Manual Hematologia

MDULO I
Procedimientos
bsicos en el
laboratorio de
Hematologa
8
ANTICOAGULANTES
La sangre es una suspensin de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en un lquido de

compleja composicin, llamado, plasma. Al impedirse el mecanismo de coagulacin
sangunea pueden separarse los elementos formes de este lquido, el cual tiene un color paja
claro. Cuando la sangre se coagula se obtiene otro lquido al separar el cogulo formado, a
este lquido se le llama suero, el cual es de composicin diferente al plasma. La diferencia
entre estos dos lquidos obtenidos de la sangre radica en su composicin pues, al inhibir la
coagulacin de la sangre se conserva el fibringeno en el plasma, mientras que el suero
carece del mismo por su transformacin a filamentos insolubles de fibrina por la activacin
de protenas coagulantes durante la hemostasia.
Debido a que la sangre fuera del sistema vascular coagula entre 3 y 7 minutos es
necesario el uso de sustancias, tales como los anticoagulantes, que permitan que los
elementos formes de la sangre permanezcan en suspensin para su estudio. Los
anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total y as poder
realizar los recuentos celulares y estudiar las caractersticas morfolgicas de las clulas. As
mismo deben procurar que las clulas sanguneas a estudiar se encuentren en el estado ms
parecido al fisiolgico, como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguneo.
Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los leucocitos, el tamao
eritrocitario, no producir hemlisis e impedir la agregacin plaquetaria, posibilitando al
mismo tiempo el mximo perodo de conservacin de la muestra (cerca de 24 horas a 25C
o incluso 48 horas refrigerada a 4 C).
Los anticoagulantes como aditivos para la sangre ms ampliamente utilizados son:
EDTA (C10H16N2O8)
Sal disdica, dipotsica o tripotsica del cido etilendiaminotetraactico, actuando

mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++), impidiendo el proceso de la coagulacin
al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realizacin de recuentos
celulares, sobre todo en los autoanalizadores y permite adems la realizacin del
hematcrito y del frotis sanguneo hasta dos horas despus de la extraccin de la muestra.
Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio, por ser ms fcilmente
solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto slido, sin embargo, las tres
sales afectan el tamao del eritrocito, especialmente despus del almacenamiento de la
sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for
Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotsica como anticoagulante
para recolectar muestras sanguneas destinadas al recuento y caracterizacin del tamao
celular y especialmente cuando los valores del hematcrito se requieren para la calibracin
de los contadores automticos. El K2EDTA2H2O posee un peso molecular relativo de
404,1g; 1g quela 100 mg de calcio inico y el pH para una solucin al 1% es de 4,8 +/- 1,0.
La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1,5-2,2 mg/mL de
sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la
coagulacin y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares.
9
Heparina
Es un anticoagulante fisiolgico que acta impidiendo que la protrombina se

transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacrido cido. Los frotis
realizados con muestras sanguneas anticoaguladas con heparina producen un color azulado
en el fondo del frotis y una pseudovacuolizacin celular por lo tanto no se recomienda para
tal fin. La proporcin adecuada es de 15-20 UI (0,1-0,2 mg) de heparina por mL de sangre.
Citrato trisdico (C6H5O7Na3)
Acta impidiendo que el calcio se ionice, evitando as la coagulacin. Se utiliza para

realizar las pruebas de Hemostasia en una proporcin sangre: anticoagulante 9:1; as como
para la velocidad de sedimentacin (VSG) en una proporcin sangre: anticoagulante 4:1. El
citrato sdico se utiliza a una concentracin de 0,105 M (3,2%) 0,129 M (3,8%).
Oxalato sdico (Na2C2O4)
Acta mediante la precipitacin del calcio como oxalato de calcio (CaC2O4),

adems de que tiene propiedad para conservar la glucosa. Recomendado en las pruebas de
coagulacin y su proporcin es de 2 volmenes de solucin de oxalato sdico 0,1M en 4
volmenes de sangre.
Oxalato de amonio y potasio [(NH4)2C2O4:K2C2O4]
Conocido tambin como mezcla de Wintrobe, fue empleado durante mucho tiempo
para la realizacin de la biometra hemtica, sin embargo dejo de emplearse al observar que
altera sensiblemente la morfologa del eritrocito alterando por tanto el volumen corpuscular
medio (VCM). Acta por precipitacin del calcio. Se emplea en forma de polvo,
constituido por 3 partes de oxalato de amonio y 2 partes de oxalato de potasio. La
proporcin recomendada es de 2 mg de mezcla por mL de sangre.
Soluciones anticoagulantes conservadoras
Los factores ms importantes que influyen sobre la recuperacin eritrocitaria en la

sangre conservada es la solucin anticoagulante conservadora utilizada. Todas las
soluciones que se utilizan hoy en da son anticoagulantes y conservadoras, pero se habla
ms de su funcin anticoagulante y se olvida la no menos importante de conservacin. Las
distintas modificaciones que tienen lugar en la sangre durante el perodo de almacenaje
denominadas lesiones de conservacin estn en relacin tanto con el perodo de tiempo
como con la naturaleza de la solucin anticoagulante.
Las soluciones anticoagulantes conservadoras tienen grandes cantidades de glucosa
como material energtico, y de citratos de sodio que previene la coagulacin de la sangre.
En la actualidad existen tres soluciones de este tipo, conocidas como:
Solucin cido-Citrato-Dextrosa (ACD)
Solucin Citrato-Fosfato-Dextrosa (CPD)
Solucin Citrato-Fosfato-Dextrosa-Adenina (CPDA-1)
10
La solucin ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar
las unidades de sangre y estudios metablicos eritrocitarios por permitir una buena
conservacin de los hemates. Se utiliza en una proporcin de un volumen de ACD por
cada cuatro volmenes de sangre. La proporcin de la mezcla del anticoagulante es de:
Acido Ctrico 0,9 g, Citrato disdico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 mL. Permite
conservar los hemates durante 21 das entre 2-6C.
La solucin CPD desarrollada por Gibson, tiene la ventaja sobre la ACD, de
condicionar un pH de 7,1 en la sangre colectada inmediatamente despus de la extraccin,
facilitando la continuacin del metabolismo glicoltico celular durante el perodo de
almacenamiento; por otro lado el in fosfato ayuda a la preservacin de los esteres de
fosfato dentro del eritrocito, por lo que permite mantener la estabilidad de la membrana
(ATP), el transporte de oxgeno y su liberacin en los tejidos (2,3-DPG).
La solucin CPDA-1 es la frmula mejorada de CPD, ya que contiene 25% ms de
glucosa y de 17,3 mg de adenina, lo cual permite la conservacin de la sangre 35 das. La
adicin de Adenina se deriv de experiencias previas en las cuales se haba demostrado que
esta sustancia poda ser tomada por eritrocito e incorporada en la reserva de nuclotidos
celulares, utilizndola para mantener la concentracin de ATP en el eritrocito.
La solucin de CPD-Adenina ha sido recientemente mejorada al aumentar la
concentracin de dextrosa y Adenina. Esta nueva versin ha sido identificada como CPDA-
2 y los ensayos clnicos muestran que la sangre completa puede conservarse por 49 das con
una sobrevida media eritroctica de 73,6%, en cambio, los eritrocitos concentrados duran 42
das pero su sobrevida es de 77,9 + 8,1%. No tiene efectos adversos sobre las plaquetas ni
sobre los factores plasmticos. Esta solucin es claramente superior al CPDA-1 para la
conservacin de los eritrocitos concentrados. Su aprobacin para ser usada en los bancos de
sangre est en consideracin.
En la Tabla 1 se muestran los anticoagulantes ms comnmente empleados en
hematologa, haciendo referencia a su concentracin, proporcin, pruebas indicadas y
contraindicadas, ventajas y desventajas de los mismos.
11
Tabla No. 1 Anticoagulantes como aditivos comnmente empleados en Hematologa
Anticoagulante Concentracin Proporcin Pruebas Pruebas no Ventajas Desventajas

indicadas indicadas
EDTA 10% 0.1mL/5mL de -BH -Muy soluble en la sangre. -En muestras con ms de
(C10H16N2O8) sangre -Frotis sanguneo -No destruye las clulas. 2 horas de haberse
K2EDTA2H2O 1.5-2.2mg/mL y de mdula sea -Poco txico tomado, pueden llegar a
K3EDTA de sangre -Impide la agregacin de presentarse diversos
plaquetas (en algunos cambios en la morfologa
casos no) de los leucocitos y
-No diluye la muestra por eritrocitos.
emplearse en forma de
polvo.
Heparina 0.1-0.2mg/mL -Fragilidad -Leucocitos -Reduce la hemolisis y la -Es caro
de sangre osmtica -Frotis agregacin plaquetaria -No recomendable para
15-20 UI -Degranulacin -Fosfatos banco de sangre
de basfilos inorgnicos
-Reduccin de
NBT
Citrato de sodio 3.8% (0.129 M) 1 parte:4 partes -VSG -BH -Permite realizar las -Diluye la muestra y no
(C6H5O7Na3) de sangre pruebas de coagulacin, puede emplearse para la
por conservar mejor las BH.
3.2% (0.105 M) 1 parte:9 partes -Pruebas de protenas coagulantes,
de sangre coagulacin debido a su accin
-Plaquetas anticoagulante.
Oxalato de 0.1 M 0.1 M/mL de -Pruebas de -Nitrgeno en -Soluble. -Altera la permeabilidad

sodio sangre coagulacin sangre del eritrocito, ligera
-VSG hemlisis.
Oxalato de 3 partes de 2mg/mL de -Frmula roja -Frotis -Econmico. -No se puede emplear en
amonio y oxalato de sangre -Leucocitos -Nitrgeno en -Fcil de preparar. las transfusiones.
potasio amonio/2 partes -Pruebas sangre -No diluye la muestra. -Altera la morfologa del
[(NH4)2C2O4:K2 de potasio bioqumicas -Determinacin eritrocito.
12
C2O4] de potasio -Altera el VCM.
TOMA DE MUESTRA
Hace mucho tiempo los griegos establecieron la teora humoral en la cual la bilis
negra y verde, flemas y sangre, eran considerados como los cuatro humores del cuerpo
humano. Esta teora fue responsable de la prctica del sangrado (flebotoma). El objeto de
invadir una vena con una aguja fijada a una jeringa o a un tubo recolector cerrado al vaco,
es obtener un espcimen de sangre para realizar anlisis mltiples de sus constituyentes en
el laboratorio clnico. La recoleccin de sangre incluye especmenes: venoso, arterial y
cutneo o capilar.
La Asociacin Nacional de Flebotoma ha ayudado a promover los conocimientos
cada vez ms necesarios para que se d la debida importancia a la recoleccin de sangre.
Adems el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) antes NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory), ha escrito varias recomendaciones orientadas a la
correccin de mtodos para la recoleccin de especmenes de sangre y al igual ha publicado
normas para la recoleccin de tubos al vaco y para el manejo de transferencia de los
especmenes.
Paciente
Muchas pruebas no requieren el ayuno, pero es preferible que los pacientes no

tomen alimento por lo menos 4-6 horas antes de la puncin venosa. Esto reducir la
posibilidad de lipemia quilomicrnica, la cual puede interferir en muchos mtodos por no
estar el suero apropiadamente lmpido. Un problema mayor que las interferencias por falta
de ayuno es la interferencia por medicamentos; cuando sea posible, deben suspenderse
medicamentos con capacidad de interferencia conocida por lo menos 48 horas antes de la
recoleccin de sangre. El consumo de cafena, el alcohol y el uso de tabaco son muy
comunes. Eliminando estmulos indeseables es la forma ms segura para prevenir la
interferencia fisiolgica. Por ejemplo, Bombear con la mano o apretar los puos durante
el proceso de la recoleccin, genera resultados anormales de potasio.
Los pacientes se clasifican en internados y externos o ambulatorios. Se sabe
perfectamente que la postura del paciente puede afectar los resultados de algunas pruebas.
Un individuo puede tener diferentes resultados para ciertas pruebas, dependiendo si est
acostado, sentado o de pie en el momento de la extraccin. La estasis por el torniquete
causa un efecto de hemoconcentracin similar al que causa la postura. El torniquete
utilizado para una puncin venosa no deber aplicarse tan apretado que el pulso de la
arteria radial se pierda y debe permanecer un minuto como mximo. El objeto del
torniquete es aumentar el llenado de las venas para que stas se hagan ms prominentes.
Bokelund et.al. han establecido que el torniquete contribuye ampliamente a la variabilidad
de los resultados.
Un flebotomista debe mantener buena salud e higiene personal, con su ropa, cabello
y uas.
Algunos factores fisiolgicos especficos del paciente pueden afectar los resultados
de las pruebas de laboratorio, algunos de ellos pueden ser:
Postura: Un cambio de posicin supina (boca arriba) a sentado o acostado genera un
paso de agua de los vasos sanguneos a los espacios intersticiales provocando que la
sangre se concentre.
13
Ritmo circadiano: El hecho de tomar una muestra durante el da o por la noche
provoca un cambio en los resultados.
Ejercicio: Incrementa el metabolismo de algunos analitos y por lo tanto puede
generar resultados errneos.
Estrs.
Dieta: ayuno prolongado o muy corto.
Habito de fumar: Dificulta las punciones cutneas por las alteraciones circulatorias
que genera.
Zonas de recoleccin
Especmenes venosos
Las venas superficiales de la cara anterior del antebrazo son las ms comunes para
la venopuncin, las tres venas principales para la recoleccin son (Figura 1):
1. Vena ceflica, ubicada en la parte superior del antebrazo y en direccin del pulgar
de la mano.
2. Vena baslica, ubicada en la parte inferior del antebrazo y en direccin contraria al
pulgar.
3. Vena cubital mediana, ubicada en la parte anterior del codo y conecta las venas
ceflica y baslica; a esta zona se le llama fosa antecubital. Esta vena es la de
eleccin para los especmenes venosos.
Especmenes capilares o cutneos
Debido a que este tipo de sangre difiere ligeramente en la composicin de la sangre

venosa, su obtencin queda restringida a casos especiales, tales como, pacientes
peditricos, personas obesas a las cuales no se les pueda localizar una vena y en pacientes
quemados o con quimioterapia. Tambin este tipo de sangre es empleada para algunos tipos
de estudios, por ejemplo, tiempo total de coagulacin y tiempo de sangrado.
Existen tres zonas para poder obtener estos especmenes sanguneos (Figura 2):
1. Yema de los dedos
2. Lbulo de la oreja
3. Taln (solo neonatos)
14
Vena cubital Fosa antecubital
mediana Vena ceflica
Anterior
Fig. 1. Venas del antebrazo (dos incidencias)

Vena ceflica Vena baslica
Posterior
Vena baslica
15
Puncin perpendicular a
las huellas digitales
Las lneas punteadas indican la

zona adecuada para la puncin
en la planta del pie
Fig. No. 2. Sitios de puncin cutnea (sangre capilar).
16
Especmenes arteriales
Este tipo de sangre rara vez se emplea para estudios de rutina, pero esto no la
descarta de emplearse para cualquier tipo de estudio, sin embargo su principal empleo es
para la determinacin de gases sanguneos. Debido al riesgo que conlleva la obtencin de
tales especmenes, estos nicamente debern ser obtenidos por un mdico, un qumico o
una enfermera con entrenamiento especial.
Los sitios habituales para obtener sangre arterial son (Figura 3):
1. Arteria radial
2. Arteria braquial o humeral
3. Arteria femoral
Arteria humeral
Arteria radial
Arteria femoral
Fig. No. 3. Principales sitios de puncin arterial
Instrumentos para recoleccin
Torniquete
Se emplea como barrera contra el flujo de sangre venosa, con el objetivo de

visualizar una vena con mayor facilidad. Puede ser una tira o manguera de ltex, una correa
de velcro o bandas ajustables. En la actualidad existen una gran variedad de formas para los
torniquetes, las cuales dan una mejor presentacin, pero sobre todo mayor comodidad tanto
para el paciente como para el flebotomista.
17
Solucin para la asepsia de la piel
La solucin asptica ms comn es el alcohol isoproplico al 70%. Debe aplicarse

con torundas empapadas de esta solucin. Pueden emplearse tambin soluciones de etanol
al 70% (ya no es recomendable), cloruro de benzalconio (cloruro de zefirn) o soluciones
antispticas comerciales.
Jeringas
Son sistemas integrados por un cilindro graduado en mililitros, un embolo y una

aguja con punta en un solo extremo y una base para montarse en el cilindro de la jeringa
(Figura 4). Las agujas para jeringa son de toma nica. Deben emplearse en la extraccin de
sangre en pacientes peditricos, geritricos o en caso de pacientes con venas frgiles o
diminutas que no puedan resistir la presin negativa del sistema al vaco.
Fig. No. 4. Esquema de una jeringa
Sistema al vaco (Figura 5)
1. Agujas: Son estriles y presentan varias longitudes y anchos (calibre o apertura).

Diseadas para encajar en el sistema de sujecin del tubo al vaco mediante una
rosca. Son consideradas de toma mltiple por el capuchn de goma en el extremo
posterior al bisel para impedir la salida de sangre. Calibre para adultos: 21, longitud
de 1 pulgada (2.4 cm). Ejemplos de agujas, son la aguja Eclipse Blood Collection
Needle (BD) y el dispositivo Vacu-Pro Venipuncture Needle Protection Device
(Concord Portex).
2. Dispositivo de sostn: Son bases plsticas diseadas para sujetar las agujas, son
desechables y de uso nico, pero pueden limpiarse sumergiendolas en solucin de
lavandina al 10%. Ejemplos: sostn BD Pronto Quick Release Needle Holder,
dispositivo Safety-Lok Needle Holder (BD) y Saf-T Clic (Winfield Medical).
3. Tubos al vaco: Son de plstico o vidrio, contienen una cantidad preestablecida de
un aditivo sellado al vaco. El vaco corresponde al volumen indicado en la etiqueta.
Por lo general estn recubiertos con silicona para disminuir las posibilidades de
hemlisis. Estos tubos se manejan por cdigo de colores en el tapn, el cual
depende del aditivo que contiene en su interior, en la Tabla 2 se muestra el color del
tapn y el aditivo que contienen los tubos ms empleados en Hematologa.
18
3
1
2
Fig. No. 5. Elementos empleados en los sistemas al vaco.
Tabla No. 2 Cdigo de colores para tubos al vaco

Color del tapn Aditivo No. de inversiones
Vacutainer
Rojo con negro Gel separador y activador de la 5
Dorado (Hemogard) coagulacin
Verde con negro Gel separador y heparina de litio 8
Verde claro (Hemogard)
Rojo Activador del cogulo 0
Amarillo con negro Trombina 8
Anaranjado (Hemogard)
Azul militar (Hemogard) Heparina sdica 8
Na2EDTA 8
Ninguno 0
Verde Heparina sdica 8
Heparina de litio
Gris Oxalato de potasio y fluoruro de sodio 8
Fluoruro de sodio 8
Fluoruro de sodio/K2EDTA 8
Tostado (Hemogard) Heparina sdica (vidrio) 8
K2EDTA
Amarillo Polianetolsulfonato de sodio (SPS) 8
cido citrato dextrosa (ACD) 8
Lavanda o lila K2EDTA lquido (vidrio) 8
K2EDTA desecado (plstico) 8
Rosa (Hemogard) K2EDTA desecado 8
Celeste Citrato de sodio 0.105 M =3.2% 3-4
Citrato de sodio 0.129 M =3.8%
19
Equipos de infusin alados (mariposas = butterflies)
Dispositivos intravenosos que presentan una aguja corta y una sonda delgada con
alas plsticas adheribles (Figura 6). Pueden conectarse a los dispositivos de sostn
Vacutainer, jeringas o frascos para hemocultivo con adaptadores especiales. Son empleados
en la toma de muestra de nios o pacientes internados difciles de extraerles sangre.
Fig. No. 6. Elementos empleados en los equipos alados. A y B: Tubos al vacio; C: Sistema
alado; D: Dispositivo de sostn.
Tubos Microtainer
Los tubos Microtainer (Figura 7) estn destinados a la extraccin, transporte y

procesamiento de muestras de sangre capilar en neonatos, nios, pacientes geritricos y
pacientes en estado crtico. Las lneas de nivel de volumen impresas en los tubos, aseguran
una relacin sangre/anticoagulante apropiada; la lnea inferior (200L) indica la cantidad
mnima de sangre que puede recolectarse y la lnea superior (800 L) la cantidad mxima
de sangre que puede contener.
Fig. No. 7. Tubo Microtainer.
Actualmente se recomienda evitar el uso de la jeringa debido al elevado riesgo de

exposicin que supone el proceso de transferencia de la sangre desde la jeringa hasta el
tubo colector. En su lugar se recomienda el uso de los sistemas al vaco, sin embargo el
instrumento de recoleccin que se deba emplear en cada toma depender de la situacin de
la misma. El CLSI ha estandarizado el procedimiento de la puncin venosa, por lo cual
cuando se trate de una toma mltiple debe seguirse un orden:
A. Mtodo de tubos al vaco2:
2
Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture. Approved Standard-Fifth
Edition. NCCLS Approved Standard Document H3-A5, Vol. 23 No. 32, p. 17. 2003.
20
a. Tubos estriles para hemocultivo
b. Tubo tapn rojo (sin aditivo)
c. Tubo tapn celeste (citrato de sodio)
d. Tubo tapn rojo con negro (gel separador y activador de la coagulacin)
e. Tubo tapn verde o verde con negro (heparina)
f. Tubo tapn lavanda o lila (EDTA)
g. Tubo tapn gris (oxalato de potasio y fluoruro de sodio)
h. Tubo tapn amarillo (ACD)
B. Mtodo de jeringa2:
a. Tubos estriles para hemocultivo
b. Tubo tapn celeste
c. Tubo tapn verde
d. Tubo tapn lavanda o lila
e. Tubo tapn gris
f. Tubo tapn amarillo
g. Tubo tapn rojo
En el caso de que slo se requiera muestra para pruebas de coagulacin por el

mtodo de tubos al vaco, primero debe obtenerse sangre en un tubo de tapn rojo para
evitar contaminacin con tromboplastina tisular. En el caso de sistemas alados debe
obtenerse primero un tubo de tapn rojo para asegurarse de llenar toda la cnula de
extraccin del sistema.
21
Fundamento
Los resultados de un examen de laboratorio como toda prueba analtica consisten de

tres etapas; preanaltica, analtica y postanaltica, por lo tanto la etapa preanaltica es la de
mayor importancia pues de la calidad del espcimen sanguneo depender el resultado final
del examen realizado. Para que el resultado de un examen sea idealmente significativo, el
espcimen de sangre debe reflejar el estado fisiolgico del paciente en el momento de la
recoleccin. La exactitud y precisin de los datos de un laboratorio, dependen
fundamentalmente de la calidad del espcimen.
Material
Torniquete (Ligadura)
Hisopos o torundas de algodn humedecidas en isopropanol al 70%
Jeringas de plstico estriles (5 mL) o tubos al vaco
Agujas (calibre 22)
Agujas para toma mltiple (Vacutainer)
Soporte para el sistema Vacutainer
Recipiente de plstico que contenga cloro al 0,5% como desactivador
Reactivos
Isopropanol al 70%
Cloro al 0,5%
Procedimiento
1. Preparar la orden de ingreso.

2. Identificar al paciente mediante la confirmacin de su nombre.
3. Verificar el protocolo de trabajo y seleccin de los tubos.
4. Etiquetar los tubos con la identificacin correspondiente del paciente.
5. Posicionar al paciente para que est cmodamente sentado o recostado.
6. Seleccionar el sitio adecuado para la venopuncin.
7. Limpiar la zona con una torunda humedecida en isopropanol al 70%, de manera
circular de adentro hacia afuera o verticalmente en un solo sentido y asegurndose
de girar la torunda.
8. Aplicar un torniquete en la parte superior del brazo con la ligadura de goma 5 cm
arriba de la zona de puncin. Que no exceda de un minuto entre la aplicacin del
torniquete y la puncin.
9. Despus de haber limpiado y antes de realizar la puncin, permtase secar el lugar
elegido. Esta precaucin previene la hemlisis y reduce el dolor por la puncin.
10. Realizar la puncin fijando la vena con el pulgar 2,5 a 5 cm por debajo de la zona e
insertar la aguja, con el bisel hacia arriba, con un ngulo entre 15-30 entre la aguja
y la piel
11. Se insertan los tubos al vaco en el orden correcto de extraccin. Si el tubo contiene
anticoagulante, mezclarlo perfectamente bien con la sangre hasta su total
homogenizacin. En el caso de emplear jeringa se retira un poco el mbolo de la
jeringa, para que la sangre comience a fluir.
22
12. Se retira el torniquete una vez extrada la cantidad de sangre requerida.
13. Colocar la torunda sobre la zona de puncin, sin presionar y se retira la aguja o la
jeringa. Presionar ligeramente sobre la zona una vez retirada la aguja hasta que deje
de fluir sangre.
14. En el caso de extraccin con jeringa se vierte la sangre en los tubos en el orden
correcto. Vaciar la sangre por las paredes del tubo de 13 x 100 mm que contenga o
no anticoagulante, segn se requiera.
15. El material punzocortante generado durante la extraccin de sangre, debe
colocarse en recipientes de colecta apropiados para jeringas, agujas etc., en
caso de que por el momento no se cuente con estos contenedores, colocar las
jeringas y agujas separadamente en un recipiente de plstico que contenga
solucin de cloro al 0.5% durante una hora.
16. Para el lavado final de tubos con sangre y material que haya tenido contacto
con el tejido sanguneo, tambin debe colocarse en los recipientes
desactivadores de Cloro al 0.5% por lo menos 1 hora antes de ser lavados. El
empleo de guantes de ltex es obligatorio para el lavado de todo este tipo de
material.
Nota: Estos dos ltimos pasos del procedimiento se deben efectuar de manera sistemtica
en cada una de las prcticas que se realizaran en este mdulo de Hematologa y que siempre
debern de seguir aqu y en el futuro de sus procedimientos de Laboratorio Clnico.
NO SE VOLVERN A INDICAR AL FINAL DE CADA PROCEDIMIENTO.
Precauciones
Toda muestra de sangre y cualquier otro tipo de muestra biolgica debe manipularse
con extremo cuidado para evitar la contaminacin del analista y del rea de trabajo. Por lo
cual se deben emplear guantes durante todo el proceso y algn otro tipo de proteccin,
como, gogles o gabinetes de seguridad cuando el proceso lo requiera; as como seguir en
todo momento las reglas de seguridad del laboratorio.
Actividades
Adquirir los conocimientos para la adecuada recoleccin de sangre y las

aplicaciones de los procedimientos de seguridad que se deben aplicar en el Laboratorio.
23
MDULO
II
Frmula roja
24
HEMATCRITO
La determinacin del hematcrito se realiza para medir el volumen que ocupan los
eritrocitos en muestras de sangre capilar o venosa. Se mide por medio de centrifugacin y
se expresa como fraccin decimal. Se consideran sinnimos las siguientes expresiones:
volumen de paquete globular (VPG), fraccin del volumen de los eritrocitos y valor del
hematcrito.
La determinacin del hematcrito es un mtodo sencillo y confiable para detectar
presencia o ausencia de anemia o policitemia y presencia de paquetes leucocitarios y
plaquetarios anormales. En realidad, el hematcrito medido por centrifugacin es ms
confiable para el monitoreo de pacientes con policitemia que los calculados con muchos
de los contadores automticos existentes en el mercado.
Para la determinacin del hematcrito existen dos mtodos a escoger: el
Micromtodo y el Macromtodo. Estos mtodos han sido seleccionados por su amplio uso
y por sus niveles aceptables de exactitud y precisin, empleando equipo relativamente
sencillo.
En ambos mtodos se centrifuga una columna de sangre, sin embargo, tanto en el
Micromtodo, como en el Macromtodo, el plasma permanece atrapado entre los eritrocitos
centrifugados e incrementa la longitud aparente de la columna de eritrocitos en 2% en la
sangre normal y an ms en ciertas condiciones anormales, principalmente en la deficiencia
de hierro, talasemia, esferocitosis y la enfermedad conocida como sickle cells (clulas
falciformes o drepanocitos). Esto debe de tomarse en cuenta cuando se requiere un alto
grado de exactitud. Existe un mtodo de referencia para corregir el porcentaje de plasma
atrapado, pero requiere de mucho tiempo y pericia, por lo que es poco prctico para su uso
ocasional en los laboratorios de rutina. Para lo cual el Consejo Internacional para la
Estandarizacin en Hematologa (ICSH) desarroll un mtodo de referencia alternativo,
que resulta prctico para la calibracin de equipos automatizados.
25
Fundamento
En el macro y micro mtodos se centrifuga una columna de sangre dentro de un

tubo uniforme cerrado en uno de los extremos, hasta obtener un paquete de eritrocitos en el
fondo del tubo. La centrifugacin se prolonga hasta que el paquete celular este tan apretado
que al volver a centrifugar en las mismas condiciones se obtenga la misma columna
inalterada.
Material e instrumentos
Sangre venosa con anticoagulante (Macromtodo)
Sangre capilar o venosa con anticoagulante (Micromtodo)
Capilares de vidrio especiales de banda roja (Micromtodo)
Sellador (plastilina)
Mechero Bunsen
Microcentrfuga
Centrfuga clnica
Tubo de Wintrobe (Macromtodo)
Pipeta Pasteur con bulbo o jeringa equipada con aguja larga
Procedimiento
Macromtodo
1. Recolectar 5 mL de sangre venosa con anticoagulante.

2. Homogenizar perfectamente bien la sangre con el anticoagulante por inversin del
tubo (Figura 8).
3. Llenar el tubo Wintrobe de la parte inferior hacia arriba con sangre empleando una
pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no formar burbujas. En caso de que se formen
burbujas, vaciar el tubo con la misma pipeta y llenarlo nuevamente.
4. Despus de retirar la pipeta o la aguja, la columna de sangre debe quedar en la
marca de 100 mm.
5. Centrifugar durante 10 minutos a 2000-2300 g (Ver Tabla 3). En la mayora de los
casos no se completa el empaquetamiento en este periodo, por tanto es necesario
extender el tiempo de centrifugacin hasta 60 minutos.
Tabla No. 3. Revoluciones por minuto requeridas para alcanzar aproximadamente 2000-
2300 g a varias distancias del eje
REVOLUCIONES POR MINUTO
RADIO (cm) 2000g 2300g
15 3400 3600
20 2900 3100
25 2600 2800
26
6. Retirar los tubos de la centrifuga. La altura de la columna de eritrocitos es expresada
como una fraccin de la longitud original de la columna de sangre (100mm=100%),
se lee la columna excluyendo la capa de leucocitos y plaquetas.
7. Para la limpieza de los tubos de Wintrobe, deben de vaciarse de la misma manera
que fueron llenados y con la misma pipeta Pasteur, cada tubo se limpia forzando el
agua hasta el fondo y desplazando la suciedad hacia afuera. Esta operacin debe
hacerse repetidas veces hasta que el tubo quede limpio.
Fig. No. 8. Forma adecuada de mezclar la sangre con el aditivo del tubo.
Micromtodo
1. Mezclar la sangre por inversin del tubo.

2. Los capilares de vidrio se llenan con sangre hasta las dos o tres cuartas partes de su
longitud total.
3. Sellar el extremo seco y opuesto al orificio de llenado con plastilina o mediante el
calor de una flama (en este caso procurar que no se estreche el cuello del capilar y
que est quede plano en la punta).
4. Colocar los capilares en los rieles de la microcentrfuga y asegurarlos, registrar el
nmero de la posicin que ocupan los capilares.
5. Centrifugar de 10000 - 15000g por 5 minutos (en la mayora de los casos las
microcentrfugas ya tienen calibrada esa velocidad durante los 5 minutos que indica
la perilla de la centrifuga).
6. Sacar los capilares de la microcentrfuga. Los capilares se miden uno por uno. Si no
se van a medir inmediatamente, se colocan de manera vertical hasta que se lean.
7. Las mediciones se hacen con respecto a la longitud de la columna de eritrocitos y
pueden hacerse colocando el tubo capilar contra papel milimtrico, o contra una
regla. Las capas de plaquetas o leucocitos se excluyen tanto como sea posible.
8. Cuando la prueba se hace por duplicado con fines de control de calidad, los dos
resultados no deben diferir ms de 2% (0.02 L/L).
Valores de referencia
A nivel de la ciudad de Mxico los valores de referencia oscilan entre:
Agrupacin Mexicana para el Estudio de la Hematologa (AMEH)
27
Hombres: 46-56% (0,46-0,56 L/L)
Mujeres. 39-50% (0,39-0,50 L/L)
Los valores del hematcrito dependen del sexo, de la edad y altura del sitio de
residencia. De conformidad con las recomendaciones ICSH/IFCC/WASP para el uso de
unidades SI en las mediciones del laboratorio clnico debiera expresarse como una fraccin.
Actividades
En la realizacin de esta prctica, se proceder a efectuar solamente el Micromtodo

para el hematcrito.
28
VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN GLOBULAR (VSG)
La VSG es una prueba sencilla, barata e inespecfica empleada desde hace muchos
aos para contribuir al diagnstico de enfermedades inflamatorias, incluyendo infecciones,
cncer y enfermedades autoinmunes. La VSG es un prueba inespecfica porque sus
aumentos indican un probable proceso inflamatorio, degenerativo o necrobitico, pero no el
sitio donde se est desarrollando y mucho menos la causa, adems de que otras causas
diferentes a la inflamacin pueden llevar a un aumento de la VSG. Es por ello que esta
prueba no se puede emplear aisladamente.
La VSG constituye una medida indirecta del grado de inflamacin presente en el
organismo. Mide la velocidad de cada (sedimentacin) de los eritrocitos en el plasma, por
lo cual esta velocidad depende de tres factores principalmente:
1. La composicin protenica del plasma (alteracin en la concentracin de las
protenas plasmticas, as como el aumento de fibringeno o alteracin en la
proporcin entre las distintas fracciones proteicas).
2. El tamao, forma y carga de los eritrocitos.
3. La concentracin de los eritrocitos.
Los resultados se expresan como milmetros de plasma transparente que quedan en

la parte superior de la columna despus de que haya transcurrido una hora. Normalmente,
los glbulos rojos van cayendo lentamente, dejando poca cantidad de plasma transparente.
El hecho de que exista una concentracin elevada de ciertas protenas (como el fibringeno
o las inmunoglobulinas) provoca que los eritrocitos caigan ms precipitadamente, debido a
que se ve afectado el potencial Z (carga negativa) de su membrana por la presencia de las
cargas positivas de estas protenas.
Se ha observado que los eritrocitos sedimentan con ms rapidez en la sangre de las
mujeres que en la de los hombres y mucho ms de prisa despus del tercer o cuarto mes de
embarazo. La aceleracin empieza a las diez o doce semanas y aumenta moderada y
progresivamente para normalizarse alrededor de un mes despus del parto.
La sedimentacin de los eritrocitos se acelera en la tuberculosis y en otras
enfermedades infecciosas crnicas tales como: endocarditis bacteriana subaguda,
espondilitis anquilosante, lupus eritomatoso diseminado y en proporcin a la actividad del
padecimiento, tambin en varias de las llamadas enfermedades del tejido conjuntivo como
la fiebre reumtica, carditis reumtica y la artritis reumatoide. En el cncer, va a depender
de acuerdo con la extensin del proceso maligno. En las inflamaciones agudas localizadas,
donde la velocidad parece aumentar en relacin con el nmero de leucocitos, as como
tambin en las disproteinemias, como por ejemplo, el mieloma mltiple. Adems el
embarazo, la menstruacin y el uso de anticonceptivos orales tambin son causa de
aumento de la VSG.
Se han empleado principalmente dos mtodos para medir la VSG: el mtodo de
Wintrobe y el mtodo de Westergren, siendo este el mtodo recomendado por el CLSI
debido a que permite un tiempo de cada libre ms largo en comparacin con el mtodo de
Wintrobe.
En la actualidad existen pipetas de sedimentacin para realizar el mtodo de
Westergren. Estas pipetas consisten en un tubo calibrado de cristal o material plstico (ms
recomendable) desechable con medidas de longitud (300 1.5 mm) y calibre (2,55 0,15
29
mm) bien definidas, montadas sobre un soporte que puede enroscarse al tubo para
inmovilizar la pipeta en posicin estrictamente vertical.
Existen en el mercado equipos automatizados que permiten obtener resultados en 20
minutos comparables con los obtenidos con el mtodo de Westergren en 1 hora, ejemplo de
estos equipos es el sistema Ves-Matic que posee un sensor optoelectrnico que mide el
cambio de la opacidad de una columna de sangre a medida que se produce la sedimentacin
de la sangre. La aceleracin de la sedimentacin se logra al colocar los tubos en un ngulo
de 18 con respecto al eje vertical.
La mayora de los mtodos automatizados diseados slo estn enfocados a reducir
el tiempo de proceso y las manipulaciones intermedias de la muestra al emplear el mismo
tubo de extraccin como base para introducir la pipeta. Existen algunas microtcnicas, tales
como, Crista, Hellige-Vollmer y la Relacin Z de sedimentacin.
30
Fundamento
Dado que la sangre es una suspensin de elementos formes en plasma, cuando se

deja sangre total anticoagulada en reposo dentro de un tubo perpendicular a temperatura
ambiente, los eritrocitos descienden hacia el fondo del tubo debido a su mayor peso sobre
los dems componentes de la sangre. La determinacin de los milmetros que los eritrocitos
sedimentan se realiza durante un periodo de tiempo dependiendo del mtodo empleado.
Durante este tiempo se observan tres fases:
1. Periodo inicial de agregacin. Durante esta fase se produce el apilamiento y la
sedimentacin es bastante lenta. Dura unos 10 minutos en un perodo de
observacin de 1 hora.
2. Perodo de sedimentacin rpida. Durante este perodo, la velocidad de
sedimentacin es constante y dura unos 40 minutos.
3. El perodo final de concentracin. Persiste hasta el final de la hora y luego ms
tiempo an.
Material
Tubos de Wintrobe
Pipetas Pasteur de punta larga o jeringas equipadas con aguja larga
Bulbos para pipeta Pasteur
Soporte para tubos Wintrobe
Sangre venosa con EDTA
Procedimiento
Mtodo de Wintrobe
1. Recolectar 5 mL de sangre venosa en un tubo con tapn lila, mezclar por inversin
(Figura 8).
2. Llenar el tubo de Wintrobe desde el fondo hacia arriba con sangre empleando una
pipeta Pasteur de punta larga o una jeringa equipada con aguja larga, teniendo
cuidado de no formar burbujas de aire.
3. La sangre debe quedar en la marca superior marcada como 0.
4. Colocar el tubo Wintrobe en posicin perfectamente vertical en un soporte para
tubos de Wintrobe y cuya posicin sea fija. Una vez colocado el tubo en el soporte
este no debe ser sometido a movimientos ni vibraciones.
5. Activar un cronmetro o tomar el tiempo inicial.
6. Al finalizar la hora de sedimentacin se lee la longitud de la columna de plasma que
queda por el desplazamiento de los eritrocitos hacia abajo. La lectura se toma de
arriba hacia abajo y cada marca del tubo corresponde a 1mm.
Nota: Procurar que la prueba sea realizada a una temperatura constante, pues
variaciones en la misma pueden alterar la VSG.
31
Interpretacin
No se han establecido muchos aspectos de la VSG. Est demostrado que es mayor

en las mujeres que en los hombres y que aumenta con la edad. Esto no parece estar
relacionado con niveles ms bajos de hemates o, por lo menos en los hombres, tampoco
con cambios en las protenas del plasma. Segn la interpretacin ms comn, la VSG
acelerada es una respuesta inespecfica a un dao de los tejidos. Esto es tan slo una
indicacin de la presencia de la enfermedad y no refleja muy exactamente la gravedad. Su
utilidad mayor consiste en demostrar la remisin de un proceso inflamatorio. Hay que
servirse de la prueba con sumo cuidado. Es sumamente til para seguir la evolucin de
ciertos procesos inflamatorios, por ejemplo, la tuberculosis y la fiebre reumtica.
Mtodo de Wintrobe
Hombres 0 7 mm 4 mm
Mujeres 0 15 mm 10 mm
Nios 1 15 mm 5 10 mm
Actividades
Realiza la determinacin del hematcrito (Macromtodo).

En caso de que el hematcrito haya resultado por debajo de los valores de
referencia, efectuar la correccin de la lectura segn el Grfico de Wintrobe
Landsberg (Figura 9).
32
100 100
90 90
80 80
70 70
V
S 60 60
G
50 50
40 40
(mm/hora)
30 30
20 20
10 10
0 10 20 30 40 50 60
Hematcrito (%)
Fig. No. 9. Grfico de Wintrobe-Landsberg
Valores de referencia del hematcrito para mujeres
Valores de referencia del hematcrito para hombres
Se busca la lnea horizontal que corresponde a los milmetros de sedimentacin en

una hora. Se sigue esta lnea hasta interceptar la vertical correspondiente al hematcrito,
desde ese punto se sigue la lnea hacia abajo hasta cruzar la curva remarcada en negro. Este
punto de interseccin representa la VSG corregida.
33
HEMOGLOBINA (Hb)
La hemoglobina es la protena eritrocitaria intracelular encargada del transporte de

oxgeno desde los pulmones hacia los tejidos y del transporte del dixido de carbono desde
los tejidos hacia los pulmones. Su propiedad tan extraordinaria de afinidad por el oxgeno
se ve reflejada en el hecho de que cada gramo de hemoglobina puede transportar hasta 1,34
mL de oxgeno.
Cada molcula de hemoglobina est compuesta por un anillo tetrapirrlico que
surge del metabolismo de las porfirinas y que una vez unido a un tomo de hierro forman el
grupo Hem y de dos pares de cadenas polipeptdicas (globinas) de tipo ( o ) o no (,
o ).
Las globinas de tipo son cadenas de 141 aminocidos y los genes que las
codifican estn localizados en el cromosoma 16. Las globinas no se forman de 146
aminocidos y los genes que las codifican se localizan de manera lineal en orden de
activacin en el cromosoma 11. La combinacin por pares de estas globinas da como
resultado distintos tipos de hemoglobina:
1. 22 Hb Portland
2. 22 Hb Gower I Hemoglobinas embrionarias
3. 22 Hb Gower II
4. 22 Hb F
5. 22 Hb A2 Hemoglobinas adultas
6. 22 Hb A
7. 4 Hb de Bart
Hemoglobinas talasemicas
8. 4 Hb H
Los mtodos empleados en hemoglobinometra pueden agruparse en cuatro clases

principales segn su tcnica bsica y sus variantes respectivas: a) colorimtricos, b)
gasomtricos, c) densitomtricos y d) qumicos.
Hay dos mtodos de uso habitual:
a) El mtodo de cianuro de hemoglobina o cianometahemoglobina (HiCN), y
b) El mtodo de la oxihemoglobina (HbO2)
Mtodo de Cianometahemoglobina
En 1967, el ICSH recomend emplear el mtodo colorimtrico de la

cianometahemoglobina basado en el clculo de la absorbancia lumnica de una solucin de
hemoglobina previa transformacin en alguno de sus derivados coloreados. Este mtodo,
tambin fue adoptado de manera oficial por el National Committee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS) en la actualidad CLSI, se caracteriza por su elevada fiabilidad debida
en gran parte a que el patrn primario de HiCN es una solucin muy estable de HiCN cuyas
especificaciones han sido reconocidas por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS).
Este mtodo es el resultado de una necesidad sentida, desde hace mucho, de
mejorar la estandarizacin de las alteraciones de hemoglobina: es actualmente el mtodo de
eleccin. Todas las formas de hemoglobina que pueden encontrarse en la sangre
(oxihemoglobina, hemoglobina reducida, carboxihemoglobina y metahemoglobina, pero no
la sulfametahemoglobina) se convierten ntegramente en cianometahemoglobina son las
ms estables de los diversos pigmentos hemoglobnicos. Puede afirmarse que las soluciones
34
de cianometahemoglobina se mantienen estables no menos de 6 meses en congelacin. La
banda de absorcin de la cianometahemoglobina en la regin de 540 nm es ms bien ancha
que estrecha.
Los colormetros fotoelctricos permiten determinar la hemoglobina con exactitud
de 1 al 2 % en sistemas automatizados y 2 a 5 % en tcnicas manuales estndar.
35
Fundamento
La sangre se hemoliza por agregado de un agente tensoactivo. Se emplea una

solucin con ferricianuro y cianuro de potasio. El ferricianuro convierte el hierro ferroso de
la hemoglobina en frrico para formar metahemoglobina, que se combina con el cianuro
potsico para formar cianometahemoglobina estable. Esta determinacin involucra la
dilucin de la cianometahemoglobina 1:251. La solucin clara y estable de la
cianometahemoglobina tiene un espectro de absorcin con un pico mximo relativamente
plano alrededor de 540 nm. Las mediciones en absorbancia obtenidas en esta solucin, con
los espectrofotmetros, sigue tpicamente la Ley de Lambert y Beer a travs de un amplio
rango de concentracin.
K3Fe(CN)6 KCN
Hb(Fe2+) metahemoglobina(Fe3+) cianometahemoglobina
La absorbancia de la cianometahemoglobina a 540 nm es directamente proporcional

a la concentracin de Hb
Sangre venosa con anticoagulante
Pipeta de Sahli de 0.02 mL (20 L)
Boquilla
Pipetas volumtricas de 1, 2, 3, 4, y 5 mL
Celdas espectrofotomtricas
Espectrofotmetro
Reactivos
Solucin diluyente de Drabkin
Estndar de cianometahemoglobina
Procedimiento
Preparacin de la curva estndar de Hb
1. Realizar las diluciones en 6 tubos de ensayo de 13 x 100 mm como se muestra en la

tabla 4.
Tabla No. 4. Curva de calibracin para la determinacin de Hemoglobina
No. de tubo Vol. Drabkin Vol. estndar Absorbancia Concentracin
(mL) (mL) de Hb (g/dL)
Blanco 5.0 0.0
1 4.0 1.0
2 3.0 2.0
3 2.0 3.0
4 1.0 4.0
5 0.0 5.0
2. Colocar las diferentes diluciones de los tubos en celdas espectrofotomtricas.
36
3. Medir la absorbancia de los tubos 1, 2, 3, 4 y 5 respectivamente, usando el tubo
indicado como blanco y leyendo a 540 nm.
4. La siguiente frmula se emplea para calcular la concentracin de hemoglobina en
g/100 ml. Para completar los espacios correspondientes en la Tabla 4.
3
Hb(g/dL) = Volumen del estndar X concentracin del estndar (g/dL) X 251
Volumen total
251 = dilucin de sangre
Muestra problema
1. Recolectar 5 mL de sangre venosa en un tubo con tapn lila y mezclar por

inversin.
2. Colocar 5 ml del reactivo diluyente de Drabkin en un tubo de ensayo de 13 x 100
mm con una pipeta volumtrica.
3. Llenar la pipeta de Sahli con la muestra de sangre venosa hasta la marca de 0.02 mL
(20 L). En caso de utilizar el mtodo de puncin capilar, tomar la muestra
directamente de la herida.
4. Limpiar la sangre adherida al exterior de la pipeta de Sahli.
5. Descargar el contenido de la pipeta de Sahli en los 5 mL de la solucin diluyente de
Drabkin, enjuagando ah mismo tres veces la pipeta, aspirando y expeliendo
cuidadosamente, a fin de arrastrar toda la sangre de las paredes internas de la pipeta
de Sahli. La dilucin es de 1:251.
6. Mezclar la sangre con la solucin reactiva por burbujeo brusco con la misma pipeta
Sahli, con la ayuda de un agitador mecnico tipo vortex o mediante rotacin brusca
del tubo.
7. Dejar reposar la mezcla durante 10 minutos para que la conversin de la
hemoglobina en cianometahemoglobina sea total.
8. Colocar la solucin de cianometahemoglobina en las celdas espectrofotomtricas.
9. Medir la absorbancia de la solucin de cianometahemoglobina, usando la solucin
diluyente de Drabkin como blanco y leyendo a 540 nm.
3
La concentracin del Estndar comercial depender de la concentracin que este indicada en la etiqueta.
37
Hb(g/dL)
Edad Hombres Mujeres
Primera semana de vida 17-21 17-21
1 semana a 2 meses 11-17 11-17
2 a 12 meses 11-15 11-15
1 a 3 aos 10-15 10-15
3 a 8 aos 11-15 11-15
8 a 15 aos 11-16 11-16
15 aos en adelante 15.5-19.5 12.5-16.6
Actividades
Determinar la concentracin de hemoglobina en g/dL a cada una de las diluciones

de la Tabla 4 (tubo 1, 2, 3, 4, y 5), utilizando la frmula indicada.
Con los datos de concentracin de hemoglobina (g/dL) de cada dilucin y su
correspondiente lectura de absorbancia, trazar grfica de A = f[C] en papel
milimtrico y ajustar los puntos.
Interpolar la lectura de absorbancia de la muestra problema con la grfica obtenida
de la curva estndar para obtener el resultado de Hemoglobina en g/dL.
38
RECUENTO DE ERITROCITOS
Los recuentos celulares anteriormente se realizaban con mtodos manuales siendo el

corazn de esta prueba los hemocitmetros o cmaras contadoras, hoy en da se emplean
equipos electrnicos que pueden ser semiautomatizados o automatizados.
El principio del recuento celular manual es sencillo y similar para eritrocitos,
leucocitos y plaquetas, solo varan la dilucin, el diluyente y el rea contada. Hasta hace
poco el recuento se expresaba en cantidad por mm3, por el volumen obtenido en el
hemocitmetro, el cual se determina mediante medidas lineales, y actualmente se expresan
en litros (L), pues los equipos automatizados cuentan una mayor cantidad de clulas
suspendidas en una solucin diluyente isotnica.
Los principios generales de estas mediciones son:
1. Escoger un lquido de dilucin que no solamente diluya los eritrocitos hasta cifras
legibles, sino tambin permita identificarlos de una u otra manera, o destruya otros
elementos celulares.
2. Emplear una cmara de recuento de glbulos, o un contador electrnico, que
presentan al observador o al aparato de lectura los glbulos en forma tal que se
pueda establecer el nmero de ellos por unidad de volumen de lquido. El contador
electrnico de glbulos evita el error humano, y al contar un mayor nmero de
glbulos, resulta estadsticamente ms preciso.
Recuento manual
Hemocitmetro o cmara de conteo
La cmara de conteo es un aparato de vidrio ptico especial de precisin, se emplea

para contar clulas o partculas en suspensin. Es una placa rectangular gruesa del tamao
de un portaobjetos, con dos superficies elevadas separadas por una hendidura en forma de
H (Figura 10).
Las prominencias transversales estn localizadas a cada lado de la zona rayada.
Sobre las prominencias transversales se coloca un cubreobjetos plano estandarizado y
pticamente corregido. Entre la superficie inferior del cubreobjetos y la superficie de la
zona rayada existe una profundidad de 0.1 mm. Suelen utilizarse los hemocitmetros con
rayado de Neubauer modificado.
Esta cmara consta de un cuadro primario que mide 3x3 mm (9 mm2), subdividido
en nueve cuadros secundarios, cada uno de 1x1 mm (1 mm2). Los cuatro cuadrados
secundarios de las esquinas llamados A, B, C y D que muestra la Figura 11, se emplean
para el recuento de leucocitos y se subdividen en 16 cuadros terciarios cada uno de ellos
respectivamente.
El cuadro milimtrico central E, est subdividido en 25 cuadros cuaternarios, y cada
uno de los cuales mide 0.2x0.2 mm. Cada uno de estos cuadros est subdividido
ulteriormente en 16 cuadros ms pequeos. El nmero total de cuadros pequeos del cuadro
central suman 400 (25x16). Como regla, cinco de los cuadros terciarios equivalen a 80 de
los cuadros ms pequeos (5x16) se emplean para el recuento de eritrocitos y se marcan
como 1, 2, 3, 4 y 5 (Figura 11).
39
Fig. 10. Cmara de Neubauer y un primer plano de las reas de conteo como se ven en el
microscopio. Los cuadros marcados con una W se emplean para contar leucocitos y los
que estn marcados con una R para eritrocitos.
Pipeta para diluir los eritrocitos
La dilucin de la muestra se puede hacer con una pipeta de Thoma o por el sistema
de dilucin en tubo.
Las pipetas de cristal de Thoma constan de un tubo capilar graduado, dividido en 10
partes y marcado con un 0,5 en la quinta seal y con 1 en la dcima, y por encima un
ensanchamiento, ampolla o pera para mezcla, con una bolita de cristal en su interior de
color rojo indicando su uso para eritrocitos y blanca para el uso de leucocitos, y por encima
de la pera otro tubo capilar corto con una marca de 101 grabada en la pipeta para recuento
de eritrocitos y de 11 en la de recuento de leucocitos. El volumen para la pipeta de
eritrocitos est constituido por una parte a nivel de la marca 1 y 100 partes en la ampolla, o
una parte a nivel de la marca 0,5 y 200 partes en la ampolla.
Cuando la sangre es aspirada hasta la marca de 0,5 y el lquido de dilucin, hasta la
marca de 101, todas las clulas sanguneas se lavan en la ampolla y la dilucin resultante en
el mismo es de 1 a 200. La parte capilar de la pipeta no contiene sangre, sino slo liquido
diluyente; por consiguiente, no est incluido en el volumen y su contenido debe ser
expulsado antes que la suspensin de eritrocitos se introduzca en la cmara de recuento.
Lquido diluyente
El lquido debe ser isotnico para evitar la lisis y la crenacin de los eritrocitos.
Debe contener un fijador para preservar la forma de las clulas y prevenir la aglutinacin y
autolisis, si y solo si, el recuento no puede ser llevado a cabo dentro de una hora.
40
Existen diversos tipos de lquidos de dilucin utilizados en el Laboratorio. Dentro
de los ms comunes se encuentra la solucin de Gower y la de Hayem, otros tambin
utilizados con cierta frecuencia son la solucin de Toison y la solucin de Daice. Utilizando
estas soluciones se evita la formacin de conglomerados y apilamientos de eritrocitos. Los
leucocitos no llegan a destruirse y, aunque se cuenten a la vez que los hemates, no se
originar demasiada variacin en el nmero total de eritrocitos contados.
El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a
mltiples causas, algunas de estas pueden ser:
Errores de extraccin: dilucin o hemoconcentracin de la muestra. Hemlisis o
coagulacin parcial.
Mala homogenizacin de la muestra.
Utilizacin de material mal calibrado, sucio o hmedo.
Errores en la dilucin de la muestra.
Cmara de Neubauer no calibrada, sucia o mojada.
Llenado incorrecto de la cmara de Neubauer.
Empleo de cubrehematimtro descalibrado.
Errores del analista durante el recuento y clculos realizados.
Debido a esto y al empleo de equipos automatizados, el recuento de eritrocitos

manual se realiza en raras ocasiones y adems este puede ser substituido por parmetros
eritrocticos manuales ms exactos, como el microhematocrito y la Hb, pues estos
parmetros guardan una estrecha relacin.
La regla del tres
Est regla slo es vlida para muestras con eritrocitos de morfologa normal. El
valor de la Hb debe ser tres veces el del recuento de eritrocitos.
Recuento de eritrocitos x 3 = Hb
41
3mm
A B
1mm
1 2
E
5
3 4
C D
0.2mm
Fig. No. 11. Cuadricula microscpica de la cmara de Neubauer
42
Fundamento
El recuento manual de eritrocitos incluye la aspiracin de una cantidad muy exacta

de sangre anticoagulada en una pipeta de Thoma escrupulosamente limpia, posteriormente
se diluye la sangre hasta la seal determina de 101 de la misma pipeta con un liquido que es
isotnico respecto a los eritrocitos. Despus de efectuar una adecuada mezcla la solucin
resultante se coloca en una cmara de recuento muy limpia (hemocitmetro) y se cubre con
cubreobjetos estandarizado, pticamente plano y limpio. La cantidad de eritrocitos en un
volumen dado se cuenta sobre la platina de un microscopio de luz.
El recuento eritrocitario total slo se calcula exactamente cuando se tienen en cuenta
las dimensiones hemocitmetrocubreobjetos y las diluciones de la pipeta. Es decir, que se
calcula mejor el nmero de eritrocitos por milmetro cbico de sangre cuando se tiene en
cuenta el rea contada, la profundidad de la cmara y la dilucin segn la frmula
siguiente:
Dilucin
Eritrocitos/mm3 = N x
Volumen
N = Nmero de clulas contadas
Volumen = lado x lado x profundidad = mm3
Dilucin = 1:200 1:100
Sangre con EDTA
Boquilla
Pipeta de Thoma para eritrocitos
Agitador para pipetas de Thoma
Cmara de Neubauer
Cubrehemocitmetro
Microscopio
Reactivos
Lquido de Hayem
Procedimiento
1. Recolectar 5mL de sangre venosa en un tubo con EDTA, y mezclar por inversin.
2. Con la pipeta en posicin horizontal aspirar sangre hasta la marca de 0,5. El exceso
de sangre se elimina tocando la punta de la pipeta con una gasa.
3. Limpiar la sangre adherida a las paredes externas de la pipeta con una gasa
procurando no tocar la punta de la pipeta.
4. Introducir la pipeta en forma vertical en el lquido de Hayem y aspirar diluyente
hasta la marca de 101. Si se aspira mas diluyente se desecha todo el contenido de la
pipeta en un recipiente con cloro y se inicia nuevamente con el paso 2.
5. Retirar el adaptador de la boquilla obturando con parafilm la punta de la pipeta para
evitar la prdida de lquido, colocar parafilm en el extremo opuesto a la punta y
43
manteniendo la pipeta siempre en posicin horizontal se coloca en el agitador
mecnico durante 3 4 minutos.
6. Colocar el cubreobjetos sobre las dos superficies elevadas de la cmara para cubrir
las dos cuadriculas.
7. Desechar las primeras 4 6 gotas de la pipeta para eliminar el diluyente que queda
en el capilar y que no diluye la muestra.
8. Cargar ambos lados de la cmara, manteniendo la pipeta en un ngulo de 45 tocar
con la punta el borde del cubreobjetos donde se junta con la superficie elevada de la
cmara. El hemocitmetro se llena por capilaridad, el flujo de llenado debe ser
constante y sin que este llene la hendidura en forma de H de la cmara.
9. Colocar el hemocitmetro en la platina del microscopio y dejar reposar de 3 a 5
minutos, para dar tiempo a que las clulas se distribuyan y se asienten en el fondo
de las cuadriculas.
10. Con el objetivo de 10X se localiza el cuadro central E y se comprueba que las
clulas estn distribuidas uniformemente.
11. Una vez enfocado el cuadro central, con el objetivo de 40X se cuentan los cuadros
marcados del 1-5 mostrados en la Figura 11.
12. Se comienza a contar las clulas contenidas en el cuadro terciario superior izquierdo
marcado como 1 y se sigue el orden establecido de los nmeros marcados en la
Figura 11.
13. El conteo de las clulas en los 16 cuadros cuaternarios de cada cuadro terciario se
realiza como se muestra en la Figura 12.
Contadas
No contadas
Fig. No. 12. Slo se cuentan las clulas en gris, discriminando las clulas que tocan las
lneas triples inferior y derecha, y que estn marcadas nicamente como halos. (Cuadro
terciario con 16 cuadros cuaternarios)
14. Se anotan separadamente el nmero de eritrocitos en cada cuadro terciario contado y
se suma el resultado de los 5 cuadros.
15. Determinar la cuenta total de eritrocitos/mm3, empleando la frmula:
Eritrocitos/mm3 = N x 200
5(0.2mm)2(0.1mm)
44
N = Eritrocitos contados
5 = Cuadros terciarios contados
(0.2)2 = rea de cuadro terciario
0.1 = altura de la cmara
200 = dilucin de la muestra
Eritrocitos/mm3 = N X 10000
10000 = Factor (depende de la dilucin empleada)
16. Lavar las pipetas de Thoma una vez con agua corriente y tres veces con agua
destilada.
17. El hemocitmetro y los cubreobjetos deben limpiarse sumergiendo en agua tibia y
nunca secados con gasa o pauelos para evitar que se rayen. Una vez limpios deben
dejarse secar al aire antes de guardarse.
Recuento de eritrocitos X106/L

Edad Hombres Mujeres
Primera semana de vida 4,50-6,50
2 meses 3,60-5,00
1 ao 3,50-5,50
1-3 aos 4,00-5,50
3-8 aos 4,10-5,50
8-15 aos 4,10-5,70

15 aos en adelante 5,00-6,30 4,10-5,70
Actividades
Realizar las pruebas de hematcrito y hemoglobina adems del recuento de

eritrocitos.
En base a las tres pruebas realizadas en el laboratorio (Hto, Hb y cuenta de
eritrocitos) calcular los ndices eritrocitarios (VCM, HCM Y CHCM).
45
NDICES ERITROCITARIOS
Los ndices eritrocticos han adquirido fiabilidad con el empleo del recuento
electrnico de los eritrocitos, la hemoglobinometra estandarizada y la tcnica del
microhematcrito. En consecuencia, estos ndices habran de calcularse en todo paciente
anmico, a fin de confirmar la impresin que en el frotis se ha obtenido acerca del tamao
celular y el contenido de hemoglobina.
Wintrobe calcul tres ndices relacionados con la serie roja y que hacen referencia al
volumen de los eritrocitos y a su contenido hemoglobnico. Debido a que se ha tenido un
gran inters hematolgico, se han seguido utilizando desde entonces. Su clculo se realiza a
partir del valor de hematcrito, de la concentracin de hemoglobina y del nmero de
eritrocitos por unidad de volumen.
Los ndices de Wintrobe son tres: el volumen corpuscular (o globular) medio
(VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la concentracin de hemoglobina
corpuscular media (CHCM).
Volumen corpuscular medio (VCM)
En las pocas en que los recuentos hematolgicos se practicaban manualmente, el

volumen corpuscular medio (VCM) era un valor calculando al dividir el hematcrito (%)
por la cifra de eritrocitos. Con el mtodo utilizado ms frecuentemente en la actualidad, el
recuento instrumental, el VCM se mide directamente con gran precisin; dicho mtodo se
basa en las variaciones de intensidad de la seal segn el volumen de cada eritrocito,
variaciones que registra el aparato de medicin. El valor medio de referencia del VCM es
de 90 fL (el femtolitro 10-15 L), siendo los lmites de referencia de 80 a 100 fL. Un VCM
bajo equivale a microcitosis, y uno elevado, a macrocitosis. Debido a que la valoracin del
tamao de los hemates es fundamental para el diagnostico de una anemia, el VCM es el
ms importante de todos los ndices eritrocitarios (an en los casos en los que la cifra de
eritrocitos sea normal, debe anotarse la cifra del VCM en el informe hematolgico, ya que
la anemia declarada puede ir precedida de una anomala en el tamao de los eritrocitos). Su
determinacin se efecta mediante la siguiente frmula:
VCM (fL)= Hto (%) x 10
Recuento de eritrocitos (1012/L)
Hemoglobina corpuscular media (HCM)
La hemoglobina corpuscular media (HCM) es el peso medio de la hemoglobina que

contiene cada eritrocito; se calcula dividiendo la cifra de hemoglobina (g/dL) con la cifra de
eritrocitos. Los lmites de referencia oscilan entre 27 y 34 pg (picogramos 10-12 g).
Aunque el peso de la hemoglobina que existe en un eritrocito depende al mismo tiempo de
la concentracin de aqulla en el interior de ste y del volumen del eritrocito, las grficas
en las que se relacionan los valores instrumentales de HCM y VCM ofrecen una relacin
lineal dentro de una amplia gama. Al parecer, la concentracin de hemoglobina no vara
ms que en aquellos trastornos en los que exista una gran alteracin de la sntesis de Hb. Es
por ello que, con el recuento electrnico, la HCM se ha convertido en un dato superfluo
para el clnico, que sirve solamente para confirmar el VCM medido directamente. No
obstante, es un parmetro til para el personal del laboratorio, como comprobacin de la
46
precisin alcanzada por el aparato de medicin. La HCM se calcula mediante la siguiente
frmula:
HCM (pg)= Hb (g/dL) x 10
Recuento de eritrocitos (1012/L)
Concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM)
Aunque la hemoglobina est presente slo en el interior de los eritrocitos, stos se

lisan para medir la concentracin de hemoglobina, y los resultados se expresan en relacin
a decilitros (dL) de sangre total. Para convertir este valor en concentracin de hemoglobina
dentro del eritrocito concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM)- se divide
la cifra de hemoglobina (g/dL) por la de hematcrito (%), es decir por el volumen de sangre
total que ocupan los eritrocitos. Los lmites de referencia de la CHCM oscilan entre 32 y 36
g/dL de eritrocitos (expresado habitualmente, de forma simple, como 32 36 %).
Antes del advenimiento de los recuentos electrnicos, se hallaba generalmente una
CHCM baja cuando los eritrocitos observados en una extensin sangunea presentaban
palidez central de mayor tamao que el habitual, es decir, que aparecan hipocrmicos. La
hipocroma se acepta, por consiguiente, como prueba visual de una concentracin reducida
de hemoglobina en los eritrocitos. Sin embargo, el hematcrito obtenido manualmente
mediante centrifugado de la sangre puede dar resultados falsamente elevados en un paciente
anmico, por atrapamiento del plasma dentro de la columna de eritrocitos. Cuando el
hematcrito instrumental (calculado a partir de los valores, medido con gran precisin,
VCM y de la cifra de eritrocitos) reemplazo al obtenido manualmente, se hallaron
resultados dentro de los valores de referencia de CHCM en pacientes cuyos eritrocitos eran
moderada, pero claramente hipocrmicos en el frotis sanguneo. Al parecer, por
consiguiente, la hipocroma moderada no se debe a una baja concentracin de hemoglobina
en los eritrocitos, sino a la presencia de unos eritrocitos ms pequeos y delgados de lo
normal.
Paradjicamente, la correccin del error del hematcrito, mediante la utilizacin de
los datos instrumentales para el clculo de la CHCM, ha disminuido la utilidad clnica de
sta, ya que sus valores han dejado de estar fuera de los valores de referencia en la fase
precoz de la anemia ferropnica. As, las cifras bajas de CHCM por recuento instrumental
se encuentran solamente en los pacientes con una gran alteracin de la sntesis de
hemoglobina, por ejemplo, anemia ferropnica grave o trastorno talasmico mayor. No
obstante, dado que estos pacientes se identifican fcilmente por la acusada disminucin del
VCM y la intensa hipocroma que presentan en el frotis sanguneo, la determinacin de la
CHCM se ha convertido tambin en superflua en estos casos. La CHCM corresponde a la
media de la concentracin de hemoglobina en cada eritrocito, y se determina mediante la
siguiente frmula:
[Hb (g/dL) x 100]

CHCM (g/dL)=
Hto (%)
47
Fundamento
El clculo de estos tres ndices eritrocitarios (VCM, HCM y CHCM), siguen siendo
una herramienta en la clasificacin de las Anemias, y esto en base al tamao del eritrocito y
a la concentracin de hemoglobina.
Actividades
En base a la prctica anterior en la cual se realiz la determinacin de hematcrito,

hemoglobina y recuento de eritrocitos, calcular los ndices eritrocitarios.
48
CUENTA TOTAL DE LEUCOCITOS
En el recuento total de leucocitos no existe distincin entre los cinco tipos de clulas
(neutrfilos, linfocitos, monocitos, eosinfilos y basfilos, en orden decreciente de
cantidad). Cada tipo de clula tiene su funcin particular en la defensa del organismo contra
las amenazas exgenas.
Los mtodos para el recuento leucocitario y los principios generales de estas
mediciones son los mismos que para los ya mencionados en el recuento eritrocitario.
Recuento celular manual
Hemocitmetro
En este mtodo suelen utilizarse los hemocitmetros con rayado de Neubauer

modificado (Ver figura 11). La zona rayada de la cmara es un cuadrado de 3 mm por lado.
Este cuadrado est dividido en 9 cuadros de 1x1 mm llamados cuadros secundarios. Los
leucocitos se cuentan en los cuatro cuadrados secundarios de las esquinas: A, B, C y D.
Cada cuadro secundario de las esquinas de la zona rayada est dividido en 16 cuadros, cada
uno de los cuales miden de 0,25 x 0,25 mm, y se llaman cuadros terciarios. Entre la
superficie inferior del cubrehematmetro y la superficie de la zona rayada de la cmara
existe una profundidad de 0,1 mm.
Pipetas para diluir los leucocitos
La pipeta automtica de Trenner tiene una pequea perla blanca y la seal 21 sobre
la ampolla. Se fabrica uniendo una ampolla con el extremo de un tubo capilar alargado
cuyo extremo superior termina bruscamente en una superficie pulida perpendicular al eje
longitudinal. Tiene la ventaja de que el tubo capilar puede llenarse por capilaridad y la
sangre se detiene exactamente en el extremo del tubo, con lo que se obtiene un control
exacto de la columna sangunea. Sin embargo, estas pipetas son ms caras y frgiles que las
dems.
El sistema Unopette se ha establecido para evitar las principales fuentes de error: la
introduccin exacta de la sangre hasta la seal y el hacer una dilucin exacta. Este sistema
utiliza una micropipeta de vidrio con autollenado que es desechable, combinada con un
recipiente de plstico y previamente llenado con un diluyente adecuado.
La pipeta de Thoma tiene un tubo y una ampolla para mezclar. El tubo est dividido
en 10 partes que miden el volumen de muestra de sangre. La graduacin quinta y dcima
estn marcadas como 0,5 y 1 respectivamente. La ampolla de la mezcla se extiende desde la
marca de 1 a la de 11. Contiene una bolita blanca que ayuda a mezclar. El volumen de la
ampolla es de 20 veces el tubo en la marca de 0,5 y 10 veces el del tubo en la marca de 1.
Si se aspira sangre hasta la marca de 1 y lquido diluyente hasta 11, dicho factor ser de 10.
Lquido diluyente
El lquido diluyente debe disolver los eritrocitos para que no se obscurezcan los
leucocitos. El ms sencillo es una solucin de cido actico al 2 3%, con una cantidad de
violeta de genciana suficiente para dar un color azul violeta plido. La solucin hipotnica
49
de cido actico destruye los eritrocitos. Puede utilizarse el lquido de Trk. El violeta de
genciana permite reconocer fcilmente el lquido, y observar mejor los leucocitos, a los que
tie ligeramente.
50
Fundamento
El mtodo general hemocitomtrico comprende el empleo de una solucin

hipotnica cida que hemoliza los eritrocitos, pero que no altera los leucocitos o clulas
nucleadas (con o sin tincin nuclear). La solucin cida se utiliza para diluir la sangre en
una pipeta especial para leucocitos. Los leucocitos se tien ligeramente para observarse
mejor. La mezcla de lquido y sangre anticoagulada se coloca en el hemocitmetro (cmara
de recuento), se cubre con un cubreobjetos especial (cubrehemocitmetro) y se deja en
reposo para que se estabilicen los leucocitos. A continuacin se efecta el recuento
leucocitario en el microscopio.
El recuento de los leucocitos totales solo se calcula exactamente cuando se tienen en
cuenta las dimensiones del espacio de la cmara-cubrehemocitmetro y las diluciones de la
pipeta. Se calcula mejor el nmero de leucocitos por milmetro cbico de sangre cuando se
toma en cuenta el rea contada, la profundidad de la cmara y la dilucin segn la frmula
siguiente:
Dilucin
Leucocitos/mm3 = N x
Volumen
Dilucin = 1:20 1:10
Sangre con EDTA
Boquilla
Pipeta de Thoma para leucocitos
Cmara de Neubauer
Cubrehemocitmetro
Microscopio
Reactivos
Lquido de Trk
Procedimiento
1. Recolectar 5mL de sangre venosa en un tubo con EDTA, y mezclar por inversin.
4. Introducir la pipeta en forma vertical en el lquido de Trk y aspirar diluyente hasta
la marca de 11. Si se aspira mas diluyente se desecha todo el contenido de la pipeta
en un recipiente con cloro y se inicia nuevamente con el paso 2.
51
mecnico durante 3 4 minutos.
9. Colocar el hemocitmetro en la platina del microscopio y dejar reposar de 3 a 5
minutos, para dar tiempo a que las clulas se distribuyan y se asienten en el fondo
de las cuadriculas.
10. Con el objetivo de 10x se localizan los cuatro cuadros secundarios y se comprueba
que las clulas estn distribuidas uniformemente. En caso contrario se carga otra
cmara.
11. Se cuentan los leucocitos en cada uno de los cuadros marcados como A, B, C y D
mostrados en la Figura 11.
12. El conteo de las clulas en los 16 cuadros que forman cada cuadro secundario se
realiza como se muestra en la Figura 13.
Contadas
No contadas
Fig. No. 13. Slo se cuentan las clulas en gris, discriminando las clulas que tocan las
lneas triples inferior y derecha, y que estn marcadas nicamente como halos.
(Cuadro secundario con 16 cuadros terciarios)
13. Se cuentan separadamente el nmero de leucocitos en cada cuadro secundario y se

suman los resultados. El recuento de cada cuadro no debe variar en ms de 10
clulas.
14. Calcular el nmero de leucocitos/mm3 con la siguiente frmula:
52
20
Leucocitos/mm3 = N x
4(1mm2)20,1mm
N = Nmero de leucocitos contados
Dilucin = 1:20 1:10
No. de leucocitos/mm3 = N X 50
50 = Factor
15. Los eritroblastos no se lisan por lo cual deben contarse juntamente con los
leucocitos y posteriormente debe corregirse la cuenta total de leucocitos mediante la
siguiente frmula: 100
Leucocitos/mm3 = N x 100 + % eritroblastos en cuenta
diferencial
16. Si la cuenta de leucocitos es menor de 4000/mm3, es preferible hacer nuevamente la
cuenta de leucocitos pero con una dilucin 1:10, si por el contrario la cuenta es muy
elevada se debe emplear una dilucin 1:100 o 1:200 con la pipeta para eritrocitos.
17. Lavar el material empleado como se indico en la prctica para el recuento de
eritrocitos.
Edad Leucocitos X103/L

Neonatos 10000-30000
Lactantes 7000-17000
Nios pequeos 6000-15000
Escolares 5000-12000
Adultos 4000-12000
53
RECUENTO PLAQUETARIO
Las plaquetas son los elementos formes ms pequeos de la sangre. Actan en la

hemostasia y en el mantenimiento de la integridad vascular, adems de participar en el
proceso de la coagulacin sangunea.
Las plaquetas son difciles de contar debido a que son pequeas y deben distinguirse
de los restos y desperdicios celulares. Otra fuente de dificultad reside en su tendencia de
adherirse al cristal, a cualquier cuerpo extrao y en particular unas a otras. Adems, las
plaquetas no estn uniformemente repartidas por la sangre. El error es mucho mayor que en
el recuento de leucocitos y eritrocitos, pero es despreciable en la prctica porque solamente
se valoran las grandes variaciones en el nmero de plaquetas.
Existen dos mtodos para su cuantificacin: el Mtodo directo y el Mtodo
indirecto.
Mtodo directo
A este mtodo pertenecen las siguientes tcnicas: La de Rees-Echer utilizando

microscopio de luz; el hemocitomtrico; el mtodo Unopette; el mtodo de microscopio de
contraste de fases y el mtodo de recuento electrnico, especialmente el del Contador
Coulter.
El pequeo tamao de las plaquetas hace que el recuento directo en un
hemocitmetro sea ms difcil que cuando se trata de otras clulas. En este mtodo directo
con cmara de recuento, se mezcla la sangre venosa o capilar en una pipeta de Thoma para
eritrocitos con un lquido diluyente (oxalato de amonio). De los otros mtodos ya se han
indicado con anterioridad algunos de ellos y sus principios fundamentales. Hoy en da este
mtodo tambin puede realizarse mediante citometra de flujo, por emplear marcadores de
membrana especficos de las plaquetas (CD42b=GpIb, CD41=GpIIb/IIIa y CD61=GpIIIa)
lo hace un mtodo muy especifico pero tambin muy caro por el empleo de anticuerpos
monoclonales unidos a fluorocromos.
Mtodo indirecto
El nmero de plaquetas se calcula durante la cuenta diferencial leucocitaria. Con

sangre capilar se realizan extensiones sanguneas, las cuales deben ser uniformes y llevarse
a cabo con gran rapidez despus de obtener la sangre, con objeto de evitar la aglomeracin
de las plaquetas y minimizar la disminucin debida a la adherencia de las mismas a los
bordes de los vasos lesionados. Es posible un mejor clculo examinando las extensiones
teidas procedentes de sangre venosa anticoagulada con EDTA, en la cual las plaquetas se
distribuyen uniformemente y la aglomeracin y prdida debidas al proceso hemostsico no
tiene lugar. A la extensin sangunea se le practica la tincin de Wright al igual que en un
recuento diferencial rutinario. A la vez que se cuentan los eritrocitos se efecta el recuento
de plaquetas hasta que sean contados por lo menos 1000 eritrocitos. El nmero de plaquetas
se calcula a partir de la relacin entre el nmero de eritrocitos total y el de plaquetas; el
nmero de eritrocitos se calcula con un hemocitmetro.
Recuento de eritrocitos/mm3
Plaquetas/mm3= 1000 x cuenta de plaquetas en el frotis
54
Por consiguiente, cuando se informa acerca de un recuento diferencial, debe hacerse
referencia especial a las anormalidades plaquetarias o alteraciones en su nmero, si existen.
55
Fundamento
En el mtodo directo con cmara de recuento, se mezcla la sangre capilar o venosa

anticoagulada en una pipeta de Thoma para eritrocitos. Es preciso actuar con rapidez para
evitar la aglutinacin de las plaquetas; las dems clulas pueden o no destruirse segn el
lquido de dilucin utilizado. Con frecuencia, suelen persistir los eritrocitos, y las plaquetas
se cuentan en un hemocitmetro.
Para el clculo del recuento de plaquetas/mm3, y bajo las condiciones especficas
del rea contada, profundidad de la cmara y la dilucin, se realiza segn la frmula
siguiente: Dilucin
Plaquetas/mm3 = N x Volumen

Dilucin = 1:200 1:100
Material e instrumento
Sangre con EDTA
Boquilla
Pipeta de Thoma para eritrocitos
Cmara de Neubauer
Cubrehemocitmetro
Microscopio
Reactivos
Oxalato de amonio al 1%
Procedimiento
1. Recolectar 5mL de sangre venosa en un tubo con EDTA, y mezclar por inversin
(Figura 8).
4. Introducir la pipeta en forma vertical en la solucin de oxalato de amonio al 1% y
aspirar diluyente hasta la marca de 101. Si se aspira mas diluyente se desecha todo
el contenido de la pipeta en un recipiente con cloro y se inicia nuevamente con el
paso 2.
mecnico durante 15 minutos.
56
9. La cmara cargada se coloca dentro de una caja de Petri cuyo fondo contiene un
disco de papel filtro o algodn hmedo para prevenir la evaporacin. Se deja
sedimentar durante 15-20 minutos.
10. Despus de este tiempo se deja reposar 10 minutos ms fuera de la caja de petri y se
coloca en la platina del microscopio para localizar el cuadro E.
11. Las plaquetas se cuentan en 10 cuadros terciarios mostrados en la Figura 14.
Fig. No. 14. Se cuenta las plaquetas contenidas en los 10 cuadros marcados en gris en la
misma forma como se explico para eritrocitos. Si el nmero de plaquetas contadas es
menor a 100, se cuentan ms cuadros terciarios hasta registrar por lo menos 100
plaquetas. (Cuadro secundario donde se marcan en gris 10 cuadros terciarios que
contienen 16 cuadros cuaternarios)
12. El conteo se realiza con el objetivo de 40X. Las plaquetas tienen un aspecto redondo
u oval y algunas presentan prolongaciones citoplasmticas y presentan movimiento
Browniano, lo que puede ser til para distinguirlas de los restos celulares.
13. Calcular el nmero de plaquetas mediante la siguiente frmula:
100
Plaquetas/mm3 = N x
10(0.2mm)2 0.1mm
N= Plaquetas contadas
10 = Nmero de cuadros terciarios contados
2
(0,2) = rea de cada cuadro terciario
57
0,1 = Altura de la cmara
100= Dilucin de la muestra
Plaquetas/mm3 = N x 2500
2500 = Factor
Este factor variar si cambia el nmero de cuadros contados.
14. Lavar el material empleado como se indico en la prctica para el recuento de

eritrocitos.
Con este mtodo directo de conteo, los lmites de valores en un 95% de poblacin
sana son:
Mtodo Directo
150 000 a 500 000/mm3
Mtodo Indirecto
140 000 a 350 000/mm3 utilizando la tincin de Wright.
500 000 a 1 000 000/mm3 utilizando el Azul de Cresil violeta.
Actividades
Ajustando el nmero de cuadrados considerados para contar por lo menos 100

plaquetas, definir el volumen cuantificado y su dilucin para corregir el Factor en
caso necesario.
58
MDULO
III
Hematopoyesis. El
origen de las clulas
sanguneas
59
HEMATOPOYESIS
La hematopoyesis se refiere al proceso de formacin, maduracin y especializacin

de todas las clulas sanguneas. A lo largo de la vida los sitios de hematopoyesis cambian
varias veces, desde el embrin hasta que se inicia la vida fetal y aun durante la vida adulta.
En general se reconocen tres fases: Mesoblstica, heptica y medular o mieloide (Figura
14).
Fig. No. 14. Sitios de hematopoyesis a lo largo de la vida. 1) Mesoblstica; 2) Heptica y 3)

Mieloide.
Periodo mesoblstico
Por varios aos se afirm que toda la hematopoyesis en el embrin se efectuaba en

los islotes sanguneos del saco vitelino, sin embargo estudios resientes probaron que en
realidad slo los eritroblastos se forman en este sitio y que las clulas troncales
hematopoyticas (stem cell) surgen de una fuente intraembrionaria cerca de la aorta. Las
clulas troncales siembran el hgado fetal a las cinco semanas de gestacin con lo que se
termina esta fase y se inicia el periodo heptico. Durante este periodo es posible medir las
Hb Portland, Gower I y Gower II.
Periodo heptico
Las clulas troncales que se implantan en el hgado cerca de la cuarta a quinta

semana de gestacin dan origen a los eritroblastos, a los granulocitos y a los monocitos; con
esto se inicia la actividad heptica, la cual puede perdurar hasta dos semanas despus del
nacimiento. En este periodo se observa el comienzo del desarrollo megacarioctico, la
60
actividad esplnica eritropoytica, la granulopoyesis y la linfopoyesis, as como una ligera
actividad hematopoytica en los ganglios linfticos y el timo, debido a que su principal
funcin es la especializacin de los linfocitos. La hematopoyesis en el bazo es transitoria y
esta concluye con la granulopoyesis. Durante esta fase son medibles los eritrocitos en todas
sus etapas de maduracin, los leucocitos y los megacariocitos, as como las hemoglobinas
F, A1 y A2.
Periodo medular (mieloide)
Entre el cuarto y quinto mes de gestacin la mdula sea comienza a tener actividad
al iniciar la osificacin y la formacin de la mdula sea en el centro de los huesos.
Rpidamente la actividad hematopoytica, cerca del sexto mes de gestacin, se incrementa
en los huesos generando una medula roja hiperplsica, siendo la fuente primaria de
produccin de clulas sanguneas, y conservndose as durante toda la vida. En esta fase ya
son medibles todas las estirpes celulares de la sangre, Hb F y Hb adultas, as como la
eritropoyetina.
Mdula sea
Las clulas del mesnquima que dan origen a la mdula sea se diferencian en tres
tipos de tejido:
a) Reticular
b) Adiposo
c) Hematopoytico
Dependiendo de la proporcin de estos tejidos, podemos clasificar a la mdula sea en dos
tipos:
1. Mdula roja: Alto contenido de tejido hematopoytico, est restringida a huesos
planos en los adultos.
2. Mdula amarilla: Mezcla de tejido adiposo y reticular, y comienza a ocupar los
huesos largos a partir de los 5 y 7 aos de edad. La mdula amarilla en realidad no
es tejido inservible, ya que esta sirve como reserva de grasa y tejido
hematopoytico, adems de que est puede revertirse a mdula roja en situaciones
extremas, como, hemorragias severas o destruccin de mdula sea roja por
agentes qumicos o radiacin.
As la mdula sea juega un papel muy importante en el suministro constante de clulas

sanguneas de cualquier tipo, ya que no solo tiene el rol de fabricar clulas, sino tambin el
de almacenarlas y as de esta manera mantener un equilibrio dentro del microambiente
medular para evitar en la medida de lo posible que esta se vuelva hiperplsica.
Microambiente medular
Al medio intercelular, que est principalmente condicionado por el estroma se le

denomina microambiente medular. El estroma de la mdula sea forma un microambiente
favorable a la continua proliferacin de las clulas hematopoyticas. Est constituido por el
sistema reticular (macrfagos y clulas reticulares) y el sistema vascular. Las clulas del
61
estroma producen una matriz extracelular de colgeno, glucoprotenas, proteoglicanos y
otras protenas.
Los macrfagos funcionan como una barrera sanguneo-medular (macrfagos
perisinusoidales) en los senos medulares y fagocitan clulas envejecidas y restos celulares;
y como centro (macrfagos centrales) para la formacin de las islas eritroblsticas.
Las clulas reticulares funcionan como soporte para la vascularizacin de la mdula
sea, mediante la formacin de fibras que se entrelazan entre s para formar una red.
Este microambiente medular se encuentra regulado por una serie de sustancias
qumicas como citocinas o factores de crecimiento, hormonas y diversos tipos celulares.
Las principales propiedades de las citocinas que actan sobre la hematopoyesis se
muestran en la Tabla 5.
Como el nivel de todas las estirpes celulares est controlado por mltiples factores
humorales y celulares, y que adems se ajustan rpidamente segn las necesidades, el
organismo responde rpidamente ante cualquier situacin que atente contra la integridad
del organismo, por esta situacin las clulas hematopoyticas pueden clasificarse en dos
compartimientos:
a) Compartimiento de clulas madre.
b) Compartimiento de diferenciacin y maduracin celular.
En el compartimiento de clulas madre se encuentran clulas con capacidad de

autorrenovacin y potencial de proliferacin que las llevan a la capacidad de diferenciarse
en los progenitores de todas las lneas celulares sanguneas que forman parte del
compartimiento de diferenciacin y maduracin celular. Las clulas del primer
compartimiento son indistinguibles morfolgicamente al microscopio, pero en la actualidad
pueden diferenciarse por sus marcadores de membrana mediante la citometra de flujo, en
comparacin con las del segundo compartimiento, las cuales son distinguibles
morfolgicamente al microscopio desde su precursor ms temprano.
En las Figuras 15 y 16 se muestra el desarrollo de la diferenciacin celular a partir
de la clula madre pluripotencial para la estirpe mieloide y linfoide respectivamente.
62
Tabla No. 5 Citocinas que intervienen en la regulacin de la hematopoyesis.
Citocina Clula final Caractersticas
IL-1 Linfocitos T Modula la accin de los leucocitos sobre la hematopoyesis
IL-2 Linfocitos T Segregada por linfocitos T
IL-3 Neutrfilos y eosinfilos Segregada por linfocitos T, clulas endoteliales, mastocitos y
Monocitos-macrfagos clulas NK
Basfilos-mastocitos
Eritrocitos
Basfilos-mastocitos
IL-5 Linfocitos B Segregada por linfocitos T y mastocitos
Eosinfilos
IL-6 Basfilos-mastocitos Segregada por linfocitos T y B, monocitos, clulas del
Neutrfilos estroma y osteoblastos
Megacariocitos
IL-7 Linfocitos B y T Segregada por linfocitos T
Megacariocitos
Eritrocitos
IL-10 Linfocitos T
IL-11 Linfocitos B
Megacariocitos
Basfilos-mastocitos
IL-12 Clulas NK
Eritropoyetina Eritrocitos Sintetizada en el rin, induce la proliferacin de CFU-E
Trombopoyetina Plaquetas Sintetizada por el rin y el hgado, induce la
megacariopoyesis
FEC-GM Neutrfilos y eosinfilos Estimula la produccin de granulocitos y monocitos
Monocitos-macrfagos Segregada por linfocitos T, clulas endoteliales, fibroblastos,
Megacariocitos macrfagos y osteoblastos
Eritrocitos
FEC-G Neutrfilos Estimula la produccin y la funcin de los granulocitos
FEC-M Monocitos-macrfagos Estimula la produccin y la funcin de los monocitos
C-kit- Neutrfilos y eosinfilos Estimula la clula madre pluripotencial
LIGANDO Basfilos-mastocitos
Megacariocitos
IL, Interleucina; FEC-GM, Factor estimulante de colonias granulomonocticas; FEC-G, Factor estimulante de
colonias granulocticas; FEC-M, Factor estimulante de colonias monocticas; NK, Clulas natural killer.
63
CPP
IL-3
Clula tronco FEC-GM
linfoide CD34
UFC-GEMM
CD10 CD3
CD34 CD34
CD38 IL-3
FEC-GM IL-3
IL-3 FEC-GM
UFC-GM FEC-GM UFC-Me
IL-3 IL-3 CD3
UFB-E CD3
FEC-GM FEC-GM CD34 CD34
FEC-G
FEC-M
IL-3 FEC-GM IL-3 FEC-
UFC-G= UFC-N CD13
CD33 Epo IL-4 GM TPO
UFC-Eo UFC-M
CD34
UFC-Ba HLA-DR UFC-E Megacarioblasto
FEC-GM
FEC-M FEC-GM
CD13 IL-3 Epo
Mieloblasto CD33
HLA-DR Monoblasto Proeritroblasto
CD13 CD71
CD33 Glucoforina A Megacariocito
HLA-DR
Epo
CD41
CD13 CD42b
Promielocito CD33 E. basfilo CD61
CD71
Glucoforina A
CD11b Promonocito Reticulocito

CD13 CD13
Mielocito CD33
Glucoforina A TPO
HLA-DR
IL-3
FEC-GM FEC-GM
IL-3
IL-3 FEC-G
IL-5
CD13 CD41
CD14 CD42b
CD33 Glucoforina A CD61
HLA-DR CD62P
Basfilo Eosinfilo Neutrfilo Monocito Eritrocito Plaquetas
Fig. No. 15. Diferenciacin mieloide, donde se muestran los marcadores de membrana que
se expresan en cada clula. CPP, clula pluripotente; UFC-GEMM, unidad formadora de
colonias eritrocticas, granulocticas, monocticas y megacariocticas; UFC-GM, unidad
formadora de colonias granulomonocticas; UFC-G, unidad formadora de colonias
granulocticas; UFC-M, unidad formadora de colonias monocticas; UFC-Me, unidad
formadora de colonias megacariocticas; UFB-E, unidad formadora de brotes eritroides;
UFC-E, unidad formadora de colonias eritroides; IL, interleucina FEC-GM, Factor
estimulante de colonias granulomonocticas; FEC-G, Factor estimulante de colonias
granulocticas; FEC-M, Factor estimulante de colonias monocticas; Epo, eritropoyetina;
TPO, trombopoyetina; CD, cumulo de diferenciacin o marcador de membrana.
64
Progenitor
linfoide
CD10
CD34
CD8
HLA-DR
IL-3 IL-3
CD10
CD19 IL-3 ?
CD34 cCD3
CD38 TdT CD5 Precursor de
IgH R Linfocito Linfocito CD7 linfocito
HLA-DR Pro-B pro-T TdT NK
IL-2
CD19 IL-4
CD20
TdT
IL-7
IgH R Linfocito Timocito CD2 cCD3
IgL R CD2
clgM Pre-B temprano
CD5 CD7
CD8
CD38 CD71
HLA-DR CD16
IL-4 TdT
CD56
CD19
IL-7 CD57
CD20 CD1 CD2 CD3
CD22 Linfocito
Linfocito B CD4 CD5 CD7
IgH R CD8 CD38 CD71 NK
IgL R temprano IL-2 TdT TCR R
IgM IL-2 Linfocito T
IgD
IL-6 comn IL-5
HLA-DR
IL.4 IL-6
CD19 CD20
CD22 CD23 CD2 CD3 CD5
Linfocito B CD25 IgH R
Linfocito T CD2 CD3 CD4 CD5
CD7 CD28 CD7 CD8 CD28
activado IgL R IgM cooperador CD45RA TCR R
CD45RA TCR R
HLA-DR
IL-2 Linfocito T
IL-3 CD19 CD20 CD22 citotxico
IL-4 IgH R IgL R IgA
IL-5 o IgG o IgE HLA-
DR
CD38 IL-6
CD2 CD3 CD4 CD5 CD2 CD3 CD5
IgH R
CD7 CD25 CD28 CD7 CD8 CD28
IgL R
CD45RA HLA-DR CD45RA TCR R
clg
CTLA-4 TCR R HLA-DR CTLA-4
Clula Linfocito B Linfocito T Linfocito T

plasmtica de memoria activado activado
CD2 CD3 CD4 CD2 CD3 CD5

CD5 CD7 CD7CD8 CD45RO
CD45RO TCR R TCR R
Linfocito T Linfocito T supresor

de memoria de memoria
Fig. No 16. Diferenciacin linfoide. Se muestran los principales marcadores de membrana

que expresan los linfocitos en cada etapa de su maduracin. IL, interleucina; NK, clula
natural killer; CD, cumulo de diferenciacin o marcador de membrana.
65
LNEA ERITROIDE
Las clulas de la lnea eritroide tienen una proporcin de cerca del 25% de todas las
clulas en la mdula sea, guardando una relacin grnulo/eritroide de 3:1. Todas las
clulas hematopoyticas se encuentran localizadas en forma de cordones cerca de los senos
vasculares. Para el caso de los precursores eritroblsticos estos se encuentran contra la
superficie externa de los capilares sinusoides, en grupos bien diferenciados llamados islas
eritroblsticas (unidad anatmica de la eritropoyesis), formadas por uno o dos macrfagos
centrales rodeados de eritroblastos; este macrfago proporciona los nutrientes requeridos
para la maduracin de los eritrocitos, los cuales van alejndose del cuerpo principal hacia la
periferia de los macrfagos, conforme maduran. La maduracin inicia a partir del
proeritroblasto, el cual genera 2 eritroblastos basfilos, los cuales se dividen en 4
eritroblastos basfilos de 1 generacin, estos generan 8 eritroblastos basfilos de 2
generacin, que despus de una ltima divisin mittica se transforman en 16 eritroblastos
policromtofilos, los cuales ya no se dividen y se transforman en eritroblastos
ortocrmicos, que al expulsar su ncleo originan 16 reticulocitos, los cuales permanecen 48
a 36 horas en la mdula sea antes de salir a torrente sanguneo y madurar hasta eritrocitos
en un periodo de 24 horas.
Debe sealarse que, aunque cada proeritroblasto puede generar 16 eritrocitos,
esto no sucede casi nunca en la realidad, debido a la existencia de un mecanismo de
eritropoyesis ineficaz fisiolgico, generando solo 8 eritrocitos.
Los cambios bioqumicos y morfolgicos que ocurren en el interior de los
eritrocitos durante su maduracin (Tabla 6) se basan principalmente en la prdida
progresiva de la intensa basofilia del citoplasma y la compactacin de la cromatina del
ncleo hasta generar un ncleo picntico que es expulsado del eritrocito por la formacin
de una especie de anillo constrictor, este anillo es formado por intensas contracciones del
citoplasma desde la parte media de la clula hasta lograr arrancar el ncleo con un pequeo
halo de citoplasma; o bien cuando la clula atraviesa un sinusoide medular. El ncleo
expulsado es fagocitado por los macrfagos de la mdula sea.
La basofilia del citoplasma en las etapas ms jvenes del eritrocito se debe a la
intensa produccin de ribosomas para iniciar la sntesis de globinas, las cuales van
ensamblando la hemoglobina a medida que madura el eritrocito y por tanto al aumentar su
cantidad en el citoplasma disminuye la basofilia del mismo por la propiedad acidfila de la
hemoglobina. El color grisceo del citoplasma del eritroblasto policromtofilo se debe a
que la cantidad de ribosomas y hemoglobina se encuentra equilibrada dando ese aspecto
sucio a la clula. Ocurre algo similar con los reticulocitos, pues al perder el ncleo
permanecen restos de ribosomas y retculo, que slo son visibles con una tincin supravital
de azul de metileno, sin embargo con la tincin de Wright obtienen un color grisceo por
contener material basfilo y acidfilo en su citoplasma.
66
Tabla No. 6. Caractersticas morfolgicas y bioqumicas de las clulas de la lnea eritroide
Nombre Morfologa Tamao Ncleo Nuclolos Relacin Tincin

(m) ncleo/citoplasma citoplsmica
Proeritroblasto 20-25 Redondo, 1-2 Muy elevada Basfila

cromatina laxa (Azul)
Eritroblasto 16-18 Redondo, Ausentes Elevada Intensa basofilia

basfilo engrosamiento (Azul intenso)
de cromatina
Eritroblasto 12-15 Redondo, Ausentes Baja Basfila/Acidfila

policromtofilo cromatina (Grisceo)
irregular y burda
Eritroblasto 10-15 Picntico Ausentes Muy baja Acidfila

ortocrmico (Anaranjado)
Reticulocito 8-10 Ausente Ausentes Basfila/Acidfila

(Grisceo)
Eritrocito 7-7.5 Ausente Ausentes Acidfila

(Rojo-rosa)
67
La observacin de la morfologa eritrocitaria en un extendido sanguneo teido con un
colorante de Romanowsky es de gran utilidad para diagnosticar diversas patologas que
suelen presentar alteraciones caractersticas en los eritrocitos. Las alteraciones en la
morfologa del eritrocito pueden clasificarse en cuatro grupos:
1. Alteraciones de tamao (Tabla 7)
2. Alteraciones de la forma (Tabla 8)
3. Alteraciones de color o contenido de hemoglobina (Tabla 9)
4. Presencia de inclusiones (Tabla 10)
Tabla No. 7 Alteraciones de tamao.

Anomala Descripcin Morfologa Estado patolgico
relacionado
Anisocitosis Variacin en el *Inespecfica
tamao de los
eritrocitos
Microcitosis Eritrocitos con un *Estados ferropnicos

VCM < 80fL y un *Hipertiroidismo
dimetro inferior a
6m
Macrocitosis Eritrocitos con un *Dficit de cido flico
VCM > 100fL y y/o Vit. B12
dimetro superior a *Aplasia medular
9m *Anemia diseritropoyetica
*Alcoholismo
*Hepatopatas crnicas
*Mielodisplasias
Megalocitosis Mxima expresin *Anemia megaloblstica
de la macrocitosis por dficit de folatos y
vitamina B12
68
Tabla No. 8. Alteraciones de forma (Poiquilocitosis).
relacionado
Esferocitos Eritrocito esfricos sin *Esferocitosis
aparente palidez central hereditaria
(Alteracin
estructural de la
espectrina,
anquirina, banda 3 o
de la protena 4.2)
*Anemia hemoltica
autoinmune
*Postransfucional
Codocitos Eritrocitos con exceso *Hepatopata
dianocitos de superficie, por lo que obstructiva
tiene una zona central *Talasemias
con mayor contenido de *Dficit de hierro
hemoglobina, dndole *Posesplenectoma
una aspecto de diana de *Deficiencia de
tiro lecitina-colesterol
aciltransferasa
(LcAT)
*Hemoglobina C
Drepanocitos Eritrocitos en forma de *Anemia falciforme
hoz o media luna, por la por presencia de
polimerizacin de la HbS
hemoglobina S en
medios hipxicos
Equinocitos Eritrocitos con *Hepatopatas,

proyecciones cortas de uremia
punta roma y *Carcinoma de
distribucin uniforme en estomago
la membrana del *Ulcera pptica
eritrocito sangrante
*Dficit de
piruvatocinasa
*Muestras
conservadas por el
descenso del
adenosin trifosfato
(ATP)
intraeritrocitario
69
Tabla No. 8. Alteraciones de forma (continuacin).
relacionado
Acantocitos Eritrocitos con *Abetalipoproteinemia
proyecciones *Hepatopata alcohlica
largas e irregulares *Sndrome de
de distribucin *Malabsorcin
heterognea en la *Posesplenectoma
superficie de la
clula
Dacriocitos Eritrocitos con *Anemia megaloblstica
forma de lagrima o *Talasemia
espejo por una *Anemia ferropnica
proyeccin *Anemia mieloptsica
citoplasmtica en *Mielofibrosis
uno de sus
extremos
Esquizocitos Fragmentos de *Anemia hemoltica
eritrocitos, tienen microangioptica
formas diversas, *Coagulacin
pero prevalecen intravascular diseminada
las formas (CID)
triangulares *Vasculitis
*Glomerulonefritis
*Carcinomas
*Quemaduras graves
*Hemoglobinuria
manifiesta
*Prtesis valvulares
Estomatocitos Eritrocitos con su *Estomatocitosis
zona central congnita
alargada en forma *Alcoholismo
de boca *Enzimopatias
70
Tabla No. 8. Alteraciones de forma (continuacin).
relacionado
Keratocitos Eritrocito con dos *Anemia hemoltica
proyecciones en forma de microangioptica
cuernos, generados por la *Coagulacin
ruptura de vacuolas intravascular
citoplasmticas diseminada (CID)
*Prtesis vasculares
Excentrocitos o Eritrocitos con *Anemias
clulas en distribucin irregular de hemolticas por
blster la Hb en uno de los qumicos o
extremos de la clula medicamentos
*Dficit de glucosa-
6-fosfato-
deshidrogenasa
Tabla No. 9. Alteraciones de color o contenido de hemoglobina (Anisocromia)

relacionado
Hipocroma Eritrocitos que *Ferropenias
presentan un *Talasemias
aumento del rea *Porfirias
central de palidez.
Disminucin de la
concentracin de
Hb en el eritrocito.
Hipercroma Termino errneo ya *Sin relevancia

que el eritrocito no alguna salvo en la
contiene ms esferocitosis o en
hemoglobina, pero algunas anemias
que por su tamao hemolticas
y forma pierde el autoinmunes.
rea central de
palidez y se tie
densamente.
Basofilia difusa o Eritrocitos jvenes *Anemias
policromasia que contienen hemolticas
(reticulocitos) restos de RNA, el *Eritropoyesis
cual le da una acelerada
tonalidad rosa
griscea o azulosa.
71
Tabla No. 10. Inclusiones eritrocitarias.
relacionado
Cuerpos de Inclusiones redondas, *Anemia por
Howell-Jolly pequeas constituidas de deficiencia de
ADN. vitamina B12 y
folatos
*Asplenia funcional
*Posesplenectoma
Anillos de Restos de microtbulos *Intoxicacin con
Cabot del huso mittico que plomo
adquieren forma de ocho *Anemia
o anular. megaloblstica
*Anemia perniciosa
*Anemia hemoltica
Punteado Grnulos de forma *Dficit de

basfilo redonda o irregular pirimidn-
formados por agregados 5nucleotidasa
de ARN que se *Intoxicacin por
distribuyen en todo el plomo
eritrocito. *Talasemias
*Eritropoyesis
ineficaz
Cuerpos de Cuerpos redondos o *Deficiencia de

Heinz irregulares constituidos glucosa 6 fosfato
por Hb desnaturalizada deshidrogenasa
visibles solo con (G6PD)
tinciones supravitales. *Estrs oxidativo
*Sndrome de Hb
inestable
*Dficit de hexosa
monofosfato
Cuerpos de Cuerpos pequeos que se *Anemia
Pappenheimer aglomeran en la periferia sideroblstica
del eritrocito *Talasemia
(siderocito), se tien de *Hemocromatosis
azul negruzco con
Wright y de verde con
azul de Prusia (tincin
supravital).
72
Tabla No. 10. Inclusiones eritrocitarias (continuacin).
relacionado
Parsitos Plasmodium: *Malaria o
P. vivax paludismo
P. falciparum
P. malariae
P. ovale
Babesia *Babesiosis
73
Fundamento
La observacin microscpica de la morfologa de los eritrocitos en un extendido de

sangre teido con un colorante tipo Romanowsky es indispensable para corroborar la
patologa sugerida por los resultados de la biometra hemtica (BH), pues las
anormalidades en los eritrocitos disminuyen la deformabilidad de su membrana para el caso
de las anemias hemolticas, evidencian la baja produccin de Hb para el caso de las
anemias ferropnicas o la alteracin de su sntesis para el caso de las talasemias, sugieren la
deficiencia de enzimas indispensables para el metabolismo eritrocitario, esclarecen algunos
casos de fiebre de origen desconocido, afirman la deficiencia de la hematopoyesis o
simplemente indican que la muestra es vieja.
El estudio morfolgico de los eritrocitos requiere de gran experiencia del analista
para identificar el tipo de alteracin eritrocitaria presente y as poder relacionar el resultado
de la BH con la anormalidad y establecer un diagnostico, pues la misma alteracin sugerir
el tipo de tratamiento.
Microscopio
Preparaciones fijas de frotis sanguneos teidos con colorantes tipo Romanowsky
Reactivos
Aceite de inmersin
Procedimiento
1. El profesor har entrega de una preparacin fija por equipo de trabajo.

2. Realizar la iluminacin de Koehler para asegurarse de enfocar adecuadamente el
microscopio.
3. Con el objetivo 100X observar la laminilla en busca de la alteracin morfolgica
indicada en la etiqueta de la preparacin.
4. Una vez localizada la anomala, se dejar fija en el microscopio para que todo el
resto del grupo observe las caractersticas morfolgicas encontradas.
5. Observar y dibujar o fotografiar las clulas con alguna anormalidad identificada
(caractersticas de la clula y sus cambios en estructura, forma, etc.).
6. Finalizada la sesin limpiar las laminillas y entregarlas libres de aceite al asesor.
7. Limpiar el microscopio.
Actividades
El reporte que se entregar consistir en los dibujos o fotos de las clulas, la

descripcin y el nombre de lo que observo.
74
LNEA MIELOIDE (GRANULOCITOS MONOCITOS Y MEGACARIOCITOS)
Lnea granuloctica
Las clulas de la granulopoyesis constituyen un 60-65% de los componentes

citolgicos medulares. Los cambios morfolgicos evolutivos se resumen en:
Reduccin de la relacin ncleo-citoplasma.
Desaparicin de los nuclolos.
Maduracin de la cromatina nuclear.
Desaparicin de la basofilia citoplasmtica.
Aparicin de la granulacin primaria azurfila a partir del promielocito. En esta
etapa es imposible distinguir con tinciones de Romanowsky si la clula dar origen
a un neutrfilo, un eosinfilo o un basfilo; sin embargo cada promielocito ya est
comprometido hacia alguna de estas lneas celulares.
Aparicin de la granulacin secundaria o especfica (neutrfilo, eosinfilo y
basfilo) a partir del mielocito. Reconocibles morfolgicamente por tinciones de
Romanowsky.
La primera clula de la serie granulopoytica identificable morfolgicamente es el

mieloblasto, el cual da origen al promielocito, y ste, al mielocito, metamielocito, banda y
finalmente al segmentado (Tabla 11). Existen 4 etapas mitticas entre el mieloblasto y el
metamielocito, a partir de esta etapa ya no hay divisiones celulares. Por ltimo, tiene lugar
la indentacin y segmentacin nuclear al llegar a la etapa de metamielocito y segmentado,
respectivamente. Todo el proceso de granulopoyesis ocurre entre 4 y 7 das.
Las principales alteraciones morfolgicas que ocurren en la serie neutrfilica se
engloban en 3 grupos:
1. Alteraciones nucleares (Tabla 12).
2. Alteraciones de la granulacin (Tabla 13).
3. Inclusiones citoplasmticas (Tabla 14)
Eosinfilos: Tienen un tamao semejante a los neutrfilos y se caracterizan

morfolgicamente por contener en su citoplasma grnulos acidfilos. Tienen una forma
redondeada, su tamao oscila entre 0,5 y 1,5 m, ocupan todo el citoplasma de la clula
pero no se sobreponen en el ncleo y se tien de color anaranjado-pardo brillante con las
tinciones panpticas, siendo muy frgiles. El ncleo en la etapa final de segmentado
solamente alcanza la bilobulacin simtrica y en una proporcin muy escasa el eosinfilo
puede llegar a formar tres lbulos perfectamente simtricos unidos por finos puentes de
cromatina.
Basfilos: La maduracin de estas clulas aun no est muy bien esclarecida como en
el caso de las otras clulas sanguneas, sin embargo se sabe que derivan de una clula
germinal comprometida hacia la granulopoyesis basfila. A diferencia de los basfilos
tisulares o mastocitos, son clulas redondeadas cuyo tamao oscila entre 10 y 13 m. El
ncleo de cromatina densa, posee generalmente dos o tres lbulos unidos por puentes
cromatnicos, en ocasiones difciles de visualizar dada la presencia de las numerosas
granulaciones basfilas propias de la clula. Su distribucin en la clula es tan irregular que
tapan el ncleo. La granulacin basfila, cuyo tamao vara entre 0,2 y 1 m, adquieren un
75
color purpureo a negro con las tinciones panpticas por el carcter cido del contenido de
sus grnulos (heparina, condroitinsulfato, histamina y mediadores vasoactivos e
inmunomoduladores). La caracterstica principal de los grnulos basfilos es su
metacromasia con los colorantes azules (azul de metileno, azul de toluidina), con los que
adquiere una tonalidad rojiza, mientras que el resto de las estructuras celulares se tien de
color azul.
76
Tabla No. 11. Caractersticas morfolgicas y bioqumicas de las clulas de la lnea granuloctica.
Clula Morfologa Tamao Ncleo Nuclolos Tincin Granulacin

celular (m) citoplsmica visible
Mieloblasto 15-20 Redondo, cromatina 2-3 Azul oscura Ausente
laxa
Promielocito 16-25 Redondo u ovalado, 1-3 Azul oscura Azurfila

cromatina menos laxa (purpura)
Mielocito 12-18 Redondo, achatado en Ausentes Rosa claro Escasa azurfila

uno de sus extremos, con halos y abundante
cromatina condensada azules especifica (rosa)
Metamielocito 10-15 Arrionado o forma Ausentes Rosado Primordialmente

de frijol, cromatina especifica
condensada
Banda 9-15 En forma de Ausentes Rosado Rojo-rosado

herradura, cromatina
picntica en los
extremos
Segmentado: 9-15 Segmentado, 2 a 4 Ausentes Rosado Rojo-rosado
77
Neutrfilo lbulos, cromatina
muy condensada
Tabla No. 11. Caractersticas morfolgicas y bioqumicas de las clulas de la lnea granuloctica (Continuacin)
Clula Morfologa Tamao Ncleo Nuclolos Tincin Granulacin

celular (m) citoplsmica visible
Segmentado: 10-13 Bi o trilobulado, Ausentes Incolora, en Azul oscuro
Basfilo compacto, poco visible ocasiones
por la abundante prpura claro
granulacin
Eosinfilo 12-14 Bilobulado, en Ausentes Rosado Rojo-naranja

ocasiones 3 lbulos refringente
78
Tabla No. 12. Alteraciones nucleares de los neutrfilos
relacionado
Pelger-Huet Leucocito con *Alteracin benigna
ncleo bilobulado,
denominadas clulas
Quevedo, por el
aspecto de lentes que
adquiere el ncleo.
Pseudo Pelger-Huet Neutrfilo con *Infecciones

ncleo redondo u bacterianas
ovalado. *Trastornos
mieloproliferativos
*Estados
mielodisplsicos
Ncleo en anillo Neutrfilos con *Trastornos
ncleo en forma de mieloproliferativos
dona crnicos y
mielodisplsicos
*Leucemias agudas
Hipersegmentacin Ncleo con ms de 5 *Anemia

nuclear segmentos en megaloblstica por
neutrfilos y ms de deficiencia de
2 en eosinfilos vitamina B12 y
folatos
79
Tabla No. 13. Alteraciones en la granulacin de los neutrfilos.
relacionado
Granulacin txica Neutrfilos con *Infecciones
abundante bacterianas
granulacin primaria *Quemaduras
*Cncer
*Anemia aplsica
*Intoxicaciones
Neutrfilos Neutrfilos sin o con *Trastornos

agranulares escasos grnulos y mielodisplsicos y
citoplasma rosa mieloproliferativos
azuloso *Leucemias
mieloides agudas
*Deficiencia de
mieloperoxidasa
Anomala de Leucocitos con *Trastorno
Chediak Higashi grnulos gigantes, autosmico
debido a la fusin de recesivo
grnulos primarios y
secundarios
Bastones de Auer Estructuras largas en *Leucemia

forma de aguja mieloide aguda:
debido a la fusin y M1
cristalizacin de M2
grnulos azurfilos, M3
se tien de color azul M4
rojizo. Presentes en
Mieloblastos y
promielocitos
Clula de Fagot Promielocito con M3

abundantes bastones
de Auer
80
Tabla No. 13. Alteraciones en la granulacin de los neutrfilos (continuacin).
relacionado
Anomala de Alder- Grnulos gruesos
Reilly rojo violceo en los
leucocitos, trastorno *Asociada a
hereditario. Su mucopolisacaridosis
aspecto en los
neutrfilos es
semejante al de las
granulaciones
txicas observadas
habitualmente en las
leucocitosis producto
de infecciones, pero
la presencia de
grnulos en los
linfocitos, a veces
dentro de vacuolas,
que en ocasiones
adquieren forma de
coma es sugestivo de
esta anormalidad
Tabla No. 14. Inclusiones citoplasmticas en los neutrfilos.

relacionado
Cuerpos de Dhle Inclusiones de *Sepsis por
color gris-azuloso infecciones
plido cerca de la bacterianas,
periferia, quemaduras
compuestas de *Sndromes
agregados de mielodisplsicos y
retculo mieloproliferativos
endoplsmico crnicos
rugoso
Vacuolizacin reas circulares o *Sepsis por

txica irregulares, claras y infecciones
no teidas bacterianas
*Quemaduras
*Estados txicos
*Cncer
81
Tabla No. 14. Inclusiones citoplasmticas en los neutrfilos (continuacin).
relacionado
Mrula Inclusiones *Anaplasmosis o
granulares, basfilas Erlichiosis
y de forma irregular granuloctica
humana
Lnea monoctica
La teora actual enmarca que los monocitos sanguneos y macrfagos libres y fijos
provienen del monoblasto y promonocito. La maduracin de esta lnea celular se inicia a
partir de la UFC-GM que pasa a monoblasto por accin de interleucinas y factores de
crecimiento correspondientes a la maduracin de los monocitos, los monoblastos son en
aspecto similares a los mieloblastos. Los monoblastos son clulas grandes con ncleo
excntrico que contienen uno o dos nuclolos visibles. Luego del proceso mittico y
maduracin el monoblasto se transforma en un promonocito, teniendo tamao similar al
blasto. El promonocito presenta poca granulacin, la cromatina ya no es tan laxa como para
mostrar nuclolos pero si lo suficiente para evidenciar una serie de pliegues y muescas que
se generan en el ncleo (caracterstica principal), el citoplasma suele ser irregular y de gran
tamao. Conforme avanza su maduracin alcanza la etapa de monocito en sangre perifrica.
Al monocito se le describe como la clula ms grande del torrente sanguneo, pero no
siempre es as. Tiene citoplasma abundante que puede o no contener vacuolas, el ncleo
tiene forma arrionada con cromatina reticular y pequeos grumos; el contenido y tamao
granular varan de manera considerable con la maduracin de la clula. A esta etapa se le
considera transicional ya que cuando el monocito abandona la sangre y se interna en los
tejidos se transforma en macrfago, que dependiendo del tejido en que se encuentre este
adquiere un nombre y caractersticas especificas. Los macrfagos son clulas de gran
tamao, pleomorficos y muy mviles (Tabla 15).
Tabla No. 15. Caractersticas morfolgicas y bioqumicas de las clulas de la lnea

monoctica.
Clula Morfologa Tamao Ncleo Nuclolos Citoplasma
celular
(m)
*Abundante
Grande y y de
redondo, carcter
Monoblasto 15-25 cromatina 1-2 basfilo
laxa *Agranular
82
Tabla No. 15. Caractersticas morfolgicas y bioqumicas de las clulas de la lnea
monoctica (continuacin)
Clula Morfologa Tamao Ncleo Nuclolos Citoplasma
celular
(m)
Irregular,
con *Abundante,
pliegues o azul grisceo
Promonocito 12-20 muescas, 0-1 *Granulacin
cromatina azurfila fina
fina
*Abundante,
irregular y
Reniforme grisceo
o irregular, *Fina
Monocito 15-30 de gran Ausentes granulacin
tamao y azurfila
cromatina *Aspecto de
grumosa vidrio
esmerilado o
arenoso
*Abundante,
Redondo u granuloso,
Macrfago 15-85 ovalado Variable vacuolado e
irregular
Lnea megacarioctica
La produccin de plaquetas presenta caractersticas nicas que no presentan las

dems clulas hematopoyticas, pues mientras que las dems estirpes se dividen por mitosis
hasta obtener aproximadamente 16 clulas maduras a partir de un precursor los
megacariocitos sufren una mitosis incompleta, es decir, tienen divisin nuclear pero
carecen de telofase creando as un ncleo multilobulado, a este proceso se le llama
endomitosis. Cada lbulo del ncleo que se forma es diploide (2N), por lo tanto los
megacariocitos siempre son poliploides.
La clula inicial en la secuencia de maduracin es el megacarioblasto (MK1), el
cual posee similitud con los dems blastos o de morfologa linfoide, tienen escaso
citoplasma y de carcter basfilo, poseen un solo ncleo que evidencia de 2 a 6 nuclolos.
Al aumentar el volumen del citoplasma y al alcanzar un dimetro de 80m el
megacarioblasto se transforma en un promegacariocito (MK2). En esta etapa se pueden
observar tres tipos de grnulos (densos, alfa y lisosmicos) dispersos en todo el citoplasma
83
y el ncleo ya es lobulado. Las lneas citoplsmicas de demarcacin se hacen notorias hasta
la tercera etapa, denominada megacariocito basfilo (MK3) por la coloracin azulosa que
adquiere el citoplasma. La etapa final es el megacariocito maduro (MK4), el cual se
encarga de liberar segmentos citoplasmticos denominados proplaquetas (plaquetas
gigantes), las cuales se van fragmentando conforme avanzan hacia torrente sanguneo
dando paso a fragmentos pequeos llamados plaquetas, que intervienen en los procesos
hemostsicos del organismo (Tabla 16).
Tabla No. 16. Caractersticas morfolgicas y bioqumicas de las clulas pertenecientes a la

lnea megacarioctica
Clula Morfologa Tamao Morfologa Citoplasma
celular (m) nuclear
Redondo,
similar al de *Escaso y de
Megacarioblasto 10-15 un linfocito, carcter
presencia de basfilo
nuclolos
*Basfilo y
Promegacariocito 50-80 Lobulado, 2-4 presencia de
(4N-8N) granulacin
azurfila
Megacariocito Lobulado , 4- *Muy basfilo

basfilo 50-80 16 lbulos Abundante
(8N-32N) granulacin
azurfila
*Rosceo y
con
Megacariocito Lobulado , 4- demarcacin
maduro 20-60 16 lbulos citoplsmica
(8N-32N) (campos
plaquetarios)
*Abundante
granulacin
84
Tabla No. 16. Caractersticas morfolgicas y bioqumicas de las clulas pertenecientes a la
lnea megacarioctica (continuacin)
Clula Morfologa Tamao Morfologa Citoplasma
celular (m) nuclear
1 *Grisceo y con
Proplaquetas(1) 2-4 y hasta 7 o abundante
y plaquetas(2) ms en las Ncleo ausente granulacin
2 proplaquetas azurfila en el
centro
85
LNEA LINFOIDE
Los linfocitos son las clulas sanguneas con la lnea de maduracin ms compleja,
pues dependiendo la estirpe a la que pertenezcan seguirn su maduracin en el bazo, en el
timo o en la misma mdula sea, por lo cual para comprender mejor su maduracin los
rganos en los que maduran se clasifican en rganos linfticos primarios (mdula sea y
timo) y secundarios (bazo, placas de Peyer, anillo de Waldermyer y ganglios linfticos),
pues cada estirpe linfoide se clasifica a su vez en diversas subpoblaciones. La proporcin
que ocupan dentro de la mdula sea junto con los monocitos y macrfagos es de
aproximadamente 15%.
Todos los linfocitos provienen de una clula madre comprometida hacia la lnea
linfoide (UFC-L), de esta se desprenden los precursores condicionados a linfocitos T que
maduran en el timo y los precursores condicionados a linfocitos B que maduran en mdula
sea. Los distintos tipos de linfocitos no se pueden diferenciar morfolgicamente, para ello
se emplea la citofluoromtria y anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de
membrana especficos en cada subpoblacin de linfocitos, sin embargo por mtodos de
tincin convencionales pueden observarse tres estadios morfolgicos de maduracin:
linfoblasto, prolinfocito y linfocito maduro.
El linfoblasto es una clula pequea o mediana (10-18m) con ncleo redondo u
ovalado que abarca casi todo el citoplasma, tiene cromatina laxa que puede mostrar uno o
ms nuclolos. El citoplasma es escaso y presenta basofilia proporcional a la cantidad de
ARN presente. En el cambio de linfoblasto a prolinfocito ocurren cambios sutiles, como,
una cromatina levemente mas condensada sin ocultar el nuclolo, una disminucin del
ncleo y un cambio en el grosor de la membrana nuclear. El cambio a linfocito sanguneo
es ms evidente, pues disminuye el ncleo, el cual posee cromatina condensada, el
citoplasma es ms abundante y levemente basfilo, en algunos casos con pequeos
grnulos azurfilos y por lo general adoptan una forma redondeada. En sangre perifrica
podemos identificar morfolgicamente tres tipos de linfocitos: pequeo, mediano y grande
(Tabla 17).
86
Tabla No. 17. Variaciones morfolgicas de los linfocitos
Clula Morfologa Tamao Ncleo Cromatina Citoplasma
celular
(m)
Redondo, Condensada, *Escaso a
Linfocito 6-10 oval, con irregular, no moderado,
pequeo muesca o definida de incoloro a
estirado azul claro
*Moderado,
de incoloro a
Linfocito 11-14 Redondo Variable matices de
mediano azul claro,
pocos
grnulos
azurfilo
Redondo, *Moderado
oval, con a abundante,
Linfocito 15-20 muesca, Variable, de incoloro a
grande estirado, por condensada, basfilo en
granular lo general reticular ocasiones
no plegado con grnulos
grandes
*Moderado
Linfocito muy
basfilo Redondo Condensada basfilo
(activado)
*Muy
Muy vasta, abundante,
Clula Redondo condensada, con intensa
plasmtica excntrico definicin basofilia y
clara de la una zona
paracromatina clara cerca
del ncleo
Los linfocitos tambin pueden clasificarse por su funcin inmunitaria, en linfocitos

B y T diferenciables nicamente por citofluorometra, pero en algunos casos es posible
establecer ciertas relaciones con la morfologa. Esta diferenciacin inmunitaria se hace
evidente en la etapa de prolinfocito.
Los linfocitos B adquieren su competencia inmunolgica en la mdula sea, donde
se desencadena la reorganizacin de los genes de inmunoglobulinas (Ig) citoplasmticas y
de superficie (IgD e IgM). A medida que avanza el proceso madurativo se van
desarrollando nuevas subpoblaciones con nuevos antgenos. Cuando el linfocito B recibe un
estmulo antignico aparecen las IgG, IgA e IgE, transformndolo en una clula plasmtica
completando as su total diferenciacin. La funcin principal de esta clase de linfocitos es
la respuesta inmunitaria humoral.
87
Los linfocitos T adquieren su competencia inmunolgica en el timo, sin embargo su
descripcin es ms compleja, ya que los marcadores de membrana aparecen, desaparecen y
reaparecen durante el desarrollo de la clula y al contrario de los linfocitos B que adquieren
su maduracin total al exponerse a un estimulo antignico, los linfocitos T sufren una
regresin a la etapa de linfoblasto para producir linfocinas y adquirir memoria
inmunolgica, cuando sufren un segundo estmulo por este mismo antgeno se genera
entonces su diferenciacin total transformndose en linfocitos activados productores de
perforinas. Los linfocitos T al igual que los B desarrollan subpoblaciones dependiendo de
los marcadores expresados en su membrana, siendo los ms comunes los linfocitos T CD4
o cooperadores/supresores y los linfocitos T CD8 o citotxicos.
Existe otra poblacin de linfocitos denominada NK o clulas asesinas naturales que
se encargan de la destruccin de otras clulas del organismo contribuyendo al recambio
celular normal y el control de la proliferacin. Estos linfocitos son los de menor porcentaje
y pueden llegar a distinguirse morfolgicamente por su tamao y cierta granulacin
azurfila en el citoplasma (linfocito grande granular).
88
Fundamento
La evaluacin morfolgica de los leucocitos en los extendidos sanguneos teidos

con un colorante de tipo Romanowsky es indispensable para diferenciar una gran cantidad
de padecimientos relacionados con la maduracin celular, infecciones bacterianas y vricas
o inclusive parasitarias, anormalidades congnitas o de proliferacin celular en sndromes
mieloproliferativos o mielodisplsicos, gracias a que los organelos de cada clula poseen
distintos compuestos que les confieren una gama de colores especficos para su
diferenciacin morfolgicamente en la mayora de los casos.
La informacin que se obtiene al examinar una extensin de sangre perifrica
adquiere gran importancia ya que del anlisis visual de las clulas blancas se puede valorar:
a) Hallazgo de anomalas de maduracin nuclear y citoplasmtica.
b) Caractersticas generales de tamao y color.
c) Hallazgos de trastornos leucocitarios y su delimitacin.
d) Presencia de cuerpos de inclusin y su asociacin a causas viables.
La evaluacin cualitativa de las caractersticas morfolgicas de los eritrocitos,

leucocitos y plaquetas, por medio del examen de extendidos de sangre puede contribuir en
mucho al diagnstico de afecciones de la sangre.
Preparaciones fijas de leucocitos
Microscopio
Reactivos
Aceite de inmersin
Procedimiento
1. El profesor har entrega de una preparacin fija por equipo de trabajo.

2. Realizar la iluminacin de Koehler para asegurarse de enfocar adecuadamente el
microscopio.
3. Con el objetivo 100X observar la laminilla en busca de la alteracin morfolgica
indicada en la etiqueta de la preparacin.
4. Una vez localizada la anomala, se dejar fija en el microscopio para que todos los
integrantes de los equipos observen la morfologa de las clulas.
5. Dibujar o fotografiar las clulas con alguna anormalidad.
6. Finalizada la sesin limpiar las laminillas hasta retirar todo el aceite de inmersin y
dejarlas secar al aire, limpiar con una gasa o algodn el exceso de aceite.
Entregarlas limpias al asesor. Finalizada la sesin, regresar las laminillas limpias y
libres de aceite al asesor.
7. Limpiar el microscopio.
89
Actividades
El reporte que se entregar consistir en los dibujos o las fotos de las clulas, la
descripcin y nombre de lo que se observ.
90
MDULO
IV
Frmula blanca y
pruebas especiales
91
FROTIS DE SANGRE PERIFERICA Y CUENTA DIFERENCIAL
La morfologa de las clulas sanguneas es el complemento de la biometra

hemtica. Slo a travs del examen cuidadoso de un frotis sanguneo se pueden obtener
indicios adicionales de la naturaleza de la anemia, leucemia, etc., como cambios en la
forma y caractersticas de tincin de los eritrocitos y leucocitos, y aparicin de clulas
inmaduras o anormales.
El recuento diferencial puede definirse como estudio cualitativo de los eritrocitos,
plaquetas y leucocitos de cada tipo: polimorfonucleares, linfocitos y monocitos, junto a un
estudio de la edad y anomalas morfolgicas de los mismos. Otra definicin para el
concepto de diferencial es que representa el porcentaje de distribucin de los diferentes
tipos de leucocitos y el estudio cualitativo de los mismos sobre una extensin teida.
Exploracin clnica de la Hematologa
En la prctica clnica, el estudio de la mdula sea reviste una importancia de

primer orden en mltiples enfermedades hematolgicas y no hematolgicas. En efecto, en
algunos procesos como la leucemia aguda, el diagnstico reside precisamente en la
identificacin de los blastos, los cuales pueden estar o no, en sangre perifrica, por lo cual
la informacin citolgica es imprescindible. Disponemos fundamentalmente de las
siguientes exploraciones:
a) Aspirado de mdula sea (citologa medular o mielograma).
b) Biopsia medular (histopatologa).
c) Gamagrafa medular.
d) Ferrocintica.
e) Cultivo de progenitores hematopoyticos.
Examen de las extensiones de sangre teidas
Se ha dicho, y con mucha razn, que un estudio inteligente de la extensin teida,

junto con el clculo de la concentracin hemoglobnica, proporcionar el 90% de toda la
informacin diagnstica que pueda obtenerse de un examen hematolgico.
Un frotis (como vulgarmente se le conoce) no es otra cosa ms que un pelcula de
sangre o cualquier otro lquido biolgico extendido sobre la superficie de una laminilla de
vidrio, el cual se seca, se fija y se tie ulteriormente con un colorante que nos permita
observar y diferenciar la morfologa de todas las clulas presentes en ese extendido. El
frotis sanguneo debe realizarse dentro de las 3 primeras horas de haber obtenido la sangre
para evitar anormalidades por efecto de almacenamiento de la muestra.
Preparacin de los frotis sanguneos
Para su preparacin puede utilizarse el mtodo de los cubreobjetos o el de los

portaobjetos (Figura 17).
El mtodo de los cubreobjetos ofrece la ventaja de obtener una distribucin ms
homognea de la sangre, sin embargo son frgiles y difciles de teir, por lo cual hoy es un
mtodo poco utilizado por no poderse emplear mtodos automatizados para su preparacin.
El mtodo de los portaobjetos es el de mayor aceptacin en todos los laboratorios, pues
92
estos por su mayor resistencia pueden rotularse y almacenarse por un tiempo indefinido.
Hoy en da existen equipos automatizados que preparan extendidos sanguneos de buena
calidad que permiten al analista ahorrar tiempo y optimizar su trabajo dentro del
laboratorio, ejemplos de estos aparatos son el Miniprep y el Ne-Alfa de Sysmex.
Tambin hay aparatos para tincin de laminillas un ejemplo de estos es el Hema-tek de
SIEMENS.
a)
b)
Fig. No. 17. Esquema de las tcnicas para preparar frotis de sangre. a) Tcnica de los
portaobjetos; b) Tcnica de los cubreobjetos.
Fijacin
La extensin sangunea, una vez seca, debe someterse a un proceso de fijacin para
poder ser teida mediante el colorante de eleccin. Este paso es omitido cuando se emplea
la tincin de Wright, pues el colorante ya contiene un fijador a diferencia de otros
colorantes. La fijacin tiene lugar en el primer minuto cuando se aplica un colorante sin
diluir. Con los colorantes acuosos hay que emplear agentes qumicos o calor antes de la
aplicacin del colorante.
Colorantes
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
molculas cargadas positivamente (cationes) o negativamente (aniones).
Colorantes cidos: Son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan
con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como las protenas.
Tambin son llamados basfilos, el ejemplo ms comn es la eosina.
Colorantes bsicos: Son compuestos cationicos con afinidad por los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos; a estos colorantes tambin se les conoce como acidfilos.
Ejemplo de colorantes acidfilos son el azul de metileno.
Colorantes policromticos: Tradicionalmente, las tinciones se han logrado
mediante el uso de colorantes que con frecuencia derivan de la anilina (tinciones
tradicionales o clsicas). Los colorantes policromticos son el resultado de la
combinacin de un colorante bsico (azul de metileno) y un colorante cido
(eosina), que al reaccionar entre s generan un compuesto de propiedades distintas a
93
los compuestos iniciales. Tambin se le conoce como, colorante de tipo
Romanowsky, ejemplos de este tipo de colorante son: el colorante de Wright,
Giemsa, Leishman, May-Grnwald, y son una mezcla de dos colorantes primarios,
el azul de metileno y la eosina.
Tinciones especiales
Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las

clulas y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiacin
visible, de un color caracterstico. Los fluorocromos ms utilizados en esta clase de
tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro.
Tinciones citoqumicas: demuestran la presencia, ms o menos abundante, o la
ausencia de determinadas enzimas, localizadas en el interior de los grnulos
citoplasmticos de los leucocitos.
o Fosfatasa alcalina: Se hace reaccionar la fosfatasa alcalina leucocitaria con
alguna solucin de fosfato de naftol, de dicha reaccin se libera naftol y por
accin de una sal de diazonio (depende de la casa comercial) se produce un
pigmento insoluble y visible en el interior de los leucocitos con actividad de
fosfatasa alcalina.
Fosfato de naftol + fosfatasa alcalina leucocitaria naftol
Naftol + sal de diazonio pigmento insoluble colorido
o Peroxidasa leucocitaria: Las peroxidasa son catalasas lisosomales que
transfieren el hidrgeno desde un donador adecuado (anteriormente
bencidina) a un perxido (perxido de hidrgeno). Empleando 4-cloro-2-
naftol se oxida y se transforma en un colorante insoluble color pardo
negruzco, que se emplea como indicador de la correspondiente actividad de
peroxidasas.
o cido Perydico de Schiff: El cido perydico oxida los glicoles hasta
aldehdos, los cuales se hacen reaccionar con el reactivo de Schiff (mezcla
de pararrosanilina y metabisulfuro de sodio) para generar un compuesto
rojizo, por la liberacin de una pararrosanilina adicional que tie los
elementos celulares que contienen glicol.
o -Naftil esterasa: Las esterasas son un grupo de enzimas que actan sobre
sustratos de manera muy selectiva. En este procedimiento se hace reaccionar
la esterasa leucocitaria con acetato de naftilo en presencia de una sal de
diazonio estable para formar depsitos de color intenso en los sitios de
actividad enzimtica.
Acetato de naftilo + esterasa leucocitaria naftol
Naftol + sal de diazonio deposito colorido intenso
o Cloroacetato esterasa: Mismo principio que en la -Naftil esterasa, pero en
este caso se hace reaccionar la esterasa con un cloroacetato de naftol.
Cloroacetato de naftol + esterasa leucocitaria naftol
Naftol + sal de diazonio deposito colorido intenso
Tinciones supravitales: son tinciones de clulas vivas, pues se requiere que el

colorante entre en las estructuras para poder hacerlas visibles (Tabla 18).
94
Tabla No. 18. Colorantes supravitales ms comunes en Hematologa para evidenciar
inclusiones no teidas o poco visibles con el colorante de Wright
Colorante Inclusin
Azul de cresilo brillante, nuevo azul de Cuerpos de Heinz
metileno, verde brillante
Azul de cresilo brillante, nuevo azul de Mallas de retculo (reticulocitos)
metileno
Azul de Prusia Cuerpos de Pappenheimer
Tincin del frotis (tincin de Wright)
Durante el proceso de maduracin de los colorantes de Romanowsky, el azul de

metileno se oxida (desmetilacin) dando lugar a colorantes secundarios. Los ms
importantes son los azures de metileno (principalmente azur A, azur B y azur C), de color
azul brillante, que son tambin colorantes metacromticos. Cuando las molculas de un
colorante metacromtico estn desordenadas en una solucin, el color observado es el
natural (azul), sin embargo, cuando dichas molculas se ordenan en el espacio muy juntas
unas de otras forman un color distinto (Rojo). Durante la tincin, si el azur de metileno tie
una sustancia cuyos sitios de unin con el colorante estn ordenados en el espacio y muy
cercanos unos a otros (sustancias metacromticas), las molculas quedan tambin
ordenadas y se produce el fenmeno de metacromasia, es decir, la sustancia se tie de color
violeta a rojo, dependiendo del grado de orden de las molculas.
La tincin de Wright es la ms empleada en los laboratorios clnicos para la
diferenciacin morfolgica de todas las clulas hematopoyticas normales y anormales.
Caractersticas de observacin celular
Las tinciones de tipo Romanowsky nos permite distinguir los siguientes aspectos
morfolgicos de las clulas:
1. Forma y dimensiones de las clulas sanguneas.
2. Forma del ncleo y de la cromatina (color prpura).
3. Citoplasma de los linfocitos (distintas tonalidades de azul).
4. Citoplasma de los monocitos (color gris).
5. Granulacin de los PMN:
a. Granulacin primaria (color prpura)
b. Neutrfilos: de pardo a rosa
c. Eosinfilos: de rojo a naranja
d. Basfilos: azul oscuro
6. Forma y color de los eritrocitos (rosa plido a naranja).
7. Basofilia difusa (color gris-azuloso).
8. Inclusiones en eritrocitos y leucocitos.
9. Variacin en la concentracin de Hb en los eritrocitos.
10. Morfologa plaquetaria.
11. Clulas inmaduras.
95
Examen crtico del frotis
Cuando se revisa un frotis hay que tener en cuenta la confirmacin de algunas

anomalas eritrocitarias que los equipos automatizados no siempre pueden detectar, tales
anomalas pueden ser:
1. Anisocitosis: Puede valorarse tras la observacin de los eritrocitos en varios campos
del frotis, con lo cual puede estimarse el promedio de eritrocitos normocticos,
microcticos o macrocticos. El grado de anisocitosis se valora en cruces (1-3).
2. Poiquilocitosis: Valoracin de la forma del eritrocito (discoidal, ovalado, esfrico,
espinoso, etc.). Esta observacin es de gran valor diagnstico y por ende debe
especificarse. El grado de valoracin es similar al de la anisocitosis (1 a 3 cruces).
3. Concentracin de hemoglobina: Valoracin de la intensidad del color en el
eritrocito para determinar si estos son normocrmicos, hipocrmicos o
hipercrmicos (relevante slo en esferocitosis). Se valora en cruces (1 a 3).
4. Policrmasia o anisocrmia: Valoracin de la uniformidad en la coloracin de los
eritrocitos. El grado de anisocrmia debe valorarse a la par de la concentracin de
hemoglobina y se reporta en cruces (1 a 3).
5. Inclusiones: Se valora la presencia de restos nucleares (Howell-Jolly o anillos de
Cabot) o intracelulares (punteado basfilo, Pappenheimer), as como la presencia de
eritrocitos parasitados (Plasmodium o Babesia). Cada una de estas inclusiones
suelen indicar una gama de procesos patolgicos especficos de cada una.
6. Eritroblastos: En condiciones normales no deben observarse en un frotis
sanguneo, sin embargo pueden presentarse en algunos casos. Cuando se observan
eritroblastos debe valorarse la cantidad de estos mediante una cuenta diferencial y
de esta forma evaluar si existe una interferencia significativa en la cuenta total de
leucocitos.
Adems de detectar estas posibles anomalas en un frotis, tambin se puede hacer

una cuenta de plaquetas por el mtodo indirecto, asegurndose de que las plaquetas estn
uniformemente distribuidas. Se observa tambin si las plaquetas son de tamao normal o si
carecen de granulacin.
Cuenta diferencial
Una definicin sencilla de lo que es una cuenta diferencial es: expresar en porcentajes
la cantidad de cada estirpe de leucocitos que hay presentes en la sangre; por lo tanto se
puede considerar como un anlisis cuantitativo y cualitativo simultneamente.
Cuando se realiza una cuenta diferencial manual se debe tomar en cuenta lo
siguiente:
a) Contar como mnimo 100 clulas, lo ideal sera realizar una cuenta de 200 clulas,
sin embargo por la optimizacin de tiempo 100 clulas es un nmero aceptable. La
cantidad de clulas a contar puede variar dependiendo de la cantidad absoluta de
leucocitos, del criterio y habilidad del analista, tomando en cuenta que entre menos
clulas se cuenten el error aumenta y entre ms clulas sean contadas el error
disminuye. Por ejemplo si se tiene una cuenta absoluta de 3000 leucocitos/L sera
preferible hacer una cuenta diferencial en 50 leucocitos, pero si por el contrario se
96
tiene una cuenta absoluta de ms de 100x103 leucocitos/L la cuenta diferencial
podra aplicar hasta en 500 leucocitos.
b) Los distintos tipos de leucocitos (monocitos, linfocitos o PMN) deben reportarse en
porcentajes relativos. Las clulas inmaduras tambin deben reportarse.
c) La presencia de eritroblastos puede generar interferencia en la cuenta total de
leucocitos, por lo cual su cuantificacin debe ser independiente de la cuenta
diferencial y se debe mencionar el porcentaje de eritroblastos en el reporte de la
cuenta diferencial.
d) Observar la morfologa de los leucocitos para identificar cualquier anomala.
97
Fundamento
Debido a que la eosina y el azul de metileno reaccionan a los cambios de pH de los

distintos componentes celulares, los que poseen carcter bsico fijan en mayor medida la
eosina (colorante cido), mientras que los que poseen carcter cido fijan mejor el azul de
metileno (colorante bsico) y nos dan una gama de colores en las clulas hemticas que
permiten clasificar a los leucocitos polimorfonucleares en base a sus propiedades tintoriales
en neutrfilos, eosinfilos y basfilos; diferenciar a los mononucleares (monocitos y
linfocitos) por la coloracin de su citoplasma, y adems permiten observar con mayor
facilidad las anormalidades morfolgicas en los mismos.
Sangre venosa con EDTA.
Porta objetos limpios y desengrasados.
Microscopio
Aceite de inmersin
Reactivos
Colorante de Wright
Amortiguador para colorante de Wright (pH de 6.8 7.2).
Agua
Procedimiento
1. Recolectar 2 mL de sangre venosa con anticoagulante en un tubo con tapn lila.

2. Homogeneizar perfectamente bien la sangre por inversin del tubo (5-10 veces).
3. Los portaobjetos se limpian y se preparan de la siguiente manera:
Los portaobjetos pueden lavarse con extrn o con agua y jabn, luego con mucha agua
caliente y limpia (que no se dejar enfriar hasta que se haya quitado todo el jabn), y por
ltimo, con agua destilada. Posteriormente se secan y se pulen con un trapo limpio sin
pelusa. A partir de entonces se manejarn tocando slo los bordes. Los portaobjetos secos
tambin pueden guardarse en una caja de Petri limpia y seca. Nota: Cuando los
portaobjetos son nuevos estos solamente deben limpiarse con una gasa o un pao
limpio.
4. Depositar una pequea gota
Gota de sangre
de sangre procedente de una
puncin cutnea, de una
jeringa o del tubo colector,
aproximadamente a un
cuarto de distancia de uno
de los extremos del
Fig. No. 18. Posicin de la gota de sangre
portaobjetos como se
muestra en la Figura 18.
5. Para extender la sangre se utiliza el borde fino de otro portaobjetos o bien se
emplean portaobjetos especiales. El portaobjetos que extiende la sangre debe
mantenerse en un ngulo de 30-40 con respecto al portaobjetos horizontal. El borde
98
del portaobjetos que efecta la extensin se desplaza hacia la gota de sangre hasta
que entre en contacto con la misma como se muestra en la Figura 19 (1 y 2).
1 2
3 4
Fig. No. 19. Desplazamiento del portaobjetos gua o extensor durante la elaboracin de
un frotis.
6. La gota de sangre se extiende rpidamente por capilaridad a lo largo del borde del
portaobjetos extensor. Desplazando ste lentamente en direccin contraria, se
realiza una fina extensin porque la sangre sigue por detrs del borde del
portaobjetos extensor como se muestra en la Figura 19 (3 y 4).
Las variaciones del grosor de la extensin se consiguen cambiando el tamao de la
gota de sangre, el ngulo del portaobjetos extensor y la velocidad de la extensin
Cuando el frotis se realiza por este procedimiento debe tener entre 3 y 4 cm, y
presenta tres zonas diferenciadas, en las que la morfologa eritrocitaria puede variar y la
distribucin de leucocitos es diferente (Figura 20).
Cabeza Cuerpo Cola
Zona de linfocitos Zona ideal Zona de monocitos y

neutrfilos
Fig. No. 20. Esquema de un frotis sanguneo con indicacin de las diferentes reas que
la componen y la distribucin celular de la misma.
7. Despus de que el frotis est seco, se escribe el nombre del paciente y la fecha en la
parte ms gruesa de la extensin.
8. Se coloca el frotis sanguneo seco en una rejilla o en un puente de tincin.
9. En caso de que el colorante no tenga un fijador, el frotis debe cubrirse totalmente
con alcohol etlico o metlico absoluto durante 1 2 minutos, para fijar la muestra.
99
10. El portaobjetos seco se cubre totalmente con el colorante de Wright y se deja un
minuto. Este tiempo vara segn el lote del colorante de Wright utilizado y se
determina mediante diversos ensayos.
11. Sobre la extensin se vierte una cantidad igual de solucin amortiguadora (pH 6.8
7.2). Hay que procurar que la mezcla de colorante y amortiguador no se derrame.
Soplar ligeramente con un piceta o un bulbo sobre la preparacin para mezclar el
buffer y el colorante. La aparicin de un brillo verde metlico indica que la tincin
es correcta.
12. Despus de que la mezcla del colorante y del amortiguador ha actuado durante 3 a 6
minutos (es preciso probar el tiempo ideal para cada lote de colorante) se elimina de
la superficie del portaobjetos, colocando ste horizontalmente bajo un chorro fino
de agua destilada. Con esto se evita que la preparacin se deteriore por el
precipitado.
13. A continuacin se lava el portaobjetos con agua corriente (o solucin salina
fisiolgica) durante un breve periodo de tiempo, si se aprecia un exceso de
coloracin azulada se efecta un lavado posterior. Procurar que el lavado no sea
muy extenso para no decolorar la preparacin y evitar que los grnulos de los
basfilos se disuelvan.
14. Dejar que se seque al aire, mantenindola inclinada o verticalmente sobre un papel
absorbente o una gasa.
15. Eliminar el exceso de colorante que existe en el otro lado del portaobjetos, frotando
con una gasa empapada en alcohol.
16. Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio, y se hace la observacin con
lente de inmersin en aceite directamente.
17. Al efectuar el recuento, se sigue el mtodo cruzado que se indica en la Figura 21.
Fig. No. 21. Patrn a seguir para realizar la cuenta diferencial en un frotis. La cuenta
diferencial se hace de este modo con el objeto de incluir las reas central y perifrica del
frotis.
18. El trmino cuenta diferencial se refiere a la distribucin porcentual de los
distintos tipos de leucocitos. El procedimiento usual consiste en contar 100
leucocitos, clasificndolos como leucocitos PMN neutrfilos, eosinfilos, basfilos,
monocitos y linfocitos. Los leucocitos jvenes o inmaduros se debern hacer contar
con todo cuidado.
Como la cuenta diferencial tiene un valor relativo es necesario tambin reportar la
cuenta diferencial en valores absolutos, para poder apreciar una patologa real en la
cantidad de cada tipo leucocitario. Para obtener los valores absolutos se emplea la siguiente
frmula:
Valor absoluto en mm3 = Cuenta total de leucocitos X % de estirpe leucocitaria
100
100
Valores de referencia:
Tabla No. 19. Valores de referencia porcentuales y absolutos para la cuenta diferencial
leucocitaria.
Tipo de leucocito % Absolutos
Neutrfilos 40 - 85 1500 7000
Bandas 0 - 11 0 - 800
Linfocitos 12 - 46 1000 - 4200
Monocitos 1 - 13 100 - 800
Eosinfilos 0-7 0 - 200
Basfilos 0-3 0 - 20
Actividades
Realizar la cuenta diferencial.

En base a los resultados obtenidos de su cuenta diferencial (porcentual), calcular los
valores absolutos de leucocitos, considerando que el conteo total de leucocitos
hubiese resultado de:
a) 7 500 leucocitos/mm3
b) 25 000 leucocitos/mm3
101
CUENTA DE RETICULOCITOS
Hay cuatro mediciones estndares de laboratorio tiles para el recambio eritroctico:

la cuenta de reticulocitos, la proporcin granulo/eritroide medular, la bilirrubina srica y la
concentracin de deshidrogenasa lctica srica (DHL). De stas, la cuenta de reticulocitos
es la ms cuantitativa y tambin la ms prctica para la evaluacin clnica del recambio
eritroctico.
El reticulocito es un eritrocito inmaduro que contiene RNA ribosomal. Su nombre
deriva del aspecto reticulado que muestra en las coloraciones supravitales debido a la
persistencia en el citoplasma de restos de organelos. Son clulas de volumen algo mayor
que los eritrocitos maduros, presentes en sangre perifrica en una proporcin entre 0,5 y 1,5
% de los eritrocitos (45-75x109/L) y constituyen un excelente indicador de la capacidad
regenerativa de la mdula sea eritroide, de forma que en las anemias arregenerativas son
escasos o nulos, y en las regenerativas son abundantes.
Para usar la cuenta de reticulocitos como ndice en la produccin de eritrocitos es
necesario hacer dos correcciones. La primera es la conversin del porcentaje a cifras
absolutas circulantes:
Reticulocitos absolutos = % reticulocitos x recuento eritrocitos
En condiciones normales, la cifra es de 50 000 reticulocitos/L. De otra manera, el
porcentaje de reticulocitos se corrige por el cambio en el hematcrito o la hemoglobina en
base a las siguientes frmulas:
ndice de reticulocitos = %reticulocitos x Hto del paciente
Hto normal

ndice de reticulocitos = %reticulocitos x Hb del paciente
Hb normal
Por ejemplo, un individuo que tiene 3% de reticulocitos y una hemoglobina de 7,5
g/dL(Hto 23%) tiene un porcentaje absoluto de reticulocitos de 1,5, como se muestra a
continuacin:
Porcentaje absoluto de reticulocitos = 3% x 7,5 = 1,5%
15

Porcentaje absoluto de reticulocitos = 3% x 23 = 1,5%
45
La segunda correccin se relaciona con la maduracin del reticulocito y su conducta
ante la estimulacin de eritropoyetina. Despus de que el eritroblasto en desarrollo pierde
su ncleo para formar un reticulocito medular, pasan cuatro das para que desaparezca el
RNA ribosmico de la clula en desarrollo. Por lo general, tres de estos das la clula
permanece en la mdula y el cuarto da en la circulacin. En el individuo normal, el
porcentaje de reticulocitos encontrados en la circulacin refleja la produccin de un da. No
obstante, con el aumento en la estimulacin con eritropoyetina, se acorta la maduracin
medular y el tiempo de maduracin de los reticulocitos en la sangre se alarga (Figura 22).
El reticulocito circula por dos o tres das antes de perder su caracterstica de teirse de azul.
Para obtener una medicin real de la produccin de eritrocitos, es necesario reconocer si los
reticulocitos han sido desplazados de la mdula y corregir por el tiempo ms prolongado
que han permanecido en la circulacin.
102
Como regla general, la correccin por el desplazamiento reticulocitario se basa en
la gravedad de la anemia. A esta correccin se le denominada ndice de produccin de
reticulocitos (IPR), ya que existe una relacin inversa, aproximadamente lineal, entre el
hematocrito y el perodo de maduracin perifrica de los reticulocitos:
Reticulocitos del paciente x Hto del paciente
IPR =
Perodo de maduracin en das x Hto normal
Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoytica medular (anemia
regenerativa), mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoytica (anemia
arregenerativa).
Por ejemplo, para una cuenta de 9% de reticulocitos en un individuo con una
hemoglobina de 7,5 g/dL (Hto 23%) se tiene un IPR de 2,25:
IPR = 9% x 7,5 = 2,25
2(correccin por tiempo de maduracin) x 15
El uso del segundo factor de correccin supone un aumento predecible de la
eritropoyetina en respuesta a la anemia. Este incremento ser menor de lo esperado si hay
un defecto en la estimulacin de la eritropoyetina, como se observa en pacientes con
insuficiencia renal o un estado inflamatorio. Ser mayor de lo esperado si el paciente est
hipxico por otras razones.
Fig. No. 22. Correlacin de hematcrito con el tiempo de maduracin del reticulocito. Al
aumentar el grado de anemia el tiempo de maduracin del reticulocito se desplaza hacia la
derecha y pasa ms tiempo madurando en sangre perifrica.
En caso de anemia intensa, el nmero de reticulocitos circulantes suele ser superior

al que corresponde al grado de regeneracin eritroblastica. Ello obedece a que la anemia se
acompaa siempre de un estmulo eritropoytico compensador, que facilita una salida
precoz de reticulocitos desde la mdula a la sangre perifrica, y un acortamiento de su
perodo de maduracin intramedular, lo que supone un aumento del perodo de maduracin
perifrica (Tabla 20). Este fenmeno se caracteriza por la aparicin en el examen
morfolgico de la extensin de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y tonalidad
azulada (policromasia). Los reticulocitos se determinan anotando la cifra observada al
contar 1000 eritrocitos en un frotis sanguneo. Con frecuencia, los resultados se expresan en
porcentaje (cifra por 100 eritrocitos), esto provoca a veces una falsa impresin del nmero
103
de nuevos eritrocitos que son producidos por el paciente anmico. Por ejemplo, un paciente
con un recuento eritrocitario de 2 millones y una cifra de reticulocitos no corregida del 5%
no est formando nuevos eritrocitos a una velocidad de cinco veces mayor que lo normal,
de esta manera un recuento (%) elevado de reticulocitos puede dar una impresin errnea
de la produccin real de eritrocitos, en estos casos se emplea el IPR, y por consiguiente si
se efecta un recuento eritrocitario, lo ms apropiado es que los reticulocitos se expresen en
cifras absolutas.
Tabla No. 20. Relacin entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia.

Hematocrito (L/L) 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15
Niveles de Hemoglobina (g/L) 150 133 117 110 83 66 50
Recuento de reticulocitos (%) 1 2 5 10 15 20 30
Recuento de reticulocitos corregido (%) 1 1,8 4 7 8,3 9 10
Tiempo de maduracin estimado 1 da 2 da 3 das
ndice de reticulocitos 1 2 5 5 7,5 10 10
El mejor colorante para el recuento manual de reticulocitos es el nuevo azul de

metileno, pues tie ms intensamente el material reticular que el azul de cresilo brillante,
que vara su intensidad de tincin entre muestras. Un buen sustituto del nuevo azul de
metileno es el azur B, el cual es fcil de conseguir y con un alto grado de pureza. Otro tipo
de tincin que puede emplearse para visualizar los reticulocitos son los mtodos de
fluorescencia con naranja de acridina, sin embargo es poco til para la rutina pues la
fluorescencia comienza a degradarse en cuanto la preparacin se expone a la luz. Hoy en
da la combinacin de la fluorescencia con la citometra de flujo permite automatizar el
recuento de reticulocitos para la rutina.
104
Fundamento
Cuando se tien con azul de cresilo brillante, azul de metileno u otros colorantes
supravitales que penetran en la clula viva antes de la fijacin, se precipita el cido
ribonucleico y aparece como una red azul que da el nombre de reticulocito a la clula.
Con respecto a la policromatofilia, la solucin de tincin puede ser azul de cresilo
brillante en solucin salina o su alcohol con o sin tincin de Wright como contraste.
Tambin puede utilizarse la tincin con nuevo azul de metileno. El material basfilo de los
eritrocitos jvenes toma el colorante supravital y adquiere el aspecto de retculo azulado.
En los reticulocitos jvenes aparecen mltiples granos y lneas; en los reticulocitos viejos
solamente hay algunos grnulos azulados.
Sangre venosa anticoagulada.
Portaobjetos desengrasados.
Cubreobjetos desengrasados.
Microscopio.
Aceite de inmersin.
Reactivos
Azul de cresilo brillante (hidrosoluble) 1% o nuevo azul de metileno al 1%.
Procedimiento
1. Recolectar sangre venosa en un tubo con EDTA.

2. Homogeneizar perfectamente bien la sangre con el anticoagulante por inversin del
tubo (mnimo 10 veces).
3. En un tubo de 12 x 75 mm, colocar 2 3 gotas de colorante, aadir de 6 a 8 gotas de
sangre anticoagulada. Si se emplea sangre capilar, es aconsejable aumentar la
cantidad de colorante para evitar la coagulacin. Mezclar perfectamente.
4. Se incuba a 37C durante 10 a 20 minutos. No se debe sobrepasar de este tiempo.
5. Mezclar bien la suspensin. Se preparan dos frotis en la forma habitual ya descrita,
quiz un poco ms delgada. No se aconseja una contratincin con Romanowsky.
6. Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio. Se hace la observacin con el
objetivo de 100X.
7. Se escoge una zona del frotis en donde no haya superposicin de eritrocitos. Los
reticulocitos se observan como eritrocitos con material granulofilamentoso de color
azul oscuro y los eritrocitos maduros se observan de color azul-verdoso.
8. Como base del clculo, por lo menos deben examinarse 1000 eritrocitos. Estos
deben examinarse en varias partes de la extensin. Contar el nmero de reticulocitos
que se encuentran en 1000 eritrocitos.
9. Informar el % de reticulocitos de acuerdo con el clculo siguiente:
% de Reticulocitos = No. de reticulocitos contados X 100

No. total de eritrocitos
105
10. Si se requiere informar el nmero de reticulocitos en mm3 se hace un cuidadoso
recuento de eritrocitos y se multiplica su nmero por el total de los reticulocitos
encontrados en 1000 eritrocitos, dividiendo el resultado entre 1000:
Reticulocitos/mm3= No. Reticulocitos encontrados x No. eritrocitos por mm3

1000
Valor relativo Valor absoluto

(%) (x109 /L)
Recin nacido 3,2 6,0 110 330
Nios y adultos jvenes de 4 0,2 2,2 25 89
a 19 aos
Adultos (20-50 aos) 0,5 1,5 24 84
106
BIOMETRA HEMTICA O CITOMETRA HEMTICA
El resultado del anlisis hematolgico, que forma lo que llamamos Biometra

Hemtica (BH), Hemograma o Citometra Hemtica, es una parte esencial de la
descripcin clnica de casi todas las enfermedades. Un nmero, una distribucin normal de
las clulas y una concentracin de hemoglobina normal en la sangre tienen tanta
importancia como constantes fisiolgicas para poder diagnosticar una posible enfermedad.
Para un diagnstico diferencial, a menudo es til saber que ciertas enfermedades no
producen notables cambios en la sangre. Respecto a las enfermedades de la sangre y los
rganos hematopoyticos, cabe sealar que muchas veces el hallazgo de anomalas en los
parmetros hematolgicos ms usuales (descenso de la cifra de hemoglobina, leucocitosis,
VSG acelerada) no traduce la existencia de una enfermedad de la sangre, sino de otro
rgano o sistema que, de forma secundaria, produce tales alteraciones.
Las enfermedades de la sangre pueden afectar, bsicamente, elementos celulares
(eritrocitos, leucocitos, plaquetas), plasmticos (inmunoglobulinas, factores de la
coagulacin), rganos hematopoyticos (mdula sea) y rganos linfoides (ganglios
linfticos, bazo). Debido a las diversas funciones que tales elementos llevan a cabo
(transporte de oxgeno, defensa frente a infecciones, coagulacin), sus trastornos darn
lugar a una serie de manifestaciones que pueden englobarse en diversos sndromes. En la
actualidad, una forma nada infrecuente de presentacin de las enfermedades hematolgicas
es la prctica, por motivos diversos, de anlisis que de forma totalmente inesperada
ponen de manifiesto una anomala que conduce al diagnstico de una enfermedad todava
asintomtica.
Los resultados de la BH se utilizan en el diagnstico, pronstico y vigilancia de la
teraputica clnica. Por tanto, es evidente, que la Hematologa Clnica abarca un campo casi
tan amplio como el del diagnstico mdico.
En la actualidad con el empleo de equipos automatizados la BH se integra de cerca
de 15 parmetros, medidos todos en tiempos record (30-40 segundos) y con eliminacin de
las fuentes de error, estos parmetros se clasifican en 2 grupos:
a) Formula roja: Recuento de eritrocitos y plaquetas, determinacin de Hb, Hto,
ndices eritrocitarios y amplitud de distribucin eritrocitaria (ADE) en los equipos
automatizados.
b) Formula blanca: Recuento total de leucocitos y cuenta diferencial
Para algunos laboratorios una BH slo incluye 6 parmetros (recuento de eritrocitos,

Hb, Hto, ndices eritrocitarios, recuento de leucocitos y cuenta diferencial) y para otros,
estos mismos 6 parmetros ms la cuenta de plaquetas. Por lo cual cada laboratorio siempre
debe especificar las pruebas incluidas en la BH, pues con esto se ha generado dos trminos
ambiguos: BH de rutina y BH completa, que en la prctica no deberan tener diferencia
alguna, pues los equipos automatizados obtienen todos los parmetros en una sola
determinacin.
Hoy en da la BH se hace acompaar de otras pruebas para diagnosticar patologas
hemticas especficas. Algunas de estas pruebas son la VSG, para dar seguimiento a
infecciones; tinciones citoqumicas, inmunofenotipo, mtodos moleculares o mtodos
citogenticos, para diagnosticar hemopatas malignas; electroforesis de Hb, para
establecer talasemias o hemoglobinopatas; crioaglutininas, para identificar anemias
hemolticas autoinmunes; slo por mencionar algunas.
107
La BH al tratarse de un estudio de la sangre no debe limitarse al diagnstico de las
patologas hemticas, sino que puede ser indispensable en otros trastornos que convergen
con alteraciones de la sangre, tales como infecciones parasitarias, cncer, enfermedades
gastrointestinales, entre otras.
Si es evidente que el elemento primario o principal de la enfermedad considerada
consiste en cambios hematolgicos o si interesa excluir la presencia de estos cambios, el
mdico ha de procurar un examen hematolgico completo. A fin de conseguir un estudio
inmediato y efectivo del enfermo, tal vez sea necesario solicitar la consulta del patlogo o
del hematlogo clnico. En todo caso, la finalidad de este examen es adquirir la mxima
informacin respecto al sistema sanguneo, con la menor incomodidad posible para el
paciente y en un tiempo mnimo. La experiencia ensea que la exactitud tcnica y la
utilidad diagnstica de los anlisis de sangre son mayores cando se hace a la vez varias
observaciones, a ser posible con una sola muestra.
Naturalmente conviene seleccionar los procedimientos de acuerdo con los hallazgos
clnicos, pero el riesgo de excederse en el nmero de observaciones en este tipo de trabajo
es mucho menor que el que resulta de tratar de reunir informacin fragmentada obtenida en
momentos diferentes y con muestras distintas del mismo paciente.
En las Figuras 23 y 24 se muestran los reportes de BH generados por un equipo
CELL-DYN 3700 (Abbott) y un ADVIA 120 (SIEMENS), respectivamente. Estos
citogramas generados por cada equipo son para uso exclusivo del laboratorio, sin embargo
cada laboratorio puede y debe realizar su formato para el reporte de resultados que se
entrega al paciente.
108
Fig. No. 23. Hoja de reporte del autoanalizador hematolgico CELL-DYN 3700.
109
Fig. No. 24. Hoja de reporte del autoanalizador hematolgico ADVIA 120.
110
Fundamento
Aunque a veces la presencia de anemia, leucemia, defectos cuantitativos y/o

cualitativos de las plaquetas u otro tipo de trastornos, se pueden sospechar por
interrogatorio y exploracin fsica. La Biometra Hemtica es una medicin mucho ms
definitiva del estado de los tejidos formadores de sangre.
Sangre venosa anticoagulada.
Todo el equipo necesario utilizado en las prcticas anteriores.
Reactivos
Todos los necesarios utilizados en las prcticas anteriores.
Procedimiento
1. Recolectar sangre venosa anticoagulada con EDTA.

2. Homogenizar perfectamente bien la sangre, mediante repetida inversin del tubo.
3. Dividir la muestra de sangre anticoagulada en 2 tubos de 12x75 mm en partes
iguales.
4. Etiquetar los tubos con el nmero de lista de la persona a la que se extrajo la sangre.
5. Entregar al asesor los 2 tubos con la muestra de sangre anticoagulada, perfectamente
homogenizados y etiquetados.
6. Con base a los conocimientos prcticos adquiridos en las prcticas anteriores,
realizar a la muestra problema proporcionada por el asesor una Biometra Hemtica
de rutina de manera manual.
7. Realizar las siguientes pruebas:
Formula Roja:
o Recuento eritrocitario
o Hb
o Hto
o ndices eritrocitarios
Formula Blanca
o Cuenta total de leucocitos
o Cuenta diferencial
Actividades
Realizar una biometra hemtica de manera manual.

Entregar en una hoja de reporte hematolgico los resultados obtenidos de la
biometra hemtica el mismo da de la prctica.
111
LOS AUTOANALIZADORES
En la actualidad la importancia del laboratorio clnico para ayudar a esclarecer

distintas patologas se ha incrementado, por lo cual el laboratorio clnico se ha visto
obligado a mejorar las tcnicas para entregar los resultados en un menor lapso de tiempo.
Esta mejora continua llev a crear equipos automatizados capaces de realizar exmenes de
laboratorio en un corto tiempo y con la mayor calidad posible para garantizar la veracidad
de los resultados.
El estudio de la Hematologa dio un gran giro cuando Paul Erlich en 1877 desarrollo
una tincin tricida, dando as la base para la diferenciacin de todas las clulas sanguneas,
pues hasta ese tiempo solo se conocan dos componentes de la sangre, los corpsculos rojos
y blancos. Conforme fueron esclarecindose los misterios de la sangre se desarrollaron
tcnicas manuales para la cuantificacin de los diversos componentes sanguneos, estas
tcnicas han ido perfeccionndose para reducir el tiempo analtico y obtener mejores
resultados, sin embargo todas estas tcnicas manuales tienen la desventaja de tener grandes
fuentes de error. Estas fuentes de error fueron borradas con el advenimiento de los equipos
automatizados, pues estos equipos no slo los eliminaron, sino que mejoraron los tiempos
analticos procesando un volumen mucho mayor de muestras en un menor lapso de tiempo;
adems proporcionan mejor exactitud y precisin, pero sobre todo reducen el riesgo de
contagio por contacto con la muestra, pues basta con presentarle la muestra al equipo para
que est la procese.
En la actualidad se emplea una gran variedad de instrumentos automatizados para
procesar biometra hemtica. Los equipos semiautomatizados aun requieren cierta
intervencin del operador para preparar las muestras a analizar y slo procesan pocos
parmetros a la vez. Los instrumentos completamente automatizados requieren que se les
presente la muestra y las identifican mediante un sistema de cdigo de barras, estos equipos
son multicanal pues pueden determinar de 8 a 20 parmetros al mismo tiempo, algunos de
estos inclusive determinan variables que no existen equivalentes en las tcnicas manuales.
La tecnologa en los autoanalizadores hematolgicos mejora y se renueva
constantemente aplicndose a las tres series del hemograma. Desde que Wallace Coulter
describi la tcnica de impedancia para el recuento celular en 1956 hasta nuestros das, sta
ha sido mejorada a la vez que se han introducido otras metodologas ms sofisticadas como
la citometra de flujo (dispersin de luz y fluorescencia con la aplicacin de anticuerpos
monoclonales).
Los sistemas ms sofisticados y complejos de cada casa comercial son:
1. Abbott: Cell-Dyn 4000 y Cell-Dyn Sapphire
2. Beckmann-Coulter: Gens, LH-750
3. Sysmex: XE-2100, XE-5000
4. Siemens: ADVIA 120, 2120, 2120i
5. Horiba-ABX: Pentra 120 DX
Recuento por impedancia. Principio Coulter
En 1956, Wallace Coulter patent el llamado principio Coulter referido al recuento

de partculas. Segn este autor: el principio Coulter es un mtodo electrnico para el
recuento y medicin de partculas. Est basado en que las clulas, las cuales son malas
conductoras de electricidad, van a interrumpir el flujo de corriente.
112
El electrodo interno est encerrado en una cubierta de cristal no conductivo, el cual
tiene una pequea apertura (Figura 25).
Corriente de apertura
Vaco (6mmHg)
Electrodo interno
Electrodo interno
Apertura
Tubo de apertura
Contenedor de Suspensin de clulas

muestra
Fig. No. 25. Esquema del recuento celular en los equipos basados en el principio Coulter
(impedancia elctrica).
Cada impulso es amplificado y comparado con los canales de voltaje de referencia

internos. Estos canales se hallan delimitados por discriminadores de tamao calibrados, que
aceptan nicamente los impulsos con una determinada amplitud. As pues, los impulsos son
clasificados en los distintos canales
medidores del tamao, segn su
amplitud. Dichos impulsos pueden
mostrase en la pantalla de un
oscilgrafo. Por ejemplo si
planteamos que tenemos 4 canales
distribuidos entre los umbrales T1 a
T5 (Figura 26), en donde el canal 2
est determinado por T1 y T2, el
canal 2 descrito por T2 y T3, y as
sucesivamente hasta obtener los
cuatro canales. Las partculas que se
contaran sern las que caigan dentro Fig. No. 26. Ejemplo de un osciloscopio en un
de estos cuatro canales, las que caigan equipo con principio Coulter.
por debajo o por encima de estos no
se tomaran en cuenta por discrimacin de tamao. Observando las 18 lneas (pulsos) en la
Figura 26, se nota que solo 17 caen en los cuatro canales y por lo tanto solo estas sern
contadas. Si ponemos un valor a cada umbral entonces tenemos que T1= 20 fL y que cada
umbral aumenta en 5fL, entonces T2= 25 fL, T3= 30 fL, etc. Entonces se puede generar
una grfica de distribucin por tamao, en donde el eje de las X corresponde al tamao de
la clula y el eje de las Y al nmero de las mismas. Continuando con el ejemplo entonces
tenemos que tres pulsos caen entre 20 25 fL, seis entre 25 30 fL, cinco entre 30 35 fL
y tres entre 35 40 fL se obtiene la grfica mostrada en la Figura 27. La finalidad de
113
establecer estos umbrales es la de excluir las partculas no deseadas, tales como restos
celulares o basura de algn otro tipo,
clasificar a las clulas por su tamao y
distinguir a los eritrocitos de las plaquetas.
Cada equipo tiene especificados sus
umbrales de contaje, los cuales deben
disponer de un umbral inferior capaz de
distinguir eritrocitos microcticos de las
plaquetas grandes y uno superior para
evitar que los leucocitos sean incluidos en
el contaje de eritrocitos.
Fig. No. 27. Construccin de un histograma

de distribucin de frecuencia.
Variaciones en los volmenes eritrocitarios: Amplitud de la distribucin eritrocitaria (ADE
o RDW)
Los histogramas generados por los equipos en base a la distribucin del volumen
celular permiten distinguir la presencia de ms de una poblacin celular, esto con la
finalidad de poder evaluar el porcentaje de clulas situadas por encima y por debajo de
unos umbrales determinados para el VCM y as poder sealar la existencia de eritrocitos
con microcitosis o con macrocitosis (Figura 28). La mayora de los equipos tambin
realizan una medicin cuantitativa de la variacin en el volumen celular, una equivalencia
del anlisis microscpico del grado de anisocitosis. A este nuevo parmetro se le denomino
amplitud de distribucin eritroctica (ADE), la cual es obtenida del anlisis de la altura del
impulso y se puede expresar como la desviacin estndar (en fL) o como el coeficiente de
variacin (en %) de las mediciones del volumen eritrocitario:
ADE (%) = Desviacin del VCM x 100

VCM
La ADE puede verse afectada por
mltiples factores, desde los generados por la
<60 >120
forma del eritrocito hasta los creados por el
flujo de paso y el tamao de la abertura de
paso. Sin embargo la misma direccin del
flujo formado puede reducir el error por la
forma del eritrocito. Tambin puede ocurrir
fL que durante el conteo dos o ms clulas
Fig. No. 28. Grfico que representa la penetren simultneamente la zona sensible de
amplitud de distribucin eritrocitaria. la abertura, generando entonces un nico
impulso de gran amplitud y una mayor rea
del impulso, pareciendo entonces que una gran clula atravesara la abertura. En
consecuencia el recuento celular experimenta una falsa disminucin y un aumento en la
ADE. A esta reduccin se le conoce como prdida por coincidencia de paso y puede
114
predecirse estadsticamente, porque se relaciona directamente con el volumen efectivo de la
abertura y el grado de la dilucin, por lo tanto los equipos generan una correccin
automtica segn la perdida por coincidencia de paso.
Dispersin lumnica (citometra de flujo)
La interaccin de la luz con una clula modifica su direccin pero no su longitud de

onda, produciendo una dispersin de la misma en todas las direcciones del espacio. Como
mtodo de anlisis celular, la dispersin de la luz es ms complejo que la impedancia ya
que, adems del tamao y la concentracin de las clulas, permite analizar la complejidad
de la estructura celular (granularidad y caractersticas del ncleo) y de esta forma
diferenciarlas entre s como si se tratara de un examen morfolgico.
El mtodo de la dispersin lumnica consiste en analizar el efecto que sobre un haz
de luz monocromtica de alta intensidad (lser) ejercen las clulas sanguneas al cruzarse
una a una en su trayectoria. El lugar donde se produce el encuentro entre las clulas y el haz
de luz lser es la cmara de flujo. Cada vez que una clula se interpone en el haz de luz se
produce una interrupcin del paso de fotones o sombra que es proyectada sobre un detector
de campo oscuro y una dispersin del propio haz que se difracta (cambia de sentido por
efecto de la superficie celular), refracta (cambia de velocidad por efecto de las estructuras
celulares) y refleja (invierte el sentido por efecto de las estructuras opacas). La suma de
todos efectos es la dispersin lumnica que normalmente es detectada por sensores situados
a dos ngulos diferentes: ngulo recto (90) o fotomultiplicador y un ngulo cnico
pequeo (0,5-10) o fotodetector (Figura 29).
Fig. No. 29. Principio de dispersin lumnica o Citometra de flujo.
115
Sistema CELL-DYN 3700
El CELL-DYN 3700 es un equipo fabricado por Abott Laboratories y puede procesar

muestras por dos vas:
Modo abierto: aspira 130 L 5% de sangre
Modo cerrado: aspira 240 L 5% de sangre
Posee tres canales de medicin independientes para determinar el hemograma y la

cuenta diferencial: 1) un canal de hemoglobina; 2) un canal de impedancia para los
parmetros eritrocitarios y plaquetarios, y 3) un canal ptico para el recuento leucocitario y
cuenta diferencial (WIC [canal de impedancia] y WOC [canal ptico]).
1. Canal de hemoglobina
El canal de Hb se utiliza para la determinacin colorimtrica de la hemoglobina. La

dilucin 1:301 de la muestra con el diluyente y el reactivo hemolizante WIC/HGB en la
cmara de mezcla del transductor del canal WIC. Esta dilucin se utiliza para el recuento
WIC y la medicin del valor de Hb. Se emplea un reactivo sin cianuro para convertir a la
Hb en un complejo hemoglobina-hidroxilamina, el cual es medido a 540 nm por un diodo
emisor.
2. Canal de impedancia (Determinacin de eritrocitos y plaquetas)
Para determinar los datos eritrocitarios y plaquetarios se utiliza un canal de

impedancia. La dilucin 1:10812 de la muestra se prepara con el diluyente. Las clulas se
cuentan y miden en un sistema de impedancia que posee una abertura de paso de 60 x 70
m a medida que pasan por el orificio del transductor del canal RBC/PLT de von Behrens.
La separacin de las plaquetas y los eritrocitos se logra mediante un umbral dinmico. Se
analizan 100 L de la dilucin para el recuento de eritrocitos y plaquetas, los datos se
recogen en 256 canales (cada uno equivalente a 1fL), para construir el histograma de
tamao. Los umbrales comprendidos entre 1 35 fL recogen los datos para las plaquetas y
los umbrales de 36 fL en ascenso recaban los datos para los eritrocitos.
Hto: El hematcrito se calcula a partir del recuento de eritrocitos y del VCM
mediante la siguiente ecuacin:
Hto = (RBC X VCM)/10
VCM: Se obtiene a partir de los datos de distribucin por tamao de los eritrocitos y
se expresa en fL.
HCM: Se calcula a partir de RBC y de la Hb mediante la ecuacin:
HCM = (Hb/RBC) X 10
1. CHCM: Se calcula a partir de la Hb y el Hto:
CHCM = (Hb/Hto) X 100
2. ADE: Este parmetro se obtiene a partir del histograma de los eritrocitos y es
equivalente al porcentaje de CV (coeficiente de variacin):

VCM
116
3. Canal ptico (recuento leucocitario y cuenta diferencial)
Utiliza las tcnicas de citometra de flujo, basada en el rayo lser, para analizar
subpoblaciones leucocitarias. La citometra de flujo se puede definir como un proceso, en el
cual las clulas u otras partculas son obligadas a pasar, de una en una, por una corriente de
lquido envolvente a travs de un sensor o sensores que miden sus caractersticas fsicas o
qumicas por el ngulo de dispersin de la luz.
El sistema CELL-DYN 3700 emplea dos canales para determinar los parmetros
leucocitarios; la citometra de flujo para realizar el recuento leucocitario y analizar las
subpoblaciones leucocitarias (WOC) y la impedancia para realizar el recuento leucocitario
y cuenta diferencial por la forma de los ncleos (WIC). El canal ptico se usa para
determinar los datos WOC. Con el reactivo envolvente se prepara una dilucin 1:51 de la
muestra, de la cual la jeringa volumtrica WOC inyecta un volumen exacto en la corriente
de flujo laminar generado por el reactivo envolvente para alinear las clulas y que estas se
vean forzadas a pasar una por una por la cmara de cuarzo, donde se encuentra un laser de
helio-nen con polarizacin vertical.
El analizador mide los parmetros de dispersin de luz en los siguientes ngulos
(Figura 30):
1. ngulo tradicional de avance = 1 3 0, que sirva para medir el tamao celular.
2. Dispersin ortogonal de la luz = 70 110 90, que sirva para medir la superficie
celular y la estructura interna (lobularidad).
3. ngulo estrecho = 7 11 10, se emplea para medir la complejidad celular.
4. Dispersin ortogonal de la luz despolarizada = 70 110 90D, que se emplea
para medir la granularidad celular.
Dispersin a 0 Dispersin a 10
Dispersin a 90 Dispersin a 90D
Fig. No. 30. ngulos de dispersin de luz para las determinaciones por citometra de
flujo en el equipo CELL-DYN 3700.
El canal WIC emplea una dilucin de 1:301 de la muestra con el reactivo
hemolizante WIC/HGB. Este reactivo liza los eritrocitos y desprende el citoplasma de los
leucocitos dejando intactos los ncleos. Los ncleos (leucocitos y eritroblastos) son
contados por impedancia en el transductor de von Behrens WIC con una abertura de paso
117
de 100 x 77 m. Se analiza un volumen de 200 L de la dilucin y los datos son recogidos
en 256 canales, con los cuales se forma un histograma de lobularidad.
Sistema ADVIA 120
Inicialmente introducido por Bayer Corporation y hoy en da fabricado por

SIEMENS, es un equipo que emplea citometra de flujo para los parmetros de formula roja
y blanca, adems de citoqumica para efectuar la cuenta diferencial leucocitaria. Este
aparato utiliza gran parte de la tecnologa de los sistemas Technicon H-1, H-2 y H-3 ms
antiguos, sin embargo Bayer simplifico la hidrulica y las operaciones del analizador. El
ADVIA 120 emplea cuatro canales de medicin independientes para determinar el
hemograma y el recuento diferencial: 1) canal para eritrocitos y plaquetas; 2) canal para
Hb; 3) canal para Peroxidasa (PEROX), y 4) canal para lobularidad de basfilos (BASO)
para recuento leucocitario y datos diferenciales.
1. Canal para eritrocitos y plaquetas
Las reacciones para el recuento de eritrocitos y plaquetas ocurre bsicamente en dos

pasos: 1) Los eritrocitos y las plaquetas se esferizan isovolumtricamente por accin del
reactivo ADVIA 120 HEM/PLQ; 2) fijacin de los eritrocitos y plaquetas. Una vez
terminada la reaccin se hace pasar un volumen constante de la suspensin por la cubeta de
lectura, en ella se miden las seales de la difraccin de luz de ngulo bajo (2 a 3) y de
ngulo alto (5 a 15) de cada clula. Esta suspensin es envuelta por el reactivo ADVIA
120 ENVOLVENTE/ACLARANTE cuando pasa por la cubeta de lectura. Se detectan las
dos seales de difraccin de luz, se amplifican electrnicamente y se dividen en cuatro
seales.
Se emplea una seal de difraccin de luz de ngulo bajo y una de ngulo alto para
analizar los eritrocitos.
La seal de difraccin de luz de ngulo bajo (2 a 3) se amplifica 30 veces, y la
seal de difraccin de luz de ngulo alto (5 a 15) se amplifica 12 veces. Estas
seales se emplean para analizar plaquetas.
Utilizando la teora de Mie de la difraccin de la luz en esferas homogneas, la
medicin de la difraccin de la luz de ngulo bajo se convierte en volumen celular y la
medicin de difraccin de luz de ngulo alto se convierte en concentracin de hemoglobina.
Los ndices eritrocitarios se calculan a partir de los parmetros medidos directamente
(eritrocitos, Hb y VCM):
VCM: Se obtiene a partir de la media del volumen eritrocitario y se expresa en fL.
Hto: El hematocrito se calcula a partir del recuento de eritrocitos y del VCM
mediante la siguiente ecuacin:
Hto = (HEM VCM)/10
HCM: Se calcula a partir de RBC y de la Hb mediante la ecuacin:
HCM = (Hb/HEM) 10
CHCM: Se calcula a partir de la Hb y el Hto:
CHCM = (Hb/[HEMVCM]) 1000
RDW: Se calcula como el CV del histograma de volumen eritrocitario.
118
VCM
2. Canal para hemoglobina
Se emplea un reactivo que contiene un agente tensoactivo y cianuro de potasio que

se disuelve en una solucin alcalina de borato a pH 11.3 (ADVIA 120 HGB). Este reactivo
hemoliza los eritrocitos y desnaturaliza las protenas sanguneas con una solubilizacin de
los grupo hemo por las micelas tensoactivas. Los grupos hemo solubilizados experimentan
una oxidacin del hierro ferroso a frrico y se combina con dos molculas de cianuro para
formar micelas de ferrihemo. Las micelas pasan a travs de una cubeta de flujo donde se
mide la absorbancia a una emisin de 546 nm. Una vez procesados, los datos pticos se
representan en una curva de la tasa de Hb a razn de tiempo.
La cantidad de Hb se calcula a partir de la siguiente ecuacin:
log(media de muestra/media lnea base) Factor cal. Hb 50
3. Canal de Peroxidasa (PEROX)
Para las reacciones del canal PEROX se emplean 4 reactivos (ADVIA 120
ENVOLVENTE PEROX, PEROX 1, PEROX 2 y PEROX 3), los cuales lisan y tien los
leucocitos por su actividad peroxidasa. La reaccin siguiente es catalizada por la peroxidasa
celular, que convierte el sustrato a un precipitado oscuro en los neutrfilos, los eosinfilos y
los monocitos, los cuales se tien segn su grado de actividad peroxidasa. Esta reaccin se
expresa en la siguiente ecuacin:
H2O2 + 4-cloro-2-naftol peroxidasa celular precipitado oscuro
Una porcin de la suspensin se coloca en la corriente de un flujo laminar que
atraviesa un sistema ptico halgeno de campo oscuro, donde se mide la absorbancia
(proporcional a la cantidad de peroxidasa) y la dispersin frontal (tamao de la clula).
4. Canal BASO
Las clulas son tratadas con un reactivo que contiene un surfactante no inico en
una solucin cida, para lisar los eritrocitos y plaquetas, adems de que desprende el
citoplasma de los leucocitos dejando intactos los basfilos. El lser ptico, con el mismo
sistema de dispersin frontal en dos ngulos del canal de HEM, se emplea para analizar las
clulas tratadas.
El ngulo alto proporciona la complejidad nuclear y el ngulo bajo proporciona el
tamao de la clula. Los basfilos son identificables por su gran dispersin en ngulo bajo,
el anlisis del cmulo permite identificar y cuantificar cada poblacin leucocitaria.
119
14
9 7
12 13
5
6
4
8 10 11
3 9
2
1 1
Fig. No. 31. Citogramas de PEROX y BASO en el equipo ADVIA 120. 1) Ruido. 2)
Eritroblastos. 3) Plaquetas agregadas. 4) Linfocitos y basfilos. 5) LUC -clulas grandes
no teidas-. 6) Monocitos. 7) Neutrfilos. 8) Eosinfilos. 9) Blastos. 10) Mononucleares.
11) Neutrfilos y eosinfilos. 12) Basfilos. 13) Posible anormalidad baso. 14)
Saturacin.
Actividades
El equipo de trabajo correspondiente presentara un seminario con la informacin

ms actualizada sobre los fundamentos, equipos y determinaciones de los diversos
equipos automatizados empleados en el rea de Hematologa.
Leer el Anexo I
120
FRAGILIDAD OSMTICA
La membrana eritrocitaria (Figura 32) es la responsable de las propiedades

mecnicas y de la mayora de las funciones fisiolgicas de la clula. Est formada por una
bicapa lipdica plana, donde predominan los fosfolpidos y el colesterol (80%) y en menor
medida los glucolpidos y aminofosfolpidos, distribuidos asimtricamente. De igual forma,
se encuentran embebidas parcial o totalmente en ella las protenas integrales de membrana,
unidas fuertemente por enlaces no polares. Su libre desplazamiento a travs de esta bicapa
contribuye a mantener su fluidez. Las protenas perifricas interactan entre s para formar
una malla o enrejado que recubre la cara interior de la doble capa de fosfolpidos y son las
responsables de la estabilidad y las propiedades viscoelsticas de la membrana.
Fig. No. 32. Representacin esquemtica de la membrana eritrocitaria. Las protenas

integrantes son la banda 3 y la glucoforina C (GPC). El citoesqueleto est formado por
tetrmeros de espectrina: bandas y bandas , actina y protenas de unin: 4.1, 4.2, 4.9
y 2.1 (anquirina).
Defectos en algunas de estas protenas pueden dar lugar a trastornos clnicos en los
cuales est involucrada la estabilidad del eritrocito. Entre ellos los ms frecuentes y mejor
estudiados son la esferocitosis hereditaria y la eliptocitosis hereditaria.
Esferocitosis hereditaria
La esferocitosis hereditaria (EH) es una enfermedad caracterizada por anemia

hemoltica de severidad variable y una respuesta clnica favorable a la esplenectoma.
La esferocitosis es la anemia hemoltica ms frecuente en la poblacin. Es una
enfermedad muy heterognea, de herencia autosmica dominante generalmente,
caracterizada por una disminucin de la relacin superficie/volumen de los eritrocitos, con
hemlisis, presencia de esferocitos en sangre perifrica, elevacin de la concentracin de
121
hemoglobina corpuscular media en la mitad de los casos y aumento de la fragilidad
osmtica (Figura 33). Los eritrocitos de pacientes con esferocitosis hereditaria presentan
una disminucin de Na+ intracelular y una prdida de lpidos de la membrana, lo cual
explica la disminucin del rea superficial de la clula.
La esferocitosis se produce por un defecto intrnseco del eritrocito y se han
demostrado defectos moleculares de diferentes protenas que conforman el esqueleto de la
membrana eritrocitaria. La presencia de alteraciones del metabolismo, del transporte
catinico, de la fosforilacin de las protenas y de la composicin de los lpidos de la
membrana, son secundarias a la causa primaria de esta enfermedad. La lesin en la
membrana est dada por una prdida del rea de la clula, pero se desconoce si esto se debe
a una prdida fsica (fragmentacin) o a una contraccin de la superficie de la membrana, y
aunque la mayora de las evidencias favorecen la fragmentacin, no parece ser el nico
mecanismo que explique este hallazgo. Adems, los eritrocitos esferocticos pierden
membrana ms rpidamente que los eritrocitos normales cuando se deprime su
metabolismo. La concentracin de fosfolpidos y colesterol es del 15 al 20 % menor de lo
normal debido posiblemente a la disminucin de su superficie y se presume que tambin se
produce una prdida de las protenas integrales de la membrana.
Fig. No. 33. Curva de fragilidad osmtica, donde se compara una persona normal
contra una persona con esferocitosis hereditaria.
Anemias hemolticas
Las anemias hemolticas se clasifican por su etiologa en congnitas y adquiridas.

En las primeras, la anomala reside en un componente del propio eritrocito: membrana,
molcula de hemoglobina o alteracin metablica. En las segundas, el causante de la
hemlisis es extrnseco al eritrocito, bien a travs de mecanismos inmunes, una alteracin
ambiental o de una microangiopata. Las anemias hemolticas congnitas y adquiridas ms
frecuentes son:
1. Congnitas
o Defectos de la membrana
Esferocitosis
Eliptocitosis
122
o Alteraciones metablicas por defectos enzimticos
En la va de Embden-Meyerhof
En la va de pentosa-fosfato
o Alteraciones en la hemoglobina
Talasemias
Hemoglobinas anmalas
2. Adquiridas
o Inmunes
Autoinmunes (por anticuerpos calientes o fros)
Isoinmunes (enfermedad hemoltica del recin nacido)
Por medicamentos
o Mecnicas
Anemia hemoltica microangioptica (Sndrome hemoltico-urmico,
hemangioma gigante)
o Infecciosas
Malaria
o Txicas
Agentes oxidantes
Arsnico
o Agentes fsicos
Quemaduras graves
123
Fundamento
Los defectos en la composicin protenica de la membrana producen una

disminucin en el cociente superficie/volumen del eritrocito lo que acarrea la prdida de la
forma bicncava del eritrocito. As mismo, se producen cambios en la viscosidad
citoplsmica como consecuencia de la entrada de agua y aumento del volumen. Debido a
ello cuando los eritrocitos se incuban en medios de hipotonicidad gradual, existe entrada de
agua al eritrocito hasta sobrepasar el lmite de elasticidad del hemate y por consiguiente se
revientan ms rpido que un eritrocito normal.
Sangre venosa anticoagulada
Una gradilla
13 tubos de 13 x 100 mm
Pipeta de Sahli de 0. 02 mL (20L)
Boquilla
Pipetas graduadas de 5 y 10 mL
Centrifuga
Celdas espectrofotomtricas
Espectrofotmetro
Reactivos
Heparina
Solucin de depsito de NaCl al 10% (pH=7.4)
Solucin al 1.0% de NaCl
Procedimiento
Mtodo de Dacie
Mtodo cuantitativo sin incubacin
1. Recolectar 3 mL de sangre venosa heparinizada en un tubo con tapn.

2. Empezando con una solucin al 1% se hacen las siguientes diluciones en tubos de
13 x 100 mm:
124
Tabla No. 21. Curva de fragilidad osmtica con soluciones hipotnicas.
Agua destilada
No. de Tubo NaCl al 1% (ml) NaCl Hemolisis Absorbancia
(ml) (%) (%)
1 0.00 5.00 0.00 100
2 0.50 4.50 0.10
3 1.00 4.00 0.20
4 1.50 3.50 0.30
5 1.75 3.25 0.35
6 2.00 3.00 0.40
7 2.25 2.75 0.45
8 2.50 2.50 0.50
9 2.75 2.25 0.55
10 3.00 2.00 0.60
11 3.25 1.75 0.65
12 3.75 1.25 0.75
13 4.25 0.75 0.85 0 0
3. Se mezcla el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre.
4. Homogeneizar perfectamente bien la sangre haciendo girar el tubo circularmente.
5. Agregar a los trece tubos el volumen de 0.2 mL (medido con precisin con la pipeta
de Sahli) de sangre del paciente.
6. Se mezcla correctamente cada tubo (NO agitar, porque se puede hemolisar la
sangre).
7. Se dejan a temperatura ambiente por 30 minutos.
8. Vuelven a ser mezclados y se centrifugan a 2000 rpm durante 10 minutos.
9. Leer en un espectrofotmetro a 540 nm el sobrante de cada tubo.
El tubo No. 13 se usa como blanco. El tubo No. 1 corresponde al patrn de 100% de
hemlisis. Para la lectura, el sobrenadante de cada tubo debe ser vertido a la celda
cuidadosamente para no incluir las clulas.
10. Calcular el % de hemolisis de cada tubo:
% Hemlisis = Absorbancia del problema x 100

Absorbancia del 100% de hemolisis
125
NaCl (%) Hemolisis (%)

0.30 97 100
0.35 90 99
0.40 50 90
0.45 5 45
0.50 05
0.55 0
Actividades
Expresar la prueba de fragilidad de eritrocitos como una curva sobre papel

milimtrico (% de hemlisis = f[NaCl]).
Indicar la concentracin de NaCl cuando:
a) Se inicio la hemlisis
b) Ocurri el 50% de hemlisis
c) Fue completa al 100% de hemlisis
126
HEMOGLOBINOPATAS
Las hemoglobinopatas son alteraciones en las cadenas globinicas, secundarias a

mutaciones genticas, las cuales pueden ser de dos tipos:
a) Cualitativas o estructurales: modificacin de la secuencia de aminocidos durante la
sntesis de una cadena de globina.
b) Cuantitativas o sndromes talasmicos: disminucin variable de la sntesis de una
cadena de globina, sin alteracin estructural.
Alteraciones estructurales
Se tiene un registro de ms de 500 variantes de hemoglobina en todo el mundo

(Tabla 22). Son el resultado de mutaciones genticas que pueden alterar alguna de las
cadenas de globina (alfa, beta, gamma o delta). Las anomalas estructurales se pueden
clasificar en cinco grupos para facilitar su identificacin:
1. Sustitucin de un aminocido por otro:
i. HbS (6GluVal)
ii. HbC (6GluLys)
iii. HbD (121GluGln)
iv. HbG (68AsnLys)
v. HbE (26GluLys)
vi. HbO-Arab (121GluLys)
vii. HbM (58HisTyr 87HisTyr)
2. Sustitucin de ms de un aminocido: HbC-Harlem.
3. Eliminacin de uno o ms aminocidos: Hb Leidem (perdida del cido glutmico).
4. Fusin de cadenas de Hb o hemoglobinas hbridas: Hb Lepore (fusin de las
cadenas y ).
5. Elongacin de la cadena de aminocidos: Hb Constant Spring que posee 31 residuos
adicionales.
Tabla No. 22. Nmero de anomalas estructurales de las variantes de Hb
Nmero de variantes
Cadena Cadena Cadena Cadena Total

Sustitucin de un solo aminocido 199 337 28 70 634
Doble sustitucin de aminocidos 1 18 0 0 19
Eliminacin, insercin o ambas 6 16 0 0 22
Cadenas extendidas 7 6 0 0 13
Fusiones 0 10 9 1 10
Totales* 213 387 37 71 698
*El nmero total de variantes de la Hb (698) es 10 menos que la suma de las primeras cuatro columnas
porque cada una de las 10 Hb de fusin se registra en dos columnas (9 entre las cadenas y ; 1 entre las
cadenas y ).
Las hemoglobinopatas estructurales se transmiten hereditariamente y son de carcter

autosmico codominante. El estado homocigoto se caracteriza por la presencia exclusiva de
la hemoglobina mutada (No hay HbA). En el estado heterocigoto, si la mutacin afecta la
cadena , se observa un 50% de HbA y un 50% de Hb mutada, mientras que si la mutacin
127
afecta la cadena se observa un 75% de HbA y slo 25% de Hb mutada (la relacin entre
los genes y son 2/1). Las alteraciones de las cadenas y no son de importancia clnica
ya que difcilmente se detectan por la cantidad de Hb involucrada.
Variantes inestables de la Hb
Existen alrededor de 200 variantes inestables de Hb. La mayora pertenecientes a la

cadena ; otras pocas pertenecientes a la cadena y slo algunas pertenecientes a las
cadenas y . Solo alrededor del 25% de las hemoglobinas inestables causan anemia
hemoltica, la cual puede ir desde una anemia leve hasta una crisis hemoltica muy severa
con formacin de cuerpos de Heinz. Se heredan de manera autosmica dominante y de
condicin heterocigota, la condicin homocigota al parecer es incompatible con la vida.
La inestabilidad de la molcula de hemoglobina se presenta por alguna de las
siguientes causas:
1. Sustitucin de un bolsillo polar por uno no polar en el interior de la molcula de Hb.
2. Sustitucin de aminocidos alrededor del bolsillo del hemo.
3. Sustitucin de las cadenas y en el punto de contacto.
4. El remplazo con prolina.
5. La elongacin o eliminacin de la estructura primaria.
La enfermedad por hemoglobina inestable se presenta desde la infancia primaria, con

ictericia y esplenomegalia. La gravedad de la anemia se determina por el grado de
inestabilidad de la molcula de Hb, pues est precipita in vivo e in vitro al exponerse a
ciertos factores que no afectan a las Hb normales.
Debido al carcter hereditario de estos padecimientos el tratamiento slo consiste en
controlar y prevenir las crisis hemolticas, y en los casos muy severos la esplenectoma
ayuda a que el secuestro y eliminacin de los eritrocitos daados disminuya. El pronstico
de los individuos con hemoglobinas inestables es incierto, ya que estos padecimientos son
raros.
Sndromes talasmicos
Las talasemias son un grupo polifactico de trastornos hereditarios, causados por

mutaciones genticas que disminuyen o anulan la sntesis de una o ms cadenas de globina,
inhibiendo la produccin adecuada de Hb por la alteracin en la estructura tetramerica de la
misma. Segn la naturaleza de estas, se clasifican en:
1. -talasemia (disminucin de cadenas )
2. -talasemia (disminucin de cadenas )
3. -talasemia (disminucin simultnea de cadenas y )
El mecanismo molecular de las talasemias es muy variable, aunque destacan la

delecin gentica en las -talasemias y los defectos de transcripcin en las -talasemias. En
ambos casos existe un exceso de las restantes cadenas de globina, de forma que en las -
talasemias se observan precipitados de cadenas en las clulas eritroides, y en el caso de
las -talasemias, precipitados de cadenas .
Los dos tipos de talasemia presentan diversas formas clnicas segn el carcter
homocigoto o heterocigoto del defecto molecular (Tabla 23). La expresividad clnica de la
128
-talasemia depende de la cantidad de sntesis de la cadena ; la forma ms grave de -
talasemia es el estado homocigoto en el cual la sntesis de cadenas es mnima o
inexistente (-talasemia mayor). Al estado doble heterocigoto se le llama -talasemia
intermedia. La forma ms leve de -talasemia es el estado heterocigoto y se conoce como
-talasemia menor o rasgo talasmico.
La forma ms grave de -talasemia es donde existe una ausencia total de cadenas
y se la llama anasarca fetoplacentaria o hydrops fetalis. La forma ms leve de -talasemia
es totalmente asintomtica y solo se puede diagnosticar mediante estudio de ADN. Las
otras formas de -talasemias se caracterizan por presentar anemia de intensidad variable y
la presencia de mayor o menor cantidad de hemoglobina H.
Tabla No. 23. Designaciones genticas en la talasemia
Cuadro Clnico Genoma
Beta talasemia menor /0; /+; /

Beta talasemia intermedia 0 /+; /
Beta talasemia mayor 0/0; 0/+Medit; +Medit/ +Medit;
Lepore/Lepore
Alfa talasemia-1 00: Alfa talasemia con 100% de
hemoglobina Bart
Alfa talasemia-2 (-talasemia menor) ++
Alfa talasemia mnima +
Enfermedad por hemoglobina H 0+
= 2 genes normales
+ = 1 gen normal y 1 gen ausente
0 = 0 genes normales
= 1 gen normal
0 = 0 genes normales
+ = 1 gen anormal (10 50% de cadenas normales)
Algunas pruebas de laboratorio tiles para determinar las Hb inestables y talasemias

son:
Anlisis de estabilidad molecular de la Hb (precipitacin con isopropanol o
desnaturalizacin por calor a 50C)
Induccin de cuerpos de Heinz
Anlisis secuencial de aminocidos
Electroforesis de Hb
Cuantificacin de la fraccin hemoglobnica HbA2
Cuantificacin de HbF
Anlisis de las cadenas de globina por cromatografa lquida de alto rendimiento
(HPLC) por intercambio inico.
Biologa molecular de , y -talasemia
129
Fundamento
La estabilidad de la hemoglobina depende fundamentalmente de las fuerzas de

unin existentes en dos reas de la molcula: la unin 11 y la unin del hemo con la
globina.
Las hemoglobinas normales difcilmente precipitan (o rompen sus fuerzas de unin)
o lo hacen en menor grado cuando se calientan a 60C durante 30 minutos, mientras que
varias hemoglobinas inestables son desnaturalizadas completamente a esta temperatura y
precipitan en forma de flculos.
Material e instrumento
Sangre venosa con anticoagulante
Pipetas Pasteur con bulbo
Equipo para Bao Mara
Termmetro
Centrifuga
Reactivos
Amortiguador de fosfatos pH=7.4
Solucin salina isotnica (0.85%)
Procedimiento
1. Recolectar 5mL de sangre venosa en un tubo con EDTA y homogenizar por

inversin.
2. En un tubo de ensayo de 13 x 100 mm poner 0,5 mL de sangre anticoagulada.
3. Lavar los eritrocitos 4 veces con solucin salina isotnica centrifugando a 3000 rpm
durante 5 minutos.
Lavado de eritrocitos: Colocar 0,5 mL de sangre total anticoagulada en el tubo de 13 x
100 mm, adicionarle solucin salina fisiolgica (0,85%) hasta las partes del tubo,
colocar un tapn adecuado al tubo y mezclar invirtiendo con cuidado hacia arriba y hacia
abajo. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante, de preferencia,
con una pipeta Pasteur. La indicacin de lavar 4 veces, representa repetir el
procedimiento 4 veces.
El residuo de eritrocitos final, es lo que importa para cualquier procedimiento, despus de
la indicacin de lavar los eritrocitos.
4. Desechar el sobrenadante del ltimo lavado y agregar al tubo 2,5 mL de agua
destilada.
5. Al hemolizado se le agregan 2,5 mL de amortiguador de fosfatos (pH=7,4). Mezclar
y centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos.
6. En un tubo de ensayo de 13 x 100 mm poner 2 mL del sobrenadante e incubarlo
en Bao Mara a 60C durante 30 minutos o a 50C por una hora.
130
Interpretacin
La sangre normal no precipita o lo hace en forma ligera. Un resultado positivo

(hemoglobina desnaturalizada presente) se caracteriza por una floculacin intensa.
Actividades
Analizar cada 5 minutos la presencia de flculo (o precipitado) hasta la culminacin

de los 30 60 minutos, segn sea el caso.
Reportar en cruces la presencia del precipitado.
131
INDUCCIN DE DREPANOCITOS
La hemoglobinopata estructural mejor conocida es la HbS, donde ocurre una

mutacin de la cadena , por la sustitucin del cido glutmico de la posicin 6 con una
valina. Est mutacin en la cadena , altera la solubilidad de la Hb, cuando la clula se
desoxigena adopta la forma falciforme caracterstica, por la formacin de tactoides o
cristales de HbS (Figura 34), el eritrocito regresa a su forma discoidea cuando vuelve a un
medio oxigenado. En el estado falciforme la clula se vuelve rgida por la polimerizacin
de las molculas de Hb, provocando la hemolisis de las clulas normales. El constante
cambio del estado discoideo al estado falciforme produce un cambio irreversible en la
membrana del eritrocito con una tendencia a permanecer en la forma drepanocitica.
La anemia de clulas
falciformes se observo por
primera vez en 1910 por
James Herrick. Pero la base
patolgica y su relacin con
la molcula de Hb fue
descrita por Hahn y Gillespie
en 1927. A pesar de ser un
padecimiento comn en todo
el mundo, tiene una mayor
incidencia en frica. Es un
trastorno de carcter
autosmico dominante, con
un gen procedente de cada
padre. Puede ser de carcter
homocigoto o heterocigoto
con mezclas de otras
hemoglobinopatas (HbSC o
HbS/-tal). El estado
homocigoto es el tipo ms
grave, con una incidencia de
Fig. No. 34. Formacin de las clulas falciformes por 1 por cada 375 nacimientos
polimerizacin de la HbS afroamericanos vivos.
Las manifestaciones
clnicas de la enfermedad por HbS pueden variar de la forma asintomtica a un cuadro
potencialmente fatal, por crisis hemolticas severas. La anemia hemoltica no se manifiesta
en los recin nacidos ya que estn protegidos por la gran cantidad de HbF circulante, pero
esta comienza a aparecer a partir de la segunda mitad del primer ao. A medida que las
cadenas de la HbS remplazan las cadenas de la HbF, los eritrocitos con HbS se hacen
susceptibles a la hemolisis, la cual es progresiva hasta desembocar en una esplenomegalia.
La vida media de los pacientes con HbS (homocigoto) es de cerca de 45 aos y para los
pacientes con HbSC de 65 aos.
La mayora de las personas con anemia de clulas falciformes cursan con episodios
de dolor, denominados crisis. Hay diversos tipos de crisis: vasooclusivas o dolorosas,
aplsicas, megaloblsticas, de atrapamiento y hemolticas crnicas. Los episodios oclusivos
vasculares son los que originan la mayora de los ingresos hospitalarios, porque estos estn
132
ligados a distintos procesos, como, la acidosis, la hipoxia, la deshidratacin, las infecciones
y la fiebre, o por la simple exposicin al fro. Los rganos que se daan con mayor
frecuencia son los pulmones, hgado, bazo, pene, ojos, los huesos y el sistema nervioso
central. La frecuencia de los episodios dolorosos vara de ninguno hasta seis por ao. En
promedio persisten durante 4 a 5 das, pero pueden llegar a durar semanas. La frecuencia de
los infartos esplnicos reduce el tamao del bazo por cicatrizacin (autoesplenectoma).
El diagnstico de la anemia falciforme se establece hasta que se comprueba la
solubilidad de la HbS en su forma desoxigenada y se confirma su presencia por
electroforesis. Sin embargo la prueba ms sencilla para establecer un diagnstico inicial
para la presencia de HbS es la induccin de drepanocitos.
Ms que un tratamiento para eliminar las clulas falciformes se dan tratamientos
preventivos para evitar en la medida de lo posible las complicaciones de la enfermedad por
clulas falciformes. Sin embargo estn en desarrollo teraputicas promisorias que pueden
modificar la patogenia gentica de la enfermedad. Una de estas teraputicas es la de
aumentar la cantidad de HbF en los eritrocitos por accin de la hidroxiurea o butirato, ya
que la HbF no polimeriza junto con la HbS.
Electroforesis
La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad

de estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa (soporte), la cual finalmente
separa las molculas por tamaos y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se
emplee.
La tcnica clsica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa (gel de agarosa,
poliacrilamida, etc.) impregnada de un electrolito. Sus extremos se sumergen en dos
depsitos independientes que contienen ambos al electrolito y estn unidos a los electrodos
del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeo trazo
transversal en la tira. La distancia de migracin se mide en relacin a un marcador interno.
Las placas son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.
Las diferentes hemoglobinas, al igual que las protenas del plasma, cuando se
colocan en un medio a un determinado pH, presentan diferente carga elctrica, por lo que
pueden ser separadas debido a su distinta movilidad al aplicar un campo elctrico.
Para la electroforesis de hemoglobina se emplean principalmente dos tcnicas:
1. Electroforesis de hemoglobina a pH alcalino (8,6): Emplea un soporte de acetato
de celulosa y es til para separar las hemoglobinas normales (A, A2 y F), adems
algunas hemoglobinas anormales, tales como, HbS, HbE, HbC y HbD.
Determinados tipos de hemoglobina, debido a que poseen una intensidad de carga
similar, migran prcticamente al mismo nivel cuando se separan por este tipo de
electroforesis.
2. Electroforesis de hemoglobina a pH cido (6,0): Emplea un soporte de gel de
poliacrilamida. Es especialmente til para separar la HbS de la HbD y la HbC de la
HbE y permite diferenciar perfectamente la HbA de la HbF.
133
Fig. No. 35. Electroforesis de hemoglobina en acetato de celulosa en medio alcalino, que
muestra el patrn de corrimiento de algunas hemoglobinopatas.
134
Fundamento
La caracterstica principal de la HbS es la de disminuir su solubilidad en medios

hipxicos, por lo cual al colocar una gota de sangre y un agente reductor como el
metabisulfito de sodio para generar un ambiente hipxico mediante el bloqueo de la entrada
de oxigeno sellando la preparacin, los eritrocitos que poseen HbS adoptaran la forma
falciforme por la polimerizacin de las molculas de Hb y su cristalizacin en tactomeros,
permitiendo que los drepanocitos sean identificables por medio del microscopio.
Material
Sangre capilar o venosa anticoagulada
Lancetas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio
Parafina o vaselina
Reactivos
Metabisulfito de sodio al 2% (recin preparada)
Solucin Salina 0.85%
Procedimiento
1. Recolectar 3 ml de sangre venosa con EDTA o utilizar sangre capilar.

2. Colocar una pequea gota de sangre venosa o capilar en un portaobjetos.
3. Adicionarle 1 gota de metabisulfito de sodio al 2%.
4. Mezclar bien y colocar un cubre objetos, tratando de que no se formen burbujas. El
exceso de sangre se elimina con un papel filtro, ejerciendo una suave presin sobre
el cubreobjetos.
5. Sellar los bordes del cubreobjetos con vaselina o parafina.
6. Montar otra preparacin semejante como se indican desde el paso 3 al 5, pero en
lugar de agregar metabisulfito de sodio al 2% poner solucin salina al 0.85%
(servir de control).
7. Observarlos inmediatamente al microscopio, despus a los 15 y 30 minutos, hasta
llegar a las 2 horas. Para dar la prueba como negativa la observacin debe
continuarse, observndose por periodos de tiempo mayor hasta completar las 24
horas.
Interpretacin
Cuando la prueba es positiva, del 10 al 100% de los eritrocitos adoptan disposicin

falciforme en 15 a 30 minutos.
135
MDULO V
Hemostasia
136
FISIOLOGA GENERAL DE LA HEMOSTASIA
La hemostasia es un conjunto de procesos bioqumicos independientes que al

interactuar entre s mantienen la integridad de los vasos sanguneos para prevenir o detener
una hemorragia y as conservar la fluidez de la sangre circulante.
Para que la hemostasia se lleve a cabo despus de una lesin, es necesario que
intervengan cuatro factores:
a) Endotelio vascular
b) Plaquetas
c) Protenas plasmticas (Factores e inhibidores de la coagulacin)
d) Sistema fibrinoltico
1) Endotelio vascular
La integridad estructural de los vasos sanguneos es fundamental para prevenir las

hemorragias. Cuando existe una lesin vascular, se produce una vasoconstriccin local que
contribuye al cese de la hemorragia y al exponerse el subendotelio proporciona el principal
estmulo para la coagulacin, pues este sirve como sustrato para la adhesin plaquetaria y
su posterior agregacin. Las protenas que se encuentra en el subendotelio son: el colgeno,
la fibronectina, la vitronectina, la trombospondina, la laminina, factor tisular (FT) y el
factor de von Willebrand (FvW). Adems el endotelio sintetiza molculas tales como: la
prostaciclina, el cido 13-hidroxioctadenoico y el xido ntrico, que inhiben la agregacin
plaquetaria.
2) Plaquetas
En condiciones normales las plaquetas circulan por la luz de los vasos sanguneos
con su caracterstica forma de disco, sin embargo cuando ocurre una lesin en el endotelio
se desencadenan una serie de eventos bioqumicos que dan inicio al proceso de
coagulacin. En este proceso de formacin del trombo se diferencian diversas etapas
secuenciales:
1. Adhesin plaquetaria al colgeno por accin de la glucoprotena (GP) Ib/IX y el
FvW.
2. Activacin o cambio de forma de las plaquetas de su forma discoidea a esferas
grandes con mltiples pseudpodos. Tambin se inicia la actividad intracelular.
3. Agregacin plaquetaria por unin de las GPIIb/IIIa y el fibringeno de manera
intraplaquetaria.
4. Secrecin plaquetaria para el reclutamiento de ms plaquetas por accin de la
trombina, el tromboxano A2 y el ADP, principalmente.
5. Formacin del tapn hemostsico primario por las plaquetas que sella la lesin y
evita la prdida de sangre adicional.
3) Factores de la coagulacin
Son un grupo de protenas plasmticas (Tabla 24) que intervienen para estabilizar el
tapn hemostsico primario. Ests protenas son de tres tipos:
137
Protenas estructurales: Protenas cuya funcin lleva a la contraccin de la estructura
del trombo para estabilizarlo. Pertenecen a este grupo el fibringeno, el FvW y el
factor tisular (FT).
Zimgenos: Protenas inertes que requieren de otra protena para su activacin y que
estas a su vez puedan activar otras protenas. En su estado inerte son solubles en el
plasma y cuando se activan se hacen insolubles. Pertenecen a este grupo el factor
XIII, factor XII, factor XI, factor X, factor IX, factor VII, factor II y protena C.
Inhibidores de protenas: Protenas cuya funcin es evitar que una protena pueda
actuar sobre otra. Pertenecen a este grupo la protena S, activador tisular del
plasmingeno, antitrombina III.
Las protenas que intervienen en la coagulacin pueden clasificarse tambin en

funcin a sus caractersticas y a su estabilidad por accin de la temperatura:
Factores dependientes de la vitamina K: Son protenas sintetizadas nicamente en el
hgado y que requieren de la accin de la vitamina K para su activacin al
carboxilar el carbono gamma de los residuos de cido glutmico en el extremo N-
terminal de la cadena polipeptdica. Sin esta carboxilacin no pueden unirse a los
fosfolpidos de las plaquetas mediante puentes de calcio. Pertenecen a este grupo los
factores X, IX, VII y II.
Factores independientes de vitamina K: Protenas que actan en ausencia de la
vitamina K, ya que no dependen del calcio para realizar su funcin. A este grupo
pertenecen los factores XIII, XII, XI, VIII, V y I.
Factores lbiles: vW, VIII y V.
Factores estables: XIII, XII, XI, X, IX, VII, II y I.
Mecanismo de la coagulacin
Existen varias teoras que tratan de explicar el mecanismo de la coagulacin:
Teora de Seegers: Fue una de las primeras teoras pero debido a su complejidad se
abandono con rapidez.
Teora de la cascada de Biggs, Douglas y McFarlane (Figura 36): Esta teora
sostiene que los factores de la coagulacin circulan en la sangre de forma inerte, y
que cuando estos se activan desencadenan reacciones secuenciales, donde cada
protena activada sirve de cofactor para activar otras protenas y as sucesivamente
hasta lograr la estabilizacin del tapn hemostsico. Esta teora es la ms empleada
para el estudio de la coagulacin en el laboratorio (in vitro), pues a partir de esta
teora se estableci que existen dos vas para la coagulacin, las cuales convergen
en una va comn:
o Va extrnseca. Se denomina extrnseca porque requiere para su inicio la
presencia del factor hstico o tisular (protena transmembranal), puesto de
manifiesto tras la lesin del endotelio. Se inicia con la formacin de un
complejo entre el factor tisular y el factor VII en presencia de Ca++, lo cual
produce la activacin del factor X. Este, una vez activado (Xa), junto con el
factor V y Ca++, transforman la protrombina (II) en trombina (I).
138
o Va intrnseca. Esta va fue denominada intrnseca debido a que no requiere
del factor tisular para generar actividad procoagulante. Su inicio tiene lugar
con la activacin parcial del factor XII en el momento que la sangre entra en
contacto con alguna superficie de carga negativa (vidrio y algunas otras
sustancias). Una vez activado el factor XII (XIIa) ejerce una actividad
proteoltica sobre la precalicreina para transformarla en calicrena, la cual, a
su vez, tiene efecto proteoltico sobre el propio factor XIIa. El factor XIIa
produce activacin inmediata del factor XI, el cual en presencia de Ca++,
activa el factor IX para que pueda formar un complejo con los fosfolpidos
plaquetarios, el factor VIII y Ca++, capaz de activar el factor X. Este, una vez
activado (Xa), junto con el factor V y Ca++, transforman la protrombina (FII)
en trombina (FI).
Esta teora no explica la coagulacin in vivo.
Teora del shunt: Teora que trat de demostrar que solo exista una va para la
coagulacin sangunea, al demostrar que parte de la va intrnseca se activa
mediante la va extrnseca, por lo cual solo existe el mecanismo intrnseco. Ms que
una teora solo se trataba de demostrar una derivacin del mecanismo de la
coagulacin in vivo.
Teora de los complejos o modelo celular: De reciente surgimiento explica la
coagulacin sangunea en etapas. Mediante la formacin de complejos que
interactan unos con otros se logra activar cada uno de los factores de la
coagulacin hasta conseguir la formacin de trombina. Todo este proceso se
desarrolla sobre la superficie de las clulas con una activacin plasmtica lenta. Se
conocen cuatro complejos:
o Complejo tisular: Se integra por el FT y el FVIIa (unido a los fosfolpidos
de las plaquetas) y activan al FX.
o Complejo tenaza: Se forma por el FIXa y FX unidos a los fosfolpidos de
las plaquetas y el FVIII que no est unido a los fosfolpidos y que necesita
de la trombina para activarse.
o Complejo protrombinasa: Integrado por el FXa, el FII unidos a los
fosfolpidos mediante puentes de calcio y el FVa.
o Complejo inhibidor: Constituido por la trombomodulina y la protena S
para activar la protena C.
La finalidad de todos los modelos para la coagulacin es explicar las

transformaciones bioqumicas que ocurren durante la formacin de fibrina, siendo las dos
teoras ms importantes, el modelo de la cascada, pues esta explica de manera prctica la
coagulacin sangunea <<in vitro>>, y el modelo celular que logra explicar la coagulacin
<<in vivo>>.
139
Tabla No. 24. Caractersticas de los factores de coagulacin
Factor Nombre Peso Actividad funcional Vida media Sitio de Dependencia de Niveles
molecular biolgica sntesis vitamina K plasmticos
(KDalton)
I Fibringeno 340 Estructural 90h Hgado No 200-400 mg/dL
II Protrombina 72 Proteasa de serina 60h Hgado Si 10-15 mg/dL
V Proacelerina 330 Cofactor 12-36h Hgado No 0.5-1.0 mg/dL
VII Proconvertina 48 Proteasa de serina 4-6h Hgado Si 0.1 mg/dL
VIII:C Factor antihemoflico 70-240 Cofactor 12h Hgado No 1-2 mg/dL
IX Componente de 57 Proteasa de serina 20h Hgado Si 4 g/dL

tromboplastina
plasmtica
X Factor de Stuart- 58 Proteasa de serina 24h Hgado Si 0.75 mg/dL
Prower
XI Antecedente de 160 Proteasa de serina 40h Hgado No 1.2 mg/dL
tromboplastina
plasmtica
XII Factor de Hageman 80 Proteasa de serina 48-52h Hgado No 0.1 mg/dL
XIII Factor estabilizador de 320 Transglutaminasa 48-52h Hgado No 2.5 mg/dL

fibrina
Precalicrena 80 Proteasa de serina 6.5 das Hgado No 0.29 mg/dL
Ciningeno de 120 Cofactor 3-5 das Hgado No 0.70 mg/dL

alto peso
molecular
Antitrombina 68 Inhibidor de 2.5 das Hgado Si 4 mg/dL
III proteasa
140
Protena C 62 Proteasa de serina 8-12h Hgado Si 4-5 g/dL
Fig. No. 36. Modelo de la cascada de la coagulacin e inhibidores de la coagulacin.
La va extrnseca se inicia con la exposicin del factor tisular (FT) en el subendotelio y culmina con la
activacin del factor X (FX). La va intrnseca se inicia con la activacin del factor XI (FXI) por accin de
los ciningenos de alto peso molecular y la Precalicreina y termina con la activacin del factor FX. La va
comn inicia con la activacin del FX y termina con la formacin de fibrina. Como todos los factores de la
coagulacin se interrelacionan unos con otros la va intrnseca y extrnseca no pueden funcionar de manera
independiente una de otra.
141
4) Sistema fibrinoltico
La formacin de fibrina es el objetivo de la hemostasia, por lo cual para evitar su

formacin excesiva es necesaria la activacin del sistema fibrinoltico mediada por la
plasmina. La plasmina fragmenta las cadenas de fibrina en productos de degradacin de la
fibrina o PDF (Figura 37). El mecanismo fibrinoltico se desencadena una vez que se
estabiliza el cogulo a diferencia de los dems mecanismos de inhibicin que interaccionan
con los factores de coagulacin para regular el proceso.
Fig. No. 37. Sistema fibrinoltico

scuPA = prourocinasa tcuPA = urocinasa
tPA= activador del plasmingeno de tipo tisular PAI-1= inhibidor del activador de plasmingeno tipo 1.
Recomendaciones generales para el laboratorio de coagulacin
Los buenos resultados en las pruebas de coagulacin dependen en su totalidad de la

calidad de la muestra, por lo cual es indispensable minimizar el traumatismo durante la
flebotoma para prevenir la hemlisis. La sustitucin de tubos de vidrio por tubos de
plstico disminuye la activacin de los factores XII y VII al entrar en contacto con la
superficie del tubo.
El anticoagulante de eleccin para casi todas las pruebas de coagulacin es el citrato
de sodio a una concentracin de 3.2% y una proporcin de un volumen de anticoagulante
por 9 volmenes de sangre, pues presenta ventajas sobre los dems anticoagulantes, por
tener una osmolalidad ms cercana a la del plasma y porque esta concentracin se emplea
como promedio del intervalo normal en el clculo del ndice Normalizado Internacional o
Radio Normalizado Internacional (INR por sus siglas en ingles).
Una vez que la sangre entra en contacto con el tubo ocurren cambios bioqumicos
con los cuales el factor VIII comienza a degradarse con rapidez, por lo cual el NCCLS
recomienda que el tiempo para determinar el tiempo de protrombina (TP) no exceda las 24
horas y que para determinar el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) el tiempo
no sea mayor a las 4 horas.
Si las muestras no se procesan inmediatamente despus de su extraccin es
recomendable separar el plasma del paquete globular por centrifugacin mnimo 10
142
minutos a 3500 rpm y almacenarla por no ms de 2 horas a 4C, pues as como a
temperatura ambiente se inactivan parcialmente los factores V y VIII, la refrigeracin
prolongada activa el factor VII. Por lo cual para evitar la inactivacin o activacin de
algunos factores es preferible congelar el plasma y almacenar a -20C hasta su anlisis.
Al igual que para toda prueba analtica, la exactitud y precisin de los resultados se
controlan mediante el empleo de procedimientos de aseguramiento de la calidad, como la
calibracin de nuevos lotes de reactivos y el empleo de controles comerciales (mnimo 2
niveles), recordando que la repeticin de un estudio de coagulacin no mejora la precisin
ni la exactitud de la prueba.
143
TIEMPO DE SANGRADO
Es una prueba sencilla que permite evaluar la hemostasia primaria <<in vivo>>.
Consiste en medir el tiempo transcurrido desde la realizacin de una pequea incisin
cutnea hasta que cesa la hemorragia.
Esta tcnica fue introducida por primera vez en 1910 por Duke realizndo la
incisin en el lbulo de la oreja; sin embargo es poco sensible y menos reproducible que el
mtodo de Ivy.
En 1935 Ivy introdujo su propia tcnica al emplear un baumanometro y realizando
la incisin en la cara anterior del antebrazo, con lo que consigui una mayor sensibilidad y
reproducibilidad de los resultados.
Fundamento
Esta prueba mide la habilidad de los pequeos vasos para responder a una lesin, lo
que depende de la integridad de la pared vascular, de su capacidad constrictora y del
nmero y calidad de las plaquetas que formarn el tapn hemosttico.
Material
Sangre capilar
Lancetas
Cronmetro
Papel filtro
Reactivos
No son necesarios para esta prueba
Procedimiento
Mtodo de Duke
1. Se limpia el lbulo de la oreja con isopropanol al 70% sin presionar ni o masajear

vigorosamente.
2. Dejar secar perfectamente la regin limpia.
3. El lbulo de la oreja debe de estar caliente antes de la puncin.
4. Se hace una puncin en el rea adecuada (Figura 38) en el lbulo de la oreja, a una
profundidad de unos 3 mm con una lanceta estril adecuada.
5. Tan pronto como se realiza la puncin y se observa que empieza a fluir la sangre,
se pone en marcha el cronmetro.
6. La sangre debe salir libremente y el lbulo no se debe comprimir.
7. Absorber la gota de sangre con un trozo de papel filtro cada 15 segundos,
procurando de no tocar la superficie del lbulo de la oreja o de manipular la lesin.
8. El cronmetro se detiene hasta que el papel filtro ya no se manche con la sangre o
que no sangre ms.
144
Fig. No. 38. Zona de puncin para el mtodo de Duke (zona gris).
1 a 3 minutos.
Interpretacin semiolgica
Esta prueba suele ser prolongada en los estados trombocitopnicos, en la

enfermedad de Von Willebrand, en algunas deficiencias hereditarias de factores
plasmticos como el V y el VIII (esto es variable y pueden obtenerse valores normales) y
en trombopatas.
El tiempo de sangrado es normal en hemofilia A y B, en hipoprotrombinemia y en
general en la hipofibrinogenemia hereditaria.
Luego de la ingesta de aspirina el tiempo de sangra se prolonga, por lo que debe
tenerse la certeza de que el paciente no la ingiri.
145
TIEMPO DE COAGULACIN DE SANGRE TOTAL
El tiempo de la coagulacin sangunea es una prueba muy poco sensible y nunca se

debe utilizar como prueba selectiva. Se usa a menudo para guiar la teraputica con
heparina, pero los resultados obtenidos son a menudo inseguros, por esto son preferibles
pruebas como el tiempo de tromboplastina parcial activada. A pesar de ello, el tiempo de
coagulacin sangunea se realiza en la mayora de los laboratorios a causa de que se pueden
obtener muchos datos de la inspeccin peridica del cogulo.
Fundamento
El tiempo necesario para que la sangre se coagule en un tubo de cristal es la medida

de la actividad total del sistema intrnseco de la coagulacin. La inspeccin peridica del
cogulo permite la valoracin de las propiedades fsicas del mismo (tamao, aspecto y
fuerza mecnica), su estabilidad, ritmo y extensin de su retraccin.
Material
Sangre capilar
Capilares sin heparina (orilla azul)
Lancetas estriles
Bao Mara a 37C
Termmetro
Cronmetro
Reactivos
Procedimiento
Mtodo capilar
1. Limpiar la zona de puncin con una torunda con alcohol (de preferencia el pulpejo
del dedo anular).
2. Deja que el alcohol se seque.
3. Puncionar hasta una profundidad de 3mm con una lanceta estril. Poner en marcha
el cronometro.
4. Se desecha la primera gota
de sangre, a continuacin se
Zonas de puncin llena un capilar sin heparina
hasta las dos terceras partes.
5. A partir del tercer minuto de
la puncin, se invierte el
capilar constantemente hasta
observar que no haya
desplazamiento de la sangre. Si es necesario, se rompe el capilar para observar el
tiempo en que se forman los hilos de fibrina o en su defecto, tratar que una gota de
146
la punta caiga sobre un papel, para poder observar si se ve un hilo entre el capilar y
el papel (Figura 40).
6. Si ya no hay desplazamiento o se observan los primeros hilos de fibrina, es el
momento en que se detiene el cronmetro.
Fig. No. 40. Visualizacin del hilo de fibrina que se forma entre el papel y el capilar con
sangre.
Los valores oscilan entre 3 a 5 minutos.
Un tiempo de coagulacin normal no descarta la existencia de un trastorno de la

coagulacin, pero un tiempo prolongado es siempre ndice de un defecto severo de la
misma, que puede deberse a una deficiencia de cualquiera de los factores que intervienen
en la formacin del cogulo de fibrina, con excepcin de una deficiencia pura de los
factores VII y XIII; pero el mtodo es mucho ms sensible a los defectos de los factores
que intervienen en la activacin por contacto y en la formacin del activador intrnseco de
la protrombina. Solo se prolonga cuando la deficiencia es muy grave, por ejemplo,
deficiencia de:
o Fibringeno (Factor I)
o Protrombina (Factor II)
o Factor V
o Factor VIII
o Factor IX
o Tambin en presencia de anticoagulantes circulantes o exceso de heparina.
Esta prueba no se ve influenciada por los niveles de factor VII.

En la hemofilia (A o B) se encuentra prolongando si los niveles son suficientemente
bajos.
La prueba carece de valor para las insuficiencias ligeras de distintos factores, por
que basta una cantidad pequea de trombina para producir un cogulo de fibrina. Es menos
til para las anomalas de las ltimas etapas de la coagulacin (factores V, X o II), pues
dichas etapas son rpidas en comparacin con las primeras. La trombocitopenia no afecta
en los tiempos de coagulacin ya que se requiere de un mnimo de plaquetas para iniciar el
proceso de coagulacin.
147
RETRACCIN DEL COGULO
Cuando se produce una lesin en un vaso sanguneo se pierde sangre,

inmediatamente se activa el proceso hemostsico para formar un cogulo que tape la lesin
y limitar el sangrado. Durante este proceso, se forma fibrina. Estas hebras se entrecruzan
(gracias a la trombina) para formar una red de fibrina que atrapa a las plaquetas y que a la
vez ayuda a mantener el cogulo que se forma en el lugar de la lesin. El tapn hemostsico
inicial o primario est formado por plaquetas y posteriormente cuando el sistema de
coagulacin se activa; se forma el tapn hemostsico secundario (cogulo de fibrina) y
ocurre la retraccin del cogulo para formar un tapn hemostsico ms efectivo. Cuando
ocurre esta retraccin <<in vivo>> el plasma que se encuentra atrapado entre las clulas es
expulsado, dejando un tapn casi exclusivamente de puras plaquetas envuelto en una malla
de fibrina, por lo cual est prueba se emplea para evaluar:
1. La concentracin de fibringeno.
2. La formacin de fibrina y su estabilizacin.
3. La cantidad y capacidad contrctil de las plaquetas para regresar a su forma original
por la accin de sus protenas estructurales (actina) para compactar el cogulo.
4. La actividad fibrinoltica.
Este proceso ocurre en el organismo para que la presin en el flujo sanguneo se

normalice, pues el tapn plaquetario debe permanecer en el sitio hasta que los fibroblastos
reparen la lesin.
Fundamento
Cuando se deja coagular espontneamente la sangre, el coagulo inicial se compone

de todos los elementos sanguneos. Con el trascurso del tiempo, el cogulo reduce su masa
y exprime suero del mismo cogulo. Esto es debido a la accin de las plaquetas sobre la red
de fibrina.
Material
Sangre venosa
Tubos cnicos o tubos de centrifuga graduados de 15 mL
Alambre enroscado (1mm de grosor)
Cronmetro
Bao Mara a 37C
Reactivos
148
Procedimiento
Prueba clsica
1. Extraer 5 mL de sangre venosa.

2. Colocar la sangre en un tubo cnico o un tubo graduado (5 mL o un volumen
exactamente medido).
3. Poner en marcha el cronmetro.
4. Colocar el alambre en el tubo con sangre. En medio del alambre colocar un
aplicador de madera para facilitar la adhesin del cogulo.
5. Colocar el tubo en un bao Mara a 37C durante 1 hora.
6. Despus de transcurrido el tiempo se saca cuidadosamente el alambre junto con el
aplicador, y se deja escurrir dentro del tubo el cogulo unido al alambre durante 1 o
2 minutos.
7. Se lee el volumen del lquido que qued en el tubo. Este volumen se anota como
porcentaje del volumen inicial de sangre completa en el tubo.
8. Se calcula el porcentaje del volumen de suero que qued en el tubo cnico con
relacin al volumen total inicial.
5 mL (volumen inicial) ----------------------- 100 %
Volumen de suero residual ------------------- X %
48 64 % (promedio 55%)
Esta prueba es dependiente de:

El nmero de plaquetas y su actividad funcional, aunque en algunas ocasiones no se
relaciona muy bien con el nmero de plaquetas (en ciertas condiciones da normal
an con 30 000 plaquetas/L).
La concentracin de fibringeno. Un aumento importante de fibringeno reducir la
retraccin por efecto de volumen, mientras que lo opuesto ocurre en casos de
hipofibrinogenemia.
Cuando la cantidad de fibringeno est reducida, el cogulo puede ser muy

pequeo.
En presencia de una actividad fibrinoltica activa puede disolverse el cogulo:
choque, quemaduras, etc.
Con un valor bajo del hematocrito, la masa del cogulo ser proporcionalmente
pequeo y puede dar valores muy elevados.
La retraccin del cogulo est alterada si hay trombocitopenia y trombastenia de
Glanzman (alteracin funcional). La eritrocitosis tambin interfiere en la retraccin del
cogulo, as como el aumento de la tasa de fibringeno. La anemia facilita la retraccin.
149
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPa)
Constituye una medida del sistema intrnseco de coagulacin. El TTPa depende de

la totalidad de factores de la coagulacin involucrados en las fases, excepto calcio,
plaquetas y factores VII y XIII.
Fundamento
Es un tiempo de recalcificacin del plasma sin plaquetas al que se le agrega un

sustituto plaquetario (tromboplastina parcial).
El plasma del paciente provee todos los factores de coagulacin, excepto el ion
calcio y las plaquetas. El anticoagulante remueve el calcio de la sangre y la centrifugacin,
las plaquetas. La emulsin de fosfolpidos reemplaza a las plaquetas, la prueba resulta
normal en presencia de deficiencias plaquetarias cualitativas o cuantitativas.
En general el TTPa se emplea para detectar valores de Factores de la primera fase
de coagulacin (XII, XI, IX, VIII) que para los de la fase 2 y 3. Tambin se usa para
detectar anticoagulantes circulantes.
Sangre venosa con citrato de sodio
Plasma citratado pobre en plaquetas
Pipeta Pasteur con bulbo
Pipeta serolgica de 1 mL
Micropipetas de 100 L o de volumen variable
Puntillas para micropipeta
Asa bacteriolgica limpia
Vaso de precipitados de 100 mL
Centrifuga
Bao Mara a 37C
Termmetro
Cronmetro
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Reactivos
Cefalina, caoln o cualquier emulsin comercial de fosfolpidos
Cloruro de calcio 0,025 M
Procedimiento
1. Recolectar sangre venosa en un tubo Vacutainer de tapn azul celeste y mezclar la

sangre con el anticoagulante por inversin. La proporcin de la sangre y el
anticoagulante deben ser exactos, por lo cual el tubo debe ser llenado hasta la marca
de drenado.
2. Centrifugar a 3000rpm por 20 minutos o 3500rpm durante 10 minutos. Es muy
importante que la centrifugacin elimine por completo las plaquetas, es decir debe
obtenerse un plasma pobre en plaquetas.
150
3. Extraer cuidadosamente el plasma de la muestra centrifugada mediante una pipeta
Pasteur y colocarlo en un tubo de ensayo de 13x100 mm.
4. En tubos diferentes y perfectamente etiquetados colocar el plasma(s) problema(s), el
cloruro de calcio y el reactivo para TTP en un bao Mara a 37C.
5. En un tubo de 13x100 mm limpio, seco y etiquetado adicionar los reactivos en el
siguiente orden (un tubo para n-muestras que se deseen medir):
Tabla No. 25. Procedimiento para el TTPa

Reactivos Cantidad (L)
Emulsin comercial de fosfolpidos 100
Plasma problema 100
Incubar la mezcla exactamente 2 minutos
CaCl2 0.025 M 100
Poner en marcha el cronmetro en el momento en que se adiciona el calcio.
Agitar brevemente para homogeneizar el contenido, mantener en el bao unos 25 segundos.
6. Se examina la reaccin de la mezcla a intervalos de 1 2 segundos para comprobar

la coagulacin; inclinando lentamente el(los) tubo(s) de manera que la mezcla
alcance cerca de la mitad del tubo y con una asa bacteriolgica, perfectamente
limpia, tratar de jalar el plasma para poder observar la formacin de la fibrina.
7. Detener el cronmetro.
8. El tiempo de coagulacin es el intervalo entre la adicin del calcio y la aparicin de
las primeras trazas de fibrina en la mezcla.
9. Es esencial por lo menos usar un control normal y realizar todas las pruebas por
triplicado4.
El tiempo normal de TTPa es de 32-46 segundos. Estos valores deben corregirse

para cada laboratorio de acuerdo con los obtenidos por mezclas de plasmas frescos
normales y con los reactivos usados.
El TTPa de 50 segundos superior al control normal se considera anormal. La prueba

esta prolongada en las deficiencias de uno o ms de los Factores XII, XI, X, VIII, V, II y I.
Debido a que la prueba es ms sensible a la deficiencia de los factores de contacto,
est se hace especialmente dependiente de la concentracin del FVIII, de manera que
elevaciones reactivas en este factor, pueden enmascarar deficiencias moderadas de otros
factores.
<<In vivo>> la deficiencia de los factores de contacto no representan un riesgo
hemorrgico, sin embargo en el laboratorio esto se ve reflejado en la prolongacin del
4
Este paso depender de la carga de trabajo y nicamente cuando se trate de procedimientos manuales, en un
proceso automatizado solo se repiten las muestras que salen de los valores de referencia y en base a los
criterios del laboratorio.
151
TTPa y cuya anomala es un simple hallazgo de laboratorio cuando el paciente no presenta
cuadros hemorrgicos.
El TTPa es muy sensible a la presencia de heparina fraccionada, por lo cual es la
prueba de eleccin para dar seguimiento a los pacientes en tratamiento con este
anticoagulante.
Las cinco causas ms comunes de un TTPa prolongado son:
1. CID (coagulacin intravascular diseminada);
2. Hepatopatas;
3. Hemaferesis mltiples con sangre almacenada;
4. Tratamiento con heparina;
5. Presencia de un anticoagulante o inhibidor circulante (comnmente anticoagulante
lpico).
Cuando los tiempos son anormales, es recomendable realizar pruebas de sustitucin

o correccin para orientar al mdico, en cuanto a si la alteracin es por la presencia de un
inhibidor circulante o por deficiencia de algn factor; sin embargo frecuentemente se
efectan pruebas confirmatorias especificas para cada factor y se pasan por alto las pruebas
de correccin por que consumen mucho tiempo.
Pruebas de correccin de TTPa y TP
La correccin de TTPa y TP implica mezclar el plasma problema con una serie de

derivados sanguneos con un contenido conocido del factor. Los componentes sanguneos
comnmente usados son cuatro: plasma normal, suero, plasma adsorbido con sulfato de
bario y plasma envejecido (Tabla 26).
Tabla No. 26. Derivados sanguneos para las pruebas de correccin de TTPa y TP y los
factores que contienen cada uno
Derivado Factores presentes Factores ausentes
Plasma normal I, II, III, V, VII, VIII, IX, X, Ninguno
XI, XII, XIII
Suero VII, IX, X, XI, XII I, V, VIII, XIII*, II*
Plasma adsorbido I, V, VIII, XI, XII, XIII II, VII, IX, X
Plasma I, II, III, VII, IX, X, XI, XII, V, VIII
envejecido XIII
*Puede estar presente, pero en concentraciones bajas.
En la tabla 27 se presentan los factores deficientes detectados por las pruebas de

correccin. Las anormalidades detectadas deben ir seguidas por pruebas especficas para la
deteccin de cada factor.
152
Tabla No. 27. Pruebas de correccin para el TTPa y el TP
Deficiencia TP TTPa Plasma Plasma Suero Plasma
del factor normal envejecido adsorbido
X Anormal Anormal Corrige Corrige Corrige No corrige
TP TP TP TP
V Anormal Anormal Corrige No corrige No corrige Corrige
TP y TTPa TP y TTPa TP y TTPa TP y TTPa
II Anormal Anormal Corrige Corrige No corrige No corrige
I Anormal Anormal Corrige Corrige No corrige Corrige
VII Anormal Normal Corrige Corrige Corrige No corrige
TP TP TP TP
XII Normal Anormal Corrige Corrige Corrige Corrige
TTPa TTPa TTPa TTPa
XI Normal Anormal Corrige Corrige Corrige Corrige
TTPa TTPa TTPa TTPa
IX Normal Anormal Corrige Corrige Corrige No corrige
TTPa TTPa TTPa TTPa
VIII Normal Anormal Corrige No corrige No corrige Corrige
TTPa TTPa TTPa TTPa
Ejemplo: tomaremos como ejemplo la Tabla 27 y la fila que est sombreada indicando que
el Factor VIII se encuentra deficiente. Se utilizar la informacin descrita en la Tabla 28.
Tabla No. 28. Ejemplo del factor VIII que se encuentre deficiente en una muestra
PRUEBA FACTORES MEDIDOS
1) TP I II V X VII Normal
2) TTPa I II V VIII IX XI XII Anormal
3) Hasta este punto se eliminan los factores que coinciden (se encuentran tachados),
quedando como factores sospechosos: VIII, IX, XI y XII (los factores X y VII se
encuentran aparentemente presentes ya que la prueba de TP resulto normal y
adems, son factores que no coinciden con la prueba del TTPa). Al plasma
problema se les adiciona plasma adsorbido y suero, respectivamente, resultando lo
siguiente al TTPa:
4) Plasma
normal I V VIII XI XII XIII Corrige
adsorbido TTPa
5) Suero No
Normal VII IX X XI XII XIII corrige
TTPa
6) En el paso 4 estamos adicionando esos factores y la prueba corrige, por lo que nos
indica que los factores sospechosos son: VIII, IX, XI, XII y XIII pero en el paso 5
estamos agregando el IX, XI, XII y XIII y la prueba no corrige, indicando as, que
esos factores no son los deficientes. El nico factor que queda y que al ser
adicionado corrige la prueba es el VIII. Los dems ejemplos se analizan de la
misma manera.
153
TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)
El procedimiento del TP permite evaluar la generacin de trombina y la formacin

de fibrina en la va extrnseca. El TP es sensible especialmente a las deficiencias del FVII y
a los factores involucrados en la va comn (FII, FV, FX). En presencia de iones calcio, la
tromboplastina tisular forma complejos con el FVII y lo activa, ofreciendo una superficie
para la activacin de los factores X, V y II. Los resultados para esta prueba pueden variar
de laboratorio a laboratorio en funcin de la tromboplastina comercial empleada, por tal
motivo la OMS diseo un mtodo de estandarizacin para evitar discrepancias en los
resultados de un mismo paciente en tratamiento con anticoagulantes.
Fundamento
Cuando se aade calcio y un extracto hstico, el Factor VII reacciona con el Factor
hstico y se forma un producto que convierte el Factor X en su forma activa, el Factor Xa;
este a su vez, reacciona con el Factor V, con el calcio y con los fosfolpidos del Factor
hstico para formar la protrombina extrnseca que convierte la protrombina en trombina.
Entonces, la trombina convierte el fibringeno de los Factores V, VII, X, protrombina (II) y
fibringeno (I), y esta prueba mide la actividad total de estos Factores.
Plasma citratado pobre en plaquetas
Pipetas serolgica de 1 ml
Micropipetas de 100, 200 L o de volumen variable
Puntillas para micropipeta
Asa bacteriolgica limpia
Vaso de precipitados de 100 ml
Centrfuga
Bao Mara a 37C
Termmetro
Cronometro
Reactivos
Tromboplastina Hstica Comercial5
Procedimiento
1. Recolectar 4,5 mL de sangre venosa en un tubo Vacutainer de tapn azul celeste. La

proporcin de sangre y anticoagulante deben ser exactos.
2. Homogenizar perfectamente bien la sangre, mediante inversin del tubo.
5
Existen en el comercio extractos liofilizados de placentas humanas. La adiccin de estabilizadores garantiza
una preparacin rpida de una suspensin estable. Estable extractos liofilizados ya contiene al ion calcio, que
est adaptado a los requerimientos de la prueba. (Por ejemplo: THROMBOREL S).
154
3. Centrifugar 20 minutos a 3000 rpm o 10 minutos a 3500 rpm. Es muy importante
que la centrifugacin elimine por completo las plaquetas, es decir, debe obtenerse
un plasma pobre en plaquetas.
4. Extraer el plasma de la muestra centrifugada cuidadosamente mediante una pipeta
Pasteur y verterlo en un tubo de 13x100 mm.
5. En tubos separados, limpios, secos y etiquetados respectivamente colocar en un
bao mara el plasma y la mezcla de la tromboplastina/calcio a 37C, en el siguiente
orden:
Tabla No. 29. Procedimiento para el TP

Reactivos Cantidad (L)
Plasma problema 100
Incubar el plasma a 37C durante 1 minuto
Mezcla de tromboplastina hstica-cloruro de 200
calcio
Poner en marcha el cronmetro en el momento en el que se coloca la mezcla
(tromboplastina hstica-cloruro de calcio).
Agitar brevemente para homogeneizar el contenido, mantener en el bao unos 5 segundos.
7. Sacar el tubo del bao, introducir el asa bacteriolgica en la mezcla.

8. Mover el asa bacteriolgica hacia arriba y hacia abajo hasta que se observe el
cogulo de fibrina en el asa.
9. Detener el cronmetro.
10. Es esencial por lo menos usar un control normal y realizar todas las pruebas por
triplicado.
TP como control en la terapia anticoagulante oral
Actualmente a muchos pacientes se les administra anticoagulantes orales en el

tratamiento y profilaxis de trastornos trombticos. El monitoreo de pacientes
anticoagulados se hace en base en el Tiempo de Protrombina.
Debido a que el TP es muy sensible a la deficiencia del FVII, la respuesta de la
prueba a la cantidad de los factores involucrados en esta va depender de la tromboplastina
comercial empleada, motivo por el cual la OMS desarrollo un mtodo de estandarizacin
denominado INR (radio o razn normalizada internacional).
Las fuentes tisulares tienen una procedencia muy variada y esto trae como
consecuencia la variacin de la sensibilidad y la variacin del propio TP. Dadas estas
circunstancias se busc una escala comn en la que se pudiera reportar el TP:
El ndice de Sensibilidad Internacional (ISI). Escala diseada para reportar el TP
basado en un sistema de referencia primario.
Para cada lote de tromboplastina se determina un valor de ISI mediante una

calibracin frente a una preparacin de referencia. Este dato lo tiene que especificar el
fabricante.
El ISI asignado a cada lote de reactivo para TP se valora contra una preparacin del
reactivo de referencia de trabajo. Esta referencia de trabajo se calibra a su vez contra un
155
estndar (referencia primaria) de aceptacin internacional por poseer un ISI de 1,0. Por lo
cual, la tromboplastina ms sensible tiene un ISI menor de 1,0 y las menos sensibles tienen
un ISI mayor a 1,0.
El valor del ISI es crucial para el clculo del INR, un mnimo error en el ISI ejerce
un gran efecto en valor del INR, ya que el ISI es el exponente en la frmula para obtener el
INR:
INR= RPISI
RP = Radio de protrombina
ISI = Asignado por cada fabricante
El RP es una relacin entre el TP del paciente y el TP normal (estndar o pool de

plasmas):
TPpaciente
RP=
TPcontrol
La expresin de resultados puede expresarse tambin mediante el empleo de la
frmula derivada de la curva obtenida por Quick:
Actividad protrombnica K
=
(% del normal) TP-a
TP = Tiempo de protrombina en segundos
K = 330
a = 8,7
Los valores de K son los logrados para tromboplastinas de 12 segundos. Para
tiempos de protrombina normales distintos de 12 segundos debemos emplear la siguiente
frmula:
Actividad protrombnica TP normal en segundos 8,7
=
(% del normal) TP paciente en segundos 8,7
En la actualidad el valor del INR es una referencia para vigilar el uso de

anticoagulantes orales, por lo cual siempre debe incluirse en el informe de los estudios de
coagulacin, tomando en cuenta que solo es un valor til para aquellos casos en que se est
llevando un tratamiento con anticoagulante oral (Tabla 30). Hoy en da la obtencin del
valor del INR es ms sencillo, pues los coagulometros automatizados calculan el valor al
momento de realizar la prueba.
Tabla No. 30. Lmites del INR en diversos tratamientos

INR Condicin
2,0 2,5 Profilaxis de trombosis venosa profunda.
2,0 3,0 Tratamiento de trombosis venosa profunda; tromboembolia pulmonar;
infarte de miocardio; estenosis mitral; fibrilacin auricular; isquemia
cerebral transitoria.
3,0 4,5 Tratamiento de recurrencias de trombosis venosa profunda; tromboembolia
pulmonar, injertos vasculares; vlvulas cardacas artificiales.
156
Los valores de referencia para los procesos de coagulacin deben ser establecidos
por cada laboratorio en base al tipo de poblacin que atienden. Para el caso del TP los
valores de referencia tambin van en relacin a la tromboplastina empleada. En promedio el
tiempo es:
12 14 segundos (dependiendo de la tromboplastina utilizada)
% actividad del paciente5 > 80%
Expresado en Radio de Protrombina6 1,2
INR < 5
El TP se prolonga en los casos de deficiencia de los FVII y los factores de la va

comn.
La prueba es muy sensible a la hipo o disfibrinogenemia y a cualquier trastorno de
polimerizacin de la fibrina.
Las deficiencias de vitamina K y la terapia anticoagulante oral con dicumarnicos
disminuyen los niveles de los factores dependientes de la vitamina K (FII, FVII, FIX, FX,
protena C y protena S) prolongan el TP.
El TP tambin se prolonga en casos de coagulopata grave, como en la coagulacin
intravascular diseminada (CID).
La presencia de anticoagulantes circulantes prolongadores del TP se describi en
casos de Lupus Eritematoso, leucemia y otras enfermedades sistmicas.
Actividades
Determinar el TP del paciente en segundos.

Establecer el TP en segundos de la Tromboplastina utilizada (11 segundos).
Calcular el Radio de Protrombina (RP)
Establecer el ISI de la tromboplastina utilizada.
Calcular el INR
6
Mtodo alternativo ms antiguo para reportar el TP. Se calcula multiplicando el cociente del TP del paciente
y el TP control por 100.
157
MDULO
VI
Inmunohematologa y
Banco de Sangre
158
SISTEMA ABO
En 1899, Shattock informa sobre un fenmeno curioso entre eritrocitos de una

persona y el suero de otra, sin embargo, no es hasta 1900 cuando Karl Landstainer, quin
descubre las diferencias de la sangre entre grupos de personas y con su teora sobre la
especificidad de las reacciones serolgicas, dio as inicio a la era inmunolgica de la
historia de la transfusin sangunea. Este hallazgo llev a Landstainer a establecer 3 grupos
sanguneos: A, B y O, al observar la aglutinacin de los eritrocitos de una persona con el
suero proveniente de otra. El descubrimiento del sistema ABO lo llevo a ser merecedor del
Premio Nobel de Medicina 30 aos mas tarde. Dos aos despus de este hallazgo, Alfredo
Von Decastello y Adriano Sturdi descubren un cuarto grupo sanguneo, el AB. Numerosos
descubrimientos surgieron a partir del sistema ABO y en 1908 Ottenberg y Epstein
postulan la forma de herencia sin aportacin de pruebas, en el mismo ao Emil von
Dungern y Ludwing Hirzfeld establecen que el tipo de herencia corresponde a las leyes de
Mendel.
Una nueva y excitante fase en el estudio de los grupos sanguneos se inici a partir
de 1939 con los trabajos de Levine, Landstainer y Wiener, quienes establecieron las bases
para el conocimiento de un nuevo sistema: el Rh y su papel fundamental en la etiologa de
la enfermedad conocida como Eritroblastosis fetal o Enfermedad hemoltica del recin
nacido (E. H. R. N.)
El estmulo cientfico desarrollado por estos descubrimientos fue de tal magnitud
que dio origen al nacimiento de una nueva especialidad, la Inmunohematologa, de la cual
Landstainer fue su lder hasta 1943, cuando acaeci su muerte. La rpida expansin de la
terapia transfusional y el desarrollo de mtodos serolgicos de mayor sensibilidad han
conducido al descubrimiento de una gran variedad de grupos sanguneos.
Se han descrito cerca de 400 antgenos de grupos sanguneos, sin embargo el
sistema ABO fue el primero de los sistemas de grupos sanguneos y es el ms importante
en la medicina transfusional.
Landstainer demostr que los eritrocitos contenan por lo menos dos factores,
designados como aglutingenos A y B, con los cuales se poda explicar los cuatro grupos
que existan y as postul que cada persona poda tener uno de ellos (A o B), ambos (AB) o
ninguno (O). Reconoci la presencia de anticuerpos en el suero y seal la relacin
reciproca que haba entre ellos y los antgenos presentes en los eritrocitos, demostrando que
cuando un determinado antgeno estaba ausente, su correspondiente anticuerpo se
encontraba en el suero o plasma. As, ha quedado establecido que los antgenos del sistema
ABO son los nicos para los cuales existe el correspondiente anticuerpo, siendo ello una
caracterstica constante y predecible en el suero de los individuos normales (Tabla 31).
Tabla No. 31. Antgenos y anticuerpos del sistema ABO.

Grupo Antgenos Anticuerpos Genotipo
sanguneo/fenotipo
O H Anti-A y Anti-B OO
A(A1 o A2) A(A1 A2) Anti-B AO o AA
B B Anti-A BO o BB
AB AyB Ninguno AB
159
La herencia del sistema ABO es controlada de acuerdo a las leyes de Mendel y se
integra de cuatro genes allicos: A (A1 A2), B y O de una serie de genes allicos menos
frecuentes como son: A3, Ax, Am, etc. En la mayora de los casos la herencia es directa y la
combinacin de los tres alelos, determinan los cuatro grupos sanguneos: A, B, AB y O. La
forma en que estos genes controlan la produccin de antgenos ABO fue establecidos por
Bernstein en 1924, cuya teora seala que cada individuo hereda dos genes ABO, uno de
cada padre, y que estos genes determinarn la presencia de los antgenos ABO en los
eritrocitos de las personas.
Cuando los antgenos de los glbulos rojos estn constituidos por protenas (Ej. Rh
y K) son, presumiblemente, los productos directos del gen; pero cuando aqullos son
carbohidratos (Ej. A y Lea), son determinados indirectamente por enzimas (transferasas)
que son los productos del gen; estas enzimas transfieren el azcar apropiado, determinando
especificidad sobre una estructura cuya sntesis puede ser determinada por uno o ms
genes no relacionados entre s. Algunos alelos que no producen algn efecto reconocible,
son denominados amorfos.
En casi todos los sistemas heredados en los autosomas, los alelos son co-
dominantes. El nico grupo sanguneo en el que el gen no es portado en un autosoma es el
Sistema Xg, el cual es portado en el cromosoma X.
Los genes del sistema ABO, ubicados en el cromosoma nmero 9, estn
estrechamente relacionados, con los de otros sistemas de grupos sanguneos, como son el
Hh, Ii, Lewis y P, ya que la conformacin de las molculas de carbohidratos de sus
determinantes antignicos (inmunodominantes) est dada por la interaccin entre los
productos gnicos de estos sistemas (cromosoma 19). Tambin se relacionan con la
condicin de secretor ubicada asimismo en el cromosoma nmero 19.
Bioqumica de los antgenos
Gran parte del conocimiento que se tiene acerca de la bioqumica de los antgenos
ABH provienen de los estudios realizados en las sustancias A, B y H presentes en las
secreciones. La razn para ello es que estas sustancias se encuentran en muy pequeas
cantidades en los eritrocitos, en cambio su concentracin es superior en las secreciones. Las
investigaciones en estos productos establecieron, que la especificidad de estas sustancias
ABH era debida a estructuras de carbohidratos unidos a polipptidos.
La purificacin de las glicoprotenas especificas de los grupos sanguneos demostr
que estn formados por carbohidratos en un 80-90% y el 10-20% restantes por aminocidos
(15 aa), los cuales estos ltimos aparentemente no juegan ningn papel en la especificidad
del grupo sanguneo de la molcula.
La informacin gentica que tiene cada individuo (genotipo) condiciona la sntesis
de enzimas que transfieren a la cadena de carbohidratos el azcar que le confiere la
determinante antignica especfica (inmunodominante). As, tenemos inicialmente la
fucosiltransferasa, que trasforma la sustancia precursora fundamental en sustancia H; a la
N-galactosaminiltransferasa que trasforma a la sustancia H en sustancia A y a la
galactosiltransferasa que transforma la sustancia H en sustancia B. Las diferencias entre las
enzimas para grupo A y B son puntuales; los individuos del grupo O sintetizan una protena
sin actividad enzimtica que, por tanto, no es capaz de agregar ningn azcar a la sustancia
H (Figura 41). Se han definidos seis alelos de O, todos ellos sin actividad enzimtica.
160
Los antgenos ABH estn presentes en la mayora de las clulas del organismo,
incluyendo plaquetas y leucocitos. Un 80% de la poblacin poseen un gen secretor
dominante (Se). Estas personas presentan antgenos solubles ABH en los tejidos y lquidos
corporales, por ejemplo, plasma, saliva, semen e inclusive en el sudor.
(Sustancia H)
Fig. No. 41. Representacin esquemtica de la sntesis bioqumica de los antgenos del
sistema ABO. Existe una cadena principal de azcares, a la cual se le denomina sustancia
precursora y se compone de Glc-Gal-GlcNAc-Gal. La ausencia de fucosa expone esta
cadena precursora en el fenotipo Bombay (Oh).
Anticuerpos del Sistema ABO
Los anticuerpos del Sistema ABO son principalmente IgM e IgG (Tabla 32) y muy
raramente IgA. Los primeros (IgM) tambin son denominados naturales, aglutinantes o
completos, se desarrollan regularmente despus que el individuo ha sido expuesto a la
inmunizacin ambiental; en su aparicin no ha ocurrido ningn evento inmunizante
reconocible. Individuos con anticuerpos anti-A y anti-B en su suero y que tienen un
estimulo inmunizante especfico pueden producir anticuerpos inmunes de la misma
especificidad pero con diferente comportamiento biolgico. La inmunizacin puede ser
secundaria a un embarazo ABO incompatible, transfusin de eritrocitos incompatibles, de
plasma conteniendo sustancias de grupo sanguneo, inyeccin de sustancias A y B
purificadas con la intencin de producir antisueros de altos ttulos, o inoculacin con
productos virales o bacterianos que contienen sustancias activas de grupo sanguneo.
Despus del estimulo inmunizante, el ttulo y la avidez de los anticuerpos aumenta,
161
desarrollando propiedades hemolticas y se hace ms difcil su neutralizacin con
sustancias solubles de grupo sanguneo; tambin se hacen activos a 37C. Estos cambios
son frecuentes en personas de grupo O, pero ocasionalmente pueden observarse en las de
grupo A y B.
Los segundos (IgG e IgA) se conocen tambin como anticuerpos incompletos
porque son capaces de adherirse al eritrocito pero no generan aglutinacin y nicamente
aparecen despus de una estimulacin antignica.
Tabla. No. 32. Caractersticas serolgicas de los anticuerpos del Sistema ABO
Caracterstica IgM IgG
Temperatura ptima de reaccin < 37C (4 20C) 37C
Tipo de reaccin Enzimtica Antiglobulina
Neutralizacin por sustancias de Completa Parcial
grupo sanguneo
Presente en fenotipo AyB O
Capacidad para atravesar placenta No Si (IgG1 e IgG3)
Causan enfermedad hemoltica No Si
Especificidad Anti-A y Anti-B Anti- AB
Tipo de respuesta inmune Primaria Secundaria
Mecanismo de produccin Natural (completos) Inmune (incompletos)
Capacidad para activar Si Si
complemento
Fijacin a monocitos/macrfagos No Si
Hemolisis <<in vitro>> No Si
Reaccin en solucin salina Si No
Aglutinacin directa Si No
Determinacin del Sistema ABO
La determinacin del grupo ABO es la prueba ms importante del banco de sangre

ya que es la base fundamental para determinar la compatibilidad de la sangre. El Sistema
ABO se integra de dos partes: Antgenos presentes en la membrana eritrocitaria y
anticuerpos correspondientes presentes en el plasma. Bajo condiciones normales, todos los
individuos poseen anticuerpos contra los antgenos que no estn presentes en sus propias
clulas. De esta manera se establece una interrelacin constante y predecible entre los
antgenos y anticuerpos del sistema, lo cual constituye la base fundamental para que en la
determinacin del Sistema ABO, se realicen dos pruebas:
1. Prueba celular para determinar los antgenos presentes en la membrana eritrocitaria.
2. Prueba srica o inversa, para determinar los anticuerpos presentes.
Las dos pruebas son complementarias entre si y por lo tanto se realizan al mismo
tiempo, pues una verificara los resultados de la otra. Deben realizarse a temperatura
ambiente (20 a 24C), la incubacin a 37C debilita la reaccin. En caso de que exista
discrepancia entre ambas pruebas debe hacerse una investigacin adicional para detectar la
fuente de la misma, ya que esta revelara una condicin que podra ser de importancia
162
clnica (Ej. Crioaglutininas, leucemias, linfomas, carcinoma de estmago,
inmunodeficiencias) o un error analtico.
Reactivos para la tipificacin del sistema ABO
Los reactivos empleados en la clasificacin de los antgenos se preparaban a partir

de anticuerpos policlonales naturales o inmunes de sangre humana y en ocasiones animal.
Ahora se preparan con anticuerpos monoclonales derivados de cultivos de clulas
secretoras o hibridomas. Estos anticuerpos son altamente especficos por lo cual ofrecen
resultados confiables y definitivos bajo condiciones normales. Estos reactivos deben
cumplir con lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA1-1993.
Para la clasificacin del suero, se deben emplear, en lo posible clulas fenotipadas
A1 y A2, B Rh positivo y O Rh positivo. Esta prueba no debe practicarse en placa, porque
generalmente la concentracin de los anticuerpos no es lo suficientemente alta para causar
la aglutinacin de los eritrocitos sin centrifugar.
Tcnicas para la determinacin de grupos sanguneos
Existen 3 tcnicas para la determinacin de grupos sanguneos: La primera tcnica

empleada fue la prueba en placa; posteriormente surgi la prueba en tubo, representando un
avance tcnico sobre la prueba en placa, adems, ampli la gama de pruebas realizadas en
el laboratorio de inmunohematologa que siguen emplendose hasta hoy en da en la
mayora de los laboratorios clnicos y bancos de sangre. Actualmente, dentro de las tcnicas
ms recientes se encuentra la tcnica llamada gel-centrifugacin desarrollada por el Dr.
Yves Lapierre, la cual emplea una matriz de gel (sephadex) en microtubos para atrapar
aglutinados de eritrocitos producidos por una reaccin antgeno-anticuerpo. Existen 3
formulaciones bsicas del gel:
1. Gel neutro: Solo contiene gel, para determinar la prueba inversa ABO, investigacin
de anticuerpos fros y pruebas enzimticas.
2. Gel especfico: Es una mezcla de gel con un antisuero especfico. Se emplea para la
tipificacin de grupo sanguneo.
3. Gel antiglobulina: Es una mezcla de gel con antiglobulina humana y/o fracciones de
complemento. Se utiliza en las pruebas de Coombs.
La tcnica de gel-centrifugacin representa un avance tcnico sobre el uso de la

tcnica en tubo, por ser un mtodo que ofrece reacciones e interpretacin de resultados de
manera estandarizada. Emplea volmenes bajos de muestra (microtcnica), las reacciones
son estables permitiendo lecturas posteriores y por ms de un analista. Adems las
reacciones pueden ser fotocopiadas y ledas por equipos automatizados eliminando los
aspectos subjetivos.
163
Fundamento
La membrana eritrocitaria posee una gran cantidad de antgenos de grupo

sanguneo, pertenecientes a distintos sistemas.
La tipificacin ABO por norma debe hacerse de los antgenos eritrocitarios (prueba
directa) y de los anticuerpos presentes en el suero de la misma muestra de sangre (prueba
inversa)
La ausencia o presencia de los antgenos de un individuo del sistema ABO solo se
logra a travs de la exposicin de los eritrocitos del individuo con antisueros monoclonales
conocidos comerciales (Anti-A, Anti-B o Anti-AB) o mediante la exposicin del suero del
individuo contra eritrocitos fenotipados (A1, A2, B y O), debido a que en el suero se
encuentran los anticuerpo recprocos de este sistema.
La presencia de los antgenos o de los anticuerpos se evidencia por la formacin de
aglutinados macroscpicos de una reaccin simple antgeno-anticuerpo.
Suspensin de eritrocitos al 5%
Suero
Aplicadores de madera
Centrifuga clnica
Reactivos
Solucin salina fisiolgica (SSF) al 0.85%
Suero comercial anti-A monoclonal (color azul)
Suero comercial anti-B monoclonal (color amarillo)
Suero comercial anti-AB policlonal (incoloro)
Eritrocitos fenotipados A1, A2, B y O suspendidos
Procedimiento:
PRUEBA CELULAR EN TUBO
1. Lavado de eritrocitos: Colocar 0,5 ml de sangre total anticoagulada en el tubo de

13 x 100 mm, adicionarle solucin salina fisiolgica (0,85%) hasta las partes del
tubo, colocar un tapn adecuado al tubo y mezclar invirtiendo con cuidado hacia
arriba y hacia abajo. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el
sobrenadante, de preferencia, con una pipeta Pasteur.
2. Eliminar el sobrenadante y preparar una suspensin de eritrocitos al 5% en SSF
(por ejemplo: 0,25 mL de eritrocitos en 4,75 mL de SSF).
3. Seleccionar 3 tubos de 13 x 100 mm e identificarlos con marcador como A, B y AB
respectivamente.
4. Colocar en el tubo marcado A, una gota de suero anti-A (azul); en el tubo B, una
gota de anti-B (amarillo) y en el tubo marcado AB (incoloro) una gota de suero
Anti-AB.
164
5. Agregar a cada tubo una gota de la suspensin de eritrocitos al 5% y mezclar.
6. Centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos o 1000 rpm por 1 minuto.
7. Desprender el botn de clulas del fondo del tubo agitndolo suavemente; inclinarlo
hasta la posicin horizontal para apreciar completamente la aglutinacin y
cuantificarla en cruces.
8. Anotar inmediatamente, tubo en mano, los resultados de la aglutinacin (Ver figura
42).
PRUEBA SRICA EN TUBO
1. El tubo de muestra colectada sin anticoagulante (as como est desde que se vaci
en el tubo) se centrifuga a 3000 rpm durante 5 minutos.
2. En caso de que aun se vea la fibrina despus de centrifugar y no se pueda extraer el
suero, sta se despegar de las paredes del tubo con un aplicador de madera (o en su
defecto con la punta de una pipeta Pasteur) empujndola hacia el fondo y sin sacar
nada del tubo; se vuelve a centrifugar (si se remueve y se saca el cogulo, ste
atrapa suero y en ocasiones no se logra obtener el suero deseado. Es recomendable
desechar el concepto de que para obtener suero se debe remover el cogulo).
3. Se separa el suero de los eritrocitos. El suero debe colocarse en otro tubo
debidamente identificado.
4. Identificar apropiadamente 4 tubos de 13x100 mm, de la siguiente manera: A, A1, B
y O.
5. Colocar 2 gotas de suero en estudio en cada tubo.
6. Agregar una gota de eritrocitos fenotipados como A1 al tubo marcado como A1; una
gota de eritrocitos identificados como A2 al tubo marcado con A2; una gota de
eritrocitos B en el tubo marcado como B y una gota de eritrocitos O en el tubo
marcado como O.
7. Mezclar agitando los tubos. Si desea potenciar la aglutinacin, los tubos pueden ser
incubados durante 5 minutos o ms a la temperatura del laboratorio.
8. Centrifugar a 3400 rpm 15 segundos a 1000 rpm 1 minuto.
9. Observar el sobrenadante contra un fondo blanco bien iluminado para detectar
hemlisis.
10. Desprender el botn de clulas del fondo del tubo con movimientos giratorios
suaves, inclinarlo hasta la posicin horizontal y leerlo contra un fondo bien
iluminado para apreciar completamente los aglutinados dispersos (Tabla 33)
11. Anotar inmediatamente, tubo en mano, los resultados de la aglutinacin.
165
4+ 3+ 2+ 1+ 0
Fig. No. 42. Interpretacin de la aglutinacin

4+ Aglutinacin total de los eritrocitos en un cmulo grande en un fondo claro.
3+ Dos o tres aglutinados grandes en un fondo claro.
2+ Aglutinados pequeos, de igual tamao, en un fondo rojo.
1+ Aglutinados muy pequeos, pero definidos, en un fondo rojo.
0 No hay aglutinacin.
Tabla No. 33. Procedimiento para la determinacin de antgenos del sistema sanguneo
ABO
Prueba celular en tubo Prueba srica en tubo Interpretacin
Tubos de 1 2 3 4 5 6 7
13x100 mm
Antisuero Anti-A Anti-B Anti- / / / /
comercial 1 gota 1 gota AB
1gota
Eritrocitos 1 gota 1 gota 1 gota / / / /
del paciente
al 5%
Eritrocitos / / / A A1 B O
fenotipados 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota
al 5%
Suero del / / /2 2 2 2
paciente gotas gotas gotas gotas
Centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos o a 1000 revoluciones por un minuto.
Interpretar aglutinacin
Interpretacin de los resultados
En la tabla 34 se expresan los resultados de las pruebas realizadas. Discrepancias

entre la prueba celular y la srica causan dificultades en la interpretacin del grupo ABO. Si
ello ocurre cada resultado debe ser anotado en el espacio correspondiente de la hoja de
resultados, pero el espacio designado para la interpretacin debe dejarse en blanco hasta
que el problema sea debidamente aclarado.
166
Tabla No. 34. Interpretacin de los resultados en la determinacin del sistema ABO
Prueba celular (Eritrocitos conocidos/sueros Prueba srica (suero Interpretacin
conocidos) desconocido/Eritrocitos del grupo
conocidos) sanguneo
Anti-A Anti-B Anti-AB A1 B
+ + O
+ + + A
+ + + B
+ + + AB
+ + Subgrupo A
+ + + Subgrupo A
ms
anticuerpo
+ = aglutinacin
= No hay aglutinacin
Discrepancias entre la prueba celular y la prueba srica
Los resultados de las pruebas con eritrocitos y con suero pueden ser discrepantes
debido a:
Los problemas intrnsecos de los eritrocitos o del suero.
Problemas relacionados con la prueba.
Errores tcnicos.
Falsos negativos
Pueden tener lugar debido a:
1. No agregar reactivo o suero a un tubo.
2. No identificar la hemolisis como una reaccin positiva.
3. Uso de una relacin inapropiada entre suero y/o reactivo con los eritrocitos
4. No centrifugar suficientemente las pruebas.
5. No incubar las pruebas a temperaturas de 20-24C o menores.
6. Interpretacin o registros incorrectos de los resultados de las pruebas.
Falsos positivos
Pueden ocurrir por:
1. Centrifugacin excesiva de los tubos.
2. Uso de reactivos, eritrocitos o solucin salina contaminados.
3. Uso de material de vidrio sucio.
4. Autoaglutinacin de los eritrocitos del paciente y realizacin slo del grupo directo
sin autotestigo.
5. Interpretacin o registros incorrectos de los resultados de las pruebas.
Toda discrepancia debe investigarse y resolverse antes de emitir un resultado

definitivo. Si se trata de una unidad de sangre donada, sta debe conservarse aparte y no
transfundirse hasta que no se haya resuelto la discrepancia. El primer paso debe ser repetir
167
la prueba con la misma muestra, si la discrepancia persiste se debe realizar en una muestra
nueva y verificar que los reactivos no estn contaminados.
168
SISTEMA Rh
El sistema Rh es despus del ABO el ms importante de los sistemas de grupos

sanguneos, por sus implicaciones clnicas en la transfusin sangunea y en la etiopatogenia
de la enfermedad hemoltica del recin nacido.
En su descubrimiento ocurrieron dos hallazgos relevantes. El primero de ellos
acaeci en 1930, por la publicacin de Levine y Stetson de su histrico trabajo describiendo
como una madre que terminaba de dar a luz a un feto muerto y macerado, haba
desarrollado una severa reaccin hemoltica por la transfusin de sangre proveniente de su
esposo. Ellos descubrieron que el suero de la madre aglutinaba los eritrocitos de su esposo
y el 85% de las sangres humanas ABO compatibles. El antgeno responsable demostr ser
independiente de los ya conocidos ABO, MN y P.
En la interpretacin de estos hallazgos, postularon que la madre haba sido
inmunizada, desarrollando anticuerpos contra un antgeno del cual ella careca pero que
estaba presente en los eritrocitos del feto, a su vez, heredado del padre. Cuando la paciente
fue transfundida con la sangre de su esposo, el anticuerpo reaccion con dicho antgeno
causando la reaccin hemoltica.
Un segundo hallazgo, esta vez experimental, se produce en 1940, como resultado de
las experiencias en animales, de Landstainer y Wiener. Ellos inmunizaron conejos y
cobayos inyectndoles eritrocitos del Macacus rhesus; aislaron un anticuerpo que,
convenientemente diluido por ser un heteroanticuerpo, aglutinaba los eritrocitos de los
monos rhesus y tambin el 85% de las sangre humanas. Los sujetos cuyos eritrocitos
aglutinaban con el suero anti-rhesus fueron denominados Rh positivos, y el 15% restante,
Rh negativos.
El siguiente paso fue la demostracin de Wiener Peters que el anticuerpo Rh,
aparentemente el mismo que haba sido elaborado en animales contra los eritrocitos del
mono rhesus, poda ser encontrado en el suero de algunas personas quienes haban
presentado alguna reaccin hemoltica despus de haber recibido transfusiones de sangre
ABO compatibles. Hasta el momento todo sugera que el antgeno presente en el eritrocito
del Macacus rhesus y el hallado en los humanos era el mismo, por consiguiente, los
correspondientes anticuerpos deberan poseer igual especificidad.
Hasta 1961 no qued completamente aclarada la confusin entre el anticuerpo de
origen humano y el anticuerpo anti-rhesus de origen animal. Sin embargo, ya para entonces
se haba generalizado tanto el trmino de Rh en la transfusin humana que resultaba
imposible modificarlo, aun cuando Levine haba sugerido que al anticuerpo anti-rhesus de
conejo se le diera el nombre de anti-LW en honor a sus descubridores.
Hoy en da se sabe que se trata de dos sistemas genticos completamente
independientes, cuyos antgenos pueden ser reconocidos por anticuerpos diferentes.
Antgenos del sistema Rh
El Sistema Rh es codificado por dos genes ubicado en el cromosoma uno; el gen

RHD es responsable de la sntesis de una protena que atraviesa la membrana lipdica del
eritrocito 12 a 13 veces y conforman los determinantes correspondientes al antgeno D. Las
personas con D negativo no poseen la informacin correspondiente a este gen, por lo que se
considera deledo; en las personas con D negativo de origen africano y asitico se ha
encontrado el gen en el locus correspondiente, aunque es inactivo.
169
El segundo gen, denominado RHC, comprende cuatro alelos. CE, ce. Ce y cE. stas
determinantes se encuentran ubicadas en una sola protena, que, al igual que la del antgeno
D, entra y sale a travs de la membrana 12 veces y posee 417 aminocidos (Figura 43).
Fig. No. 43. Esquema de la ubicacin de los determinantes especficos para los
antgenos del sistema Rh. RhCE: contiene los antgenos C o c (2 bucle) y E o e (4
bucle) RhD: expresa el antgeno D (aminocidos D-especficos en 3, 4 y 6 bucle)
El primer antgeno humano del sistema Rh fue el antgeno D, si todos los individuos
fueran homocigotos para este antgeno (DD), no existiran sujetos Rh negativos, sin
embargo, el hecho de que existan los Rh negativos, sugera la existencia de un alelo,
denominado d, pero hasta ahora no ha podido comprobarse este alelo. El sistema Rh es ms
complejo de lo que parece, pues se han encontrado ms de 48 antgenos, pero solo 5 se
consideran de importancia clnica: Existe el alelo D y dos pares de alelos antitticos (Cc y
Ee). Los genes del sistema Rh se hallan en el cromosoma 1, estn estrechamente
relacionados y se heredan de forma conjunta.
Desde el descubrimiento del sistema Rh en 1940, se fueron postulando varias teoras
acerca del modelo de herencia y la nomenclatura que deba de emplearse para este sistema,
sin embargo, en 1977 la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), para evitar las
divergencias en el sistema Rh recomend que se empleara la nomenclatura de Fisher (Tabla
35). La nomenclatura de Fisher supone la existencia de tres loci o genes separados pero
estrechamente ligados en haplotipos en el mismo cromosoma. Los denomina por separado
y los haplotipos resultantes se expresan por la conjuncin de tres letras. Los haplotipos ms
comnmente heredados son CDe y cde, para los sujetos con Rh positivo y Rh negativo
respectivamente.
El modelo gentico ms reciente es el descrito por Tippett (1986). En l se propone
dos locus estructurales estrechamente ligados, D y CcEe como base para la produccin del
antgeno Rh. Para los ocho fenotipos Rh ms comunes se describen dos alelos en el primer
locus: D y no D. En el segundo locus CcEe se necesitan cuatro alelos que incluyen: ce, Ce,
170
cE y CE. En 1900, Colin y colaboradores secuenciaron los dos genes descritos por Tippett
y demostraron que el locus Rh de los individuos Rh positivos est compuesto por dos genes
diferentes. En los individuos D negativos uno de estos genes se halla ausente. Se sugiere la
hiptesis de que uno de estos genes Rh codifica el polipptido D y el otro gen codificara los
polipptidos C/c y E/e. Estos hallazgos confirmaron el modelo de Tippett con la excepcin
de que el alelo no D parece no existir. Adicionalmente, la Sociedad Internacional de
transfusin Sangunea agreg la terminacin numrica para los antgenos del Rh, basndose
en la nomenclatura descrita por Rosenfield.
Tabla No. 35. Algunos de los genotipos probables del sistema Rh a partir de los fenotipos
ms frecuentes, segn la nomenclatura de Fisher.
Fenotipo Rh Genotipo probable Estatus Rh
1
DCcee DCe/dce (R r) Positivo
DCCee DCe/DCe (R1R1) Positivo
DccEe DcE/dce (R2/r) Positivo
DccEE DcE/DcE (R2/R2) Positivo
DCcEe DCe/DcE (R1/R2) Positivo
ddccee dce/dce (rr) Negativo
Nomenclatura de Rosenfield: R = Rh positivo, r = Rh negativo, 1 = C, 2 = E
Anticuerpos del sistema Rh
A diferencia del sistema ABO, en donde existen anticuerpos naturales, las personas
Rh negativos no contienen bajo condiciones normales, anticuerpos anti-Rh. La formacin
de este anticuerpo es casi siempre el resultado de la exposicin del antgeno, sea por
transfusin o por el embarazo al tener contacto con eritrocitos que contienen el antgeno D,
por lo tanto, la naturaleza de los antgenos es inmune. La antigenicidad del factor Rh es
mayor que la de cualquier otro grupo sanguneo. As, la administracin de sangre de un
individuo Rh positivo a otro Rh negativo tiene un 50% de probabilidades de quedar
inmunizado (sensibilizado) y provocar la aparicin del anticuerpo especfico.
Relativa importancia del antgeno D
El antgeno D, es hasta ahora el ms inmunognico de los antgenos Rh, siendo por

lo menos 20 veces ms inmunognico que el c, que es el siguiente ms potente del los
antgenos Rh.
Los anticuerpos contra antgenos del sistema RH en su gran mayora son del tipo
IgG, que no activan el complemento; es importante mencionar que anti-E frecuentemente
es considerado como natural regular.
171
Fundamento
Para identificar el aglutingeno Rh se usa un antisuero especfico y su presencia se

pone de manifiesto por la aglutinacin de los eritrocitos.
Pipeta pasteur
Bulbo para pipeta pasteur
Aplicadores de madera
Centrifuga clnica
Reactivos
Solucin Salina Fisiolgica (SSF) al 0,85%
Suero anti-D monoclonal (Rh0)
Suero D control
Procedimiento
PRUEBA CELULAR EN TUBO
1. Homogeneizar perfectamente bien el tubo de sangre anticoagulada por inversin del

tubo.
2. Lavar los eritrocitos una vez con SSF, centrifugado a 3000 rpm/5 min. Lavado de
eritrocitos: Colocar 0,5 ml de sangre total anticoagulada en el tubo de 13 x 100
mm, adicionarle solucin salina fisiolgica (0,85%) hasta las partes del tubo,
colocar un tapn adecuado al tubo y mezclar invirtiendo con cuidado hacia arriba y
hacia abajo. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante,
de preferencia, con una pipeta Pasteur.
3. Eliminar el sobrenadante y preparar una suspensin de eritrocitos al 5% en SSF.
4. Identificar apropiadamente un tubo de vidrio de 13 x 100 mm, y agregar 1 gota de
antisuero-D (Rh0) y 1 gota de suspensin de eritrocitos al 5% y mezclar.
5. Identificar como tubo control un tubo de vidrio de 13 x 100 mm, y agregar 1 gota de
suero-D control y 1 gota de suspensin de eritrocitos al 5% y mezclar.
6. Centrifugar inmediatamente durante 1 minuto a 1500 revoluciones.
7. Agitar cuidadosamente el sedimento, inclinar el tubo lentamente hasta la forma
horizontal y examinar la aglutinacin sobre fondo claro. (En este tubo se puede
continuar la prueba D dbil).
172
Tabla No. 36. Procedimiento de determinacin del Antgeno Rh.
Indicaciones Factor Rh Control Interpretacin
D
Tubos 13 x 100 mm 1 2
1 Antisuero Comercial D 1 gota Nada
(Rh0)
Suero control D Nada 1 gota

2 Suspensin de eritrocitos del 1 gota Nada
paciente al 5%
3 Centrifugar el tubo No. 1 a 500 revoluciones por 1 minuto
4 Interpretar aglutinacin: Nada
Si el resultado es positivo la (+) Rh positivo
prueba aqu termina.
(-)
Si el resultado es negativo
hay que continuar el
Coombs (D dbil)
Interpretacin
Los resultados posibles se observan en el cuadro siguiente:
Tabla No. 37. Interpretacin del sistema Rh

Tubo con anti-Rh Tubo con control Rh Interpretacin
+ Rh positivo*
(+) dbil Posible D dbil **
Rh negativo; o posible D
dbil (practicar la prueba
Coombs)**
Autoaglutinacin (Investigar
+ + dicha
situacin)
*
Si la prueba se interpreta como Rh positivo, aqu termina el procedimiento en el paso 6 y no se hace variante
D dbil del antgeno D.
**
Si la prueba se interpreta como posible D dbil o Rh negativo se contina con los mismos tubos de ensayo
del paso 7 del procedimiento antes descrito, al paso 7 del procedimiento que se describe en la prueba de
variante D dbil del antgeno D.
173
EXPRESIONES DBILES DEL ANTGENO D (D PARCIAL O DBIL)
No todos los eritrocitos pueden ser clasificados como Rh positivo o negativo,

mediante las pruebas de aglutinacin directa con los sueros anti-Rh. La mayora de las
muestras de sangre, de una reaccin de aglutinacin macroscpica, muy definida y clara,
inmediatamente despus de la centrifugacin; estas clulas que as reaccionan pueden ser
fcilmente clasificadas como Rh positivo. Otras, no muestran aglutinacin directa; sin
embrago, no pueden ser clasificadas como Rh negativo porque el antgeno D puede estar
presente en tales clulas pero dbilmente expresado, por lo que se requiere de pruebas
adicionales como la de antiglobulina para poderlo demostrar. Estos tipos de reactividad son
debidos a variantes del antgeno D y los individuos cuyos eritrocitos exhiben tal
comportamiento son clasificados como D parcial dbil.
Antiguamente el Du (D dbil) se consideraba como un antgeno ajeno al D, sin
embargo hoy se sabe que en realidad se trata de un alelo dbil del D; la mayora de las
veces est asociada a los antgenos C o E y es rara en la raza blanca. La importancia
prctica del D dbil radica en que puede sensibilizar a un receptor D negativo. Con la
utilizacin de reactivos monoclonales se detectan la mayora de alelos dbiles del antgeno
D, sin embargo, cada laboratorio debe considerar las pruebas ms apropiadas para la
deteccin de estos D dbil, con el fin de evitar la transfusin de sangre errneamente
clasificada como Rh negativa.
Algunas variantes del antgeno D relacionadas a expresiones dbiles de este
antgeno, pueden ser las siguientes:
1. Efecto de posicin: DC en posicin trans, que debilita la expresin del D.
2. Codificacin gentica para menor nmero de sitios antignicos R0.
3. Antgeno D incompleto que se relaciona con los eptopes que conforman el antgeno
Rh; se han descrito nueve eptopes identficados con sueros monoclonales anti-D,
que permiten caracterizar siete categoras de clulas. En la categora seis, se
identifican eptopes D3, D4 y D9, mientras, en la categora tres, se identifican nueve
eptopes.
La baja frecuencia de las variantes dbiles del antgeno D (D dbil) explica su falta
de trascendencia clnica. Algunos de estos individuos pueden producir anticuerpos anti-D
contra el eptope que no tienen, lo que explica la observacin de individuos con Rh D
positivo con anticuerpo anti-D en su suero.
Aparte de las variaciones de los antgenos D que se mencionan arriba, y que son
ms o menos comunes, hay otros hallazgos que alteran la simplicidad de la concepcin del
sistema Rh como un conjunto de tres haplotipos con tres unidades de variacin:
Antgenos de ms:
o Antgeno G.
o Antgenos compuestos (cooperacin de de dos genes vecinos en el mismo
haplotipo, pero situados en posicin cis).
o Antgenos indiferenciados.
Antgenos de menos (antgenos deprimidos o silenciosos)
Antgenos asociados
o Antgeno LW (confundido inicialmente con el descubierto por Levine y que
dio origen al Rh).
174
LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA O DE COOMBS
Prueba empleada para demostrar la presencia de antgenos o anticuerpos de grupos

sanguneos, as como tambin en el diagnstico de la enfermedad hemoltica del recin
nacido.
El fundamento de la prueba de Coombs se basa en los siguientes principios:
1. Los anticuerpos y el complemento humano son globulinas y adems son diferentes a
las de otras especies, por lo tanto, se comportan como antgenos cuando se inyectan
en otros organismos.
2. Si un animal (conejo, chivo, caballo) es inyectado con globulinas humanas
purificadas o con el suero total, este animal las reconoce como extraas y elabora
anticuerpos contra ellas; estos anticuerpos tendrn especificidad antiglobulina
humana.
3. El suero antiglobulina humana obtenido reaccionara especficamente con las
globulinas humanas. Si molculas de globulinas, sean anticuerpos o complemento
se fijan en la membrana del eritrocito, el suero antiglobulina se combinar con ellas
y causar aglutinacin de las clulas. En cambio, si los eritrocitos no estn
sensibilizados, no habr aglutinacin.
En resumen, se puede decir que el principio de la prueba de antiglobulina humana o

de Coombs es muy simple: detectar inmunoglobulina de la clase IgG y/o fracciones de
complemento (C3d), unidos a la membrana eritrocitaria. No se considera necesario incluir
alguna otra actividad contra las dems inmunoglobulinas (IgM, IgA), en este reactivo.
La sensibilizacin de los eritrocitos se puede producir en dos formas:
a) <<In vivo>>, es decir, cuando la reaccin del antgeno y su correspondiente
anticuerpo se efecta en el organismo, mientras ambos estn circulando, como por
ejemplo, en casos de anemia hemoltica autoinmune, de enfermedad hemoltica del
recin nacido, etc.
b) <<In vitro>>, la sensibilizacin de los eritrocitos por el anticuerpo se realiza en un
tubo de ensayo en el laboratorio, donde se mezclan e incuban eritrocitos adecuados
con el suero en estudio. Si en el suero existen anticuerpos contra antgenos presentes
en los eritrocitos, se producir la reaccin antgeno-anticuerpo y los eritrocitos
quedaran sensibilizados.
Existen dos mtodos para la prueba de la antiglobulina humana:

a) Prueba de Coombs directa: Se emplea para detectar anticuerpos o fracciones de
complemento en la superficie del eritrocito cuando ha ocurrido una sensibilizacin
<<in vivo>> (Figura 44). Este tipo de sensibilizacin puede presentarse en alguno
de los siguientes casos:
i. Enfermedad hemoltica del recin nacido.
ii. Anemia hemoltica autoinmune.
iii. Anemia hemoltica medicamentosa.
iv. Reaccin hemoltica postransfusional.
175
Solucin salina
Eritrocitos lavados
3 veces
Suero de Coombs
+
Eritrocitos
Aglutinacin
(prueba +)
Inmunoglobulina (Ac) antieritrocito Eritrocito Anti-IgG
Fig. No. 44. Esquema de la prueba de Coombs directa
b) Prueba de Coombs indirecta: Se emplea para detectar anticuerpos incompletos en

el suero del paciente. Es un procedimiento de dos etapas, pues requiere de una
sensibilizacin de eritrocitos <<in vitro>>, y posteriormente la reaccin propia de la
antiglobulina (Figura 45). Se emplea para la deteccin de anticuerpos irregulares.
Interpretacin del resultado
La reaccin antgeno-anticuerpo ms importante empleada en el banco de sangre es

la aglutinacin. En ella el anticuerpo reacciona con el antgeno que es parte de una
estrcutura de mayor tamao como son los eritrocitos, formndose masas o aglutinados que
pueden ser evidenciados a simple vista.
La reaccin de aglutinacin de los eritrocitos ocurre en dos fases o etapas: la
primera, representa la reaccin inmunoqumica especfica conocida como la sensibilizacin
y en la cual el anticuerpo se une al antgeno [Ej. Tipificacin de grupos sanguneos y Rh0
(D)]. La segunda fase representa el proceso fsico de la aglutinacin, que resulta de la unin
de los eritrocitos mediante puentes de anticuerpos (Ej. Prueba de Coombs).
176
Incubacin 37C
+ 30
Eritrocitos de
Suero problema
grupo conocido
Eritrocitos
sensibilizados
Suero fisiolgico + Suero de Coombs
Aglutinacin
(prueba +)
Fig. No. 45. Esquema de la prueba de Coombs indirecta.
Si la primera y/o principalmente la segunda fase muestran aglutinacin, se interpreta

positiva, la intensidad de la reaccin se debe sealar en cruces, como se muestra en la
Figura 42. No debe olvidarse la posibilidad de errores capaces de ocultar el resultado de la
prueba de Coombs (Tabla 38).
177
Tabla No. 38. Causas de error en la prueba de Coombs
Falsos positivos
Sensibilizacin eritrocitaria in vitro por anticuerpos naturales o complemento por mantener
mucho tiempo la muestra a 4C.
Lavado insuficiente de los eritrocitos.
Fijacin inadecuada del suero antiglobulina.
Reaccin con el recubrimiento de algunos tubos de vidrio.
Reticulocitos elevados en la muestra analizada.
Falsos negativos
Tiempo insuficiente de incubacin.
Dilucin incorrecta del suero antiglobulina.
Suero antiglobulina de poca sensibilidad o caducado.
Cuando el anticuerpo presente es anti-IgA.
Lavado inadecuado de los eritrocitos que conlleve a la neutralizacin o eliminacin de los
anticuerpos fijados a su superficie.
Empleo de material sucio.
Reactivos antiglobulnicos humano
El reactivo antiglobulnico humano o suero de Coombs, se obtiene al inmunizar

animales con globulinas del suero humano, estas pueden ser inmunoglobulinas purificadas
(IgG, IgM, IgA) y/o fracciones de complemento (C3b, C3d, etc.), producindose
antiprotenas humanas en el suero animal, las que se purifican tras adsorcin con eritrocitos
humanos lavados que eliminan las aglutininas no deseadas.
Los sueros antiglobulnicos se obtienen de forma policlonal y mediante la
tecnologa de hibridomas, ambos pueden ser poliespecficos o monoespecficos:
Poliespecficos: Contienen anticuerpos anti-inmunoglobulinas y anti-complemento.
Monoespecficos: Contienen un nico anticuerpo; Anti-IgG, Anti-IgA, o Anti-IgM
si no tienen actividad anti-complemento. Anti-C3d si no tienen actividad anti-
inmunoglobulina.
178
Fundamento
No todos los eritrocitos pueden ser clasificados como Rh positivo o Rh negativo,

mediante las pruebas de aglutinacin directa con los antisueros anti-D. El antgeno D puede
estar presente en tales clulas pero dbilmente expresado.
1. <<In vitro>>, la sensibilizacin de los eritrocitos por el anticuerpo se realiza en
un tubo de ensayo en el laboratorio, donde se mezclan e incuban eritrocitos del paciente con
el anti-D. Si en los eritrocitos existen los antgenos correspondientes al antisuero-D, se
producir la reaccin antgeno-anticuerpo y los eritrocitos quedaran sensibilizados. Si los
eritrocitos carecen del antgeno D, los eritrocitos no quedaran sensibilizados.
2. El suero antiglobulina reaccionar con las globulinas humanas. Si las molculas
de anti-D se fijan en la membrana del eritrocito, el suero antiglobulina se combinar con
ellas y causar aglutinacin de las clulas. En cambio, si los eritrocitos no estn
sensibilizados (debido a la falta del antgeno D) no habr aglutinacin.
Pipeta Pasteur
Bulbo para pipeta Pasteur
Centrfuga
Bao Mara a 37C
Reactivos
Solucin Salina fisiolgica (SSF) al 0,85%
Suero anti-D (Rho) monoclonal
Antiglobulina humana o Suero de Coombs poliespecfico (Frasco gotero de color
verde)
Procedimiento
DETERMINACIN DE LA AUSENCIA O DE EXPRESIONES DBILES DEL

ANTGENO D
Para esta prueba, pueden ser usados los mismos tubos de la determinacin del
antgeno D, a menos que las instrucciones del fabricante sealen otro mtodo.
Fase I
1. Homogenizar perfectamente bien el tubo de muestra de sangre anticoagulada por
inversin del tubo.
2. Lavar los eritrocitos anticoagulados una vez con SSF, centrifugado a 3000
revoluciones durante 5 minutos. Lavado de eritrocitos: Colocar 0,5 mL de sangre
total anticoagulada en el tubo de 13x100 mm, adicionarle solucin salina
fisiolgica (0,85%) hasta las partes del tubo, colocar un tapn adecuado al tubo y
mezclar invirtiendo con cuidado hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar a 3000 rpm
durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante, de preferencia, con una pipeta Pasteur.
179
3. Eliminar el sobrenadante y preparar una suspensin de los eritrocitos al 5% en SSF.
4. Identificar apropiadamente un tubo de vidrio de 13 x 100 mm, y agregar 1 gota de
antisuero-D (Rho) y 1 gota de suspensin de eritrocitos al 5% y mezclar.
5. Identificar como tubo control un tubo de vidrio de 13 x 100 mm, y agregar 1 gota de
suero-D control y 1 gota de suspensin de eritrocitos al 5% y mezclar.
6. Centrifugar inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm.
7. Agitar cuidadosamente el sedimento, inclinar el tubo lentamente hasta la forma
horizontal y examinar la aglutinacin sobre fondo claro. (En este tubo se puede
continuar la prueba D dbil).
Fase II
1. Agitar homogneamente el contenido del tubo e incubar a 37C durante 30 minutos.
Incorporar un segundo tubo que solo contenga 2 gotas de suspensin de eritrocitos
al 5% como control negativo e incubarlo tambin a 37durante 30 minutos. Cada
muestra al que se le determine el factor Rh y que pase a la Fase II se le debe
incorporar un tubo Control (Ejemplo: Si se est haciendo una muestra debe haber
2 tubos; si se est determinando en 2 muestras debe haber 4 tubos y as
sucesivamente).
2. Centrifugar los 2 tubos (o los que se estn determinando) durante 2 minutos a 3000
rpm. Decantar completamente toda la solucin salina.
3. Agregar unas gotas de sol. salina fresca a los tubos, resuspender las clulas y luego
agregar ms salina para realizar el segundo lavado, llenando el tubo hasta las 3/4
partes con sol. salina y homogenizar.
4. Centrifugar nuevamente y repetir el mismo procedimiento hasta completar 4
lavados (Pasos 8, 9 y 10).
5. Inmediatamente despus del cuarto lavado, agregar 2 gotas de reactivo de
antiglobulina humana a cada uno de los dos tubos y mezclar.
6. Centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos o a 1000 rpm por 1 minuto.
7. Resuspender suavemente el botn de clulas del fondo de los tubos y leer en cruces
la aglutinacin (Figura 42).
180
Tabla No. 39. Procedimiento analtico de la prueba de Coombs indirecta.
Fase I
INDICACIONES ANTGENO CONTROL INTERPRETACIN
D
Tubos 13x100 mm 1 2
1 Antisuero comercial D (Rho) 1 gota Nada
Suero control D Nada 1 gota

2 Suspensin de eritrocitos del 1 gota Nada
paciente al 5%
3 Centrifugar el tubo No. 1 a 1500 revoluciones por minuto
4 Interpretar aglutinacin Nada
Si el resultado es positivo la prueba (+) Rh positivo
aqu termina
(-)
Si el resultado es negativo hay que
continuar el Coombs
Fase II
5 Suspensin de eritrocitos del Este tubo
paciente al 5% ( la misma muestra viene del 1 gota
que la utilizada en el paso 2) paso 4
6 Incubar a 37C los tubos No. 1 y 2 durante 30 minutos
7 Centrifugar ambos tubos a 3000 revoluciones por minuto
8 Decantar el sobrenadante de ambos tubos
9 Resuspender los botones de ambos tubos hasta 3/4 partes con
salina.
10 Centrifugar ambos tubos a 3000 revoluciones por 2 minutos
(Repetir del paso 8 al 10 tres veces ms hasta obtener ambos
tubos finalmente decantados)
11 Suero de Coombs (color verde) 1 gota 1 gota
12 Centrifugar a 3400 revoluciones por 15 minutos o a 1000
revoluciones por minuto.
13 Interpretacin de aglutinacin (-) (-) Rh negativo
(+) (-) Rh positivo
Interpretacin de la prueba de Coombs
Si se observa aglutinacin positiva, indicara la presencia de la variante D dbil en la

membrana eritrocitaria, por lo que se clasificara al sujeto como Rh positivo variante dbil
(D dbil).
Como control siempre deber practicarse una prueba directa de antiglobulina
mediante los eritrocitos problemas.
181
Algunas normas de bancos de sangre establecen que es necesario hacer la
determinacin del D dbil cuando se trata de donantes, no as en los receptores, quienes
deben recibir sangre Rh negativo.
En la experiencia de algunos autores, consideraron que las normas de banco de
sangre deben requerir que:
1. Toda sangre con resultado negativo debe ser procesada para la prueba D dbil,
mediante el mtodo de la antiglobulina humana.
2. Si se trata de un donante que resulta ser D dbil positivo, debe ser interpretado y
considerado como Rh positivo y la sangre debe ser transfundida a un receptor Rh
positivo.
3. Cuando se trata de un receptor D dbil positivo, debe ser interpretado y considerado
como Rh positivo. Este paciente puede ser transfundido con sangre Rh positivo.
4. Es obligatorio en la realizacin de la prueba D dbil, incluir el procesamiento
simultneo de un control por el mtodo de Coombs directo. En aquellos casos en
que esta prueba control resulte positiva, la prueba D dbil se invalida y el receptor
deber ser transfundi con sangre Rh negativo, hasta que se esclarezca el resultado.
5. Las mujeres embarazadas D dbil positivo, cuyo hijo sea Rh positivo, no genera
problema alguno con la inmunoglobulina anti-Rh.
182
ANTICUERPOS IRREGULARES
Todas las clulas sanguneas poseen en su membrana glicoprotenas o glicolpidos

que pueden actuar como antgenos (Ag) y provocar la formacin de anticuerpos (Ac) en las
personas que carecen de ellos, a este fenmeno se le denomina como aloinmunizacin.
Desde el punto de vista de la medicina transfusional, los anticuerpos contra antgenos
sanguneos se clasifican de la siguiente forma:
Anticuerpos contra aloantgenos: los producidos contra antgenos de eritrocitos,
leucocitos y plaquetas.
Anticuerpos contra los propios antgenos del individuo: autoanticuerpos producidos
contra antgenos de eritrocitos y plaquetas, y cualquier anticuerpo derivado de las
enfermedades autoinmunes. En este contexto podemos considerar a los
autoanticuerpos como regulares e irregulares, y dividir a los aloanticuerpos como
sigue (Tabla 40):
o Regulares naturales: los producidos contra el sistema ABO.
o Irregulares naturales: Anti-A1, Anti-M, Anti-N, Anti-P1, Anti-E, entre
otros.
o Irregulares inmunes: Anti-Rh-Hr (Anti-D, Anti-C, Anti-c, y otros), Anti-
Kell, Anti-Duffy.
Tabla No. 40. Clasificacin de los aloanticuerpos de los sistemas sanguneos

Regulares: Ac presentes durante toda nuestra vida, son
de tipo IgM y de amplio espectro trmico; su
produccin inicial est relacionada con la exposicin a
bacterias (sistema ABO). Son espontneamente
aglutinantes y no poseen capacidad hemolizante. No
Naturales pueden atravesar la barrera placentaria.
Anticuerpos Irregulares: Ac que pueden producirse en cualquier

etapa de nuestra vida, su periodo serolgico es variable
y estn relacionados con alimentos y Ag bacterianos;
son de tipo IgM que actan entre 427C (H, I, i, M, N,
P, Le, A1, E, etc.).
Irregulares: Ac producidos por transfusiones o

embarazos, su duracin serolgica es variable, el tipo
Inmunes de Ac que los caracterizan son de tipo IgG que actan
normalmente a 37C y que tiene capacidad para fijar o
no complemento (sistema Rh-Hr, Diego, Duffy, Kell,
Kidd y otros). No siempre son espontneamente
aglutinantes y poseen capacidad hemolizante. Son
capaces de atravesar la barrera placentaria.
En base a lo anterior se establece entonces que los anticuerpos irregulares son

aquellos que no se encuentran de manera natural en un individuo, pues son resultado de la
exposicin a un antgeno ajeno al organismo del individuo al momento de la transfusin o
183
en las mujeres en el embarazo; estos anticuerpos son dirigidos contra antgenos fuera del
sistema ABO. Estos anticuerpos inmunes (adquiridos) son regularmente inmunoglobulinas
G (IgG), las cuales producen hemolisis extravascular en el bazo o en el hgado mediante
fagocitosis de los complejos Ag-Ac.
Los aloanticuerpos irregulares ms comunes entre nuestra poblacin son los que
involucran a los sistemas:
Rh-Hr
MNSs
P1
Kidd
Duffy
Kell
Lewis
Diego
Lutheran
Rastreo bsqueda de anticuerpos irregulares
La inmunohematologa, junto con la medicina transfusional, es una rama de la

patologa clnica que se ocupa de las siguientes materias: transfusin de sangre y de sus
componentes; patogenia y diagnstico, prevencin y tratamiento de la inmunizacin
(sensibilizacin) relacionada con el embarazo y pruebas leucocitarias para el trasplante de
rganos.
Se ha comprobado que existen distintos tipos de Ac en base a su tamao, peso,
temperatura ptima de reaccin, medio de reaccin, etc. Sin embargo de todas estas
caractersticas la ms importante es la temperatura ptima de reaccin, pues la temperatura
tiene efectos inversamente proporcionales con la constante de equilibrio y la velocidad de
reaccin si esta se aleja del rango ideal de trabajo. De acuerdo a la temperatura ptima de
reaccin, estos Ac se dividen en dos grupos: anticuerpos fros y anticuerpos calientes.
a) Anticuerpos fros: reaccionan a temperaturas entre 4 y 27C. No son importantes

desde el punto de vista transfusional, pues generalmente no son activos a
temperatura corporal, sin embargo pueden influir o interferir en la clasificacin
sangunea de las personas y en las pruebas de compatibilidad realizadas a
temperatura ambiente. Estos Ac son de tipo IgM, cuyo peso molecular es de 950
KD y su mejor medio de reaccin es el salino. Los Ac fros van dirigidos contra los
sistemas MN, Lewis y P1. Entre estos Ac slo M y N han sido relacionados con la
enfermedad hemoltica del recin nacido, cuya severidad va de leve a moderada.
b) Anticuerpos calientes: se han denominado as porque su temperatura ptima de
reaccin es 37C. Estos Ac tienen una relevante importancia clnica ya que se les
asocia con reacciones transfusionales de intensidad moderada a severa, que pueden
llegar a ocasionar la muerte; son los principales causantes de la enfermedad
hemoltica del recin nacido. Estos Ac son de clase IgG, cuyo peso molecular es de
150 KD y reaccionan mejor en medio proteico (albmina).
184
Banco de sangre y su objetividad
Un Banco de sangre es el establecimiento autorizado para obtener, recolectar,

conservar, aplicar y proveer sangre humana, as como para analizar y conservar, aplicar y
proveer componentes de la misma.
La Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993, Para la disposicin de sangre
humana y sus componentes con fines teraputicos, aplica las siguientes definiciones para
los productos o componentes sanguneos:
Unidad: Volumen de sangre o componente sanguneo recolectado de un solo
disponente en una bolsa o recipiente que contenga anticoagulante adecuado y
suficiente.
Sangre fresca: Tejido hemtico no fraccionado, de menos de seis horas despus de
su recoleccin.
Sangre total: Tejido hemtico no fraccionado, de ms de seis horas despus de su
recoleccin.
Componentes de la sangre: Fracciones separadas de una unidad de sangre u
obtenidas por afresis.
o Concentrado de eritrocitos: Fraccin que contiene principalmente glbulos
rojos, como resultante de la remocin casi completa del plasma de la sangre
recolectada.
o Concentrado de eritrocitos pobre en leucocitos: Glbulos rojos en los que
se ha eliminado la mayor parte del plasma y de otras clulas sanguneas por
remocin de la capa blanca sobrenadante.
o Concentrado de eritrocitos lavados: Glbulos rojos de los que se han
removido en proporcin suficiente el plasma y otras clulas sanguneas,
mediante baos sucesivos con solucin salina isotnica.
o Concentrado de eritrocitos congelados: Glbulos rojos en una solucin
criopreservadora, que permite incrementar su periodo de vigencia
conservados a bajas temperaturas.
o Concentrado de leucocitos: Glbulos blancos recolectados por afresis o
preparados mediante fraccionamiento de unidades de sangre fresca.
o Concentrado de plaquetas: Trombocitos recolectados por afresis o
preparados mediante fraccionamiento de unidades de sangre fresca.
o Plasma envejecido: El que en cualquier momento despus de la recoleccin
ha permanecido seis horas o ms a temperaturas por arriba de menos 18 C.
o Plasma desprovisto de crioprecipitado: El remanente despus de haber
separado algunos factores de coagulacin por tcnicas de precipitacin en
fro.
o Plasma fresco: El que se encuentra en el lapso de las primeras seis horas
despus de la recoleccin.
o Plasma fresco congelado: El que se congela en el lapso de las primeras seis
horas, despus de la recoleccin y as se conserva.
o Crioprecipitado: Fraccin proteica del plasma fresco congelado que
precipita al descongelarse en condiciones controladas.
185
Muestras piloto
Toda unidad de sangre siempre debe tener muestras piloto, las cuales son muestras
sanguneas que acompaan a cada unidad de sangre o de eritrocitos. Estas muestras sern
tomadas en el momento de la donacin por la persona que extraiga la sangre y estarn
marcadas desde antes de la toma de la sangre para indicar que son idnticas al contenido de
la unidad de sangre total.
En el laboratorio de Banco de Sangre el objetivo determinante es dar al paciente
donde se encuentre, el producto o productos tales como: Paquete globular (concentrado de
eritrocitos), Plasma fresco, Plasma congelado, Plasma rico en plaquetas, Concentrado
plaquetario, Concentrado leucocitario y Crioprecipitado; los cuales deben estar en cantidad
suficiente en el momento preciso y con los estudios pertinentes que avalen su inocuidad.
Dentro de estos estudios se encuentra un grupo de pruebas denominadas como
pruebas pretransfusionales. Este procedimiento asegura de manera adecuada la
compatibilidad eritrocitaria y plasmtica, por las siguientes pruebas:
1. Grupo sanguneo ABO (visto en la prctica anterior).
2. Determinacin del factor Rho (D) (visto en la prctica anterior). Ratificacin del Rh0
(D) del donador cuando el paciente es Rh0 (D) negativo (visto en la prctica
anterior).
3. Investigacin de anticuerpos irregulares fuera del sistema ABO.
4. Pruebas cruzadas de compatibilidad.
Todos y cada uno de estos exmenes deben estar bajo control. Para este fin, el
empleo de un grupo de clulas de perfil fenotpico conocido (panel) no es solo til sino
indispensable.
La transfusin de componentes sanguneos se considera entonces como un
procedimiento relativamente seguro, inocuo y eficaz. Sin embrago, la terapia transfusional
conlleva riesgo de reacciones adversas, desde leves hasta muy severas que incluso pueden
provocar la muerte. Estas reacciones adversas no siempre son registradas y reportadas en
forma adecuada, por lo tanto los riesgos de la transfusin deben ponderarse en comparacin
con los beneficios teraputicos esperados. Por todo esto el personal de salud debe ser capaz
de reconocer y manejar las diferentes reacciones adversas de la transfusin y emplear los
medios disponibles para eliminar o minimizar tales riesgos al paciente.
Anticuerpos irregulares
Las normas de Banco de Sangre establecen que debe practicarse la investigacin de

anticuerpos irregulares en el suero de:
Donadores de sangre.
Candidatos a recibir transfusin.
Mujeres embarazadas, para detectar anticuerpos que puedan causar enfermedad
hemoltica del recin nacido o discrepancias en las pruebas cruzadas en el momento
del parto, en caso de que la paciente requiera ser transfundida.
Para aclarar discrepancias del sistema ABO.
En el estudio de reacciones hemolticas transfusionales.
En el estudio de anemia hemoltica autoinmune.
186
En los donantes, la investigacin tiene por finalidad detectar anticuerpos irregulares
para prevenir su transferencia al receptor. Las normas de la Asociacin Americana de
Bancos de Sangre recomiendan especialmente, que esta prueba debe realizarse en aquellos
donantes con historia de transfusiones anteriores o embarazos.
En los receptores de sangre, la prueba cruzada, como prueba pretransfusional
completa, acorta y facilita la transfusin, dndole mayor seguridad.
El estudio pretransfusional de rastreo de anticuerpos irregulares es habitual para
determinar la existencia de anticuerpos contra otros antgenos diferentes a los
comprendidos en el sistema ABO. Para esto se estudian anticuerpos contra eritrocitos de
grupo O, para los cuales no se espera aglutinacin por anticuerpos anti-A o anti-B, pero si
puede haber aglutinacin por otro tipo de anticuerpos.
A estas clulas O se les denomina Clulas Panel, pues son una mezcla de
eritrocitos y antgenos conocidos. Al conjunto de reactivos de eritrocitos con un fenotipo
conocido se le conoce como Panel de anticuerpos irregulares, los antgenos para los cuales
son tipados los eritrocitos de estos paneles siempre se indican en una Tabla de trabajo que
acompaa a cada lote de reactivo.
El empleo del Panel es para realizar una identificacin de anticuerpos irregulares
presentes en un receptor y descubrir su especificidad. Tras la identificacin del anticuerpo
irregular presente, se debe elegir para el paciente una unidad de sangre negativa para el
antgeno correspondiente al anticuerpo inesperado identificado.
187
Fundamento
En la membrana del eritrocito se encuentra una gran variedad de antgenos de grupo

sanguneo, pertenecientes a varios sistemas.
La determinacin de la presencia o ausencia de anticuerpos del receptor presentes en
su suero, dirigidos contra los antgenos eritrocitarios del panel para determinar su
especificidad, se ponen en evidencia al formarse el complejo Ag-Ac, el cual puede
observarse como aglutinacin o hemlisis.
Gradilla para tubos de ensayo
Centrfuga
10 15 tubos de ensayo de 13x100 mm preferentemente limpios y secos
Pipetas Pasteur
Bao mara a 37C
Carta control del panel de trabajo, la cual cambia cada 15 das (Solicitar al asesor)
Reactivos
LISS (Solucin de Baja Fuerza Inica: NaCl 0,03 M y glicina 0,3 M)
Reactivo de antiglobulina humana poliespecfico (Coombs)
Solucin salina fisiolgica (0,85%)
Panel de clulas de fenotipo conocido (Antgenos conocidos en los eritrocitos)
Suero problema proporcionado por el asesor (Ac irregular desconocido)
Eritrocitos sensibilizados para el control de Coombs
Procedimiento
1. Numerar 10 tubos de 13 x100 mm (1 al 10).

2. Colocar en cada tubo 2 gotas del suero problema, usando una pipeta Pasteur.
3. Agregar en cada tubo una gota de eritrocitos del correspondiente frasco del panel.
Ejemplo: en el tubo 1, agregar una gota de clulas del frasco identificado como el
No. 1 (frasco de clulas) y as sucesivamente hasta el final.
4. Mezclar cada tubo (1 al 10) y centrifugar a 3400 rpm por 20 segundos.
5. Observar cada tubo para detectar hemlisis en el sobrenadante. Leer la aglutinacin
en cruces y anotar los resultados, tubo en mano (figura 42).
Nota: Si algn tubo presenta aglutinacin o hemlisis en alguno de los pasos, anotarlo y
eliminarlo; continuar el procedimiento con los dems.
6. Incubar a 37C durante 15 minutos.
7. Centrifugar a 3400 rpm por 20 segundos. Si hay hemlisis o aglutinacin, anotar
tubo en mano los resultados en cruces.
8. Lavar todos los tubos restantes (los que continan siendo negativos) 4 veces con
solucin salina fisiolgica de la siguiente manera: Agregar 3 mL de solucin salina
fisiolgica, resuspender y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos, eliminar el
sobrenadante, volver a agregar 3 mL de solucin salina fisiolgica, repitiendo el
procedimiento 4 veces.
188
9. Eliminando el ultimo sobrenadante y secando las clulas invirtiendo el tubo
completamente vertical (sin miedo de perder las clulas restantes) sobre un papel
absorbente. Agregar a cada tubo 2 gotas de reactivo de antiglobulina humana
poliespecfico (Coombs).
10. Mezclar, centrifugar a 3400 rpm durante 20 segundos, leer la aglutinacin y anotar
tubo en mano los resultados en cruces (si algn tubo va resultando aglutinado o con
hemolisis anotarlo y eliminarlo).
11. Comprobar los resultados negativos, haciendo la prueba de control de Coombs
(consumo de Coombs) y anotar los resultados.
12. Control de Coombs. A los todos los tubos que resultaron negativos hasta la prueba
de Coombs, se apartan y se les agrega 1 gota de eritrocitos sensibilizados a cada
uno.
13. Mezclar, centrifugar a 3400 rpm durante 20 segundos, leer la aglutinacin. Todos
los tubos deben de resultar positivos.
Es extremadamente importante leer cuidadosamente cada reaccin y registrarla en

cruces, pues ello puede ser de gran ayuda para la interpretacin de una reaccin por efecto
de dosis o de mltiples anticuerpos con ttulos diferentes (Figura 42).
Interpretacin de los resultados
Una forma rpida y sencilla para la interpretacin del panel es el estudio de

exclusin o descarte de posibles anticuerpos, basado en la no reactividad del anticuerpo con
aquellas clulas del panel que poseen determinados antgenos. Es decir, si el suero no
reacciona con una determinada clula del panel en todas las fases de la prueba, significa
que el o los Ac presentes en el suero no estn dirigidos contra los antgenos presentes en
esa determinada clula. En cambio, el anticuerpo tendr especificidad contra el o los
antgenos que estn en las clulas que resulten aglutinadas.
El primer paso para la interpretacin del panel es observar el autocontrol, que son
las clulas del paciente suspendidas en su propio suero y tratadas en la misma forma que el
resto de las clulas del panel. Si el autocontrol es negativo, sirve de comparacin para otras
clulas del panel que no reaccionen, o que reaccionen en forma muy dbil. Si es positivo,
permite igualmente compararlo en diferentes fases con las clulas que aglutinen. (El
autocontrol no se realizara ya que el asesor solo proporcionara el suero problema).
Actividades
Analizar los resultados en base al ejemplo presentado.
Reportar los resultados de igual manera que la Tabla 42.
Anexar la carta control.
Ejemplo
Todos los paneles de eritrocitos conocidos traen anexo una carta en la que se
proporcionan los antgenos que contiene cada una de las clulas que forman el panel. Para
este ejemplo se emplea una carta descriptiva para 11 tubos de DiaMed-ID (Tabla 42).
La identificacin de un solo Ac puede realizarse por simple observacin de los
resultados positivos y negativos.
189
Usando el panel, cuya carta descriptiva se da en la Tabla 42, se obtuvieron los
siguientes resultados para el suero problema: reaccin positiva en los tubos 3 y 5. En la
Tabla 43 se da un ejemplo de cmo anotar los resultados obtenidos.
Tabla No. 42. Carta control de DiaMed-ID para una prueba de 11 tubos.
0 = Antgeno ausente + = Antgeno presente
Tabla No. 43. Resultados del enfrentamiento del suero problema con el Panel de clulas de
la Tabla anterior.
Donador... Fecha..
Grupo sanguneo y Rh. Interpretacin (anticuerpo encontrado).
Reviso.
Tubo Sol. salina o Coombs Consumo de Resultados
LISS a Coombs
37C/15
1 0 0 0
2 0 0 0
3 + + Positivo (37c)
4 0 0 0
5 + + Positivo (37C)
6 0 0 0
7 0 0 0
8 0 0 0
9 0 0 0
10 0 0 0
11 0 0 0
0 = Antgeno ausente + = Antgeno presente
190
Se compara este esquema de resultados, con la carta descriptiva (Tabla 44)
buscando si hay alguna columna que tenga un esquema o patrn igual. En este caso la
columna E tiene el mismo patrn que el suero problema (Tabla 43).
Tabla No. 44. Carta control del Panel comparada con los resultados del problema.
Para rectificar se hace reaccionar las clulas problema en suero anti-E; no debe
haber reaccin, puesto que estas clulas deben ser E negativas y por tanto no deben tener el
antgeno E, por lo cual formaron el anticuerpo anti-E.
Presencia de varios anticuerpos. Siempre debe tenerse en mente que un suero puede
tener ms de un anticuerpo. Por ejemplo, es bastante comn encontrar sueros que tienen
anti-E y anti-c, o bien, anti-c y anti-e. En estos casos el patrn del suero problema no
coincide con ninguno de los patrones sealados en la carta descriptiva. Se observan
reacciones de intensidad variable, independientemente del fenmeno de dosis.
191
BANCO DE SANGRE Y LAS PRUEBAS CRUZADAS
La prueba de compatibilidad es un proceso de laboratorio que permite conocer si

existe compatibilidad serolgica entre la sangre de un donante y la de un receptor.
La metodologa vara segn los recursos del servicio y la urgencia del caso, aunque
de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana (NOM-003-SSA-1993) siempre debe incluirse la
tcnica de la antiglobulina humana como mnimo. El procedimiento debe ser lo ms simple
posible, sin comprometer la exactitud, porque la complejidad aumenta el riesgo de cometer
errores.
Existen varios mtodos, algunos de los cuales son muy sensibles a ciertos tipos de
anticuerpos; sin embargo la prueba ms importante es la prueba cruzada, pues incluye la
realizacin de una serie de procedimientos que tienen como finalidad asegurar al paciente
los mayores beneficios de la transfusin.
Tanto la prueba de compatibilidad como la prueba cruzada mayor tienen como
objetivos:
a) Garantizar que los eritrocitos a transfundir son ABO compatibles con el receptor.
b) Detectar anticuerpos en el suero del receptor que estn dirigidos contra antgenos
presentes en los eritrocitos del donante.
Ambas pruebas tienen sus limitaciones y entre ellas podemos sealar las siguientes:
No garantizan la sobrevida normal de los eritrocitos transfundidos.
No previenen la inmunizacin del receptor.
No detectan todos los errores en la clasificacin del sistema ABO.
No detectan errores en la clasificacin del factor Rh en el donante o en el receptor, a
menos que el suero contenga anticuerpos anti-Rh.
No previenen reacciones hemolticas tardeas, secundarias a respuestas anamnsticas
a antgenos contra los cuales el paciente haba sido previamente inmunizado, pero
cuyos anticuerpos no eran demostrables en el momento que se practicaron las
pruebas.
No detectan anticuerpos antileucocitarios, antiplaquetarios o contra protenas del
suero (IgG, Gm, etc.).
No previenen reacciones febriles o alrgicas provocadas por la sangre transfundida.
No detectan errores secretariales o administrativos.
Por ltimo, no detectarn anticuerpos a menos que el procedimiento sea practicado
correctamente y que el suero y las clulas hayan sido adecuadamente preparados.
La prueba de compatibilidad es una prueba analtica de laboratorio que comprende

una serie de procedimientos que deben ser realizados cuidadosamente para que la
transfusin de sangre sea segura. Internacionalmente se han establecido los siguientes
procedimientos:
Solicitud del producto y datos relevantes del paciente (receptor).
Identificacin y recoleccin de las muestras sanguneas del receptor.
Estudios y pruebas del donador.
Determinacin de los antgenos ABO/Rh del receptor.
Deteccin de anticuerpos irregulares en el receptor.
Seleccin de componentes ABO/Rh apropiados para el receptor.
192
Realizacin de pruebas cruzadas.
Comparacin entre resultados actuales y el historial de las pruebas transfusionales
realizadas con anterioridad (en caso de que existan).
Reidentificacin y control clnico del receptor.
Pruebas cruzadas
Antes de realizar esta prueba, se debe verificar que la muestra de sangre del receptor
y del donante estn correctamente identificadas, clasificadas y que los resultados estn
anotados en el registro de transfusiones.
Si en el estudio del receptor se identifican discrepancias en la determinacin del
sistema ABO/Rh y Coombs directo, ests deben resolverse antes de proceder a la prueba
cruzada. Cuando por razones clnicas es necesario efectuar la transfusin antes de resolver
algn problema, deber seleccionarse el grupo ABO y Rh que no represente un riesgo para
el paciente. Por ejemplo, si existen dudas en la determinacin del antgeno D, debe usarse
sangre Rh negativo; pero si la discrepancia se presenta con el sistema ABO, la sangre
seleccionada deber ser del grupo O.
Vale la pena sealar que si la prueba cruzada mayor es importante para la
transfusin, no menos lo es la prueba de deteccin de anticuerpos.
Considerando que el 90% de los anticuerpos clnicamente significantes pueden ser
demostrados en los procedimientos de deteccin (cuando stos se realizan correctamente),
entonces, la prueba cruzada mayor tendra tres objetivos:
1. Confirmar una vez ms que existe compatibilidad ABO entre receptor y donante.
2. Detectar un anticuerpo en el suero del paciente que no se demostr en la prueba de
deteccin, porque el correspondiente antgeno no estaba presente en las clulas
detectoras o clulas pantalla (Panel).
3. Cumplir con las regulaciones que establecen las organizaciones de banco de sangre
y las legislaciones de los diferentes pases.
Tradicionalmente, la prueba cruzada se ha realizado en dos partes, sin embargo

consta de tres partes:
a) Prueba cruzada mayor: Consiste en mezclar el suero del receptor con los
eritrocitos del donante.
b) Prueba cruzada menor: Detecta anticuerpos irregulares en el suero del donador y
ratifica algn error de clasificacin ABO/Rh. Consiste en mezclar suero del donante
con los eritrocitos del receptor.
c) Prueba autotestigo: Permite detectar una prueba antiglobulina directa positiva, as
como la presencia de rouleaux y otras reacciones autoinmunes. Se realiza con una
gota de eritrocitos lavados del receptor ms dos gotas de suero del receptor.
Como su nombre lo expresa, la prueba cruzada mayor es mucho ms importante
para la seguridad de la transfusin, que la prueba menor.
193
Los Bancos de Sangre y los componentes de transfusin sangunea
El servicio de Banco de Sangre asegura que la recoleccin, procesamiento y

transfusin de sangre y componentes sanguneos se realicen de acuerdo a los
requerimientos especificados.
La valoracin riesgo/beneficio es la primera premisa del Banco de Sangre. La mejor
manera de evitar riesgos transfusionales es no transfundir en situaciones no indicadas. Por
lo cual la responsabilidad del banco de sangre es el asegurar la entrega de componentes
sanguneos idneos para cada receptor, esta responsabilidad implica el entregar unidades de
componentes con el mnimo riesgo de inmunizacin, asegurando de este modo que no
existe un riesgo de discrepancia y reaccin transfusional importante.
Actualmente la medicina transfusional es posible gracias a la donacin de sangre, la
cual puede emplearse como unidad total o fraccionarla en sus diferentes componentes, los
principales componentes sanguneos se mencionan a continuacin:
A. Sangre total: Una unidad de sangre total tiene un volumen aproximado de 520 mL
(450 mL de sangre + 60-70 mL de solucin anticoagulante conservadora). El
hematcrito medio es de 36-40%. Su vida de almacenaje es de aproximadamente 35
das a una temperatura de 1-6C.
B. Concentrados de hemates: Se preparan a partir de sangre total mediante
sedimentacin o centrifugacin. Deben tener como mnimo, una cantidad de Hb de
45g/unidad y un hematcrito del 70-80%, en un volumen de 250-350 mL.
Habitualmente se conservan a 4C (1-6C) durante 35 o 42 das dependiendo de la
sustancia conservadora empleada. Si se congelan se almacenan en glicerol a -40C
durante 10 aos.
C. Concentrado de plaquetas: Consisten en plasma rico en plaquetas separado de la
sangre dentro de las 6 horas siguientes a su recogida. Cada unidad contiene 5.5x1010
o ms plaquetas, el volumen depende de la temperatura de conservacin, 50 mL si
se mantiene a 22C y 20 mL si se conserva de 2-6C. Pueden conservarse durante 5
en agitacin constante.
D. Plasma fresco congelado: Se separa de la sangre total y se debe congelar dentro de
las 6 horas posteriores a su recogida. El volumen es de 225-250 mL. Se almacena
congelado entre -30 a -70C por un periodo de un ao.
E. Crioprecipitado: Debe prepararse dentro de las primeras 6 horas despus de la
extraccin. Contiene FVIII y FvW. Cada unidad tiene en promedio 80 UI de factor
VIII y al menos 250 mg de fibringeno. El volumen es de 10-15 mL y se almacena
congelado entre -30 a -70C durante un ao; despus de descongelado dura 4 horas.
194
Fundamento
La prueba de compatibilidad permite conocer si existe compatibilidad serolgica

entre la sangre de un donante y la de un receptor. Este procedimiento incluye la prueba
cruzada, que consiste en poner en contacto el suero del receptor con eritrocitos del donante
(prueba cruzada mayor) y eritrocitos del receptor con suero del donante (prueba cruzada
menor). Esta prueba es requerimiento fundamental, porque es la mejor manera de detectar
anticuerpos que puedan daar los eritrocitos transfundidos y causar una reaccin hemoltica
transfusional. La incompatibilidad de las sangres puede provocar desde una simple
aglutinacin hasta una reaccin hemoltica, por tanto la seguridad del paciente depende no
solo de que las tcnicas se realicen de forma adecuada, sino tambin de la debida
identificacin de grupos sanguneos de receptor y donador.
Sangre venosa anticoagulada de un donante y de un receptor
Suero del donante y del receptor
Suspensin de eritrocitos al 5% del donante y del receptor
Pipetas Pasteur con bulbo
Centrfuga
Bao Mara a 37C
Termmetro
Reactivos
Solucin salina fisiolgica al 0,85%
Suero de Coombs
Eritrocitos sensibilizados
Procedimiento
PRUEBA CRUZADA MAYOR
1. Seleccionar un donante y un receptor a los cuales ya se les ha realizado la

verificacin de los antgenos ABO/Rh.
2. Recolectar sangre venosa en dos tubos, uno de tapn lila y uno de tapn rojo para el
donante (D) y realizar el mismo procedimiento para el receptor (R). Asegurarse de
identificar correctamente los cuatro tubos.
3. A partir de las muestras de tapn lila del donador (D) y del receptor (R), preparar
una suspensin de eritrocitos al 5% respectivamente.
4. Centrifugar ambos tubos de tapn rojo para obtener el suero del donante (D) y del
receptor (R).
Fase I
5. Identificar un tubo de 13x100mm como prueba mayor (PM) y colocar en el, 2 gotas
de suero del receptor (SR).
6. Agregar una gota de suspensin de eritrocitos al 5% del donador (D) y centrifugar a
3400 rpm/15 o a 1000 rpm/1 (asegurarse que las pipetas empleadas para agregar
195
las clulas y el suero sean del mismo calibre, con el fin de mantener la proporcin
de suero a clulas en 2:1).
7. Observar el sobrenadante para detectar hemlisis. Desprender suavemente el tapn
de clulas del fondo del tubo para observar si hay aglutinacin. Anotar el resultado
tubo en mano.
Fase II
8. Si el tubo resulta negativo, mezclar e incubar 15 minutos a 37C.
9. Centrifugar segn las normas (centrifugar a 3400 rpm/15 o a 1000 rpm/1),
observar el sobrenadante para evidenciar la hemlisis, desprender suavemente el
tapn de clulas del fondo del tubo y anotar los resultados, tubo en mano.
Fase III
10. Si el tubo contina negativo, lavar los eritrocitos 4 veces con solucin salina. Aadir
solucin salina hasta partes del tubo, mezclar y centrifugar a 3000 rpm durante 2
minutos.
11. Despus del cuarto lavado y habiendo desechado el ltimo sobrenadante, agregar 2
gotas de reactivo de Coombs poliespecfico y mezclar.
12. Centrifugar inmediatamente y leer desprendiendo suavemente el botn de clulas.
Examinar si hay aglutinacin, emplear ayuda visual (lupa, microscopio u otro) en
caso de resultados negativos.
13. Anotar el resultado tubo en mano.
14. Si la prueba resulta negativa, aadir al tubo una gota de clulas control de Coombs,
centrifugar, leer y anotar los resultados. Esta prueba debe ser positiva, de lo
contrario, los resultados no son vlidos y el procedimiento debe repetirse por
completo.
PRUEBA CRUZADA MENOR
1. Identificar un tubo de 13x100mm como prueba menor (Pm) y colocar en el, 2 gotas
de suero del donador (SD) y 1 gota de suspensin de eritrocitos al 5% del receptor
(ER). Proceder de la misma forma que para la prueba mayor.
AUTOCONTROL
Es una prueba adicional que se realiza paralelamente con las pruebas cruzadas.
Consiste en agregar en un tercer tubo debidamente identificado (AC):
1. Dos gotas de suero del receptor (SR).
2. Una gota de suspensin de eritrocitos al 5% del receptor (ER).
3. Procesar simultneamente con la prueba mayor (PM) y la prueba menor (Pm),
siguiendo el mismo procedimiento aplicado.
Este paso permite detectar una prueba de antiglobulina directa positiva, as como la
presencia de rouleaux y otras anormalidades sricas que puedan causar problemas en la
prueba mayor. Algunos centros realizan como parte del estudio del receptor la prueba de
antiglobulina directa, suprimiendo el autocontrol en la prueba cruzada.
196
Interpretacin
Se considera que existe compatibilidad si no se visualiza hemlisis o aglutinacin

en ninguno de los pasos de la prueba. Sin embargo el hecho de que la prueba sea
compatible no garantiza que el suero del donador este exento de anticuerpos eritrocitarios
clnicamente significativos; slo indica que no se encuentran anticuerpos reactivos contra
las clulas del receptor.
Cuando la prueba cruzada sea positiva (incompatible) pero exista aglutinacin o
hemlisis en la prueba autocontrol, el problema debe ser identificado. Si existen
aloanticuerpos inesperados presentes en el suero del receptor estos deben ser identificados
para usar el antisuero correspondiente y as confirmar que los eritrocitos del donador
carecen del correspondiente antgeno.
Las pruebas cruzadas tambin pueden presentar incompatibilidad cuando hay
presencia de autoanticuerpos, interacciones adversas con reactivos o por la formacin de
rouleaux, en todos estos casos el problema debe ser identificado y resuelto antes de entregar
la sangre para transfusin.
197
Tabla No. 45. Diagrama de procedimientos en las pruebas cruzadas
Fase I Fase II Fase III Resultado
Prueba mayor (PM): Tubo PM Al mismo tubo PM Al mismo tubo PM agregar: Si no se visualizo
Suero del receptor (SR) y 2 gotas SR + 1 gota ED agregar: 2 gotas de Coombs hemlisis o aglutinacin
eritrocitos del donador (ED) Aglutinacin y/o hemlisis: 2 gotas albmina Aglutinacin y/o hemlisis: en alguna de las fases:
Negativo bovina / Incubar 15 Negativo Compatibilidad
Positivo: En este a 37C Positivo: En este
punto se termina la Aglutinacin y/o punto se termina la
prueba hemlisis: prueba.
Negativo
Positivo: En
este punto se
Prueba menor (Pm): Tubo Pm Al mismo tubo Pm Al mismo tubo Pm agregar: Si no se visualizo
Eritrocitos del receptor 2 gotas ER + 1 gota SD agregar: 2 gotas de Coombs hemlisis o aglutinacin
(ER) y suero del donador Aglutinacin y/o hemlisis: 2 gotas albmina Aglutinacin y/o hemlisis: en alguna de las fases:
(SD) Negativo bovina / Incubar 15 Negativo Compatibilidad
Positivo: En este a 37C Positivo: En este
punto se termina la Aglutinacin y/o punto se termina la
Negativo
Positivo: En
este punto se
Autocontrol (AC): Tubo AC Al mismo tubo AC Al mismo tubo AC agregar: Cuando la prueba es
Suero del receptor (SR) y 2 gotas SR + 1 gota ER agregar: 2 gotas de Coombs positiva, permite detectar
eritrocitos receptor (ER) Aglutinacin y/o hemlisis: 2 gotas albmina Aglutinacin y/o hemlisis: una prueba de Coombs
Negativo bovina / Incubar 15 Negativo directa positiva,
Positivo: En este a 37C Positivo: En este interaccin adversa con los
punto se termina la Aglutinacin y/o punto se termina la reactivos o rouleaux.
Negativo
Positivo: En
198
este punto se

Manual Hematologia

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Manual Hematologia

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual Hematologia

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

MDULO I

La sangre es una suspensin de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en un lquido de

Sal disdica, dipotsica o tripotsica del cido etilendiaminotetraactico, actuando

Es un anticoagulante fisiolgico que acta impidiendo que la protrombina se

Citrato trisdico (C6H5O7Na3)

Acta impidiendo que el calcio se ionice, evitando as la coagulacin. Se utiliza para

Oxalato sdico (Na2C2O4)

Acta mediante la precipitacin del calcio como oxalato de calcio (CaC2O4),

Oxalato de amonio y potasio [(NH4)2C2O4:K2C2O4]

Soluciones anticoagulantes conservadoras

Los factores ms importantes que influyen sobre la recuperacin eritrocitaria en la

Anticoagulante Concentracin Proporcin Pruebas Pruebas no Ventajas Desventajas

Oxalato de 0.1 M 0.1 M/mL de -Pruebas de -Nitrgeno en -Soluble. -Altera la permeabilidad

Muchas pruebas no requieren el ayuno, pero es preferible que los pacientes no

Especmenes capilares o cutneos

Debido a que este tipo de sangre difiere ligeramente en la composicin de la sangre

Fig. 1. Venas del antebrazo (dos incidencias)

Las lneas punteadas indican la

Fig. No. 2. Sitios de puncin cutnea (sangre capilar).

Fig. No. 3. Principales sitios de puncin arterial

Instrumentos para recoleccin

Se emplea como barrera contra el flujo de sangre venosa, con el objetivo de

La solucin asptica ms comn es el alcohol isoproplico al 70%. Debe aplicarse

Son sistemas integrados por un cilindro graduado en mililitros, un embolo y una

Fig. No. 4. Esquema de una jeringa

Sistema al vaco (Figura 5)

1. Agujas: Son estriles y presentan varias longitudes y anchos (calibre o apertura).

Fig. No. 5. Elementos empleados en los sistemas al vaco.

Tabla No. 2 Cdigo de colores para tubos al vaco

Los tubos Microtainer (Figura 7) estn destinados a la extraccin, transporte y

Fig. No. 7. Tubo Microtainer.

Actualmente se recomienda evitar el uso de la jeringa debido al elevado riesgo de

A. Mtodo de tubos al vaco2:

En el caso de que slo se requiera muestra para pruebas de coagulacin por el

Los resultados de un examen de laboratorio como toda prueba analtica consisten de

1. Preparar la orden de ingreso.

Adquirir los conocimientos para la adecuada recoleccin de sangre y las

En el macro y micro mtodos se centrifuga una columna de sangre dentro de un

1. Recolectar 5 mL de sangre venosa con anticoagulante.

1. Mezclar la sangre por inversin del tubo.

A nivel de la ciudad de Mxico los valores de referencia oscilan entre:

Agrupacin Mexicana para el Estudio de la Hematologa (AMEH)

En la realizacin de esta prctica, se proceder a efectuar solamente el Micromtodo

Los resultados se expresan como milmetros de plasma transparente que quedan en

Dado que la sangre es una suspensin de elementos formes en plasma, cuando se

No se han establecido muchos aspectos de la VSG. Est demostrado que es mayor

Realiza la determinacin del hematcrito (Macromtodo).

Se busca la lnea horizontal que corresponde a los milmetros de sedimentacin en

La hemoglobina es la protena eritrocitaria intracelular encargada del transporte de

Los mtodos empleados en hemoglobinometra pueden agruparse en cuatro clases

En 1967, el ICSH recomend emplear el mtodo colorimtrico de la

La sangre se hemoliza por agregado de un agente tensoactivo. Se emplea una

La absorbancia de la cianometahemoglobina a 540 nm es directamente proporcional

Preparacin de la curva estndar de Hb

1. Realizar las diluciones en 6 tubos de ensayo de 13 x 100 mm como se muestra en la

2. Colocar las diferentes diluciones de los tubos en celdas espectrofotomtricas.

251 = dilucin de sangre

1. Recolectar 5 mL de sangre venosa en un tubo con tapn lila y mezclar por

Determinar la concentracin de hemoglobina en g/dL a cada una de las diluciones