si no es as, y la larva continua alimentndose, se
produce un retardo importante en el crecimiento y desarrollo larvario, lo cual lleva en
muchos casos a su muerte. Adems de actuar frente a insectos, tambin se ha visto que
pueden inhibir el crecimiento de hongos, aunque todava no se conoce el mecanismo por el
cual ejercen esta actividad antifngica (Heitz et al, 1999). Tambin se les atribuye una
funcin defensiva frente a nemtodos.
La endoproteinasa P69 de tomate es la representante de la familia PR-7, y su
expresin se induce en plantas infectadas con viroides (Vera y Conejero, 1988). La familia
PR-9 incluye las peroxidasas, que pueden ser bsicas y vacuolares, o cidas y
extracelulares. Su funcin en la defensa est directamente relacionada con el reforzamiento
de la pared celular catalizando la deposicin de lignina en respuesta tanto a patgenos como
a insectos (Chittoor et al, 1999). Las protenas de la familia PR-10 tienen como principal
caracterstica

una

localizacin

citoslica

una

actividad

ribonucleasa

(Datta

Muthukrishnan, 1999).
Las familias PR-12, PR-13 y PR-14 incluyen respectivamente las defensinas,
tioninas y protenas transportadoras de lpidos. Son protenas con actividad antimicrobiana y
se caracterizan por su bajo peso molecular, su naturaleza bsica y el hecho de ser ricas en
residuos de cistena (van Loon y van Strien, 1999; Datta y Muthukrishnan, 1999).
La

familia

PR-12,

las

defensinas,

son

un

grupo

de

pptidos

bsicos

de

aproximadamente 4 kDa, ricos en cistenas, estructurados con diferentes motivos, y que

estn estrechamente relacionados con la defensa de las plantas frente a patgenos (Lay y
Anderson, 2005). Adems de en plantas, se han identificado defensinas en muchos otros
organismos, como son moluscos, caros, artrpodos, insectos y mamferos. Es el nico
grupo de protenas del sistema de inmunidad innato que se encuentra conservado entre
plantas, vertebrados e invertebrados (Thomma et al, 2002), lo que sugiere que son un
grupo antiguo de protenas que se origin antes de la divergencia entre plantas y animales
(Thevissen et al, 2004). En los mamferos, estas protenas tienen una estructura de hoja-
antiparalela estabilizada por 3 puentes disulfuro. Las defensinas de invertebrados y de
plantas se caracterizan por tener 3 y 4 puentes disulfuro respectivamente, y una estructura
conservada formada por una -hlice ligada a una hoja- por 2 puentes disulfuro (Marshall y

25

Introduccin _______________________________________________________
Arenas, 2003; Thevissen et al, 2004). Aunque haya una gran conservacin a nivel de
estructura

secundaria,

sus

secuencias

de

aminocidos

son

bastante

divergentes,

conservndose solamente los residuos de cistena que estabilizan la estructura. Esta

variacin puede reflejar las diferencias en las actividades biolgicas de cada defensina, as
como la adaptacin de las diferentes especies que las producen, a sus entornos naturales
(Zasloff, 2002; Spelbrink et al, 2004).
En plantas, la expresin de los genes de defensinas, al igual que los otros genes PR,
se induce en respuesta al ataque por patgenos. Probablemente son el grupo de protenas
antimicrobianas ms estudiado (Conceiao y Broekaert, 1999; Thomma et al, 2002; Castro y
Fontes, 2005). Se aislaron por primera vez en los aos 90, y en un principio se clasificaron
como una tercera clase de tioninas, las -tioninas, por la similitud de secuencia aminoacdica
(Collila et al, 1990). Ms tarde se observ que las -tioninas presentaban bajos niveles de
similitud estructural con otras tioninas ya descritas. En 1995, se acept que estas protenas
se considerasen como un grupo no relacionado evolutivamente con las tioninas y se
renombraron defensinas (Broekaert et al, 1995). Las defensinas de plantas poseen actividad
antifngica, encontrndose defensinas morfognicas, esto es, que inducen cambios en las
hifas de los hongos susceptibles (ramificacin y aumento del grosor, principalmente en las
puntas), y defensinas no-morfognicas, las cuales inhiben el crecimiento de las hifas pero
sin causar cambio en la morfologa de las mismas (Broekaert et al, 1995; Thomma et al,
2002). No se ha demostrado que tengan un efecto txico frente a clulas de plantas ni de
mamferos (Thomma et al, 2002; Ferket et al, 2003).
Las defensinas de mamferos e insectos ejercen su actividad antifngica por la
formacin de canales inicos y poros en la membrana plasmtica. En el caso de las
defensinas vegetales existen evidencias de que la permeabilizacin de la membrana viene
determinada por interacciones especficas y de elevada afinidad con sitios de unin en la
membrana del hongo (Thevissen et al, 1997; Theis y Stahl, 2004; Spelbrink et al, 2004). Se
ha visto que una defensina de dalia (DmAMP1) y otra de rbano (RsAFP2) inducen varias
alteraciones fisiolgicas, como una rpida entrada de Ca2+ y salida de K+, y alcalinizacin del
medio. Estas alteraciones requieren la presencia de receptores especficos en la membrana
fosfolipdica, en el caso de Neurospora crassa (Thevissen et al, 1996). Ms concretamente,
se ha demostrado, que el modo de accin de la protena DmAMP1 es dependiente de la
presencia de esfingolpidos, uno de los principales componentes de las membranas de
eucariotas (Thevissen et al, 2000). As, en mutantes de Saccharomyces cerevisae deficientes
en un gen involucrado en la biosntesis de esfingolpidos, la defensina de dalia DmAMP1 no
presenta actividad (Thevissen et al, 2000; Thomma et al, 2002; Ferket et al, 2003).
La actividad antifngica y el amplio espectro de accin de las defensinas hacen que
estas protenas tengan un gran potencial para ser utilizadas en la obtencin de plantas

26

____

Introduccin

transgnicas resistentes a patgenos. As, se ha descrito que la expresin constitutiva de

una defensina de rbano en tabaco y tomate permite aumentar la resistencia frente a varios
patgenos (Terras et al, 1995; Parashina et al, 2000). Otros ejemplos, como son la
expresin de una defensina de guisante en canola (Wang et al, 1999), o de una defensina de
alfalfa expresada en plantas de patata tambin han permitido obtener resistencia frente a
patgenos (Gao et al, 2000).
La familia PR-13 la forman las tioninas. Estas fueron las primeras protenas de
plantas para las cuales se demostr una actividad antifngica in vitro (Bohlmann, 1999).
Son protenas antimicrobianas muy ricas en cistenas (contienen 6 u 8 residuos de cistena
conservados),

generalmente

muy

bsicas

(pI>8),

con

un

peso

molecular

de

aproximadamente 5 kDa (Thevissen et al, 1996; Marshall y Arenas, 2003). Su secuencia

aminoacdica es muy conservada, y la estructura tridimensional tiene forma de "L", donde el
brazo vertical est formado por un par de hlices- antiparalelas con residuos hidrofbicos e
hidroflicos distribuidos a un lado o a otro de cada hlice. El brazo horizontal consiste en una
pequea hoja antiparalela, que confiere carcter anfiptico de la molcula (Teeter et al,
1990). Las tioninas muestran toxicicidad in vitro frente a bacterias y hongos fitopatgenos
(Bohlmann, 1999). La expresin de los genes que codifican las tioninas se induce en
respuesta al ataque por patgenos. Ello unido a su toxicidad frente a patgenos apoya una
funcin importante de estas protenas en la respuesta de defensa de las plantas. Presentan
efectos txicos frente a bacterias, hongos, levaduras, clulas animales y algunas vegetales
(Castro y Fontes, 2005). El mecanismo inicialmente descrito para explicar su actividad
antifngica es a nivel de la membrana plasmtica (Thevissen et al, 1996; Broekaert et al,
1997). Su toxicicidad requiere interacciones electrostticas con los fosfolpidos negativos de
la membrana, posible por su carcter anfiptico, seguida de la formacin de poros o de la
interaccin con determinados dominios presentes en la bicapa lipdica (Thevissen et al,
1996). Adems de su claro efecto en la membrana plasmtica, tambin se ha descrito que
las tioninas son capaces de inhibir la sntesis de protenas en sistemas in vitro,
probablemente por una interaccin directa con el RNAm o a nivel del inicio de la traduccin
(Garcia-Olmedo et al, 1983; Brmmer et al, 1994). Las similitudes estructurales entre los
motivos helix-turn-helix (H-T-H) de las tioninas y de las protenas de unin a DNA llev a
proponer que las tioninas pueden representar un nuevo grupo de protenas de unin a DNA
(Marshall y Arenas, 2003). Las purotioninas, unas de las primeras tioninas descritas, son
capaces de inhibir la enzima ribonucletido reductasa, interfiriendo en la sntesis de DNA
(Johnson et al, 1987). Otra de las posibles funciones in vivo descrita para las tioninas est
asociada a su actividad como tioredoxinas, pudiendo ser por lo tanto mensajeros
secundarios de tiol en la regulacin redox de enzimas (Johnson et al, 1987). Adems, como
muchas de estas protenas se encuentran en las semillas, se les ha atribuido una funcin de

27

Introduccin _______________________________________________________
protenas de almacenamiento, principalmente como fuente de sulfuros (Castro y Fontes,
2005).
Los genes de las tioninas ya se han utilizado para la obtencin de plantas
transgnicas resistentes a hongos y bacterias patgenas por ejemplo, plantas de tabaco que
expresan constitutivamente el gen -hordothionin son resistentes a Pseudomonas syringae
(Carmona et al, 1993). La expresin de una tionina de avena en arroz confiere resistencia a
las bacterias Burkholderia plantarii y B. glumae (Iwai et al, 2002). Tambin se han obtenido
plantas de Arabidopsis thaliana resistentes a Plamodiophora brassicae, expresando una
tionina de murdago (Holtorf et al, 1998), o a Fusarium oxysporum por sobreexpresin de
una tionina endgena (Epple et al, 1997).
Las protenas transportadoras de lpidos (LTPs) representan la familia PR-14 de
protenas PR. Son protenas involucradas en el transporte de lpidos desde su sitio de
sntesis, el retculo endoplasmtico, a otros orgnulos, como por ejemplo cloroplastos,
mitocondrias o membrana plasmtica (Kader, 1996; Guerbette et al, 1999). Se han descrito
LTPs en mamferos, hongos, bacterias y plantas (Selitrennikoff, 2001). Son protenas
pequeas y bsicas que se dividen en dos subfamilias segn su peso molecular: 9 kDa
(LTPs1) y 7 kDa (LTPs2). Aunque no tengan una secuencia primaria muy conservada entre
ellas, la estructura tridimensional es muy parecida. Presentan una estructura muy compacta,
formada por 4 segmentos de -hlice (un 40% de la estructura total) conectados por 4
puentes disulfuro (Selitrennikoff, 2001; Ge et al, 2003a; Castro y Fontes, 2005). El dominio
C-terminal es variable y se sintetizan con una extensin N-terminal, o pptido seal, para la
entrada de la protena en la ruta de secrecin a travs de su internalizacin en el retculo
endoplasmtico (Ge et al, 2003a). Poseen una cavidad hidrofbica interna en forma de tnel
que forma un sitio adecuado para la interaccin entre la cadena aliftica de los lpidos, con
los residuos hidrofbicos expuestos en la cavidad (Ge et al, 2003a; Castro y Fontes, 2005).
Tienen baja especificidad, siendo capaces de transportar diferentes tipos de lpidos, por lo
que se denominan tambin protenas transportadoras de lpidos no especficas (ns-LTP).
Se han atribuido varias funciones a las LTPs. Se piensa que participan en la formacin
de la cutcula, en la embriognesis, en el establecimiento de relaciones de simbiosis, y en la
adaptacin de las plantas a diferentes condiciones ambientales tales como cambios de
temperatura, humedad, salinidad, o ataque por patgenos (Molina et al, 1993; Buhot et al,
2001; Selitrennikoff, 2001; Maldonado et al, 2002; Castro y Fontes, 2005). Su inducibilidad
en situaciones de infeccin por patgenos llev a incluir a las LTPs dentro de las protenas
PR. Se han caracterizado LTPs de maz, cebada y pimienta, (Molina et al, 1993; Park C. J. et
al, 2002; Ruelland et al, 2002; Jung et al, 2003), las cuales tienen capacidad para inhibir el
crecimiento in vitro de bacterias y hongos, como Pseudomonas solanacearum, Clavibacter
michiganensis, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Trichoderma viride, Cercospora beticola

28

____

Introduccin

y Magnaporthe grisea (Terras et al, 1992; Molina et al, 1993; Kader, 1996; Carvalho et al,
2001; Ge et al, 2003b). Otro dato consistente con la participacin de estas protenas en la
defensa vegetal es su localizacin en la pared celular (Castro y Fontes, 2005). En situaciones
de infeccin por patgeno se observa una mayor acumulacin de LTPs, tanto en las capas
exteriores de la pared celular, como en el tejido vascular (Kader, 1996; van Loon y van
Strien, 1999; Ge et al, 2003a). A pesar de la gran similitud estructural con las defensinas y
tioninas, parece ser que el mecanismo de regulacin de la expresin de las LTPs no
responde a los mismos estmulos (van Loon y van Strien, 1999).
El mecanismo por el cual las LTPs ejercen su actividad antimicrobiana no se conoce.
Recientemente, Regente y colaboradores (2005) han demostrado que una LTP de planta es
capaz de permeabilizar la membrana de hongos formando poros que permiten la salida de
iones de la clula llevando a la muerte celular. En ensayos de mutagnesis dirigida, se ha
podido demostrar que la unin de estas protenas a los lpidos no es decisiva para su
actividad antifngica, ya que mutantes que seguan manteniendo la capacidad de unirse a
lpidos ya no eran efectivos frente a hongos (Ge et al, 2003b). Otro dato que corrobora estos
resultados es el hecho de que una LTP de cebolla, la protena Ace-AMP1, tiene una fuerte
actividad antifngica, pero no posee capacidad de unirse a lpidos (Cammue et al, 1995). En
2001, Buhot y colaboradores pudieron demostrar que una LTP de trigo se une a receptores
localizados en la membrana plasmtica de plantas de tabaco, una vez ms indicando que
hay otros factores adems de la unin a lpidos que pueden estar involucrados en el
mecanismo de accin de las protenas LTP.
Se han obtenido plantas transgnicas resistentes a patgenos que expresan genes
que codifican LTPs. Por ejemplo plantas de tabaco y Arabidopsis thaliana que sobreexpresan
una LTP de cebada, muestran resistencia frente a la infeccin por bacterias (Molina y GarcaOlmedo, 1997). Estos estudios refuerzan el papel de estas protenas en la defensa vegetal, y
confirman su potencial biotecnolgico para la obtencin de plantas resistentes a patgenos.
Las familias PR-15 y PR-16 se componen de oxidasas de oxalato, tambin conocidas
como germinas. Son protenas oligomricas muy resistentes a la desnaturalizacin por calor
y SDS. En la interaccin planta-patgeno estas protenas son responsables de la produccin
de H2O2 a partir de oxalato, necesario para los procesos de polimerizacin mediados por
peroxidasas (van Loon y van Strien, 1999; Datta y Muthukrishnan, 1999). Finalmente, la
familia PR-17 est compuesta por un nuevo tipo de protenas de cerca de 25 kDa y que
presentan homologa con otras protenas inducidas por patgenos en trigo y tabaco
(Christensen et al, 2002). Ciertas regiones de estas protenas presentan similitud con el
centro activo de una exopeptidasa de eucariotas (aminopeptidasa N) y con una
endopeptidasa de bacterias (termolisina). Su implicacin y mecanismo de accin en la
respuesta de defensa de las plantas an no se conoce.

29

Introduccin _______________________________________________________
4.2- Respuestas de Defensa Sistmicas
Las plantas tienen la capacidad de desarrollar una respuesta de defensa tanto a nivel
local como sistmico. Una vez se ha puesto en marcha todo el sistema de defensa local (2-3
das despus del contacto inicial con el patgeno), ya sea como resultado de una resistencia
inducida (o interaccin inespecfica), o en situacin de respuesta HR (interaccin
incompatible), se activa una respuesta sistmica por toda la planta. Esta respuesta,
conocida como resistencia sistmica adquirida, SAR (Systemic Acquired Resistance), protege
la planta de posteriores ataques, no slo frente al patgeno causante de la respuesta inicial,
sino tambin frente otros patgenos (Ross, 1961). La SAR se caracteriza molecularmente
por la acumulacin de protenas PR en diferentes tejidos de la planta. Adems de observarse
en respuesta al ataque por patgenos, tambin se puede inducir por tratamientos con
agentes qumicos concretos que actan como inductores cuando son aplicados externamente
(p. e. benzothiadiazole (BTH)).
Hasta la fecha, an no se sabe cul es la molcula responsable de la transmisin de
la seal implicada en el establecimiento de la SAR (Agrios, 1988; Durrant y Dong, 2004).
Durante mucho tiempo se pens que era el cido saliclico (SA). Sin embargo, en
experimentos utilizando mutantes deficientes en la acumulacin de SA libre y mediante
injertos cruzados con plantas salvajes, se observ que la SAR se segua desarrollando. En el
mismo experimento tambin se pudo comprobar que aunque el cido saliclico no es la
molcula responsable del establecimiento de SAR, se necesitan niveles elevados para que se
observe resistencia en las hojas sistmicas (Vernooij et al, 1994). Por todo esto se puede
concluir que el SA no es la molcula sealizadora responsable de la SAR, pero su
acumulacin es indispensable para que ocurra. El SA es mediador de varias de las
respuestas de defensa, como la produccin de las barreras de lignina, y de la expresin de
genes PRs. El SA juega tambin un importante papel en la modulacin del equilibrio redox y
protege las plantas del estrs oxidativo (Yang et al, 2004). Es importante destacar que las
plantas de arroz tienen un nivel basal de SA de 50 a 300 veces superior al que se encuentra
en tabaco y Arabidospis, incluso cuando comparamos los niveles en plantas infectadas (Chen
Z. et al, 1997). En plantas de arroz infectadas por hongos o bacterias los niveles de SA
varan muy poco, y cuando ste se aplica de manera exgena es un pobre activador de la
expresin de genes PR y de la resistencia sistmica inducida. Estas observaciones sugieren
que el SA endgeno puede no tener la funcin de molcula sealizadora en la resistencia
inducida en arroz (Yang et al, 2004). Adems de todo lo mencionado anteriormente, la SAR
mediada por SA puede ser activada tanto por estreses biticos como abiticos, poniendo de
manifiesto la importancia de esta hormona vegetal en los procesos de respuesta de las
plantas a los estmulos ambientales (Agrawal et al, 1999).

30

____

Introduccin

Ms recientemente se ha propuesto que la molcula sealizadora implicada en la SAR

sea una molcula lipdica ya que plantas mutantes en protenas transportadoras de lpidos
(Maldonado et al, 2002) o defectivas en la sntesis de lipasas (Falk et al, 1999; Jirage et al,
1999) no son capaces de establecer la SAR (aunque desarrollan normalmente las respuestas
locales a la infeccin). Otra evidencia que corrobora un papel de molculas lipdicas en la
transmisin de la seal para la SAR es la identificacin de una lipasa que se une a SA en
tabaco, y cuya actividad aumenta hasta 5 veces en respuesta al tratamiento con esta
hormona. Adems, el silenciamiento del gen que codifica esta lipasa disminuye las
respuestas de defensa locales y sistmicas (SAR) (Kumar y Klessig, 2003). Plantas de
Arabidopsis thaliana con una mutacin que inhibe la sntesis de cidos grasos de la
membrana de cloroplastos presentan una menor acumulacin de ROS en hojas y una menor
HR (Yaeno et al, 2004). Finalmente, una mutacin en un gen involucrado en la sntesis de
glicerolpidos reduce los niveles de acumulacin de SA y de la protena PR-1 en los tejidos
sistmicos de la planta, comprometiendo la respuesta SAR (Nandi et al, 2004). Estos datos
demuestran la participacin de molculas lipdicas en la respuesta de defensa.
Otra va de sealizacin que lleva al establecimiento de la respuesta de defensa es la
del cido jasmnico (JA), una hormona vegetal involucrada en diversos procesos del
desarrollo de las plantas, incluyendo la senescencia, crecimiento y reproduccin (Agrawal,
1999). El JA est relacionado con la defensa frente a algunos patgenos, y principalmente
frente a insectos fitfagos (Schweizer et al, 1998). La primera evidencia fue la observacin
de un aumento local y sistmico de la concentracin de JA en respuesta al ataque de
insectos y patgenos (Staswick, 1992). Se ha observado que el tratamiento de plantas de
Arabidopsis con metil-jasmonato aumenta la resistencia frente a ciertos hongos, pero no a
bacterias.
El etileno (ET) es otra hormona vegetal, en estado gaseoso, que regula muchos de
los procesos de desarrollo (germinacin, maduracin de frutos, senescencia) y respuestas a
estrs en las plantas. Activa vas de sealizacin en respuesta al ataque por patgenos e
insectos, e induce la acumulacin de varios compuestos de defensa, como protenas PR y
lignina. Algunas plantas tratadas con ET se hacen ms resistentes a hongos, virus e
insectos. El ET, en combinacin con el JA, es necesario para la induccin de la expresin de
ciertos genes de defensa (quitinasas, defensinas e inhibidores de proteasas), genes que no
son inducidos por la va del SA (por ejemplo el gen de la defensina PDF1.2) (Penninckx et al,
1998). Las vas de sealizacin de SA, JA y ET estn interconectadas sabindose que el
tratamiento con SA o con JA resulta en la induccin de 55 genes en comn (Schenk et al,
2000), existen tambin evidencias que llevan a creer en un antagonismo entre estas tres
vas de sealizacin. La induccin de la SAR, fuertemente vinculada al SA, tiene un efecto
negativo en las vas de JA/ET, normalmente inducidas en respuesta a insectos y herida.

31

Introduccin _______________________________________________________
Asimismo un aumento en los niveles de SA se asocia a la inhibicin de la sntesis de JA con
la consecuente disminucin de la expresin de genes activados por esta hormona (Heil y
Bostock, 2002). Anlisis en la expresin gnica en plantas normales y plantas mutantes de
Arabidopsis en la sealizacin de las vas del SA, JA y ET, revelan que aunque las vas del
JA/ET pueden inhibir algunas veces la del SA es ms frecuente que el SA inhiba la va del JA
(Glazebrook et al, 2003).
Se ha descrito otro tipo de respuesta de defensa sistmica que no depende de SA, y
que no va asociado a la sntesis de protenas PR, ni tampoco a la reaccin hipersensible.
Esta respuesta, definida como resistencia sistmica inducida (Induced Systemic Resistance,
ISR) se identific en la interaccin de rizobacterias no patognicas con algunas plantas, y
tambin protege frente a nuevos ataques por virus, hongos y bacterias (van Loon et al,
1998). En relacin a las vas de sealizacin involucradas en la respuesta de defensa ISR,
parece estar modulada por cido jasmnico y etileno (Piterse et al, 1998).
Uno de los componentes ms estudiados involucrado en la va del SA, es el gen npr1
(non-expressor of PR genes, tambin denominado nim1 de non-inducible immunity
phenotype) (Cao et al, 1994; Delaney et al, 1995). Este gen fue identificado en un mutante
de Arabidopsis el cual mostraba una acumulacin normal de SA despus de una infeccin
por patgeno, pero que era incapaz de expresar genes PR y de desarrollar una respuesta
SAR (Cao et al, 1994; Delaney et al, 1995; Glazebrook et al, 1996). Por otro lado, la
sobrexpresin de este gen en plantas de arroz y Arabidopsis lleva a un aumento en la
resistencia frente a varios patgenos (Cao et al, 1998; Chern et al, 2001; Friedrich et al,
2001). Diferentes estudios han demostrado que este gen est implicado en la respuesta de
defensa tanto a nivel local como en la respuesta SAR (Cao et al, 1994; Delaney et al, 1995;
Glazebrook et al, 1996). La protena NPR1 se localiza en el citoplasma de la clula en forma
oligomrica estabilizada por puentes disulfuro. En situaciones de induccin, la protena NPR1
(forma monomrica inducida por cambios redox citoplasmticos) se transloca al ncleo
(Kinkema et al, 2000) donde interacciona con factores de transcripcin de la subclase bZIP
(familia de factores TGA) que estn involucrados en la activacin dependiente de SA de
genes PR (Desprs et al, 2000; Subramanian et al, 2001; Fan y Dong, 2002; Spoel et al,
2003). El gen npr1 tambin es necesario para el establecimiento de la respuesta ISR en las
interacciones con rizobacterias (Piterse et al, 1998; van Wees et al, 2000), y media las
interconexiones entre las vas del SA, JA y ET. Las plantas mutantes en el gen npr1
presentan una tolerancia reducida al SA, que adems se acumula en cantidades ms altas
en estas plantas que en las normales (Cao et al, 1997; Kinkema et al, 2000). En
experimentos con plantas de Arabidopsis thaliana, se ha visto que plantas mutantes
incapaces de acumular SA producan 25 veces ms JA que las salvajes y mostraban un
aumento en la expresin de genes regulados por JA en respuesta a la infeccin por

32

____

Introduccin

Pseudomonas syringae pv. tomato. Adems, en este mismo trabajo, se ha demostrado que
el efecto antagonista del SA sobre el JA requiere la presencia de la protena reguladora
NPR1, pero en este caso no es necesaria la localizacin nuclear de NPR1. Esto indica que la
interconexin entre estas dos vas est modulada por NPR1 en el citoplasma (Spoel et al,
2003). Podemos concluir que NPR1 es un importante regulador en las respuestas de defensa
inducidas tanto por SA como por JA/ET, y que tiene la capacidad de regular diferencialmente
estas respuestas segn las diferentes seales.
La sistemina, un polipptido de 18 aminocidos, se produce en las hojas en
respuesta al ataque de insectos o a un dao mecnico, siendo una molcula seal capaz de
moverse por el floema.

Es reconocida por receptores presentes en la superficie celular

activando una cascada de seales mediada por lpidos que se origina con la liberacin de
cido linolico de la membrana plasmtica y que conduce hasta la sntesis de cido
jasmnico (Len et al, 2001).
El cido abscsico (ABA) es otra de las hormonas vegetales involucrada en las
respuestas de la planta, aunque ms especficamente en aquellas relacionadas con estreses
abiticos, como pueden ser la sequa o el exceso de salinidad. En lo que se refiere a la
defensa, responde a la herida causada por insectos, probablemente en una va

de

transduccin de seal anterior a la del JA, aumentando los niveles de JA en tejidos daados
(Hildmann et al, 1992; Wasternack y Parthier, 1997).
La sacarosa es el producto primario de la fotosntesis y se transloca a travs de la
planta por el floema desde las hojas fotosintticamente activas hasta los otros rganos
(semillas, flores u hojas en desarrollo). Tambin es capaz de actuar como molcula
sealizadora regulando la expresin gnica. En 2003, Murillo y colaboradores pudieron
correlacionar el aumento en los niveles de sacarosa en hojas de tabaco con la expresin de
genes de defensa (PRs). Como resultado de ello, se observa la resistencia frente a
patgenos. Estos datos indican que la sacarosa tambin podra ser una molcula
sealizadora de las respuestas de defensa.
En definitiva, la respuesta de defensa de las plantas frente al ataque por patgenos o
insectos est regulada por una amplia red de vas de transduccin de seal. La interconexin
entre ellas les proporciona un elaborado potencial de regulacin que lleva a la activacin de
la defensa ms adecuada frente a cada organismo invasor. Ocurren importantes reajustes
fisiolgicos en el que participan de manera decisiva las hormonas vegetales, que en esta
situacin adquieren nuevas funciones para proporcionar una defensa eficaz. Diferentes vas
de transmisin de la seal de defensa actan en cooperacin y proporcionan una resistencia
ms efectiva frente al ataque de un patgeno (van Wees et al, 2000). En determinados
casos, el antagonismo entre vas permite controlar la respuesta de defensa de una manera
ms focalizada y especfica. Esta gran multiplicidad de respuestas, como resultado de la

33

Introduccin _______________________________________________________
activacin de diferentes vas de sealizacin y de las diferentes interconexiones que pueden
existir entre ellas, explicara los efectos de resistencia cruzada observados frente a los
diferentes organismos potencialmente agresores de las plantas.
4.3- Los genes PRms, mpi y ZmPR4 de maz
Los genes PRms, mpi y ZmPR4 son genes PR de maz, que han sido identificados y
estudiados en el laboratorio, y que pertenecen a las familias PR-1, PR-6 y PR-4 de las
protenas PR, respectivamente. Se describen a continuacin las caractersticas ms
importantes de estos genes, cuyos promotores han sido utilizados en este trabajo (captulo
II).
El gen PRms (Pathogenesis-Related maize seed) fue identificado en el
transcurso de un estudio dirigido al anlisis y caracterizacin de genes que se expresan en el
periodo de germinacin de la semilla de maz (Casacuberta et al. 1991). As, su expresin se
induce en tejidos concretos de la semilla en germinacin (la aleurona y el epitelio escutelar),
en respuesta a la infeccin por el hongo Fusarium verticilloides. La expresin de este gen
responde adems a la infeccin por otros hongos, tanto patognicos como no patognicos
para maz, tales como F. culmorum, F. oxysporum, Pythium spp., Penicillium spp,
Microdochium nivale y Trichoderma spp, as como por tratamiento con elicitores fngicos (F.
verticilloides, Phytophthora megasperma) o con moniliformina (toxina producida por el
hongo F.moniliforme (Casacuberta et al. 1991, 1992; Murillo et al, 1999). El promotor del
gen PRms contiene un elemento regulador en cis cuya presencia es suficiente y necesaria
para mediar la respuesta a elicitores fngicos del gen PRms as como tambin del promotor
mnimo del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el elemento ERE (Elicitor Responsive
Element) (Ravents et al, 1995). El elemento ERE se localiza en la posicin -246 del
promotor PRms con respecto al inicio de la transcripcin.
La protena PRms es una protena de aproximadamente 15.5 kDa y de carcter bsico
(pI 8,5). La caracterstica ms destacable de esta protena de defensa es su peculiar
localizacin subcelular, ya que se localiza especficamente en los plasmodesmos de tejidos
infectados de maz (Murillo et al, 1997). Los plasmodesmos son canales citoplasmticos de
comunicacin entre clulas contiguas. Inicialmente se pens que la funcin de los
plasmodesmos era permitir el paso de molculas pequeas (de hasta 1000 daltons,
aproximadamente). En la actualidad se sabe que los plasmodesmos son estructuras
dinmicas capaces de regular el paso de macromolculas, como son los complejos de
ribonucleoprotenas virales, factores de transcripcin, etc. (Jackson y Kim, 2003; Lucas y
Lee, 2004; Zambryski, 2004). Estudios posteriores llevados a cabo en el laboratorio en
plantas transgnicas de tabaco que sobreexpresan el gen PRms, mostraron que la protena

34

____

Introduccin

PRms presenta la misma localizacin subcelular en plasmodesmos en las plantas de tabacoPRms.

Los plasmodesmos son la va de transporte simplstico de la sacarosa, principal
fotoasimilado de la planta, entre clulas del mesfilo de las hojas fotosintticamente activas
(rgano productor) hasta su entrada en el sistema conductor (carga del floema) para su
posterior transporte hacia las partes en crecimiento de la planta (rganos consumidores).
Los resultados obtenidos del estudio de las plantas de tabaco-PRms, indicaron que la
presencia de la protena PRms modifica la estructura y propiedades funcionales de los
plasmodesmos entre clulas del mesfilo, de tal manera que se observa una activacin del
proceso de descarga de sacarosa a travs del pecolo de las hojas de las plantas de tabacoPRms. Ello adems de acelerar el crecimiento de la planta y aumentar la productividad de la
misma (biomasa foliar, produccin de semillas), determina niveles de acumulacin de
sacarosa en las hojas jvenes de la planta superiores a los normales. La sacarosa acta
como molcula sealizadora para la activacin de la expresin de genes PR endgenos, esto
es de la propia planta de tabaco. Como consecuencia, se observa una acumulacin
constitutiva de protenas PR de tabaco en las plantas transgnicas que confiere proteccin
a la planta frente a infeccin por patgenos (Murillo et al, 2003).
El gen mpi (maize protenase inhibitor) de maz, al igual que el gen PRms, se
expresa en respuesta a infeccin durante el periodo de germinacin de la semilla de maz
(Cordero et al, 1992, 1994). Sin embargo, la expresin de ambos genes, PRms y mpi, est
regulada por diferentes seales. Mientras que la induccin del gen PRms viene determinada
por el reconocimiento molecular del patgeno (respuesta a elicitores), la induccin del gen
mpi es una consecuencia de la herida que el patgeno produce en el tejido de la planta
durante el proceso de infeccin y colonizacin (Cordero et al, 1994). As, la herida mecnica
y el tratamiento con las hormonas sealizadoras de la respuesta a herida metiljasmonato y
cido abscsico, inducen la acumulacin de trnscritos del gen mpi. La induccin de la
expresin del gen mpi en respuesta a herida se observa tanto a nivel local como a nivel
sistmico en la planta de maz. En situaciones de ataque por insectos fitfagos, como es el
caso de larvas del insecto lepidptero Spodoptera littoralis, tambin se observa la
acumulacin rpida de la protena MPI en los tejidos en los que se alimentan las larvas
(Tamayo et al, 2000).
El gen mpi codifica un inhibidor de proteasas bifuncional con capacidad de inhibicin
de sern-proteasas digestivas de lepidpteros (Chilo suppressalis, Spodoptera littoralis
Cacyreus marshalli) del tipo elastasa y quimotripsina (Tamayo et al, 2000). Su expresin en
plantas transgnicas de arroz es efectiva para inhibir el crecimiento de las larvas de C.
suppressalis, no slo cuando es expresado de manera constitutiva sino tambin cuando es
expresado bajo control de sus propias secuencias reguladoras (promotor y terminador) (Vila

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Introduccin _______________________________________________________
et al, 2005). El promotor mpi, ha mostrado ser un buen promotor para la expresin regulada
del gen insecticida de Bacillus thuringiensis CryIB en plantas de arroz, tanto en condiciones
controladas de invernadero (Breitler et al, 2001) como en ensayos de campo (Breitler et al,
2004).
El gen ZmPR4 codifica una protena quitinasa de clase II que pertenece a la familia
PR-4 de protenas PR. Su peso molecular y punto isoeltrico calculados son respectivamente
13,3 kDa y 4,9, tratndose por lo tanto de una protena cida (Bravo et al, 2003). En
embriones infectados con esporas de hongos (Fusarium verticillioides, Penicillium spp,
Trichoderma spp), o tratados con elicitores fngicos o moniliformina, se observa una rpida
activacin transcripcional del gen ZmPR4. Su expresin no se ve afectada por tratamientos
con cido acetil saliclico (SA) o cido giberelico (GA), pero s por cido abscsico (ABA) y
metil jasmonato (JA). Tambin se observa un aumento rpido y considerable de los niveles
de RNAm del gen ZmPR4 en respuesta a herida, niveles que se mantienen estables hasta
por lo menos 24 horas despus de la herida. La respuesta mltiple observada en el caso del
gen ZmPR4 probablemente se debe a una convergencia entre el reconocimiento molecular
del patgeno (inducibilidad por elicitores), y la herida causada por su penetracin en tejido
al que infecta. En ensayos de hibridacin in situ en embriones aislados en germinacin, se
pudo localizar una expresin del gen ZmPR4 en el epitelio y en las capas ms externas de
las clulas del parnquima del escutelo. Este patrn de expresin mostr ser el mismo que
para el gen mpi, pero diferente del gen PRms (la expresin del gen PRms se observ en el
epitelio del escutelo pero no en clulas del parnquima escutelar). La expresin localizada en
las capas celulares exteriores del escutelo (epitelio y parnquima) puede significar que esta
quitinasa tenga un papel directo en la defensa de la semilla frente al ataque por patgenos,
ya que estos son los primeros tipos celulares invadidos por el hongo F. verticillioides.
4.4- Otras protenas antimicrobianas de plantas
Adems de las protenas PR descritas en el apartado 4.1 de este trabajo, se han
descrito otras protenas con actividades antimicrobianas de plantas, que no han sido
incluidas dentro de la clasificacin de protenas PR. Un ejemplo es la hevena, la protena
ms abundante del rbol productor de ltex, Hevea brasiliensis. La hevena es una protena
rica en glicina y prolina, que tiene la capacidad de unirse a quitina o a oligmeros de Nacetilglucanos. Como otras muchas protenas antimicrobianas, presenta un tamao reducido
(43 aminocidos) y posee 8 cistenas que forman los 4 puentes disulfuro responsables por su
estabilidad estructural (Van Damme et al, 1999). Debido a su capacidad de unirse a
carbohidratos, la hevena tambin se considera una lectina. As, las protenas que presentan
uno o ms dominios de tipo hevena se clasifican dentro de la superfamilia de las lectinas.

36

____

Introduccin

Se propuso que la actividad antifngica de estas protenas de basa en su capacidad de

unirse a quitina. Sin embargo, Os y colaboradores (2003) demostraron que dos protenas de
tipo hevena de Pharbitis nil presentan actividad antifngica in vitro, tanto frente a hongos
que tienen quitina en su pared celular, como frente a hongos que no la tienen. Ello indica
que la presencia de quitina no es fundamental para que estas protenas ejerzan su efecto
antifngico. Estos mismos autores han obtenido tambin plantas transgnicas de tomate
sobreexpresando una de estas dos hevenas, que se mostraron resistentes al ataque de
hongos, con o sin quitina en su pared celular.
Las protenas inactivadoras de ribosomas, o RIPs, son un grupo de enzimas con
actividad N-glicosidasa que hidrolizan los rRNAs en un residuo especfico de adenina que se
encuentra muy conservado en la subunidad mayor de los ribosomas (28S en mamferos,
26S en plantas y hongos, y 23S en bacterias). Liberan un fragmento de RNA conocido como
fragmento- de 240 a 500 nucletidos segn la especie (Endo et al, 1987). Esta
modificacin irreversible impide la unin de los factores de elongacin EF-1 en el caso de
eucariotas y EF-TG en procariotas, bloqueando la traduccin y llevando a la muerte celular
(Jensen et al, 1999; Hartley y Lord, 2004). Todas las protenas RIPs presentan una
estructura tridimensional muy conservada alrededor de la regin cataltica, esencial para la
unin al sustrato (Chen et al, 1997). Se clasifican en 3 grupos: tipo1) de simple cadena
(entre 11 y 30 kDa); tipo 2) formadas por dos subunidades peptdicas unidas por un puente
disulfuro. La cadena A es homloga a las protenas RIP de tipo 1, con actividad Nglicosidasa, mientras que la cadena B presenta propiedades de lectinas y especificidad por
galactosa (cerca de 60 kDa); y tipo 3) formada por una nica cadena que contiene un
dominio adicional en su extremo carboxi terminal (Selitrennikoff, 2001; Stirpe, 2004; Mi et
al, 2005). Hasta la fecha se han identificado protenas RIP en diversas especies vegetales,
incluyendo monocotiledoneas y dicotiloedoneas, aunque las protenas de tipo 3 solo se han
descrito en monocotiledoneas (Jensen et al, 1999; Nielsen y Boston, 2001; Pelosi, 2005). Se
han detectado en diferentes rganos y tejidos, como endospermo, frutos, races y hojas, y
algunas muestran una regulacin dependiente del desarrollo o especfica de tejido (Jensen et
al, 1999; Stirpe, 2004). Aunque sean mayoritariamente vegetales, tambin se han descrito
algunas protenas de tipo RIP en hongos, como es el caso de la protena tricolina del hongo
Thichoderma viride, y las protenas gigantina y -sarcina, aisladas del hongo del suelo
Aspergillus giganteus (Lin et al, 1991; Lin et al, 1994; Salvarelli et al, 1994; Ng, 2004).
Dada su gran toxicicidad, se postulan dos funciones principales para las protenas
RIP: como inductoras de muerte celular programada, y/o como protena de defensa frente a
herbvoros o patgenos, aunque se hayan propuesto tambin actividades RNasa y DNasa,
superxido dismutasa o fosfolipasa (Jensen et al, 1999; Park et al, 2004). Las protenas
RIPs son en su mayora sintetizadas en una forma inactiva de preprotena y secretadas al

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Introduccin _______________________________________________________
espacio extracelular. Una vez fuera de la clula, se activan por la accin de enzimas
proteolticas. De esta manera las clulas productoras se autoprotegen de su actividad
ribonuclesica (Jensen et al, 1999; Veronese et al, 2003; Stirpe, 2004). Penetran en las
clulas diana por endocitosis mediada por interacciones con la membrana plasmtica, y
llevan a la muerte celular a travs de la induccin de apoptosis como causa directa de su
actividad cataltica en los ribosomas. As, se ha demostrado una actividad antifngica para
protenas RIP de meln (hispin) (Ng y Parkash, 2002), de maz (Nielsen et al, 2001), y de
ginseng (Ng y Wang, 2001); adems de una doble funcin fungicida y bactericida para dos
protenas RIP de Mirabilis expasa (Vivanco et al, 1999), y para una RIP de tabaco (Sharma
et al, 2004). Tambin se demostr un efecto sinrgico entre una protena RIP de la hierba
carmn (Phytolacca americana) y otras protenas de defensa como quitinasas, -glucanasas y
proteasas (Park, S-W. et al, 2002), y entre una quitinasa de clase II y una RIP de cebada en
plantas transgnicas de tabaco (Jach et al, 1995). Las protenas RIP se han utilizado con
xito para la obtencin de plantas transgnicas resistentes a patgenos. La sobreexpresin
de la protena IRIP de iris en tabaco permiti obtener plantas resistentes al virus del
mosaico del tabaco (Desmyter et al, 2003; Vandenbussche et al, 2004). En otro trabajo, se
obtuvieron plantas de arroz resistentes al hongo Rhizoctonia solani mediante la expresin
constitutiva de una protena RIP de maz en combinacin con una quitinasa de arroz. Sin
embargo, hay que destacar que estas mismas plantas no presentaron resistencia
significativa frente a los hongos Bipolaris oryzae y Magnaporthe grisea (Kim et al, 2003).
Adems, generalmente las protenas de tipo RIP presentan cierto grado de toxicidad, lo que
limita su aplicacin para la obtencin de plantas transgnicas (Jensen et al, 1999).
Las protenas tipo "Knottin" comprenden una familia de protenas pequeas (25-35
aminocidos), cuya estructura tridimensional se caracteriza por una peculiar disposicin de 3
puentes disulfuro, donde uno de ellos atraviesa el crculo formado por los otros 2 (Rees y
Lipscomb, 1982). sta es la caracterstica estructural que agrupa a todas las protenas tipo
"knot", ya que no presentan gran homologa a nivel de secuencia. La primera protena con
estas caractersticas a ser descrita fue aislada de patata, un inhibidor de carboxipeptidasas
(PCI). Las protenas "knottin" tienen varias funciones biolgicas, y aunque todava no se
haya demostrado, parece ser que ejercen su accin por la interaccin con receptores, ya
sean protenas, azcares o lpidos (Skerra, 2000; Gelly et al 2004). Para la protena PAFP
aislada de semillas de Phytolacca americana (Shao et al, 1999), y para 4 protenas de tipo
"Knot" aisladas de plantas de caf (Tam et al, 1999) se ha descrito una actividad
antimicrobiana.
En 1997, Tailor y colaboradores aislaron 4 pptidos de semillas de Impatiens
balsamina, y los denominaron Ib-AMP 1, 2, 3 y 4. Son muy bsicos y tienen 4 residuos de
cistena que forman 2 puentes disulfuro. Estos pptidos, muy relacionados entre si,

38

____

Introduccin

mostraron tener la capacidad de inhibir el crecimiento de diversos hongos y bacterias, no

presentando ninguna toxicidad frente a clulas humanas. Constituyen el grupo de pptidos
antimicrobianos

de

plantas

ms

pequeos

que

se

conoce,

con

una

longitud

de

aproximadamente 20 aminocidos (2-3 kDa) (Tailor et al, 1997; de Lucca y Walsh, 1999).
La caracterizacin molecular de sus cDNAs revel que los 4 pptidos estaban codificados por
un nico trnscrito. Se sintetizan en forma de una protena precursora que se procesa para
dar lugar a los 4 pptidos Ib-AMP (Tailor et al, 1997). El mecanismo de accin de estos
pptidos no se conoce.
En tubrculo de patata se han identificado unos pptidos antimicrobianos que
responden a infeccin, o "snakins". Son pptidos de aproximadamente 7 kDa, muy bsicos
y ricos en cistena. Tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias y hongos
fitopatgenos a bajas concentraciones (10M). Se encuentran tambin en tejidos no
infectados, sugiriendo que pueden representar una defensa constitutiva de la planta (Segura
et al, 1999; Berrocal-Lobo et al, 2002).
Las puroindolinas son otro tipo de protenas antimicrobianas, relacionadas con las
LTPs, por homologa de secuencia, y con las tioninas. Tienen un peso molecular de cerca de
13 kDa, 5 puentes disulfuro estabilizando la estructura de -hlice, y una regin rica en
triptfano. Son protenas exclusivas de la familia Triticeae (Krishnamurthy et al, 2001). Se
encuentran en el endospermo de semillas de trigo, cebada y avena; y as como otras
protenas, son capaces de desestructurar la membrana plasmtica provocando la muerte
celular (Charnet et al, 2003). Por esta caracterstica y por la similitud con otras protenas
antimicrobianas, se ha propuesto que las puroindolinas tambin podran estar participando
en las respuestas de defensa de las plantas. Efectivamente, Dubreil y colaboradores (1998)
mostraron la actividad antifngica de una puroindolina in vitro, y plantas transgnicas de
arroz expresando una puroindolina de trigo resultaron resistentes a la infeccin por los
hongos Magnaporthe grisea y Rhizoctonia solani (Krishnamurthy et al, 2001).
Finalmente,

cabe

mencionar

que

las

plantas

producen

inhibidores

de

poligalacturonidasas (PGIPs), glicoprotenas que se localizan en la pared celular vegetal y

que

inhiben

especficamente

poligalacturonidasas

producidas

por

hongos.

Los

poligalacturanos, componentes estructurales de la pared vegetal, representan una de las

dianas de los hongos fitopatgenos en los primeros estadios de la infeccin. Esta capacidad
de inhibir la actividad de las poligalacturonidasas fngicas hace que se haya propuesto a los
inhibidores de poligalacturonidasas vegetales como componentes de la respuesta de defensa
de las plantas.

39

Introduccin _______________________________________________________
5- Protenas y pptidos con actividad antimicrobiana de origen no vegetal
La inmunidad innata es una de las estrategias de defensa ms antiguas utilizadas por
los organismos multicelulares para combatir la infeccin por patgenos. Esta estrategia
incluye, entre otras respuestas, la produccin de sustancias con actividad antimicrobiana
como son el perxido de hidrgeno, las enzimas hidrolticas, y los pptidos antimicrobianos
(AMPs, de antimicrobial peptides). Estos pptidos antimicrobianos, en general, presentan un
amplio espectro de accin (Thevissen et al, 1997; Theis y Stahl, 2004). La distribucin de
las AMPs entre organismos tan diversos como plantas, vertebrados, insectos, hongos y
bacterias, sugiere que estas protenas tuvieron un papel fundamental en la evolucin, y que
siguen siendo elementos importantes de las respuestas de defensa (Zasloff, 2002). La
diversidad de estas protenas y/o pptidos con actividad antimicrobiana que se han
identificado hasta la fecha es enorme, con ms de 800 representantes (una lista detallada se
puede consultar en http://www.bbcm.univ.trieste.it/tossi/antimic.html). Se agrupan segn
sus

caractersticas

bioqumicas

estructurales

en

dos

grandes

grupos:

las

protenas/pptidos aninicos y los catinicos. El primer grupo es el ms pequeo y

comprende principalmente pptidos aislados de mamferos, como molculas derivadas de
neuropptidos, dipptidos aromticos o protenas que se unen a oxgeno (Marshall y Arenas,
2003). El grupo de las protenas/pptidos catinicos es el ms grande y el mejor
caracterizado, incluyendo pptidos ampliamente distribuidos en los diferentes reinos.
Las protenas/pptidos antimicrobianos catinicos se caracterizan por su capacidad de
adoptar una estructura en forma de hlice- como es el caso por ejemplo de las cecropinas
de insectos. En otros casos, presentan estructuras muy compactas con dominios de hojas-
y varios puentes disulfuro que estabilizan su estructura, como por ejemplo las defensinas de
insectos. En general son pptidos pequeos (< 6kDa) y muy bsicos, presentando carga
positiva a pH fisiolgico. La mayora de los pptidos antimicrobianos estudiados hasta el
momento ejercen su actividad por su interaccin con los fosfolpidos de la membrana a
travs de un mecanismo basado en las cargas, lo que explica su amplio espectro de accin
(Hwang y Vogel, 1998; Thevissen et al, 2004). La diferente composicin de membrana de
las clulas animales y vegetales con respecto a microorganismos explica las diferencias de
susceptibilidad frente a este tipo de protenas antimicrobianas. A diferencia de animales y
plantas, que tienen los lpidos de membrana cargados negativamente orientados hacia el
lado citoplasmtico, las membranas de bacterias y hongos tienen la capa exterior de su
membrana bilipdica formada por lpidos cargados negativamente (Zasloff, 2002).
Actualmente el modelo ms aceptado de interaccin entre los pptidos formadores de
-hlices y las membranas plasmticas de los organismos afectados por ellos es el modelo
SMH (Shai-Matsuzaki-Huang) (fig. 9) (Matsuzaki, 1999; Shai, 1999; Yang, 2000). Este

40

____

Introduccin

modelo propone la interaccin del pptido con la membrana, seguido por un desplazamiento
de lpidos que desestabiliza su estructura y conduce a la formacin de poros en la membrana
y muerte celular por prdida de iones y material citoplasmtico (Sazloff, 2002). El colesterol
presente en la membrana de los mamferos reduce el efecto de estos pptidos ya sea por
una estabilizacin de la membrana o por una interaccin directa con el pptido (Matsuzaki,
1999). En algunos casos el pptido puede entrar en la clula y afectar dianas intracelulares
concretas. En lneas generales, las etapas propuestas en este modelo y que se presentan en
la figura 9 son: 1) los pptidos (cargados positivamente) interaccionan con los fosfolpidos
de las membranas de bacterias y hongos (interacciones electrostticas e hidrofbicas),
adoptando su estructura de -hlice. 2) una vez unidos a la membrana, y dependiendo de
cada pptido, de su concentracin en el medio y de la composicin lipdica de la membrana,
se produce la formacin de poros por uno u otro de los siguientes mecanismos: a) a travs
de la formacin de una estructura de tipo "alfombra" o b) directamente haciendo canales en
la propia estructura de la membrana ("poro-canal"). En el primer caso, los pptidos se unen
a la superficie de la membrana formando una especie de "alfombra", aumentando el grosor
y la tensin en la capa exterior de la bicapa lipdica (fig. 9a). Como consecuencia de esta
tensin la membrana se desestabiliza y desestructura, formando en un primer momento
poros transitorios (poros toroidales) que permiten el transporte de lpidos de la capa exterior
hacia la interior y viceversa. El pptido antimicrobiano en este momento puede penetrar en
la clula para interaccionar con una diana intracelular, si fuera el caso. La presencia de estos
poros transitorios, y posteriormente de poros definitivos lleva a una desestructuracin fsica
de la membrana que culmina con la muerte celular. En el segundo caso, la insercin del
pptido multimerizado en la bicapa lipdica puede dar lugar a la formacin de poros ("porocanal") (fig. 9b). A travs de este poro se pierde el contenido citoplasmtico. Puede
asimismo producirse la entrada de pptido antimicrobiano.

41

Introduccin _______________________________________________________

a)"alfombra

b) "poro-canal"

Figura 9: Mecanismo de accin de los pptidos antimicrobianos con estructura de hlice, segn el modelo SMH. (Adaptado de Zasloff, 2002; Theis y Stahl,
2004).
En general, los pptidos catinicos derivan de precursores ms grandes que
contienen

pptidos

seal,

sufren

modificaciones

postraduccionales

tales

como

procesamiento proteoltico, glicosilaciones y amidaciones, entre otros (Zasloff, 2002). Con

base en sus caractersticas estructurales, se pueden agrupar en tres grandes clases: 1)
pptidos lineales formando estructuras de -hlice, 2) pptidos lineales sin -hlice, ricos en
aminocidos especficos, como prolina, glicina, histidina y triptfano, y 3) pptidos ricos en
cistenas y con 1 o ms puentes disulfuro (tabla 3).

42

____

Introduccin

Tabla 3: Clasificacin de los pptidos antimicrobianos catinicos segn su estructura. Se

citan algunos ejemplos de cada clase (Adaptado de Zasloff, 2002 y Marshall y Arenas,
2003).

Lineales con -hlice

cecropina A
magainina 2
buforinas
Lineales sin -hlice
indolicina
histatina
shepherin I y II
pyrrhocoricin
Ricos en cistenas
1 puente disulfuro
thanatin
brevinina
lanthionin
2 puentes disulfuro
androctonina
tachyplesin
protegrina
3 puentes disulfuro
tioninas
, y defensinas
defensinas
penaeidinas
4 puentes disulfuro
drosomicina
defensinas
Como

muestra

la

Organismo

Actividad antimicrobiana

insectos
anfibios
anfibios

bacterias, hongos, virus

bacterias, protozoos
bacterias, hongos

mamferos
humanos
plantas
insectos

bacterias
bacterias, hongos
bacterias, hongos
bacterias, hongos

insectos
anfibios
bacterias

bacterias, hongos
bacterias
bacttias

artrpodos
crustceos
mamferos

bacterias, hongos
bacterias, hongos, virus
bacterias, hongos, virus

plantas
mamferos
insectos
crustceos

bacterias, hongos
bacterias, hongos
bacterias, hongos, protozoos
bacterias, hongos

insectos
plantas

hongos
bacterias, hongos

tabla

anterior,

existe

una

gran

variedad

de

pptidos

antimicrobianos en los ms diversos organismos. En muchos casos, un organismo produce

varios de estos AMPs al mismo tiempo, muy probablemente con el fin de defenderse de
manera ms efectiva frente al ataque por patgenos.
Aunque est ampliamente aceptado que las protenas y pptidos antimicrobianos
ejercen su actividad a travs de la permeabilizacin de la membrana plasmtica, cada vez
toma ms fuerza la hiptesis de que estas protenas tambin puedan tener dianas
intracelulares (DNA, RNA y protenas). La permeabilizacin de membrana seguida de
internalizacin en la clula permitiran a estas protenas/pptidos antifngicos alcanzar sus
dianas intracelulares (Wu et al, 1999; Xiong et al, 1999; Friedrich et al, 2000; Thomma et
al, 2002). Por ejemplo las apidaecinas, pptidos ricos en prolina y arginina, interaccionan
con la membrana y penetran en las clulas bacterianas. Una vez en el interior de la clula
afectan la sntesis de protenas (Castle et al, 1999). En el caso de algunas defensinas

43

Introduccin _______________________________________________________
aisladas de cebada, se sabe que tienen la capacidad de inhibir la sntesis de protenas tanto
en eucariotas como en procariotas, reforzando la teora de dianas intracelulares para las
defensinas vegetales (Mendez et al, 1996). En cualquier caso, resulta de su interaccin con
la pared/membrana, con dianas intracelulares, o es el resultado de ambas actividades (Theis
y Stahl, 2004).
Se describen a continuacin las caractersticas ms importantes de algunos pptidos
antimicrobianos identificados en insectos, anfibios y humanos.
Las cecropinas de insectos componen una familia de pptidos lineales de 3-4 kDa
con 2 dominios claramente diferenciados en su cadena polipeptdica: un dominio N-terminal
fuertemente bsico con capacidad de formar una -hlice anfiptica, y un dominio Cterminal altamente hidrofbico (Marshall y Arenas, 2003; Bulet y Stocklin, 2005). La primera
cecropina (cecropina A) se aisl a finales de los aos 80 de la hemolinfa de la mariposa
nocturna Hyalophora cecropia (Boman y Hultmark, 1987), y mostr una importante
actividad frente a bacterias (tanto gram-positivas como negativas) y frente a hongos, pero
no frente a clulas eucariotas (a concentraciones de 0,1-5 M) (Sharma et al, 2000). La
estructura

tridimensional

de

estas

protenas

es

fundamental

para

su

actividad

antimicrobiana. La cecropina A ha demostrado ser muy efectiva, a bajas concentraciones,

frente a hongos fitopatgenos de gran importancia (Powell et al, 1995; Cavallarin et al,
1998; Vila et al, 2001). Plantas transgnicas de arroz expresando constitutivamente una
cecropina B mostraron resistencia frente a la bacteria Xanthomonas oryzae pv. oryzae
(Sharma et al, 2000). De la misma forma, la expresin constitutiva de la cecropina A ha
permitido obtener plantas de arroz resistentes al hongo Magnaporthe grisea (Coca et al,
2005).
La melitina es el principal componente del veneno de las abejas. Es un pptido de
26 aa que adopta una conformacin de -hlice anfiptica. Presenta una fuerte actividad
antifngica y antibacteriana, pero tambin es txica frente a clulas de eucariotas superiores
(Hancock y Diamond, 2000), y frente a virus de plantas (Marcos et al, 1995).
La buforina II (21 aa) es un pptido con una fuerte actividad antimicrobiana que
deriva de la buforina I (39 aa), aislado del estmago del sapo asitico Bufo bufo
garagrizans. La buforina II presenta una estructura anfiptica compuesta por 2 hlices
separadas por un residuo de prolina. Comparado con otras protenas antimicrobianas con
estructura de

-hlice, tiene una actividad antimicrobiana ms fuerte y frente a un espectro

ms amplio de patgenos (Park et al, 2000). Se ha visto que este pptido tiene la capacidad
de translocarse hacia el interior de las clulas y que se une fuertemente a molculas de DNA
y RNA (Park et al, 1998). Otro grupo de pptidos con actividades antimicrobianas aislados
de anfibios son las magaininas. Son pptidos de 22-24 aminocidos, y su modo de accin
tambin se basa en la desestructuracin de la membrana de los patgenos. Su actividad

44

____

Introduccin

antimicrobiana se ha utilizado para obtener plantas transgnicas de tabaco resistentes al

ataque de hongos y bacterias (DeGray et al, 2001; Li et al, 2001).
Entre los pptidos lineales no formadores de -hlice, se encuentra la histatina, rica
en residuos de histidina, y que forma parte de la saliva de humanos y primates. Esta
protena es capaz de translocarse al interior de la clula e interaccionar con las mitocondrias
(Helmerhorst et al, 1999).
Adems de los estudios dirigidos a la bsqueda de pptidos antimicrobianos
naturales, se ha trabajado intensamente en el diseo y sntesis de nuevos pptidos
derivados de los pptidos naturales, ms potentes frente a patgenos, y no txicos frente a
clulas de plantas o mamferos. Esto ha permitido la identificacin de pptidos sintticos
con una actividad antimicrobiana ms amplia y efectiva que los pptidos naturales a partir
de los cuales fueron diseados (Marcos et al, 1995; Powell et al, 1995; Cavallarin et al,
1998; Ali y Reddy, 2000). Ello ha venido a ampliar el repertorio de genes antimicrobianos
potencialmente aplicables a la proteccin de plantas. As, plantas transgnicas de tabaco
expresando un gen derivado de la cecropina B mostraron resistencia frente a Pseudomonas
syringae pv. tabaci (Huang et al, 1997). En otro trabajo, se obtuvieron plantas de tabaco
resistentes a hongos mediante expresin inducible de un gen-fusin de los genes cecropina
A y melitina ("CEMA"). El pptido hbrido resultante mostr una fuerte actividad
antimicrobiana, y las plantas transgnicas un alto nivel de proteccin frente a patgenos
(Yevtushenko et al, 2005). Este mismo pptido hbrido se haba utilizado antes para la
obtencin de plantas de patata transgnicas resistentes frente a hongos (Osuky et al, 2000).
En

la

bsqueda

de

nuevos

compuestos

antimicrobianos,

la

qumica

combinatorial

proporciona mtodos eficientes para el anlisis rpido de grandes colecciones de pptidos

(bibliotecas sintticas combinatoriales), siendo sta una manera de identificar una infinidad
de nuevas molculas. Este mtodo se ha utilizado con xito para la identificacin de pptidos
con una gran actividad frente a hongos fitopatgenos (Reed et al, 1997; Lpez-Garca,
2000, 2002, 2003), y tambin para la obtencin de plantas transgnicas resistentes (Cary et
al, 2000).
5.1- Protenas antimicrobianas producidas por microorganismos del suelo
Los hongos micoparsitos del gnero Trichoderma, estn siendo empleados desde
hace tiempo para el control biolgico de algunos patgenos (Rey et al, 2000; Harjono y
Widyastuti, 2001). Se sabe que estos hongos producen enzimas hidrolticas, como endo y
exoquitinasas, -1,3-glucanasas y proteinasas, enzimas que degradan la pared celular de
otros hongos, y que actan de manera sinrgica en el proceso de parasitismo (Lorito el al,
1994, 1996). Trichoderma y otros hongos micoparsitos del suelo pueden representar una

45

Introduccin _______________________________________________________
buena fuente de genes antimicrobianos que pueden ser aplicables a la obtencin de plantas
transgnicas resistentes a enfermedades. En este sentido, se han obtenido ya plantas de
patata y tabaco expresando una quitinasa de Trichoderma resistentes a la infeccin por
hongos (Lorito et al, 1998).
Por otra parte, el hongo del suelo Aspergillus giganteus se sabe que produce y
secreta al espacio extracelular dos protenas mayoritarias en forma de preprotena, la sarcina y la AFP (ver apartado 5.2) (Olson y Goerner, 1965). La -sarcina es una protena
con actividad ribonuclesica de tipo RIP que se internaliza en las clulas diana va
endocitosis y acta hidrolizando una unin fosfodister especfica en la subunidad mayor del
RNA ribosomal (Gasset et al, 1994; Olmo et al, 2001). Como resultado, se afecta la
interaccin entre los factores de elongacin 1 y 2 y se bloquea la sntesis de protenas (Endo
y Wool, 1982; Endo et al, 1983). La -sarcina hidroliza este sitio especfico del ribosoma de
todos los procariotas y eucariotas analizados hasta la fecha, incluso del propio hongo
productor A. giganteus, debido a la gran conservacin de secuencia que presenta la regin
del RNA ribosomal (Martnez-Ruiz et al, 1998; Miller y Bodley, 1988). La -sarcina se
sintetiza en forma de preprotena que se activa por la accin de proteasas en el espacio
extracelular. Ello protege el hongo A. giganteus de su accin txica (Endo et al, 1993).
Adems de su actividad enzimtica hidrolizando el ribosoma, la -sarcina es capaz de
interaccionar con membranas lipdicas promoviendo su fusin y ruptura, siendo capaz
tambin de translocarse al interior de vesculas lipdicas (Gasset et al, 1994; Siemer et al,
2004). Finalmente, la -sarcina es una protena citotxica activa frente a diferentes lneas
tumorales humanas (Turnay et al, 1993), pero no presenta actividades antibacterianas o
antifngicas muy significativas (Olson y Goerner, 1965).
Otra protena producida por el hongo del suelo A. giganteus es la protena AFP (ver
ms adelante, apartado 5.2).
Serratia marcescens, una bacteria gram-negativa del suelo, produce una quitinasa, la
quitinasa A (chiA), enzima responsable de la degradacin de la quitina, principal
componente de la pared celular de muchos hongos. Se han obtenido plantas transgnicas de
tabaco resistentes a R. solani por la expresin de un gen de ChiA (Howie et al, 1994).
Aunque no sean protenas antimicrobianas, sino insecticidas, cabe mencionar las
protenas Cry de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis. Estas protenas (conocidas como
Bt), se han utilizado ampliamente para la obtencin de plantas transgnicas resistentes a
insectos. En un estudio con larvas del insecto Spodoptera littoralis se pudo comprobar el
efecto sinrgico entre la quitinasa ChiA de S. marcescens y la toxina Cry de B. thuringiensis,
donde probablemente la accin de la quitinasa sobre la membrana peritrfica del trato
digestivo de los insectos abra el paso y facilitaba el acceso de la toxina Cry a sus receptores
en las clulas epiteliales (Regev et al, 1996).

46

____

Introduccin

5.2- La protena AFP (Antifungal Protein) de Aspergillus giganteus

La protena AFP es una protena secretada por el hongo del suelo Aspergillus
giganteus, y como ocurre en muchos hongos antagonistas y micoparsitos, se piensa que es
resultado de una adaptacin evolutiva que proporciona ventajas a A. giganteus en su
interaccin con otros hongos competidores de su hbitat. Fue identificada en los aos 60 en
Michigan

(EUA)

durante

un

trabajo

de

bsqueda

de

compuestos

con

actividades

antitumorales (Olson y Goerner, 1965). En 1990 se describi su secuencia aminoacdica y

algunas caractersticas bioqumicas (Nakaya et al, 1990). Se trata de una protena muy
pequea (5,78 kDa), de 51 aminocidos y un gran contenido en residuos de lisina y tirosina,
6 y 12 respectivamente, lo que hace que sea muy bsica, con un punto isoelctrico de
10,65. Posee una estructura muy compacta con 8 residuos de cistena que forman 4 puentes
disulfuro.
El gen que codifica esta protena contiene una pauta abierta de lectura de 282 nt que
codifica una protena precursora, estando interrumpida por dos intrones, de 89 y 56 nt. La
forma precursora de la protena AFP (preprotena de 94 aminocidos), contiene una
secuencia N-terminal o pptido seal de entrada en la va de secrecin, seguida de una prosecuencia (del aa 27 hasta el aa 43) que tras su procesamiento da lugar a la protena AFP
madura de 51 aa. La existencia de esta forma precursora permite mantener a la protena en
su estado inactivo hasta su procesamiento por proteasas extracelulares (Wendt et al, 1994;
Martnez-Ruiz et al, 1997). As, la presencia de la prosecuencia, adems de permitir el
correcto plegamiento de la protena tiene una funcin de autoproteccin para el organismo
productor, A. giganteus, (la protena solamente es activa una vez fuera de la clula) (Marx,
2004). El genoma de Aspergillus giganteus contiene una nica copia del gen afp.
Se han descrito protenas homlogas a la AFP en otros hongos. La protena que
presenta ms homologa con la AFP es una protena sintetizada por el hongo Penicillium
chrysogenum, la protena PAF (P. chrysogenum antifungal protein) (Vollebregt et al, 1994;
Marx et al, 1995, Kaiserer et al, 2003). Al igual que la AFP, tambin se sintetiza en forma de
preproprotena de 92 aminocidos, que se procesa dando lugar a una protena madura de 55
aas. La identidad que se observa entre ambas protenas maduras es del 42,6% (MartnezRuiz et al, 1997). Otra protena con homologa significativa a la AFP, es la protena Anafp,
secretada por el hongo Aspergillus niger, que presenta un 31% de identidad con la AFP (Lee
et al, 1999). Un dato interesante es la presencia de un gen silenciado, idntico al gen afp,
pero sin los 2 intrones, en el hongo Trichoderma viride (Hao et al, 2000). Al ser introducido
en clulas de Escherichia coli, este gen se transcribe correctamente y da lugar a una
protena AFP funcional.

47

Introduccin _______________________________________________________
La estructura tridimensional de la protena se determin por resonancia magntica
nuclear (RMN) (Campos-Olivas et al, 1995). Est compuesta por 5 hojas antiparalelas
estabilizadas por 4 puentes disulfuro, definiendo una estructura muy compacta (fig. 10). La
estructura de la protena AFP es similar a la que presentan las defensinas y tioninas de
plantas (ver apartado 4.1, familias PR12 y 13).

Figura 10: Estructura tridimensional de la protena AFP (en rojo, amarillo, azul y verde
oscuro, las 5 hojas ). (Tomado de Research Collaboratory for Structural
Bioinformatics-ProteinDataBank (RCSB-PDB).
(http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1afp)
Esta estructura tan compacta es probablemente la responsable de que la AFP sea una
protena altamente resistente a la digestin por proteasas (proteasa SV-8, tripsina, pepsina
y termolisina). Esta resistencia a la protelisis es una propiedad importante para una
protena que es secretada al espacio extracelular donde la presencia de enzimas proteolticas
es muy frecuente. Adems, tambin se ha visto que la conformacin de AFP se mantiene
estable a altas temperaturas (manteniendo su funcionalidad hasta 80C), y en condiciones
de pH extremas (pH de 3 a 8) (Campos-Olivas et al, 1995; Lacadena et al, 1995).
La secuencia de aminocidos de la protena AFP presenta una regin catinica
formada por 3 lisinas adyacentes a una regin hidrofbica compuesta por 3 residuos de
tirosina y una valina, ambas en la superficie de la protena. Ello puede representar un sitio
potencial de unin a fosfolpidos, donde la regin catinica se unira a iones fosfato mientras
que la hidrofbica interaccionara con la regin hidrofbica de los fosfolpidos. Para
comprobar esta hiptesis, Lacadena y colaboradores (1995) realizaron experimentos de
unin a vesculas formadas por fosfolpidos cidos de DMSP (dimiristoilfosfatidil-serina). Se
pudo comprobar que la AFP es capaz de interaccionar con estos fosfolpidos y de producir
agregacin de las vesculas. Sin embargo en vesculas compuestas de fosfolpidos neutros, la

48

____

Introduccin

presencia de AFP no produce ningn efecto. Esta observacin sugera que en el proceso de
unin de AFP a fosfolpidos podran estar implicadas interacciones electrostticas.
Por otra parte, la estructura tridimensional de la protena AFP muestra una gran
similitud con los motivos de unin a oligonucletidos y oligosacridos ("OB fold") presentes
en otras protenas, a pesar de la ausencia de una homologa de secuencia significativa a
nivel de la protena entera. Mediante ensayos de interaccin in vitro, se pudo comprobar la
capacidad de AFP de interaccionar con DNAs tales como el DNA de cadena sencilla del
bacterifago F1 o el DNA de timo de ternera, y de provocar la condensacin de los mismos
(Martnez del Pozo et al, 2002).
Se ha demostrado la actividad antifngica de la protena AFP frente a hongos
filamentosos con valores de inhibicin total del crecimiento (valores MIC) en el rango de 6 a
25 M. Frente al hongo Thricoderma harzianum, el valor MIC fue de 127 M, mientras que
frente a otros hongos (p. e. Penicillium frequentans y Aspergillus flavus) esta protena no
mostr ningn efecto antifngico (Lacadena et al, 1995). La AFP no tiene ningn efecto
frente a bacterias y levaduras, ni tampoco sobre el hongo del cual se origina, A. giganteus.
En ensayos con los hongos Penicilliun chrysogenum y Aspergillus niger, productores de las
protenas antifngicas PAF y Anafp respectivamente, la AFP no mostr ningn efecto
antifngico (Lacadena et al, 1995).
Estudios posteriores realizados en nuestro laboratorio mostraron la capacidad de la
protena AFP para inhibir el crecimiento de hongos fitopatgenos, Magnaporthe grisea y
Fusarium

moniliforme,

as

como

del

oomiceto

Phytophtora

infestans,

siendo

las

concentraciones MIC encontradas de 4 M, 100 nM y 10 M, respectivamente (Vila et al,

2001). La aplicacin directa de la protena AFP previamente a la infeccin con esporas de M.
grisea tambin mostr un efecto protector frente a la infeccin en plantas de arroz.
6- Plantas transgnicas resistentes a patgenos
La biotecnologa aplicada a la proteccin de plantas frente a enfermedades representa
una alternativa atractiva para la agricultura, complementando as las tcnicas clsicas de
mejora gentica dirigidas a la obtencin de cultivos resistentes. El desarrollo de plantas
transgnicas puede ser de gran utilidad en el contexto del control de enfermedades,
sobretodo en aquellos casos en los que stas no son eficientemente controladas por los
mtodos tradicionales.
La mayora de los trabajos realizados hasta la fecha con la finalidad de obtener
plantas transgnicas resistentes a hongos patgenos se basa en la utilizacin de promotores
constitutivos para dirigir la expresin de genes antifngicos. Estos promotores han
demostrado ser efectivos en la obtencin de plantas transgnicas con resistencia frente a

49

Introduccin _______________________________________________________
diversos patgenos (Gao et al, 2000; Coca et al, 2004). Sin embargo, la utilizacin de estos
promotores no es la estrategia ms adecuada cuando se trata de plantas destinadas al
consumo humano o animal. En estos casos es deseable que el producto del transgn se
encuentre slo en los tejidos y en los momentos en que se necesita su presencia, esto es, en
los tejidos que se encuentran infectados por el patgeno. El aspecto ms importante a
considerar en el caso de cultivos destinados al consumo humano o animal, es el hecho de
que el producto del transgn no debe acumularse en los rganos de la planta destinados al
consumo. De ah la importancia de la identificacin de promotores capaces de regular la
expresin de un transgn de manera especfica en tejidos concretos (Stuiver y Custers,
2001).
En lo que se refiere a los cereales, existe una clara necesidad de encontrar
promotores con estas caractersticas que sean capaces de dirigir la expresin de transgenes
que confieren a la planta propiedades de resistencia frente a diferentes patgenos pero que
sean inactivos en semilla (Altpeler et al, 2005). En trigo, se han utilizado promotores
constitutivos para la obtencin de plantas resistentes a hongos. Oldach y colaboradores
(2001) obtuvieron plantas bien expresando una quitinasa de classe II de cebada, bien gen
afp de Aspergillus giganteus. En ambos casos las plantas mostraron niveles de resistencia
aumentados entre un 40 y 50% frente a los hongos Erysiphe graminis y Puccinia recondita.
En otro estudio tambin se obtuvieron plantas resistentes, en este caso frente al hongo
Blumeria graminis, por la expresin constitutiva de un gen antifngico de cebada (Bieri et al,
2003). En ambos trabajos el promotor utilizado fue el promotor del gen de la ubiquitina de
maz (promotor constitutivo comnmente utilizado en monocotiledneas). Sin embargo,
poco se ha hecho hasta la fecha con la utilizacin de promotores inducibles o con expresin
especfica de tejido en cereales. Recientemente, Altpeler y colaboradores (2005), han
demostrado que la expresin en trigo de un gen que codifica una peroxidasa bajo control de
un promotor tambin de trigo especfico de epidermis, es efectivo para la proteccin de la
planta frente al hongo Blumeria graminis.
En lo que se refiere a arroz, existen algunos trabajos que describen la obtencin de
plantas resistentes a diferentes patgenos, en todos los casos mediante la utilizacin de
promotores constitutivos. La expresin de dos genes de quitinasa de clase I de arroz
(Nishizawa et al, 1999), o del gen Rir1b (familia WIR1 de genes de cereales relacionados
con la defensa) (Schaffrath et al, 2000), bajo el control del promotor 35S CaMV, han
permitido obtener plantas ms resistentes al hongo M. grisea. Dos genes de puroindolinas
de trigo expresadas en plantas de arroz bajo el control del promotor constitutivo ubiquitina,
confirieron resistencia frente a piriculariosis. Asimismo, plantas transgnicas de arroz que
expresan constitutivamente el gen de una defensina de la planta wasabi, mostraron
resistencia frente a M. grisea (Kanzanki et al, 2002). La expresin bajo el control del

50

____

Introduccin

promotor 35S CaMV de una protena antimicrobiana de la leche humana, la lactoferrina,

confiere resistencia frente a la bacteria Pseudomonas plantarii (Takase et al, 2005). Sin
embargo, no se han obtenido hasta la fecha plantas transgnicas de arroz resistentes a
patgenos mediante la expresin inducible de un transgn.
Para conseguir resistencia en plantas transgnicas frente a hongos patgenos,
adems de utilizarse un promotor adecuado capaz de conferir expresin del transgn en el
momento y lugar correcto y con niveles de expresin suficientemente elevados, hace falta
utilizar el gen antifngico ms apropiado para frenar el desarrollo de la enfermedad.
Tradicionalmente se han utilizado genes de origen vegetal para la obtencin de plantas
transgnicas. Sin embargo, estas estrategias no han resultado del todo satisfactorias. Por
ese motivo, se trabaja intensamente en la identificacin de genes antifngicos que
participan en la respuesta de defensa de otros organismos (Lorito y Scala, 1999; Kawata et
al, 2003). Tal y como se ha comentado en el apartado 5, las protenas antifngicas y
antibacterianas son componentes clave en los mecanismos de defensa de muchos grupos de
hongos y de bacterias, y casi siempre son efectivos frente a un amplio rango de dianas.
Frecuentemente, estos genes muestran una actividad antifngica mucho ms fuerte que los
genes de origen vegetal (Lorito y Scala, 1999). Un ejemplo tpico son las quitinasas. Los
genes que codifican quitinasas vegetales han sido utilizados durante mucho tiempo para
transformar una gran variedad de plantas, pero hasta la fecha no se ha conseguido obtener
ninguna con niveles de resistencia suficientemente elevados o frente al patgeno que se
desea combatir. Cuando se utilizan genes de quitinasas de hongos como transgenes se
obtienen niveles de resistencia ms importantes y frente a un espectro ms amplio de
patgenos, comparado con lo que se observa cuando se utilizan genes de quitinasas
vegetales (Terakawa et al, 1997; Lorito et al, 1998). Estos resultados no son del todo
sorprendentes, ya que las quitinasas de hongos, especialmente de los micoparsitos, han
evolucionado y estn especializadas en degradar la pared celular de otros hongos del
entorno.
El primer ejemplo del empleo de un gen de origen no vegetal para aumentar la
resistencia frente a patgenos se describi en 1988 por Jones y colaboradores. En ese
trabajo expresaron una quitinasa de la bacteria Serratia marcescens, chiA, en plantas de
tabaco, demostrando que la protena se acumulaba correctamente en las hojas. En el mismo
ao, se demostr que plantas de tabaco expresando ese mismo gen presentaban resistencia
frente la infeccin por Alternaria longipes (Suslow et al, 1988). Posteriormente se vio que
estas plantas tambin eran resistentes a Rhizoctonia solani en ensayos de campo (Howie et
al, 1994). Como se ha indicado anteriormente, en plantas de arroz tambin se ha obtenido
un aumento en la resistencia frente a la bacteria Xanthomonas oryzae pv. oryzae por la
expresin constitutiva, bajo el control del promotor 35S CaMV, del gen de la cecropina B del

51

Introduccin _______________________________________________________
insecto Bombyx mori (Sharma et al, 2000). El ejemplo ms conocido y que mejor ilustra las
ventajas de la utilizacin de genes de origen no vegetal para la obtencin de plantas
resistentes, son los genes Bt. As, diferentes genes Bt. provenientes de diferentes
subespecies de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis se han utilizado para obtener
plantas resistentes de variedades comerciales de maz, arroz, patata o algodn. El uso de
genes Bt. ilustra las ventajas de la utilizacin de un gen microbiano para la obtencin de
plantas transgnicas.
Otra forma alternativa de obtener resistencia en plantas transgnicas empleando
genes de origen no vegetal, es a travs de la utilizacin de genes de avirulencia (avr) de
patgenos capaces de activar las respuestas de defensa de las plantas. En interacciones
planta-patgeno que siguen el modelo gen-a-gen (Flor, 1971), la interaccin entre el
producto del gen de avirulencia del patgeno (avr) con el producto del gen de resistencia de
la planta (R) conduce a la resistencia. En base a este sistema, se han expresado genes avr
en plantas que poseen el correspondiente gen R. En estos casos es fundamental evitar la
expresin basal o constitutiva del gen avr. En caso contrario, se producira una respuesta HR
generalizada en toda la planta con la consecuente muerte de la misma. El gen avr debe
expresarse bajo control de un promotor inducible por patgenos, de forma que la respuesta
de defensa se active solamente en el momento de la infeccin. Algunos ejemplos de esta
estrategia son la resistencia en tomate por la expresin del gen Avr9 de Cladosporium
fulvum, y de AvrPto de Pseudomonas syringae (Strittmatter et al, 1996; Tobias et al, 1999);
o en plantas de tabaco por la expresin de los genes inf1 de Phytophtora infestans, y Avr9
de C. fulvum (Kamoun et al, 1999). Estos resultados indican que la utilizacin de genes de
avirulencia de los patgenos puede ser empleada para la obtencin de resistencia en plantas
que poseen el correspondiente gen R. Una estrategia similar es la expresin de genes que
codifiquen un elicitor bacteriano, capaz de activar las respuestas de defensa de la planta.
Siguiendo esta estrategia, se obtuvieron plantas de tabaco resistentes a Phytophtora
parasitica var. nicotianae a travs de la produccin de la protena elicitora cryptogena
(expresado bajo control de un promotor inducible por patgeno) (Keller et al, 1999).
En lo que se refiere al control de las enfermedades causada por el hongo Botrytis
cinerea a travs de la obtencin de plantas transgnicas, poco se ha hecho hasta la fecha.
Punja y Raharjo (1996) introdujeron el gen de una quitinasa bsica de tabaco en plantas de
zanahoria y observaron cierta proteccin frente a la infeccin por B. cinerea. Sin embargo,
en el mismo estudio no se pudo observar ninguna proteccin al introducir este mismo gen
en plantas de pepino. Terakawa y colaboradores (1997) obtuvieron plantas de tabaco
transgnicas resistentes a los hongos Sclerotinia sclerotiorum y Botrytis cinerea. Para ello
expresaron un gen de quitinasa involucrado en la autlisis del hongo filamentoso Rhizopus
oligosporus, bajo el control del promotor constitutivo 35S CaMV. Tabei y colaboradores

52

____

Introduccin

(1998), produjeron plantas de pepino expresando

el gen de una endoquitinasa de arroz

bajo control del promotor constitutivo 35S CaMV obtenindose niveles de resistencia frente a
B. cinerea bastante satisfactorios.
Finalmente, la expresin constitutiva de un inhibidor de poligalacturonidasa de pera
en plantas de tomate, ha permitido obtener plantas resistentes al ataque de B. cinerea,
siendo el primer ejemplo de plantas de tomate transgnicas resistentes a este patgeno
(Powel et al, 2000). En este estudio se pudo demostrar que aunque se produce el
establecimiento inicial de la infeccin por B. cinerea, la expansin de las lesiones se reduce
significativamente tanto en los frutos como en las hojas de las plantas transgnicas.

53

Introduccin _______________________________________________________

54

Objetivos
Las protenas y pptidos antimicrobianos han sido identificados en diferentes
organismos, incluyendo plantas, hongos, bacterias, insectos, invertebrados y vertebrados.
Los mecanismos de accin de estas protenas son tan variados como los organismos de los
cuales provienen, e incluyen la degradacin de polmeros de la pared celular, la formacin
de poros en las membranas, daos a ribosomas e inhibicin de la sntesis de DNA o del ciclo
celular. Estas protenas son efectivas para inhibir el crecimiento de un amplio espectro de
hongos, siendo necesarias concentraciones muy bajas para que sean efectivas (nivel
micromolar). Los genes que codifican protenas antimicrobianas representan por lo tanto una
herramienta de gran utilidad para generar plantas transgnicas resistentes a la infeccin por
hongos. Sin embargo, el mecanismo por el cual muchos de estos compuestos ejercen su
actividad antimicrobiana sigue sin conocerse.
La presente tesis se ha centrado en el estudio de las propiedades antifngicas y
mecanismo de accin de la protena AFP del hongo del suelo Aspergillus giganteus, y en la
evaluacin de la eficacia del gen afp para la proteccin frente a enfermedades en plantas
transgnicas. Los objetivos concretos que se plantearon fueron los siguientes:
I: Determinar si la protena AFP es efectiva para inhibir el crecimiento de hongo Botrytis
cinerea, y en particular de aislados de este hongo responsables de la podredumbre gris en
plantas de geranio.
II: Obtener de plantas transgnicas de arroz resistentes al hongo Magnaporthe grisea
mediante una estrategia basada en la expresin inducible del gen afp de Aspergillus
giganteus.
1)

Identificar un promotor adecuado para el objetivo propuesto, esto es, un promotor

inducible en situaciones de infeccin por M. grisea.

2) Determinar el grado de proteccin que confiere la expresin inducible del gen afp en
plantas transgnicas de arroz.
III: Estudiar del mecanismo por el cual la protena AFP ejerce su actividad antifngica frente
a Magnaporthe grisea.

55

Objetivos__________________________________________________________

56

___

__

Material y Mtodos

I MATERIAL
1- Material Biolgico
1.1 Bacterias
-

Escherichia coli DH5F` (Hanahan, 1983), utilizada para las clonaciones.

Agrobacterium tumefaciens EAH105 (Hood et al, 1993), utilizada para la

transformacin estable de Oryza sativa.

1.2 Hongos
-

Magnaporthe grisea PR9 (CIRAD Montpellier, Francia)

Botrytis cinerea aislados CC1, CC19, CC24 y CC27 (Fundacin Promiva, Madrid)

1.3 Plantas
-

Oryza sativa L. var. japonica Senia (arroz)

Pelargonium hortorum cv. Eclipse RedII (geranio)

1.4 Plsmidos
-

pGEMTeasy (Promega), utilizado para clonar productos de PCR.

pAHC17 (Christensen & Quail, 1996), cedido por el Dr. Emmanuel Guiderdoni
(CIRAD-Montpellier, Francia) formado a partir del esqueleto del plsmido pUC8.
Contiene el promotor del gen de la ubiquitina 1 de maz (1 intrn y 1 exn) y el
terminador del gen de la nopalina sintasa (nos) con una nica diana de clonacin
entre ambos (BamHI).

pBSK (pBluescript). Utilizado para clonaciones.

pCAMBIA 1381Z (CAMBIA, www.cambia.org). Vector para la transformacin de
plantas mediante Agrobacterium tumefaciens. KanR, higromicinaR. Portador del gen
reportero -glucuronidasa (uid A o gus A) y utilizado para el anlisis funcional de
promotores.

pCAMBIA 1300 (CAMBIA). Vector para la transformacin de plantas mediante

Agrobacterium tumefaciens. KanR, higromicinaR.

2- Medios de cultivo
2.1 Bacterias
Medio LB
Triptona

10 g/L

Extracto de levadura

5 g/L

NaCl

10 g/L

pH 7,5 ajustado con NaOH

Agar (para medio slido)

15 g/L

Autoclavar 20 minutos

57

Material y Mtodos___________________________________________________
Medio SOB
Triptona

20 g/L

Extracto de levadura

5 g/L

NaCl

10 mM

KCl

2,5 mM

MgCl2

10 mM

MgSO4

10 mM

Autoclavar 20 minutos
Medio YEB
Beef extract

5 g/L

Extracto de levadura

1 g/L

Peptona

5 g/L

Sacarosa

5 g/L

MgSO4

0,48 g/L

Agar (para medio slido)

15 g/L

Autoclavar 20 minutos
2.2 Hongos
Medio PDB
Potato dextrose broth (PDB) (Difco)

24 g/L

Agar (para medio slido)

15 g/L

Autoclavar 40 minutos
Cloramfenicol

30 mg/L

Medio de arroz
Granos de arroz (var. Senia) triturados

20 g/L

Extracto de levadura

2,5 g/L

Agar (para medio slido)

15 g/L

Autoclavar 40 minutos
Cloramfenicol

30 mg/L

2.3 Plantas
Medio Agar+Kinetina
Agar

1%

Autoclavar 20 minutos
Kinetina

1 mL/L (de una solucin a 2 mg/mL en etanol 50%)

58

___

__

Material y Mtodos

Medio MS (Murashige & Skoog, 1962)

NH4NO3

1650 mg/L

KCl

170 mg/l

KNO3

1900 mg/L

CaCl2, 2H2O

440 mg/L

MgSO4, 7H2O

370 mg/L

MnSO4, 4H2O

6,2 mg/L

H3BO3

22,3 mg/L

Kl

0,83 mg/L

Na2MoO4, 2H2O

0,25 mg/L

CuSO4, 5H2O

0,025 mg/L

CoCl2, 6H2O

0,025 mg/L

cido nicotnico

0,5 mg/L

Piridoxina HCl

0,5 mg/L

Tiamina HCl

0,1 mg/L

Mio-inositol

100 mg/L

Glicina

2 mg/L

Medio para germinacin de arroz in vitro

MS (sales y vitaminas, marca Duchefa)

4,4 g/L

sacarosa

10 g/L

pH 5,8 ajustado con NaOH

agar (marca Difco)

8 g/L

Autoclavar 20 minutos
Sustrato para cultivo de arroz
Se hace una mezcla de turba rubia de sphagnum pH 3,5 (materia orgnica = 96%;
nitrgeno total = 1%; marca Torficosa Plantaflor) y de vermiculita a 1:1. Por cada kilo se
aade 1 gramo de CaCO3 y 1 gramo de abono 15-15-15*. Esta mezcla se humedece y se
deja reposar 1 semana. Despus de ese tiempo se puede usar. No se debe autoclavar.
* Nitrgeno total (ntrico, amoniacal y ureico), 15%
Anhdrido fosfrico (P2O5), 15%
Oxido de potasio (K2O), 15%
Solucin nutritiva para fertirrigacin de arroz
KNO3

8,4 mM

NH4NO3

1,2 mM

59

Material y Mtodos___________________________________________________
K2HPO4

1,2 mM

KH2PO4

3,6 mM

Ca(NO3)2, 4H2O

2,5 mM

MgSO4, 7H2O

0,7 mM

SO4Fe, 7H2O

0,6 mM

Kelamix (quelato de hierro: Fe-EDDHA)

35 mg/L

microelementos*

0,4 g/L

*B

0,005%

Cu

0,001%

Fe

0,012%

Zn

0,004%

Mo

0,005%

Mn

0,005%

Quelados por EDTA

3- Tampones y soluciones
TE
Tris-HCl pH 8,0

50 mM

EDTA

5 mM

Guardar a temperatura ambiente

SSC 20X
NaCl

3M

Citrato trisdico

0,3 M

Guardar a temperatura ambiente pH=7,0

SSPE 20X
NaCl

3,6 M

NaH2PO4

0,2 M

EDTA

20 mM

Autoclavar y guardar a temperatura ambiente pH=7,4

TBE 10X
Tris-HCl

0,089 M

cido brico

0,089 M

EDTA

0,002 M

Guardar a temperatura ambiente

60

___
MEN 10X
MOPS

200 mM

Acetato sdico

50 mM

EDTA

10 mM

Guardar a 4C. pH=7,0

Denhardts 100X
Ficoll

20 g/L

Polivinilpirrolidona (PVP)

20 g/L

BSA

20 g/L

Guardar a -20C
Solucin desnaturalizante
NaOH

0,5 M

NaCl

1,5 M

Guardar a temperatura ambiente

Solucin neutralizante
Tris-HCl

0,5 M

NaCl

1,5 M

pH 8,0 ajustado con HCl 25 %

Guardar a temperatura ambiente
Tampn de carga para DNA 6X
Glicerol

30 %

Azul de bromofenol

0,25 %

Xileno cianol FF

0,25 %

EDTA

0,5 M pH 8,0

Guardar a -20C
Tampn de carga para RNA 2X
Tampn de carga para DNA 6X

20 %

Formamida desionizada

50 %

Formaldehdo

6,4 %

MEN 10X

10 %

Bromuro de etidio

200 g

Guardar a -80C

61

__

Material y Mtodos

Material y Mtodos___________________________________________________
RNAsa
Tris-HCl

10 mM

NaCl

15 mM

Ribonucleasa A

10 mg/mL

Calentar a 65C durante 15 minutos antes de guardar a -20C

II MTODOS
Las tcnicas de manipulacin y anlisis de cidos nucleicos se han realizado siguiendo
los manuales Molecular Cloning: A laboratory manual (Sambrook et al, 1989), y Current
Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, 1998). Los mtodos que se describen a
continuacin corresponden a tcnicas puestas a punto en el transcurso de este trabajo, o
bien que han sido fundamentales para la obtencin de los resultados presentados.
1- Relacionados con bacterias y cidos nucleicos
1.1 Preparacin de clulas competentes de Escherichia coli
- se inocula en 5 mL de medio LB una colonia de E. coli de la cepa DH5
- se incuba durante 16h a 37C con una agitacin orbital constante de 250 rpm
- se pasan 2,5mL de este cultivo a otro erlenmeyer (de 1 L) con 250 mL de medio LB
- se incuba en agitacin a 37C hasta que el cultivo alcance una D.O. de 0,5 a 600 nm
- se enfria el cultivo en hielo durante 15 minutos
- se transfiere el cultivo a tubos de centrfuga previamente enfriados en hielo
- se centrfuga durante 10 minutos a 4C y a 4000 rpm (anular el freno de la centrfuga para
que la parada no sea brusca)
- se descarta el sobrenadante y se resuspende el precipitado, por pipeteado suave, en 50
mL de solucin TFB1, previamente enfriada a 4C
- se transfiere a otro tubo de centrfuga y se incuba 10 minutos en hielo
- se centrfuga nuevamente durante 10 minutos a 4C y a 4000 rpm
- se descarta el sobrenadante y se resuspenden las clulas por pipeteado suave en 5 mL de
solucin TFB2, previamente enfriada a 4C
- se hacen alcuotas de 100 L de clulas en tubos eppendorf y se congela inmediatamente
en N2 lquido
- se guardan las clulas a -80C
Solucin TFB1*
KOAc

30 mM

MnCl2, 4H2O

50 mM

CaCl2, 2H2O

10 mM

62

___
RbCl

100 mM

glicerol

15%

__

Material y Mtodos

Solucin TFB2*
MOPS pH 7,0 con NaOH

10 mM

CaCl2, 2H2O

75 mM

RbCl

10 mM

glicerol

15%

* esterilizar por filtracin

1.2 Transformacin de clulas competentes de E. coli
- se aade 1 g de DNA plasmdico o la reaccin de ligacin de DNA a una alcuota de 100 L
clulas competentes
- se congela inmediatamente en N2 lquido
- se incuba el tubo en bao-mara a 37C durante 5 minutos
- se aade 1 mL de medio SOB y se incuba en agitacin durante 1 hora a 37C
- se centrfuga durante 60 segundos a 13000 rpm, se descarta el sobrenadante y se
resuspenden las clulas en 100 L de medio SOB
- se siembran las clulas en placa de Petri con medio LB slido con los antibiticos
adecuados para la seleccin de la cepa bacteriana y de los plsmidos utilizados
1.3 Extraccin de DNA plasmdico de E. coli a gran escala
Para la obtencin de DNA plasmdico de E. coli a gran escala se utiliz el kit para
midipreparaciones de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Partiendo de un
cultivo bacteriano de 200 mL, el rendimiento fue de 200-300 g de DNA plasmdico (para
plsmidos derivados del vector pBSK).
1.4 Extraccin de DNA plasmdico de E. coli a pequea escala (mini prep)
- se inocula en 4 mL de medio LB una colonia de bacteria y se incuba durante 16h a 37C
con agitacin orbital constante de 250 rpm
- se centrfugan 1,5 mL del cultivo, 2 minutos a 13000 rpm
- se descarta el sobrenadante y se repite el paso anterior
- se resuspende en 200 L de solucin I
- se aaden 200 L de solucin II y se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos (el
lquido se pone transparente)
- se aaden 200 L de solucin III y se mezcla (el lquido se pone viscoso)
- se centrfuga durante 10 minutos a 13000 rpm

63

Material y Mtodos___________________________________________________
- se pasa el sobrenadante a otro tubo
- se centrfuga durante 5 minutos a 13000 rpm
- se pasa el sobrenadante a otro tubo
- se aade 0,7% del volumen de isopropanol y se centrfuga durante 10 minutos a 13000
rpm
- se descarta el sobrenadante
- se aaden 300 L de etanol 70% para lavar el precipitado
- se centrfuga durante 5 minutos a 13000 rpm
- se descarta el sobrenadante y se seca el precipitado a temperatura ambiente
- se resuspende en 40 L de agua MilliQ autoclavada
- se aaden 2 L de RNAsa (10 mg/mL) y se incuba a 37C durante 15 minutos
- se guarda a -20C
Solucin I:
glucosa

50 mM

EDTA

10 mM

Tris-HCl pH 8,0

25 mM

Ajustar el pH a 8,0 con HCl. Autoclavar 15 minutos y mantener a 4C.

Solucin II:
NaOH

0,2 N

SDS

1%

Guardar a temperatura ambiente

Solucin III:
Acetato potsico

3M

cido actico glacial

5M

No autoclavar y mantener a 4C.

1.5 Preparacin de clulas competentes de Agrobacterium tumefaciens
- se inocula a partir de colonia o glicerinado la cepa de Agrobacterium tumefaciens que ser
utilizada, en 5 mL de medio YEB y se incuba durante 16h a 28C con una agitacin orbital
constante de 250 rpm
- se pasa 2 mL del cultivo anterior a un erlenmeyer con 50 mL de medio YEB y se incuba a
28C con una agitacin orbital constante de 250 rpm hasta que la D.O. a 600 nm sea de
0,5-1,0
- se enfria el cultivo en hielo

64

___

__

Material y Mtodos

- se centrfuga durante 5 minutos a 4500 rpm y a 4 C

- se descarta el sobrenadante y se resuspenden las clulas en 1 mL de CaCl2 20 mM enfriado
en hielo.
- se preparan alcuotas de 100 L de clulas competentes y se guardan a -80 C
1.6 Transformacin de clulas competentes de A. tumefaciens
- se aade 1 g de DNA plasmdico a una alcuota de clulas competentes
- se congela inmediatamente en N2 lquido
- se incuba en bao-mara a 37 C durante 5 minutos
- se aade 1mL de medio YEB y se incuba en agitacin durante 2-4 horas a 28 C
- se centrfuga durante 30 segundos a 11000 rpm, se descarta el sobrenadante y se
resuspenden las clulas en 100 L de medio YEB
- se siembran las clulas en placa de Petri con medio YEB slido y los antibiticos adecuados
para la seleccin de la cepa bacteriana y de los plsmidos utilizados
1.7 Extraccin de DNA plasmdico de A. tumefaciens a pequea escala
- se inocula en 4 mL de medio YEB una colonia de bacteria y se incuba durante 16h a
28C con una agitacin orbital constante de 250 rpm
- se centrfugan 1,5 mL del cultivo durante 1 minuto a 13000 rpm
- se descarta el sobrenadante y se repite el paso anterior
- se aade 1mL de tampn STE y se agita vigorosamente
- se centrfuga durante 1 minuto a 13000 rpm
- se descarta el sobrenadante y se sigue como en la extraccin de DNA plasmdico de E. coli
a partir de la solucin I (apartado 1.4)
Tampn STE:
NaCl

150 mM

Tris-HCl pH 8,0

10 mM

EDTA pH 8,0

1 mM

Nota: Se recomienda hacer una extraccin con fenol/cloroformo (Sambrook et al, 1989) una
vez finalizado el protocolo.
1.8 Extraccin de DNA genmico de Oryza sativa y Magnaporthe grisea
Este mtodo permite la extraccin rpida de grandes cantidades de DNA genmico.
Se ha de tener en cuenta que todos los pasos se deben realizar suavemente y que el DNA
genmico se debe guardar a 4C (y no a -20C) para evitar su fragmentacin.

65

Material y Mtodos___________________________________________________
- se tritura aproximadamente 1 gramo de material congelado en N2 lquido y pasarlo a un
tubo de polipropileno de 15 mL
- se aaden 5 mL de tampn de extraccin MATAB precalentado a 74C
- se agita vigorosamente
- se incuba en bao-mara a 74C de 20 minutos a 1hora, agitando de vez en cuando
- se enfria a temperatura ambiente, se aaden 6 mL de cloroformo/alcohol isoamlico (24:1
VV) y se mezcla las 2 fases suavemente
- se centrfuga durante 20 minutos a 4000 rpm y se transfiere el sobrenadante a un tubo
limpio
- se aaden 15 L de RNAsa (10 mg/mL) y se incuba a 37C durante 30 minutos
- se aaden 6 mL ms de cloroformo/alcohol isoamlico (24:1 VV) y se mezclan las 2 fases
suavemente
- se centrfuga durante 20 minutos a 4000 rpm y se transfiere el sobrenadante a un tubo
limpio, de 50 mL
- se aaden 5 mL de isopropanol a temperatura ambiente y se invierte el tubo suavemente
para precipitar el DNA, que se visualiza en forma de un agregado algodonoso de color
blanco.
- con la ayuda de una pipeta Pasteur se transfiere el DNA a un tubo eppendorf con 300 L
de agua autoclavada para que se resuspenda, y se guarda a 4C
- se comprueba la calidad del DNA en un gel de agarosa. Se cuantifica mediante
espectrofotometra a una longitud de onda de 260 nm (1 OD260nm=50 g de DNA). La pureza
del DNA se puede estimar mediante el clculo de la relacin de absorbancias a 260 y 280
nm. El valor considerado ideal est entre OD260/OD280 = 1,8 - 2,0.
Tampn de extraccin MATAB
Tris-HCL pH 8,0

100 mM

NaCl

1,4 M

EDTA

20 mM

MATAB*

2%

PEG 6000

1%

Sulfito sdico

0,5%

* Mixed alkyltrimethylammonium bromide (Sigma)

1.9 Extraccin de RNA total de Oryza sativa
La extraccin de RNA es un proceso delicado que requiere mucho cuidado para evitar
su degradacin. Todo el material utilizado debe ser cuidadosamente lavado con detergente y
aclarado con agua MilliQ autoclavada libre de RNAsas.

66

___

__

Material y Mtodos

- se tritura el tejido vegetal congelado en N2 lquido y se llenan aproximadamente 2/3 partes

de un tubo eppendorf
- se aaden 200 L de tampn Z6 a temperatura ambiente y 20 L de -mercaptoetanol
- se mezcla vigorosamente en un vrtex
- se aaden 200 L ms de tampn Z6 y se vuelve a mezclar
- se aaden 400 L de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1 VVV) y se agita
vigorosamente
- se centrfuga durante 30-45 minutos a 13000 rpm preferentemente a 4C
- se pasa el sobrenadante a un tubo nuevo
- se aade 1/10 del volumen de cido actico 1 M y 1 volumen de etanol absoluto, en este
orden
- se mezcla vigorosamente y se precipita el RNA (20 minutos a -80C o toda la noche a 20C)
- se centrfuga durante 10 minutos a 13000 rpm y se descarta el sobrenadante
- se lava el precipitado con 300 L de etanol 70% fro, centrfugando 5 minutos a 13000 rpm
- se descarta el sobrenadante y se lava el precipitado, como indicado arriba, con 200 L de
acetato sdico 3 M para eliminar los polisacridos
- se repite el lavado con etanol 70% 2 veces ms
- se descarta el sobrenadante y se seca el precipitado a temperatura ambiente
- se resuspende en 50 L de agua autoclavada
- se agita durante 15-20 minutos
- se calienta a 65C durante 5 minutos
- se centrfuga 2 minutos a 13000 rpm y se pasa el sobrenadante a un tubo nuevo
- se guarda el RNA a -80C
- se comprueba la calidad del RNA en un gel de desnaturalizante de formaldehdo (ver
apartado 1.13.1). Se cuantifica mediante espectrofotometra a una longitud de onda de 260
nm (1OD260nm=40g de RNA). La pureza del RNA se puede estimar mediante el clculo de la
relacin de absorbancias a 260 y 280 nm. El valor considerado ideal est entre OD260/OD280
= 1,8 - 2,0.
Tampn Z6
Guanidin-HCl

8M

MES pH 7,0 *

20 mM

EDTA

20 mM

* ajustar el pH con KOH 10 N

67

Material y Mtodos___________________________________________________
1.10 Purificacin de DNA a partir de geles de agarosa
Para la purificacin de DNA a partir de geles de agarosa se utiliz el kit comercial
GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences) siguiendo las
instrucciones del fabricante. La cuantificacin se hizo visualmente en geles de agarosa por
comparacin con patrones de DNA de concentraciones conocidas.
1.11 Reacciones de modificacin de DNA: digestin, defosforilacin y ligacin
En este trabajo se realizaron reacciones de digestin de DNA con endonucleasas de
restriccin, defosforilaciones y ligaciones, siempre siguiendo los protocolos descritos por
Ausubel et al. (1998) y Sambrook et al. (1989), y teniendo en cuenta las recomendaciones
de los fabricantes para cada uno de los enzimas utilizados.
1.12 Transferencia de DNA (Southern Blot) e hibridacin con sondas radioactivas
1.12.1 Transferencia de DNA a membrana de nylon
- se separan electroforticamente las muestras de DNA por analizar en un gel de agarosa
0,8% preparado con tampn TBE 1X, 10 g de DNA genmico digerido con los enzimas
adecuados, con un voltaje constante de 70 voltios durante aproximadamente 7 horas
- antes de empezar el tratamiento del gel para la transferencia, se hace una foto con una
regla al lado del marcador de peso molecular para posteriormente inferir el tamao de los
fragmentos hibridados
- se realiza un tratamiento del gel (siempre con agitacin suave):
- 20 minutos en HCl 25N
- 30 minutos en solucin desnaturalizante
- 15 minutos en solucin neutralizante
- se lava con agua autoclavada
- se monta el sistema de transferencia siguiendo este orden:
- en una bandeja de vidrio se pone solucin de SSC 10X
- sobre la bandeja se pone una placa de vidrio y sobre sta un trozo de papel 3MM de
manera que est en contacto con el SSC de la bandeja por los 2 lados (puente)
- sobre este puente completamente empapado de SSC 10X se pone el gel
- sobre el gel, se pone en el siguiente orden:
- membrana de nylon Hybond-N (Amersham) previamente mojada en agua
(no se puede secar), con cuidado para que no queden burbujas de aire entre
el gel y la membrana
- 5 hojas de papel 3MM *
- una pila de aproximadamente 10 cm de papel de filtro *
- una placa de vidrio

68

___

__

Material y Mtodos

- un peso de aproximadamente 250 gramos

* los papeles sobre el gel no deben tocar el puente
- se deja la transferencia por aproximadamente 18 horas
- se retiran todos los papeles, y con un lpiz se marca sobre la membrana, antes de retirarla
del gel, los pocillos y la orientacin en que estaba puesta
- se fijar la membrana durante 5 minutos con luz ultravioleta, y despus por 2 horas a 80C
- despus de fijado el DNA en la membrana, sta se puede guardar a temperatura ambiente
hasta su utilizacin
1.12.2 Marcaje y purificacin de sondas radioactivas
Para el marcaje radioactivo del fragmento a ser utilizado como sonda, se utiliz el
Random Primed DNA Labeling Kit (ROCHE), que se basa en la utilizacin de oligonucletidos
de 100-200 pb de secuencias aleatorias, y del enzima Klenow DNA polimerasa.
- a 2 L del DNA sonda (entre 50 y 100 ng) se aaden 10 L de agua, se desnaturaliza a
100C durante 10 minutos e inmediatamente despus se pone en hielo
- se aade 1 L de cada nucletido no marcado, 2 L del nucletido marcado
radioactivamente (-32P dCTP en este trabajo), 2 L de la mezcla de oligonucletidos y 1 L
del enzima Klenow
- se incuba durante 1 hora a 37C y se procede a la purificacin de la sonda
La

purificacin

se

realiza

para

eliminar

los

oligonucletidos

radioactivos

no

incorporados a los fragmentos sintetizados en la reaccin de marcaje. Para la purificacin se

utilizaron las columnas Probe Quant G-50 Micro Columns (Amersham Pharmacia),
siguiendo las instrucciones del fabricante.
1.12.3 Hibridacin
- Prehibridacin:
- se coloca la membrana en el tubo de hibridacin con 20 mL de solucin de
prehibridacin
- se prehibrida durante al menos 5 horas a 65C con constante rotacin del tubo
- Hibridacin:
- de desnaturaliza la sonda previamente marcada con radioactividad durante 10
minutos a 100C
- se aade la sonda a 10 mL de solucin de hibridacin y se sustituye la solucin de
prehibridacin
- se hibrida durante 16 horas a 65C y con rotacin constante
- Lavados:

69

Material y Mtodos___________________________________________________
Los lavados se hacen para eliminar interacciones inespecficas en la membrana.
Todos se hacen a 65C con rotacin constante.
- 1 lavado de 10 minutos en la solucin 1
- 2 lavados de 30 minutos en la solucin 2
- 2 lavados de 30 minutos en la solucin 3
- Exposicin:
Despus de los lavados de la membrana, se coloca dentro de un plstico sellado, y se
expone dentro de un casete con un film de autoradiografia (Kodak X-OMAT AR Film, XAR-5)
a -80C durante el tiempo necesario.
Solucin de prehibridacin e hibridacin*
Tris-HCl pH 8,0

50 mM

EDTA pH 8,0

10 mM

SSC

5X

SDS

0,2 %

sol. Denhardts

1X

DNA de esperma de salmn desnaturalizado

0,1 mg/mL

* para la solucin de hibridacin se aade 10 % de sulfato de dextrano y la sonda marcada

radioactivamente previamente desnaturalizada por 10 minutos a 100C
Soluciones de lavado
Solucin 1
SSC

2X

SDS

0,5 %

Solucin 2
SSC

0,5 X

SDS

0,1 %

Solucin 3
SSC

0,1 X

SDS

0,1 %

1.13 Transferencia de RNA (Northern Blot) e hibridacin con sondas radioactivas

1.13.1 Electroforesis en gel desnaturalizante de RNA
Despus de la extraccin del RNA total del tejido de inters, en este caso hojas de
arroz, se procede a su cuantificacin por espectrofotometra.
Una vez cuantificadas, las muestras se preparan para cargar en el gel de la siguiente
manera:

70

___

__

Material y Mtodos

- se aade a cada muestra, llevadas al mismo volumen con agua autoclavada, el

mismo volumen de tampn de carga para RNA 2X y se desnaturalizan por 5 minutos a 65C.
- se cargan las muestras en un gel desnaturalizante de formaldehdo y se aplica un
voltaje constante de 80 voltios durante aproximadamente 4 horas
- una vez terminada la electroforesis, se lava el gel con agua MilliQ autoclavada antes
de transferir a la membrana de nylon.
Gel desnaturalizante de formaldehdo
MOPS

1X

Agarosa

1,5 g/100mL

Se calienta en el microondas hasta que la agarosa quede bien disuelta. Se enfria

hasta 60C y se aade el formaldehdo, hasta que est a una concentracin final de 6,3%
1.13.2 Transferencia de RNA a membrana de nylon
La transferencia de RNA a la membrana de nylon y la posterior fijacin se hacen
exactamente como descrito anteriormente para la transferencia de DNA (Southern Blot)
(apartado 1.12.1).
1.13.3 Marcaje y purificacin de sondas radioactivas
El marcaje y la purificacin de la sonda radioactiva se hacen exactamente como
descrito para el Southern blot (apartado 1.12.2).
1.13.4 Hibridacin
- Prehibridacin:
- se introduce la membrana en el tubo de hibridacin con 20 mL de solucin de
prehibridacin
- se prehibrida durante al menos 5 horas a 42C con constante rotacin del tubo
- Hibridacin:
- se desnaturaliza la sonda previamente marcada durante 10 minutos a 100C
- se aade la sonda a 10 mL de solucin de hibridacin y se sustituye la solucin de
prehibridacin
- se hibrida durante 16 horas a 42C y con rotacin constante
- Lavados:
Los lavados se hacen con rotacin constante, inicialmente a 42C y posteriormente a
65C. En general se hacen 3 lavados de 30 minutos a 42C y 1 lavado a 65C tambin de 30
minutos.

71

Material y Mtodos___________________________________________________
- Exposicin:
Despus de los lavados de la membrana, se coloca dentro de un plstico sellado, y se
expone dentro de un casete con un film de autoradiografia (Kodak X-OMAT AR Film, XAR-5)
a -80C durante el tiempo necesario.
Solucin de prehibridacin e hibridacin*
Formamida

40%

SSPE

5X

SDS

0,5%

Denhardts

5X

DNA de esperma de salmn

0,1 mg/mL

* para la solucin de hibridacin se aade la sonda marcada radioactivamente previamente

desnaturalizada por 10 minutos a 100C
Solucin de lavado
SSC

3X

SDS

0,5%

2 Anlisis histoqumico de la actividad -glucuronidasa (gusA)

El enzima -glucuronidasa, o GUS, codificado por el gen uidA, hidroliza el sustrato 5bromo-4-cloro-3-indol -D-glucuronido (X-GLUC) en un compuesto que forma cristales
azules, el diXH-indigo. A travs de la observacin de esta coloracin azul podemos decir si
este gen se est expresando en un determinado tejido o en una determinada condicin, y de
esta manera estudiar la actividad de un promotor concreto. Se sigui el protocolo descrito
por Jefferson et al (1987). Se analizaron muestras de tejido vegetal en diferentes
condiciones que se enumeran a continuacin, siempre en plantas en un estado de 2 hojas.
Tallo:
- se cortan fragmentos de tallo de aproximadamente 1,5 cm de longitud y se procesan (ver
apartado 2.1).
Raz:
a) se seccionan fragmentos de raz y se procesan (T=0h)
b) en otra raz de la planta se realizan cortes longitudinales con un bistur y se dejan sobre
papel embebido en agua durante 2h antes del procesamiento (T=2h)
Semillas:
a) se decortican manualmente las semillas y se procesan

72

___

__

Material y Mtodos

b) se decortican manualmente las semillas, se hace un corte longitudinal con un bistur y

se procesan
c) se decortican las semillas con la utilizacin de papel abrasivo y se procesan
Hojas:
a) control: se seccionan fragmentos de cerca de 1cm de longitud de la segunda hoja de
plantas sin tratar, eliminando siempre la extremidad.
b) tratadas con esporas o elicitores de M. grisea:
- se corta la segunda hoja de una planta cultivada en invernadero y se coloca en posicin
invertida con la cutcula en la parte inferior (abaxial) con la ayuda de pinzas en una placa
con medio agar+kinetina, con cuidado para no daar la hoja
- con pinzas se colocan sobre cada hoja de 4 a 6 discos de papel de filtro embebidos en la
solucin de inters (esporas o elicitores de M. grisea a la concentracin deseada). La
preparacin de los elicitores se realiza tal y como se describe en el apartado 4.8.
- se sellan las placas con parafilm, se ponen en bandejas de plstico con el fondo cubierto
con papel de filtro humedecido. Se envuelve toda la bandeja con plstico transparente para
que se forme una cmara hmeda. Esta bandeja ahora se mantiene en oscuridad a 28C
durante 48h
- despus de este periodo, se abre la cmara hmeda, las placas, y se retiran los discos
con la ayuda de pinzas. Se continua el tratamiento ahora en condiciones de fotoperiodo
controlado (12h luz/12h oscuridad), a 28C durante el perodo de tiempo necesario.
c) heridas
- se corta un fragmento de hoja de aproximadamente 1,5 cm y se procesa (control)
- con un bistur se hacen cortes transversales al eje de la hoja en un fragmento de
aproximadamente 1,5 cm y se procesa (T=0h)
- se repite el procedimiento anterior, pero el procesamiento de la muestra se hace 6h
despus de haber hecho los cortes (T=6h)
d) cintica de induccin por herida
- se corta un fragmento de hoja de aproximadamente 1,5 cm y se procesa (control)
- con un bistur se hacen cortes transversales al eje de la hoja en un fragmento de
aproximadamente 1,5 cm y se procesa (T=0h)
- se hacen cortes transversales con un bistur a lo largo de toda la lmina foliar, se recogen
muestras de cerca de 1,5 cm a diferentes tiempos, y se procesan

73

Material y Mtodos___________________________________________________
2.1 Protocolo de procesamiento del material vegetal para deteccin de la
actividad de la -glucuronidasa
- se sumerge la muestra en solucin X-GLUC
- se aplica vaco durante 20 minutos para que el sustrato pueda penetrar en el tejido
- se incuba la muestra a 37C en oscuridad durante aproximadamente 18h
- despus de ese tiempo, se sustituye la solucin X-GLUC por etanol 70%
- el material se conserva as a 4C
Solucin X-GLUC (para 10 mL)
tampn P

8 mL

metanol 100%

2 mL

X-GLUC*

1 M

* 10 mg X-GLUC en 100 L de DMSO

Tampn P* (para 10mL):
NaH2PO4-H2O (100mM)

1 mL

Na2HPO4-2H2O (100mM)

4 mL

H2O

5 mL

*concentracin final de 50 M y pH 7,0

3- Obtencin de la protena AFP de Aspergillus giganteus
La protena AFP utilizada en este trabajo nos fue cedida por el Dr. lvaro Martnez del
Pozo, de la Universidad Complutense de Madrid. Para su expresin y purificacin se utiliz el
protocolo descrito por Lacadena y colaboradores (1995). En lneas generales, se cultiva el
hongo en erlenmeyers de 1L conteniendo 250 mL de un medio compuesto de 2% de almidn
de maz, 1,5% de beef extract, 2% de peptona y 0,5% de NaCl. El cultivo se incuba con
agitacin y a 30C durante 90-100 horas. La purificacin se hace en una columna de
Sephadex G25 (1,5 x 34,0 cm) equilibrada con 0,1M de cido actico. La comprobacin de la
purificacin se hace por gel SDS-PAGE, anlisis de aminocidos, y HPLC.
4- Estudios con hongos
4.1 Obtencin de esporas de los hongos Magnaporthe grisea y Botrytis cinerea
- todo el procedimiento se realiza en condiciones de esterilidad bajo campana de flujo
laminar
- se crece el hongo en una placa de Petri con el medio adecuado (medio de arroz para M.
grisea y PDB para B. cinerea). En el caso de B. cinerea, se hace inoculando un trozo de
micelio proveniente de una placa previamente cultivada. Para M. grisea, se parte de un

74

___

__

Material y Mtodos

pequeo trozo de papel de filtro en el que se ha crecido previamente el hongo. Para la

preparacin de ste, se hace crecer el hongo en un papel de filtro puesto sobre una placa
con medio de arroz. Una vez el micelio ha ocupado todo el filtro, se retira del medio y se
pone a secar dentro de una placa de Petri vaca a 37C durante 7 das. Cuando el filtro est
seco, se corta en trocitos pequeos con unas tijeras previamente esterilizadas y se guarda a
-20C.
- se incuban las placas con los inculos a 28C y un fotoperiodo de 12h de luz/12h de
oscuridad durante 2 semanas. Es importante no sobrepasar este tiempo, principalmente en
el caso de M. grisea, ya que esto influye negativamente en la viabilidad de las esporas.
- una vez el micelio ha crecido, se aaden 5 mL de agua estril a la placa y se pasa
suavemente un asa de vidrio previamente esterilizada para desprender las esporas del
micelio.
- se recoge la suspencin de esporas con una pipeta y se filtra a travs de Miracloth
(Calbiochem)
- se cuentan las esporas con una cmara Burker y se procede a su utilizacin. Para los
ensayos in vitro las esporas se pueden guardar previamente a 4C, pero para los ensayos in
vivo es aconsejable utilizarlas el mismo da (las esporas son ms infectivas).
4.2 Determinacin de la actividad antifngica de la protena AFP in vitro
Para la determinacin de la actividad antifngica in vitro de la protena AFP frente al
hongo fitopatgeno B. cinerea, se sigui el protocolo descrito por Cavallarn et al, 1998. El
ensayo se basa en determinar el crecimiento del hongo en cultivos lquidos midiendo
periodicamente la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm.
- en una placa de microtitulacin de 96 pocillos, se ponen 150 L de medio PDB lquido con
0,03 g/L de cloramfenicol (para impedir el crecimiento de bacterias) y 50 L de esporas a
una concentracin de 106esporas/mL. Se hacen controles en los que se aade 50 L de
agua, 20L de nistatina (0,1 g/L) (agente antifngico), 50M de BSA.
- se pregerminan las esporas incubando la placa durante 6h a 28C, y despus de este
periodo se aade la protena AFP a las concentraciones deseadas (siempre en un volumen
mximo de 2L). Se hacen lecturas de la D.O. a 595 nm a diferentes tiempos despus de
aadir la protena (16, 20, 24 y 40 horas).
- en cada ensayo se realizan 3 rplicas de cada concentracin de protena.
4.3 Tincin con azul de lactofenol
4.3.1 En ensayos in vitro
- se aade una gota de azul de lactofenol a los pocillos de la placa de microtitulacin y se
incuba a temperatura ambiente durante 4h

75

Material y Mtodos___________________________________________________
- se lava con agua antes de la observacin al microscopio ptico
4.3.2 En ensayos in vivo
- se incuba el trozo de hoja previamente infectado con el hongo en una solucin fijadora
(etanol 80%; formaldehdo 3,5%; cido actico 5%) y se somete al vaco durante 1h
- se retira la solucin fijadora y se sustituye por otra nueva
- se incuba aproximadamente 18h a temperatura ambiente
- se lava con etanol 70% 2 veces durante 5 minutos
- se aade azul de lactofenol hasta que cubra la muestra y se incuba 6h a temperatura
ambiente
- se lava con agua antes de la observacin al microscopio ptico
4.4 Determinacin de la actividad antifngica de la protena AFP frente a Botrytis
cinerea in vivo
Para la determinacin de la actividad antifngica de la protena AFP frente a Botrytis
cinerea in vivo se realiz un ensayo utilizando plantas de geranio de la variedad Eclipse
RedII.
Se inoculan localmente hojas de geranio (en la superficie adaxial) con 20L de una
suspensin de esporas de B. cinerea a una concentracin de 106 esporas/mL y con 0,25% de
detergente tween 20. Enseguida se inocula en el mismo punto 20L de una solucin de
protena AFP a la concentracin deseada. En los controles positivos se inocula agua en lugar
de AFP. Las plantas se mantienen bajo condiciones de alta humedad y los sntomas de las
infecciones se siguen visualmente.
En otro ensayo, se inocul la protena AFP 3 o 14 das antes de inocular las esporas
de B. cinerea, tal y como se ha descrito anteriormente.
4.5 Ensayo de inhibicin de la germinacin de esporas.
Este ensayo se hizo para observar el efecto de la protena AFP en la germinacin de
las esporas del hongo B. cinerea.
Sobre el lado cncavo de un vidrio de reloj fijado dentro de una placa de Petri, se
colocan

30L

de

esporas

una

concentracin

de

106 esporas/mL

diferentes

concentraciones de protena AFP, en un volumen final de 500 L de medio PDB lquido. En

los controles positivos en lugar de AFP se aade agua. Las placas se cierran con parafilm y
se incuban a 28C durante 6h antes de la visualizacin de las esporas al microscopio ptico.

76

___

__

Material y Mtodos

4.6 Ensayo de determinacin de actividad fungisttica o fungicida de AFP

Las protenas antifngicas pueden actuar de manera fungisttica, esto es, inhibiendo
el crecimiento del hongo solamente en el periodo en que est en presencia de la protena
(una vez retirada del medio de cultivo el hongo puede seguir creciendo), o fungicida, esto
es, matando el hongo (aunque se retire la protena del medio el hongo no crece).
Para determinar si la protena AFP acta de manera fungisttica o fungicida frente al
hongo B. cinerea se hicieron ensayos en los que se crece el hongo en presencia de protena
AFP por diferentes periodos de tiempo, y despus sta fue eliminada del medio de cultivo
mediante lavados sucesivos.
Se incuban en una placa de microtitulacin 50 L de esporas (106 esporas/mL) en
150 L de medio PDB lquido y se hace 2 ensayos: uno con esporas pre germinadas durante
6h a 28C, y otro con esporas sin pregerminar. Despus se aade la protena AFP a
diferentes concentraciones. Como controles se utilizan la protena BSA (10 M) y nistatina
(0,1 g/L). Las placas se incuban a 28C por diferentes periodos de tiempo, y se lavan los
cultivos 2 veces con 200 L de medio PDB (centrfugando durante 3 minutos a 11.000 rpm).
Despus de los lavados, las esporas se resuspenden en 50 L de medio PDB y se inoculan en
el centro de una placa de Petri con medio PDB. El crecimiento del hongo se sigue
visualmente.
4.7 Ensayo con los colorantes sytox green y congo red en cultivos de hongos
Para realizar este ensayo, se pregerminan las esporas (50 L, 106 esporas/mL en 150
L de PDA) en placas de microtitulacin durante 6h a 28C. Despus de este periodo, se
aade la protena AFP a la concentracin deseada y se incuba durante 21h a 28C. Como
controles se utilizan la protena BSA (10 M), y nistatina (0,1 g/L). Tambin se realiza un
control en PDA.
Despus de este periodo de incubacin se aaden 8 L de sytox green (5 M,
concentracin final de 0,2 M), o 2 L de congo red

(70 g/L, concentracin final de

1mM). Los cultivos se mantienen durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitacin
suave antes de la observacin al microscopio confocal (Leica TCS SP, Heidelberg, Alemania).
Las longitudes de onda utilizadas son de 488 nm de excitacin y 500-554 nm de emisin
para el sytox green, y de 543 nm de excitacin y 560-635 nm de emisin para el congo red.
4.8 Obtencin de elicitores de hongos
A partir de un trozo de miclio del hongo crecido en una placa de Petri, se inoculan
500 mL de medio lquido (medio de arroz o PDB segn el hongo en un erlenmeyer de 2 L).
Se mantiene a temperatura ambiente 1 mes hasta que el micelio del hongo cubre toda la
superficie del medio. Una vez pasado este tiempo, se filtra el micelio en papel de filtro

77

Material y Mtodos___________________________________________________
Whatmann 1MM, se transfiere a un tubo de polipropileno de 50 mL y se congela a -20C. Se
aaden 10 mL de agua y se sonica durante 20 minutos a 100W. Se autoclava durante 40
minutos y se congela a -80C. Se liofiliza y se resuspende en agua para obtener una
suspensin final de 1mg/mL.
4.9 Marcaje de AFP con el fluorocromo Alexa 568
Se ha utilizado el fluorocromo comercial Alexa 568 (Molecular Probes) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se disuelven 0,5 mg de protena AFP en 165 L de bicarbonato
sdico 100mM, pH: 8,3. A esta solucin se le aaden 5 L de Alexa-568 previamente
disueltos en DMSO (10 mg/mL). La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 5
horas en oscuridad. Despus de este tiempo la protena se guarda a 4C hasta su utilizacin.
El tratamiento de los cultivos de hongos con la protena AFP marcada con Alexa 568 se
realiza siguiendo el mismo procedimiento que con la protena AFP no marcada (ver apartado
4.2). La observacin se realiza en un microscopio confocal (Leica TCS SP, Heidelberg,
Alemania), con longitudes de onda de 577 nm de excitacin y 603 nm de emisin.
4.10 Ensayos de unin de la protena AFP a cidos nucleicos
Los ensayos de unin a DNA con la protena AFP se hicieron utilizando DNA extrado
de M. grisea siguiendo el protocolo indicado en el apartado 1.8. Los experimentos se
realizaron mezclando una cantidad fija de DNA con cantidades crecientes de AFP, en un
volumen final de 20 L de tampn TAE 1X. Las mezclas se mantienen 10 minutos a
temperatura ambiente, y se analizan en un gel de agarosa al 0,8%, preparado con tampn
TAE 1X.
Tampn TAE 1X:
Tris-acetato, pH 7,0

40mM

EDTA

1mM

Los ensayos de unin a tRNA con la protena AFP se hicieron utilizando tRNA de
levadura comercial (Roche). Los experimentos se realizaron mezclando una cantidade fija de
tRNA con cantidades crecientes de AFP, en un volumen final de 20 L de tampn TAE 1X.
Las mezclas se incuban 10 minutos a temperatura ambiente, durante 15 minutos a 65C, y
se analizan en un gel de formaldehdo.
4.11 Actividad ribonuclesica de la -sarcina frente a reticulocitos de conejo
Los reticulocitos de conejo utilizados fueron el "rabbit reticulocyte lysate, untreated
(Promega, ref.: L-4151). En este trabajo se analiz la posible actividad ribonuclesica de

78

___

__

Material y Mtodos

tipo RIP de la protena AFP. Como control positivo se utiliz -sarcina comercial (Sigma, ref.
S-6907), protena que tambin es producida por el hongo del suelo Aspergillus giganteus, y
que tiene conocida actividad ribonuclesica de tipo RIP sobre el RNA de reticulocitos de
conejo. El tampn utilizado en el ensayo fue el siguiente:
KCl

40 mM

EDTA

10 mM

Tris-HCl (pH: 7,5)

40 mM

Para estos ensayos se utiliz el siguiente protocolo:

- a 20L de reticulocitos de conejo se le aaden 50L de tampn final
- se incuba con las protenas AFP o -sarcina (1g) durante 30 minutos a 30C. Como
control se utilizan reticulocitos no tratados
- se aade 130L de tampn de parada y se incuba a temperatura ambiente durante 5
minutos
- se aaden 200L de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:24:1, v/v/v) y se centrfuga a
10.000 rpm durante 30 minutos a 4C
- se precipita la fase acuosa con 1/10 del volumen de AcNa 3M y 2 volmenes de etanol
100%
- despus de secar, se resuspende el precipitado en 20L de solucin de anilina
- incubar los tubos durante 30 minutos en hielo, y hacer otra precipitacin con AcNa y etanol
- despus de secar el precipitado resuspender en 10L de agua
- se aaden 10L de tampn de carga para RNA y se incuba durante 15 minutos a 65C
antes de cargar las muestras en un gel de agarosa desnaturalizante (ver apartado 1.13.1).
Tampn final
KCl

40 mM

EDTA

10 mM

Tris-HCl (pH: 7,5)

40 mM

Tampn de parada
SDS

0,5%

Tris-HCl (pH: 7,5)

50 mM

Solucin de aniline (pH: 4,5)

anilina (Sigma, ref. A9880)

1M

cido actico

0,8 M

79

Material y Mtodos___________________________________________________
4.12 Microscopa electrnica de transmisin
Para observar las alteraciones estructurales que eltratamiento con AFP provoca en las
clulas del hongo Magnaporthe grisea, se realizaron estudios de microscopia electrnica de
transmisin, en los Servicios Cientfico Tcnicos de la Universidad de Barcelona. El protocolo
utilizado fue el siguiente:
- se crece el hongo en una placa de microtitulacin de 96 pocillos (descrito en el apartado
4.2). Despus de 6 horas de pregerminacin se aade la protena AFP a una concentracin
final de 50nM (IC50). Tambin se crecen cultivos control sin tratar
- se incuba la placa durante 24 h a 28C
- se fijan las muestras en una solucin 1,5% de glutaraldehdo preparado en medio PDB,
durante aproximadamente 18 h, a 4C
- se incluye el material en una burbuja de agar al 2,5% para facilitar la manipulacin
(siguiendo el protocolo descrito por Hernndez Marin, 1992).
- se hacen 4 lavados de 10 minutos a 4C en tampn cacodilato sdico 0,1M
- se realiza una pos fijacin con tetrxido de osmio a 4C durante 3h
- se hacen 4 lavados de 10 minutos a 4C con agua destilada
- se realiza una deshidratacin en acetona a diferentes concentraciones, a temperatura
ambiente sin agitacin, y en este orden:
- 50%: una vez de 10 min
- 70%: dos veces de 10 min
- 90%: 3 veces de 10 min
- 96%: 3 veces de 10 min
- 100%: 3 veces de 15 min
- se hace la inclusin en resina SPURR (Spurr, 1969) a diferentes concentraciones, a
temperatura ambiente con agitacin suave, y en este orden:
- 30%: 18 h
- 50%: una vez de 5 h, y otra de 3 h
- 70%: 5 h
- 100%: 18 h
- 100%: 4 h
- se cortan los bloques de resina y se secan durante 2 o 3 das a 60C
- se hacen los cortes semifinos* (de 0,5 m de grosor) y se tien con azul de metileno para
visualizar al microscopio ptico
- se escogen las regiones con ms material para los cortes ultrafinos
- se hacen los cortes ultrafinos* (de 80 nm de grosor) con un cuchillo de diamante
- se colocan sobre rejillas de cobre de 200mesh y se contrastan con acetato de uranilo al 2%
y citrato de plomo

80

___

__

Material y Mtodos

- se guardan las rejillas a temperatura ambiente hasta su observacin en el microscopio

Hitachi, modelo H 600AB (Japn), con un potencial de aceleracin de 75KeV
* tanto los cortes semifinos, como los ultrafinos se hicieron por el equipo de la Dra.
Nria Cortadellas de los Servicios Cientfico Tcnicos de la Universidad de Barcelona.
Tampn cacodilato sdico 0,2M
Na(Ch3)2AsO2-3H20

4,28 %

pH 7,4 con HCl (para 100 mL de volumen final, aadir 5,6 mL de HCl 0,2 N)
Muy txico, trabajar siempre bajo campana
Solucin de post-fijacin
tetrxido de osmio

1%

FeCNK

0,8 %

preparado en tampn cacodilato sdico 0,1M

5 - Estudios con clulas humanas
5.1 Tratamiento de clulas humanas (HeLa) con AFP.
En este trabajo se han utilizado clulas humanas HeLa crecidas en monocapa
adheridas a un sustrado. Todo el proceso se realiza bajo estricta esterilidad y con
condiciones de cultivo constantes de 37C de temperatura y una atmsfera de CO2 del 5%.
5.1.1 Conservacin del stock de clulas
Las clulas HeLa se guardan en alcuotas congeladas a -80C. En el momento de
empezar un cultivo se descongela una alcuota y se pasa a placa de Petri de 100mm de
dimetro con medio D-MEM. El protocolo utilizado para la preparacin de estas alcuotas del
stock de clulas es el siguiente:
- se lava con 10 mL de PBS 1X atemperado una placa de cultivo con clulas HeLa (en un
estadio de confluencia del 90% aproximadamente)
- se pone 1 mL de tripsina-EDTA y se incuba durante 5-10 minutos a 37C
- se pasa el lquido con las clulas a un tubo de polipropileno de 15mL y se centrfuga a
temperatura ambiente durante 5 minutos a 1000 rpm
- se elimina el sobrenadante, y se resuspenden las clulas en 2 mL de PBS 1X
- se vuelve a centrfugar como antes
- se elimina el sobrenadante y se resuspenden las clulas en 3 mL de medio D-MEM con
10% de DMSO estril y 30% de suero fetal bovino
- se hacen alcuotas de 1 mL y congelar a -80C

81

Material y Mtodos___________________________________________________
La descongelacin de las clulas se debe hacer de manera rpida, de modo que se
pasa una alcuota congelada a -80C directamente a un bao-mara a 37C, y una vez
descongeladas se les aade 9 mL de medio D-MEM previamente atemperado. Se cultivan en
una placa de Petri.
5.1.2 Mantenimiento de las clulas
Las clulas se transfieren a medio fresco 2 veces a la semana, antes de que lleguen a
confluencia, siguiendo el protocolo:
- se lava la placa 2 veces con 10 mL de PBS 1X estril
- se pone 1 mL de tripsina-EDTA y se incuba 5-10 minutos a 37C
- se adicionan 9 mL de medio D-MEM previamente atemperado a 37C
- se disgregan las clulas por pipeteado suave, 3-4 veces
- se siembra la dilucin deseada, normalmente 1/10 y 1/20 (1 mL de clulas + 9 mL de
medio y 0,5 mL de clulas + 9,5 mL de medio respectivamente).
Solucin PBS 1X
PO4H2Na, H2O

1,6 mM

PO4HNa2, 2H2O

8,4 mM

NaCl

0,15 M

pH 7,4
Solucin tripsina-EDTA
EDTA

500 nM

NaCl

125 mM

KCl

4,65 mM

Na2HPO4, 2H2O

0,93 mM

Tris-HCl

18,6 mM

Tripsina (Sigma)

0,025%

Medio D-MEM
medio D-MEM

500 mL

suero fetal bovino inactivado por calor

50 mL

L-glutamina 200 mM

5 mL

penicilina-estreptomicina*

5 mL

* 10000 unidades/mL penicilina y 10000 g/mL de estreptomicina, utilizando penicilina G y

sulfato de estreptomicina

82

___

__

Material y Mtodos

5.1.3 Tratamiento de clulas HeLa con AFP y tincin con el colorante sytox green
Para realizar este ensayo, se incubaron clulas HeLa con diferentes concentraciones
de la protena AFP y se sometieron a tincin con el colorante fluorescente verde sytox green.
Este colorante se une a DNA una vez est dentro de las clulas, pero es incapaz de
atravesar las membranas plasmticas si estas se encuentran en perfecto estado. En clulas
en las que la membrana plasmtica se encuentra daada, el sytox green es capaz de
penetrar y se puede visualizar el ncleo marcado en verde. Para realizar este ensayo se
utiliz el protocolo siguiente:
- antes de empezar, se pone 1 cubreobjetos redondo dentro de cada pocillo de una placa
NUNC de 24 pocillos con ayuda de pinzas estriles, y se deja esta placa abierta en una
cmara de flujo laminar con el UV durante 30 minutos.
- despus de los 30 minutos, se pone en cada pocillo 1 mL de medio D-MEM con 100.000
clulas.
- se incuba la placa a 37C y en una atmsfera de CO2 de 5% durante aproximadamente
24h.
- se cambia el medio de los pocillos, y en aquellos que vayan a ser tratados con la protena
AFP, se aade el medio ya conteniendo la cantidad deseada de protena
- se incuba nuevamente la placa en las mismas condiciones, durante aproximadamente 15h.
- despus de ese tiempo, se trata las clulas control con 1% de triton (100 L de triton 10%
en cada pocillo). Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- se aaden 40 L del colorante sytox green a una concentracin de 5 M (concentracin
final de 0,2 M) y se incuba la placa en oscuridad con una agitacin suave a temperatura
ambiente durante 15 minutos
- se lava 2 veces los pocillos con 1 mL de PBS1X y se pone 1 mL de fijador (4% de
paraformaldehdo en PBS1X).
- se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- se lava 2 veces con PBS1X, se escurre un poco los cubre objetos en papel de filtro y se
monta en un portaobjetos con 6 L de mowiol.
- se seca 15 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz antes de observar al
microscopio. Estos portaobjetos se pueden guardar a 4C protegidos de la luz.

83

Material y Mtodos___________________________________________________
6- Estudios con plantas
6.1 Tratamiento de protoplastos de arroz con AFP.
De la misma manera que en el estudio con clulas humanas, el ensayo con
protoplastos se realiz utilizando el colorante sytox green, con la finalidad de observar las
clulas de arroz despus del tratamiento con AFP. Se considera que los protoplastos donde
se observa el ncleo marcado de color verde estn muertos o presentan daos estructurales
en la membrana.
6.1.1 Obtencin de protoplastos de arroz
6.1.1.1 Esterilizacin de semillas de arroz
- se descortican semillas de arroz manualmente
- en condiciones de esterilidad se incuban en etanol 70% (marca Carlo Erba) en tubos de
polipropileno de 50 mL durante 1 minuto
- se sustituye el etanol por una solucin de hipoclorito sdico 30% y los tubos se incuban a
temperatura ambiente en posicin horizontal durante 30 minutos con agitacin orbital de
150 rpm.
- se lava con abundante agua estril 2 o 3 veces, y se vuelve a incubar en las mismas
condiciones, en agua estril durante 1h.
- se vuelve a lavar como antes y se siembran con pinzas estriles en jarras con el medio
deseado.
6.1.1.2 Obtencin de protoplastos de arroz
- se germinan semillas de arroz previamente desinfectadas en jarras con medio MS
- cuando el coleptilo alcanza un tamao de aproximadamente 5 cm, se cortan en
fragmentos de 1 cm
- se incuba en 8 mL de solucin enzimtica por peso fresco, con agitacin orbital constante
de 50 rpm, a 24C y en oscuridad
- se filtra con una malla de nylon de 63 m
- se aade al lquido filtrado 15 mL de medio W5 y se centrfuga durante 5 minutos a 80 g
- se resuspende el precipitado en 8 mL de medio W5 + 0,6M de sacarosa y se repite la
centrfugacin anterior
- se recupera la interfase y se cuentan los protoplastos en una cmara de Nageotte
- se ajusta la densidad de protoplastos a 1,6 x 106 protoplastos/mL con medio CPW13M, y se
guardan en oscuridad a 24 C
Solucin enzimtica
celulasa Onozuka RS*

2%

macerozyme*

0,5%

84

___
manitol

__

Material y Mtodos

13 %

pH 5,6
* ambos de la marca Yakult Onza
Medio W5
NaCl

9 g/L

CaCl2

18,3 g/L

KCl

0,37 g/L

glucosa

0,99 g/L

pH 6,0
Medio CPW13M
K2HPO4

0,16 mM

KNO3

1 mM

CaCl2

10 mM

MgSO4

1 mM

Kl

1 M

CuSO4

0,1 M

manitol

71 mM

pH 5,8
6.1.2 Tratamiento de protoplastos de arroz con AFP y tincin con el colorante sytox green
- en un tubo de 1,5 mL se pone 1 mL de la suspensin de protoplastos a una concentracin
de 1,6 x 106 protoplastos/mL y se aade la protena AFP a la concentracin deseada.
- se incuba a 28C durante 16-18h en oscuridad
- se aade el colorante sytox green a una concentracin final de 0,2 M, y se incuba en
oscuridad con una agitacin suave a temperatura ambiente durante 15 minutos
- se observa al microscopio confocal
6.2 Transformacin de plantas de arroz.
Los mtodos descritos a seguir se utilizaron para la obtencin de plantas transgnicas
de arroz de la variedad Senia. Esta parte del trabajo se desarroll por la Dra. Joaquima
Messeguer y su grupo en el laboratorio de Biologa Molecular del IRTA en Cabrils.
6.2.1 Obtencin de callos embriognicos a partir del escutelo del embrin zigtico maduro
- se decortican aproximadamente 200 semillas de arroz
- en condiciones de esterilidad, se incuban las semillas en etanol 70% durante 1 minuto

85

Material y Mtodos___________________________________________________
- se transfieren las semillas a un erlenmeyer estril con una solucin de leja comercial
diluida al 16% en agua destilada con una gota de detergente Tween 20 para cada 100 mL.
Se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitacin orbital de 150 rpm
- se hacen 2 o 3 lavados de 10 minutos con abundante agua estril
- se siembran las semillas individualmente en tubos de 9mL de capacidad con 2 mL de
medio N6 para la induccin del callo e incubar a 28 2C durante una semana en oscuridad
- se transfieren las semillas que han germinado correctamente a placas de Petri de 9 cm con
25 mL de medio N6 (de 8 a 10 semillas por placa) y se incuban en las mismas condiciones
durante 2 semanas
- pasado ese tiempo se forman callos primarios de 0,5-1 cm de donde se seleccionan las
unidades embriognicas para la transformacin, con ayuda de una lupa y en condiciones de
esterilidad. Se transfieren las unidades embriognicas seleccionadas a placas de Petri de 9
cm con 25 mL de medio N6 (15-20 ndulos por placa) y se incuban a 28 2C durante dos
semanas en oscuridad hasta que adquieran la talla necesaria para la transformacin. Estas
unidades embriognicas deben cumplir ciertos requisitos para garantizar una alta eficiencia
de transformacin:
. talla entre 0,8 y 1,6 mm: los ms grandes ya estn en un estadio de desarrollo muy
avanzado y resultan en frecuencias de transformacin bajas, mientras que los ms pequeos
no soportan el impacto de la transformacin
. forma esfrica y superficie lisa: los de formas ms complejas y rugosos tambin
estn en un estadio muy avanzado de diferenciacin y no se deben utilizar
. color beige y ligeramente translcidos: los blancos o amarillentos y opacos se tienen
que eliminar
. textura compacta y resistentes a la manipulacin con las pinzas: hay que evitar los
callos friables no resistentes a la manipulacin, y los viscosos y cristalinos que ya estn
diferenciados para formar estructuras de raz
6.2.2 Transformacin por Agrobacterium tumefaciens
Se utilizaron los callos embriognicos descritos en el apartado anterior, utilizando el
protocolo a seguir.
. Cocultivo con Agrobacterium tumefaciens:
- se siembra la cepa deseada de A. tumefaciens previamente transformada con la
construccin a ser introducida en las plantas, a partir de un stock glicerinado, en una placa
de Petri con medio LB slido suplementado con los antibiticos necesarios
- se incuba a 28C por 2 das

86

___

__

Material y Mtodos

- a partir de una colonia aislada de la placa anterior, se hace un inculo en 50 mL de medio

LB lquido con los correspondientes antibiticos y se incuba en agitacin constante de 250
rpm a 28C durante una noche
- se hace una dilucin de este cultivo en otro erlenmeyer con 50mL de medio LB lquido,
para tener un cultivo con una D.O. de 0,1 a 600 nm, lo que corresponde a cerca de 108
bacterias/mL.
- se centrfuga este cultivo durante 10 minutos a 3000 rpm y se resuspende el precipitado
en 40 mL de medio N6 lquido + AC
- se ponen en una placa de Petri de 5 cm, 15 mL del cultivo bacteriano y se sumergen los
callos embriognicos (100 por construccin), y se incuban durante 15-20 minutos
- se secan suavemente los callos sobre papel de filtro estril para eliminar el exceso de
bacterias y se disponen en placas de Petri de 9 cm con 25 mL de medio de cocultivo N6 +
AC (15 a 20 callos por placa).
- se incuban las placas selladas con Parafilm durante 3 das en oscuridad y a 28 2C
. Seleccin de los callos transformados y obtencin de plantas:
- se disponen de 15 a 20 callos transformados en placas de Petri de 9 cm con 25 mL de
medio N6+H+Cf+T (cerca de 20 placas por cada ensayo de transformacin) y se incuban en
oscuridad durante 12-15 das a 28 2C
- despus de este tiempo, se vuelve a transferir los callos a nuevas placas de Petri con el
mismo medio, y se incuban durante 2 semanas ms
- a partir de aqu empieza el proceso de regeneracin de los callos transformados. Se
transfieren aquellos que presentan un crecimiento activo al medio de pre-regeneracin (N6PR + H) y se incuban durante 1 semana en las mismas condiciones
- se transfieren al medio de regeneracin (N6-R + H), incubar 2 das a 28 2C en
oscuridad, y se pasan a la luz (con un foto periodo de 16h luz: 8h oscuridad) durante 3-6
semanas
- a medida que aparecen las plantas, estas se individualizan de los callos y se transfieren a
tubos de cultivo de 62 mL de capacidad con 8 mL de medio N60 + H para estimular el
desarrollo de las races
- 1 semana despus, se pasan las plantas a un sustrato adecuado de aclimatacin en
semilleros con capacidad para 60 plantas, y en condiciones de alta humedad donde
permanecen 15 das antes de ser transferidas definitivamente a macetas con el sustrato de
arroz descrito en el apartado 2.3 de "material". El proceso de aclimatacin de las plantas se
hace reduciendo gradualmente la humedad relativa para evitar un choque hdrico.

87

Material y Mtodos___________________________________________________
6.2.3 Transformacin por biolstica
Se disponen las unidades embriognicas seleccionadas (apartado 5.1.1), 4 horas
antes del bombardeo, en el centro de una placa de Petri con medio N6 bomb., a 0,7cm del
centro de la placa, formando un crculo de 1cm de dimetro. Esta es la disposicin ideal para
que los callos reciban los disparos de manera homognea, y la composicin del medio N6
bomb., suplementado con manitol y sorbitol, cambia la condicin osmtica de las clulas
reduciendo los daos causados por el impacto de las micro partculas de oro.
. Preparacin de las micropartculas de oro
- se pesan en una balanza de precisin, en un eppendorf siliconado, 1,5 mg de micro
partculas de oro de 1m de dimetro, y 1,5 mg de partculas de 1,6m de dimetro
- se aade 1 mL de etanol absoluto y se sonican las micro partculas durante 30 segundos
- se deja que precipiten durante 1 hora
- se retira el etanol y se aade 500 L de agua MilliQ autoclavada
- se vuelve a sonicar y se dejar precipitar
- se retira el agua, se vuelve a aadir 50 L de agua y se sonica durante 30 segundos
- con agitacin constante al vrtex, se aade 10 L del DNA a utilizar a una concentracin de
0,5 g/L; 20 L de espermidina a 0,1 M y 50L de CaCl2 a 2,5 M.
- se deja que precipiten las micro partculas manteniendo el eppendorf en hielo durante
cerca de 10 minutos
- se centrfuga durante 10 segundos y se descarta el sobrenadante
- se resuspenden las micro partculas de oro ya recubiertas de DNA, en 38 L de etanol
absoluto, sonicando brevemente
- se ponen las micro partculas ya recubiertas de DNA en el centro de cada una de las 4
membranas que se utilizarn par los disparos (2 por placa de callos, y 2 placas por
construccin)
- se deja que se evapore completamente el etanol
. Realizacin del bombardeo
Los parmetros utilizados fueron los siguientes: vaco a una presin de 27 inches de
mercurio, disco de ruptura de 1100 psi, posicin del soporte con la placa de Petri a 6 cm del
disco de parada, y dos disparos por placa de Petri.
Todo el material utilizado en el bombardeo (discos de parada, discos de ruptura,
membranas, soportes metlicos para las membranas y para los discos de ruptura) se
esteriliz previamente con alcohol absoluto, y la cabina de flujo laminar se limpi con etanol
70%.

88

___

__

Material y Mtodos

- se dispone el disco de ruptura sobre su soporte y se acopla en el orificio de entrada del

helio
- se dispone el disco de parada en el fondo de su soporte metlico y se acopla boca abajo
asegurndose de que quede bien apretado. Se coloca dentro de la cmara de disparo
- a 6 cm del disco de parada se coloca la placa de Petri con los callos y se cierra la puerta.
Se hace el vaco hasta alcanzar los 27 inches de presin y se dispara hasta que se rompa el
disco de ruptura
- se deshace el vaco y se repite el proceso girando de 90 la placa con los callos
- una vez finalizados los disparos, se sellan las placas con Parafilm y se incuban a 28C
durante 16-20h
. Seleccin de los callos transformados y obtencin de plantas:
Se hace esencialmente como descrito en el apartado de transformacin por
Agrobacterium tumefaciens, con la nica diferencia que el medio de seleccin no contiene
cefotaxima ni cido clavulnico.
6.2.4 Medios de cultivo
N6

N60

N6-PR

N6-R

N6-bomb

100

100

100

100

100

microelementos* (mL/L)

10

10

10

10

10

FeNaEDTA (mL/L)

18,7

18,7

18,7

18,7

18,7

tiamina (mL/L)

myo-inositol (mg/L)
hidrolizado de casena
(mg/L)

100

100

100

100

100

300

300

300

300

300

prolina (mg/L)

500

500

500

500

500

glutamina (mg/L)

500

500

500

500

500

2,4 D (mL/L)

18,2

AIA (mL/L)

2,85

2,85

ABA (mg/L)

10

BA (mL/L)

13,26

13,26

manitol (g/L)

72,88

sorbitol (g/L)

72,88

sacarosa (g/L)

30

30

30

30

30

gelrite (g/L) (medio solido)

2,6

2,6

2,6

2,6

2,6

macroelementos* (mL/L)

Macroelementos*1
KH2PO4

4 g/L

CaCl2, 2H2O

1,66 g/L

MgSO4, 7H2O

1,85 g/L

89

Material y Mtodos___________________________________________________
KNO3

28,3 g/L

(NH4)2SO4

4,63 g/L

Microelementos*2
MnSO4, 4H2O

2,23 g/L

ZnSO4, 7H2O

0,86 g/L

H3BO3

0,62 g/L

Kl

0,083 g/L

Na2MoO4, 2H2O

0,025 mg/L

CuSO4, 5H2O

0,0025 mg/L

CoCl2, 6H2O

0,0025 mg/L

FeNaEDTA: 2,5g/L
Tiamina (o vitamina B1): 10-4 M
2,4D (2,4 dicloroferroactico): 5x10-4 M (disuelto en etanol absoluto)
AIA (acido 3-indolactico): 10-3 M (disuelto en etanol absoluto)
BA (6-benzilaminopurina): 10-3 M (disuelto en HCl 0,5 N)
ABA (acido abscsico): 1 mg/mL (disuelto en NaOH 1 N)
Suplementos de los medios:
Rifampicina (rif): 100 mg/L
Higromicina (H): 40 mg/L
Kanamicina (Kan): 50 mg/L
Cefotaxima (CF): 250 mg/L
cido clavulnico (T): 100mg/L
Acetosiringona (AC): 19,62 mg/L
7- Ensayos de resistencia de plantas de arroz transgnicas expresando el gen afp
frente a la infeccin por Magnaporthe grisea.
7.1 Ensayo en hoja cortada
El ensayo de resistencia en hojas cortadas de arroz se hace tal y como se ha descrito
en el apartado 2 de material y mtodos (anlisis histoqumico de la expresin del gen uidA
en hojas tratadas con esporas o elicitores). Para este ensayo se utilizaron inculos de
esporas de M. grisea a diferentes concentraciones (104, 105 y 106 esporas/mL).

90

___

__

Material y Mtodos

7.2 Ensayo en planta entera

El ensayo en plantas enteras de arroz transgnicas expresando el gen afp, se hizo
pulverizando las plantas con una solucin de esporas a una concentracin de 104 esporas/mL
y 0,02% de detergente tween 20, poniendo 5 mL de esta solucin en las plantas de cada
una de las macetas del ensayo.
Despus del inculo con las esporas, las plantas se mantienen en una cmara de
metacrilato cerrada, en un ambiente con 95% de humedad, a una temperatura de 28C.
Esta cmara de metacrilato se mantiene en oscuridad durante 2 das, y despus en
condiciones de fotoperodo de 12h/luz y 12h/oscuridad.
La aparicin de los sntomas de la infeccin se sigui visualmente.

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_________ _____ Captulo I

Activity of the antifungal protein from Aspergillus giganteus

against Botrytis cinerea
Ana Beatriz Moreno, lvaro Martnez del Pozo,
Maris Borja, Blanca San Segundo
Publicado en Phytopathology, 93: 1344-1353, 2003.

Resumen
La podredumbre gris (Botrytis Blight) causada por el hongo Botrytis cinerea, es una
de las enfermedades ms frecuentes en las plantas ornamentales. En plantas de geranio,
esta enfermedad es responsable de importantes prdidas en la produccin. El hongo
Aspergillus giganteus produce y secreta una protena bsica de bajo peso molecular, la
protena antifngica AFP (antifungal protein). En este trabajo, se investigan las propiedades
antifngicas de la protena AFP frente a varios aislados de B. cinerea obtenidos de geranios
infectados de modo natural. La AFP inhibe fuertemente tanto el crecimiento del micelio,
como la germinacin de los conidios de B. cinerea. La observacin microscpica de cultivos
de este hongo tratados con AFP revela la presencia de hifas de menor longitud con
ensanchamientos en las puntas de las hifas. Experimentos en los que B. cinerea se incub
con AFP por diferentes periodos de tiempo, retirndose despus del medio de crecimiento,
revelaron una actividad fungicida de la AFP. La aplicacin de AFP en plantas de geranio
protegi las hojas de una infeccin por B. cinerea. La protena cecropina A tambin se
mostr efectiva frente a este patgeno. Se observ un efecto aditivo cuando la AFP se
combin con la cecropina A. Estos resultados se discuten en relacin al potencial del gen afp
para aumentar la proteccin de plantas frente a enfermedades causadas por Botrytis
cinerea.

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