Desarrollo de Modelos Cinéticos para Bioprocesos Xantano
Desarrollo de Modelos Cinéticos para Bioprocesos Xantano
Desarrollo de Modelos Cinéticos para Bioprocesos Xantano
*530986438X
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
5 1
MEMORIA
que para optar al
GRADO de DOCTOR
presenta:
Al Profesor D. Pedro Lus y Luis, por su categora cient{flea y humana, por sus
buenos consejos y nimos desde el princz~io de esta Tesis Doctoral.
A la Dra. Aurora Santos y al Dr. Jose Antonio Casas por estar siempre
dispuestos a echarme una mano yfacilitar mi trabajo.
A Jose Carlos y a David, con quienes he compartido estos dos ltimos aos de
tesis, gracias por su sincera amistad y la ayuda que me han brindado. Gracias por el
buen humor y las risas de cada da.
A mi madre por sus mimos, paciencia y gran impulso, para continuar gracias
por todo.
Y, por supuesto, a mi padre, que fue el que ms me anim para empezar con
esta Tesis, casi con ms ilusin que yo. Gracias por tu sacrcio,por tu enseanza y
por tu cario.
INDICE
Pgina
1.- INTRODUCCIN 1
1.1.- OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO 10
1.2.- MODELOS CINETICOS 12
1.2.1.-Modelos Cinticos No Estructurados, No Segregados 12
1.2.1.1.- Modelos No Estructurados del Crecimiento 13
1.2.1.2.- Modelos de Consumo de Sustratos y Formacin de 18
Productos.
t.2.1.3.- Influencia de las Variables en los Parmetros /9
1.2.2.- Modelos Metablicos 24
1.2.3.- Modelos Estructurados o de Clula 30
1.2.3.1.- Modelos Compartimentados 30
1.2.3.2.- Modelos de Clula 35
1.2.4.- Modelos Qumicamente Estructurados 38
1.2.5.- Modelos Segregados 39
1.2.6.- In2eniera Metablica 43
1.3.- GOMA DE XANTANO 47
1.3.1.- Xanthomonas campestris 56
1.3.2.- Produccin de Xantano 59
1.3.3.- Transporte de Oxgeno 67
1.3.4.- Aislamiento y Purificacin 74
1.3.5.- Propiedades del Xantano 78
i
Pgina
2.3.- REALIZACIN DE UN EXPERIMENTO /08
2.4.-MEDIDA DE COMPONENTES EXTRACELULARES 110
2.4.1.-Anlisis de Biomasa lO
2.4.2.- Medida de la Concentracin de Sustrato Carbonado /1/
2.4.3.- Medida de la Concentarcin de Sustrato Nitrogenado /13
2.4.4.- Anlisis de Xantano 114
2.5~ ANLISIS DE COMPONENTES INTRACELULARES lId
2.5.1.- Anlisis de Componentes Intracelulares por
Espectrofotometra de Absorcin /18
2.5.1.1.- Anlisis de Protenas /18
2.5.1.2.- Anlisis de cidos Nucleicos /21
2.5.2.- Tcnicas dc Fluorescencia /25
2.6.- MTODOS MATEMTICOS 135
2.6.1.- Tcnicas de Estimacin de Parmetros 135
2.6.2.- Simulacin con los Modelos Cinticos 137
iii
P2ina
iv
1.- INTRODUCCIN
Introduccin
1.- INTRODUCCIN
Los procesos llevados a cabo con microorganismos han llegado a ser una fuente
importante de numerosos productos comerciales, principalmente en la industria
farmacutica y alimentaria, pero tambin en otras industrias, tales como la cosmtica, el
anlisis clnico y qumico, en la biorremediacin con fines ambientales, etc.
1
Jntroduccwn
- Transporte de nutrientes o productos desde el seno del gas hasta la interfase gas-
lquido.
- Intercambio en la interfase gas-lquido.
- Transporte desde la interfase al seno de la fase lquida.
- Transpone a travs de la fase lquida.
- Transporte a travs de la pelcula de lquido que rodea la clula.
- Transporte a travs de la membrana o pared celular.
- Transporte en el interior de la clula, hasta el lugar donde se produce la reaccin
bioqumica.
Este sistema puede generalizarse a otros donde la fase continua no sea un lquido
sino un gas, e incluso, en casos especiales, puede ser un slido (fermentaciones en
estado slido, de compostaje, por ejemplo) y la fase dispersa una o ms de las
siguientes:
- Slidos, tales como clulas, partculas con enzimas soportadas y sustratos slidos.
- Lquidos, tales como sustancias insolubles.
- Gases, como aire, dixido de carbono y metano.
3
Introduccin
4
Introduccin
Po2
tG
Interfase Gas-Lquido
Membrana
lA8
ni o:
o o: Co2
Gr
4
o:
o 4
0 o
Gfl 4:
4
4 o
u
4 ni 4: Gr
Figura 1.1.- Esquema de las resistencias en el transporte de oxgeno desde el gas hasta el
microorganismo, o la fase slida con enzima o clulas inmovilizadas.
5
Introduccin
6
Introduccin
DNA
A TP
RNA hexosa Nucletidos Glicsidos
A
Nudetidos Triglicridos
Desoxinucletidos Pentosa Triosa Glicerol U,iidos membrana
41
MX
NADA Purinas
Pirbnidinas
Histidina
Tirosina
Triptofano Tetrosa P-Gticerato Serbia fr01cina
+
Fosfoenolpiruvate
$
Cisteina
Porfirinas, etc.
Glutamina
A cido Flico
p-aminobenwato Piruvato
p-hidroxibenzoato
cidos grasos, Lpidos,
Poliqutidos
Quit,J respiratoria
4
Carotenoides, Terpenos
}
Treonina Arginina
so/encina Pretina
1! etionina
Lisina
Giutamato
Succinato < 2-Oxoglutarato
1fr Glutamina
sI!
Porjirinas Transferencia
NH t
4
Figura 1.2.- Esquema general de las rutas anablicas y del catabolismo central
-7
Introduccin
9
Introduccin
Los modelos que se van a proponer a lo largo de esta Tesis Doctoral son de diferente
grado de complejidad. El primer paso es comenzar por un modelo sencillo, de los conocidos
como no estructurados, pues desde un punto de vista tcnico tiene sentido iniciar un
estudio de este tipo con los modelos cinticos ms sencillos. Adems, el abordaje, tanto
experimental como matemtico, es relativamente asequible, lo que hace que el primer
planteamiento al comenzar a modelizar un sistema sea con modelos de este tipo. Se
determinar si este modelo es suficiente para la descripcin del sistema, para lo cual se
estudiar la influencia de dos variables sobre la evolucin de los parmetros del modelo
(temperatura y concentracin de nitrgeno inicial). En caso de que no exista una relacin de
parmetros con las variables a estudiar, se modificar el modelo planteado de modo que
sea capaz de tener en cuenta la evolucin de los parmetros con la variable, y as poder
obtener una relacin en funcin de la variable estudiada. En caso de no ser suficiente este
modelo se ir complicando hasta [legar a modelos estructurados, que, si bien ms
complejos, se acercan ms a la realidad, es decir tienen ms sentido fisiolgico.
10
Introduccin
Finalmente ser necesario desarrollar una metodologa para hacer frente a la dificil
tarea de proponer y aplicar modelos cinticos estructurados. Hay que tener en cuenta que
apenas hay antecedentes en la literatura en cuanto a la propuesta de este tipo de modelos, y
no se encuentra ajuste de datos experimentales, y el consiguiente clculo del valor de los
parmetros, ni, desde luego, la relacin de los valores de los parmetros en diferentes
experimentos realizados en condiciones diversas.
11
introduccion
A continuacin se realiza una breve revisin sobre los diferentes tipos de modelos
cinticos planteados en la literatura de acuerdo a la clasificacin comentada en la Tabla 1.1.
12
Introduccin
Lisis celular
Energia de Mantenimiento
CELULAS NO
VIABLES
PRODUCTOS
Respiracin Endgena
/3
Introduccwn
dC~
____ = C~. 1 cx [1.2]
di C~.
14
Introduccin
dt y(C5).Q~ [1.3]
4Cs)11m.iCs>It,nB
[1.4]
Cs
B
donde B es una constante. Este modelo plantea que hasta que la concentracin de sustrato
no haya llegado a cierto valor no influye en el crecimiento y se puede aplicar la ley de
Malthus.
di
proponiendo, por primera vez, una relacin estequiomtrica entre la velocidad de consumo
del sustrato y la de produccin de biomasa:
15
fu trod;tccwjj
siendo:
C~ =C~ Y~ C8 [1.9]
El modelo propuesto por Monod est formado por las ecuaciones [1.7] y [1.11]. Este
modelo se simplifica en las siguientes condiciones particulares:
dC~ _
K5 C5 ~. ____ p 45 [1.12]
di
K ~ d~i% Mm c .cj [1.13]
16
Introduccin
Inhibicin por sustrato, fue propuesto por Wayman y Tseng (1976); estos autores
consideran que existe una concentracin crtica de sustrato, por debajo de la cual no
se produce inhibicin del crecimiento.
7
introduccin
[1.4].
18
Introduccin
19
lnroducc tau
iH
k0, exp( RT
AH2 [1.19]
+ .exp( ----)
RT
P,n(PH) = [1.22]
20
Introduccin
dC0
+ 1 [1.25]
q7X
= K-i-? [1.28]
OQ Q
velocidades de produccin de cada uno de los compuestos que intervienen. En el caso de que
la expresin de velocidad de produccin del sustrato limitante del crecimiento se vea afectada
por la produccin, se tendrn que repasar las suposiciones realizadas para el planteamiento de
la expresin para describir el crecimiento. Esto es particularmente importante en el caso de
adoptar la ecuacin logstica, ya que esta ecuacin parte de la suposicin de que el crecimiento
y el consumo del sustrato limitante estn relacionados nicamente por un rendimiento
macroscpico o coeficiente estequiomtrico constante a lo largo de la transformacion.
Los modelos descritos hasta ahora, esto es, los modelos no estructurados sern
buenos cuando los microorganismos posean una composicin celular que est
aproximadamente en estado estacionario. No obstante, cuando tienen lugar cambios en la
composicin celular, los modelos no estructurados proporcionan, en la mayora de los casos,
una pobre aproximacin a la realidad. Es tambin lgico pensar que los modelos no
estructurados no sean capaces de reflejar la influencia de ciertas variables,
fundamentalmente la composicin del medio. Para estos casos se han propuesto un tipo de
modelos que tienen en cuenta cambios en la estructura interna del microorganismo y, en
casos muy complejos, nicamente modelos de este tipo sern capaces de explicar la
evolucin del cultivo.
22
Introduccin
ser tratable matemticamente y debe tener alta fidelidad en los procesos biolgicos,
teniendo que ser posible la verWcacin experimental del modelo
Este tipo de modelos plantea estructura slo para el metabolismo del o de los sustratos
carbonados, sin diferenciar panes en la biomasa, ya que la siguen considerando como en los
modelos no estructurados; es por ello que se pueden considerar como modelos no
estructurados-no segregados. Dentro de este tipo, existen modelos muy diferentes, muchas
veces propuestos para problemas muy especficos de forma terica (Van Dedem y Moo-
Young, 1973; Geraats y col., 1990; Bibila y Flickinger, 1991), realizando una simulacin a
partir de unos parmetros estimados de una manera que no siempre queda clara.
24
introduccin
Figura 1.4.- Esquema general de los modelos metablicos para la levadura Sacchoromyces
cerevisie, existentes en la literatura.
25
Introduccin
El modelo de Koga y col. (1969) plantea seis reacciones dentro del metabolismo de la
levadura Saccharomyces cerevisi, y que responderan al esquema planteado en la Figura 1 .4.:
- Glicolisis (rj:
5 + YTPO ADP -e~ YTP.G A TP
. + Y/RO . IR [1.29]
Respiracin (rR):
4 +r~i~,.>~ ATPr.up M
. .
[1.33]
YYID.R NADH + YITPR ADP+ ~2 >YVADR NAD .
Fermentacin (rF):
IR> YP,F P [1.341
Los autores proponen ecuaciones cinticas globales tipo Monod- para cada una de dichas
reacciones:
- Glicolisis:
cs ~ Cx
rrcma [1.35]
KATP + CATP
- Metabolismo anablico:
r2rA~.,~ KvCx
+?\; CTPCX [1.36]
26
Introduccin
- Metabolismo catablico:
rk0C TP C [1.37]
- Ciclo TCA:
C Pv
Cx [1.38]
KNAD+CrvAn Ka +Cp
- Respiracin~
- Fermentacin:
u6 k FC ~ ,~. [1.40]
Koga y col. (1969), no estiman los parmetros del modelo por ajuste de datos
experimentales sino que toman estos parmetros de la bibliografia, realizando de esta forma
simulaciones con el modelo.
El esquema de reaccin que plantean viene dado por el siguiente grupo de ecuaciones:
- Para el transpone del sustrato carbonado a travs de la membrana plasmtica, (ri):
[1.42]
- Transformacin del sustrato en el IR (r2):
S*~~>7p IR+y~ ATP [1.43]
27
Introl,.ccon -
Las ecuaciones cinticas que proponen estos autores tambin son tipo Monod:
C [1.47]
r~k ~
!K+C/ x
[1.48]
rskj <y
Kw + Cm
[1.49]
r4C4 Cii Cx
Km + Cii?
[1.50]
rs kv Ci Cx
La velocidad
r2, la obtienen a partir de la suposicin de estado pseudoestacionario para
Por lo tanto el modelo final viene dado por el siguiente grupo de ecuaciones
diferenciales (velocidades de produccin):
- Sustrato carbonado:
dC5
___ :t-I,I [1.52]
dt
Biomasa:
dC~
5 [1.53]
dt
28
Introduccin
- ffitermediario reducido:
dC15 =r~ .r, r3 r4 ~y, r5 [1.54]
di
- Oxgeno disuelto:
dC<, =3r, [1.55]
It
- ParaelATP:
dCTP =(~>~ +1)r4 +y~ .y~, ~~Y r5 [1.56]
dt
Como puede observarse el planteamiento del modelo es muy similar al de Koga y col.
(1969), pero este modelo es ms sencillo pues el nmero de componentes clave se ha reducido
a cinco en lugar de tener once como en el caso anterior.
,
Los parmetros del modelo de Barford se estiman, en todos los casos, a partir de datos en
bibliografa o tomando en consideracin datos experimentales, pero por mtodos particulares,
no por regresion.
De los modelos metablicos planteados en la literatura se puede concluir que este tipo de
modelos son abordables tanto desde el punto de vista matemtico como desde el punto de vista
experimental, pues, como se ha visto, el nmero de parmetros que presentan no es elevado y
los productos o componentes clave que son necesarios analizar no suelen precisar de mtodos
de anlisis complicados.
29
Introduccion
0+ T * + (17,,)T [1.59]
DT-4 ND [1.60]
El citado modelo proporciona curvas de crecimiento con todas las fases observadas
experimentalmente, incluyendo la fase de latencia. La concentracin total de protoplasma
viable es la suma de las concentraciones de los dos compartimentos. El modelo predice
fenmenos observados en el crecimiento en discontinuo, ya que las curvas obtenidas
dependen de las siguientes variables (Tsuchiya y col., 1966):
S*K +G [1.61]
(C~ + C0)
[1.62]
= k,, C5 C~ . [1.63]
1sI( flCJCY
= fI 4-1
[1.64]
Estos autores calculan los parmetros del modelo por regresin no lineal y
reproducen datos experimentales.
Las ltimas modificaciones del modelo de Williams (1967) son las realizadas por
Nielsen y col. (1991a y 1991b); Nikolajsen y col. (1991). En estos modelos se incluyen los
dos compartimentos, aunque cambia la nomenclatura empleada, denominan compartimento
A o parte activa de la clula (protenas y RNA) y compartimento G o parte inactiva (DNA e
hidratos de carbono). El modelo desarrollado por el equipo de Villadsen (Nielsen y col.,
1990a y 1991b; Nikolajsen y col., 1991) incluye dos tipos de sustratos (carbonado y
nitrogenado) y la formacin de productos, suponiendo que el sustrato nitrogenado slo
32
Introduccin
Estos autores (Nielsen y col., 199 la y 199 lb) calculan los valores de los parmetros
a partir de los experimentos realizados, pero no por regresin, y comprueban la
reproduccin de datos experimentales (Nielsen y col., 1991) donde aumentan el nmero de
sustratos carbonados a tres reproduciendo posteriormente a datos experimentales.
s P
Figura 1.5.- Esquema general del Modelo de Nielsen y col. (1991a y 199 Ib).
33
Introduccin
R
4
34
Introduccin
poblaciones: en 1985, fue ampliado (Shuler, 1985) para incluir situaciones de anaerobiosis,
alterando los mecanismos de generacin de energa en la clula; en 1986 fue modificado por
Peretti y Bailey (1986) examinando las interacciones huesped-plsmido.
Otro ejemplo de este tipo de modeJos es el propuesto por Jeong y col. (1990). Estos
autores desarrollan un modelo muy complejo para la descripcin del crecimiento y la
esporulacin de Bacillus subtilis. El esquema de reaccin considerado se recoge en la Figura
1.8. Este modelo tiene en cuenta 35 componentes intracelulares, en los que se incluyen
intermedios metablicos de la glicolisis, gluconeognesis, ciclo TCA, y una representacin
detallada del metabolismo de los nucletidos. En total est formado por 39 ecuacIones
diferenciales que contienen 200 parmetros.
frente a la simplicidad de los modelos no estructurados. En cualquier caso, aunque los modelos
de clula sean necesarios, es de suponer que sern modelos ms sencillos que los propuestos
hasta ahora, con menos componentes clave, y, por tanto, con necesidad de medir menos
compuestos, de tal forma que el clculo de parmetros por regresin sea abordable. Esto
implica hablar de modelos con no ms de 7 a 10 componentes clave, el mismo nmero de
etapas en el esquema de reaccin, y no ms de 20 parmetros.
37
Introduccin
co; NH
Los modelos ms complejos empleados hasta ahora han sido los modelos de clula con
los cuales era posible realizar una buena descripcin del crecimiento teniendo en cuenta la
38
Introduccin
39
Introduccin
Las clulas de los hongos filamentosos estn unidas en estructuras denominadas hifas,
estos elementos hifales crecen slo en las clulas situadas en los extremos de las hifas,
denominadas puntas o yemas, producindose nuevas yemas en clulas intermedias de la hifa
por un mecanismo denominado ramificacion.
40
Introduccin
Nielsen y col. (Nielsen, 1992; Nielsen y Villadsen, 1992; Nielsen 1993) refieren el
ndice de crecimiento de la hifa que se emplea generalmente es la unidad de crecimiento hifal,
a la masa de la hifa (miigi3:
lbgu [1.56]
= [1.57]
n
Mb [1.58]
~ [1.59]
4
Este autor (Nielsen, 1992) comprob que la unidad de crecimiento hifal referida a la
masa de la hifa es aproximadamente constante en diferentes condiciones y para diferentes
especies de hongos filamentosos; sin embargo, el dimetro de la hifa vara, lo que implica que
la unidad de crecimiento hifal referida a la longitud de la hifa tambin ser variable.
41
Introduccin
42
Introduccin
Los modelos segregados estn especialmente indicados y quizs slo en esos casos,
para describir el crecimiento de microorganismos filamentosos de los que se obtienen
productos de gran inters.
43
lutroduccion
Durante las dos ltimas dcadas, se ha ido desarrollando una tcnica ms racional
para conseguir la produccin ptima del producto deseado (Bailey , 1991), tratando por un
lado de identificar la reaccin crtica o cueiio de botella del metabolismo en la produccin
del compuesto deseado y por otro, minimizar esfuerzos en la optimizacin del proceso. Esta
tcnica es la denominada Ingeniera Metablica.
44
Introduccin
45
fY?tYOd celn
-/6
introduccin
Finalmente, a nivel microbiano se puede realizar una manipulacin gentica que permita
obtener gomas con propiedades reolgicas fijadas, lo cual est lejos de conseguirse con las
especies vegetales.
48
Introduccin
La goma de xantano fue descubierta a fmales de los 50, como ya se ha indicado, por
los Nothem Regional Research Laboratories (N.R.R.L.) del Departamento de Agricultura de
los Estados Unidos, durante unos trabajos de investigacin sobre las aplicaciones industriales
de polisacridos microbiolgicos y la utilizacin de excedentes agrcolas. Los estudios
realizados mostraron que el polisacrido, producido por la bacteria Xanthomonas campestris
NRRL B-1459, posea propiedades muy interesantes. Propiedades que hicieron pensar que el
polisacrido podra suplir, por sus mejores caractersticas reolgicas, a otras gomas naturales y
sintticas solubles en agua (Kennedy y Bradshaw, 1984; Kang y Pettit, 1993).
Las soluciones de xantano tienen gran estabilidad y compatibilidad con sales, excepto
con iones polivalentes a valores elevados del PH (Margaritis y Zajic, 1978). Las soluciones,
especialmente en presencia de electrolito, tienen una estabilidad trmica excelente, y su
viscosidad, en presencia de cantidades moderadas de electrolito (0,1% NaC), es independiente
del pH en el intervalo de 5 a 9 (Margaritis y Zajic, 1978).
En general, las casas comerciales establecen dos calidades del producto: grado
alimentario y grado tcnico. Su presentacin es generalmente en forma de slido, aunque en
aplicaciones especficas en el campo de la recuperacin del petrleo utilizan caldos de
fermentacin clarificados. De cualquier forma, el xantano debe cumplir una serie de requisitos
referentes a sus caractersticas fisicas y qumicas.
49
Introduccin
ALIMENTARIA Sopas, salsas yjugos 0,05- 0,5 Mejora la textura, contribuye a dar
cuerno
Controla la formacin
a la texturadecrenlosa
cristales;
Helados ~ alimentos congelados 0.05 -0,2 contribuye
.50
Introduccin
Produccin del polisacrido: para llevar a cabo el proceso, son necesarias unas
etapas previas, como la conservacin, mantenimiento y crecimiento de la bacteria con
el fin de preparar el inculo que se emplear posteriormente en la citada produccion.
En cualquier etapa del proceso, es fundamental mantener la esterilidad para evitar
posibles contaminaciones. Las etapas de conservacin de la cepa, as como el
crecimiento del microorganismo, son criticas en el proceso, ya que el estado del
microorganismo en el reactor influir de forma notable, tanto en la duracin de la fase
de latencia durante la produccin como en la calidad del xantano que se obtenga. Las
condiciones de fermentacin son muy importantes, ya que tanto el crecimiento de la
bacteria como la biosntesis del xantano se encuentran afectadas por numerosas
variables (Santos 1993, Garca-Ochoa y col., 1997): el inculo previo, la composicin
del medio de cultivo, la aireacin y agitacin del medio, el pH del medio de cultivo y
la temperatura de fermentacin
si
Introduccin
BACTERIA CONSERVACIN
Xanlwmonas campestris y
MANTENIMIENTO
CRECIMIENTO
Medio
ESTE RIL IZAC IN Composicin
Temperatura
Transporte de 0~
4
r
1 Volumen
INCULO
Fases en la preparacin
r
BIORREACTOR
MEDIO de PRODUCCIN Temperatura
Sustratos (C,N) PH, control
Nutrientes: r
Oxgeno disuelto
Macro - Caudal
NIlero
- Agitacin
CALDO DE FERMENTACIN
1
Y
PASTEURIZACIN
Fsica,Quimica y/o Enziintica
CLARIFICACIN
Filtracin, Centrifugacin
PRECIPITACIN
Alcoholes, Sales, Mezclas
FILTRACIN
Piruvato PROPIEDADES
Peso Molecular
53
Introduccin
CH2 OH CH
2 OH 1
r
2
co~ - Na, K~, 112 Ca
:oo M o OH
c
CH3
La cpsula de este tipo de bacterias no presenta una estructura especial, por observacin
microscpica con tcnicas simples de tincin. Sin embargo, la tincin capsular con tinta Indio
ha llevado a observar cpsulas en muchos cultivos de Xanthomonas y especialmente de X
campestris (Bradbury, 1984). La produccin de gran cantidad de estos polisacridos capsulares
-o goma de xantano- se lleva a cabo cuando se emplean medios ricos en hidratos de carbono.
.56
Introducc,n
y Bradshaw, 1984; Sutherland, 1985). Hay que destacar la importancia de los lpidos
intennedios de la sntesis, que parecen ser los que transportan el monmero de xantano hasta la
membrana celular y gracias a ellos, se unen a diferentes monosacridos para la formacin del
esqueleto carbonado (Sutherland, 1975 y 1977). El residuo de piruvato proviene del
fosfoenolpiruvato (P.E.P) obtenido generalmente por va de Entner-Doudoroff, que es la ruta
-
por la que la bacteria lleva a cabo el metabolismo de la glucosa (Bradbury, 1984: Pons y col.,
1989)- unindose, finalmente, al esqueleto carbonado ya formado (lelpi y col., 1981a y 1981b).
LIPIDOP
UDP SIc
UMP
Sic LIPIDOP-P-G(c
Sic GP .-*GIc1P DF- DF
UDP-Ac SIc LIPIDO-P-P-Gc-GIc
Entier
Doudoroff
GP*Man- GP*Man
1 UD P
LIPIDO-P-P-GIc-GIc- Man
LPIDO- P-P-GIc-Glc- Man
1
PEP
LIPIDO-P-P-GIc- Sic-Man
-
Ac- Sic
Ac-Gk
Man
LIPIDO-P-P y,
1r
LIPIDO-Glc- Sic- Man- Ac-GIc
PYR= Man
Sic- Sic
Man
Ac Sic
Mcin= Pyr
MONOMERO DE XANTANO
55
Introduccin
partir del 4 al lOOo de azcar. Si se emplea Al phaseoli se puede Llegar a obtener hasta 10 gIL
de una goma de caractersticas similares, con una composicin similar, al xantano. pero con
diferente relacin molar entre los azcares que lo forman. Otras especies, como Xi
ma!vacearurn, Xi heredae, Xi papavericola y Xi vesicatoria, producen polisacridos formados
por las mismas unidades de azcar (Margaritis y Zadic, 1978; Bradbury, 1984). Es la goma
sintetizada por Xsrewartii la que presenta una clara diferencia con el resto, ya que las unidades
de azcar que la forman son D-glucosa, D-galactosa y cido glucurnico (Slodki y Cadmus,
978). La mayora de las bacterias del gnero Xanthomonas producen una familia de
polisacridos extracelulares, cuyo papel parece ser proteger a las clulas de la desecacin y
otras condiciones adversas, ya que es, en realidad, la cpsula bacteriana (Bradbury, 1984). En
la Tabla 1 .3 se resumen a composicin de diversos biopolmeros sintetizados por diferentes
especies del gnero Xanthomonas.
Tabla 1.3.- Composicin media (en porcentaje) de Los diferentes polisacridos sintetizados por
Las bacterias del gnero Xanthomonas (Kennedy y Bradshaw, 1984).
a
contiene O-Galactosa
58
Introduccin
Se han descrito tres tipos diferentes de cepas de esta bacteria (Slodki y Cadmus, 1978;
Cadmus y col., 1976 y 1978; Jeanes y col., 1976; Kidby y col., 1977):
Peters y col.. 1989: Pons y col., 1989 y 1990; Santos, 1993). El tiempo necesario para la
preparacin del inculo est influido por la composicin del medio empleado para el desarrollo
del microorganismo- algunos autores varian la composicin de una etapa a otra (Rogovin y
col., 1961; Cadmus y col, 1978; Peters y col., 1989; Pons y col., 1989) y por la temperatura
-
1991; Zaidi y col., 1991; Suh y col.. 1992). Sin embargo, parece que es la sacarosa, en
concentracin entre 20 y 40 gIL, la que proporciona mejores resultados (Souw y Demain,
1979; Funahashi y col., 1987; De Vuyst y col., 1987a; Santos, 1993).
Tabla 1.4.- Condiciones de operacin empleadas por diferentes autores para llevar a cabo la
produccin de xantano en un tanque agitado.
0C) pH1
Autores V(L) Q(L/L/min) N(r.p.m.) T(
Cadinus y col. (1978) lO 1.5 225-300 20-30 6.8
(control)
Como puede apreciarse en la tabla, la temperatura que se debe emplear para llevar a
cabo la produccin se encuentra en el intervalo de 25 a 33 0C. La gran mayora de los autores
emplean la misma temperatura en la preparacin del inculo que en la produccin (Rogovin y
col., 1961 y 1965; Moraine y Rogovin, 1966, 1971 y 1973; Suman y Rogovin, 1970 y 1972;
Davidson, 1978; Souw y Demain, 1979 y 1980; Kennedy y col., 1982; Trilsbach y col., 1984;
62
Introduccin
Pinches y Pallent, 1986; Tait y col., 1986; Funahashi y col., 1987, De Vuyst y col., 1987a y b;
Peters y col., 1989; Lee y col., 1989; Qadeer y Baig, 1989; Pons y col., 1989 y 1990; Zaidi y
col., 1991; Suh y col., 1992). Sin embargo, se ha propuesto el empleo de temperaturas
diferentes en ambas etapas del proceso (Thonart y col., 1985; Shu y Yang, 1990 y 1991).
Aunque los valores del caudal de are empleados son dispares (de 0,3 a 1,5 L/L/min),
todos los autores mantienen constante la citada variable. Por tanto, la transferencia del oxgeno
en el caldo depende nicamente de la velocidad de agitacin. Sobre esta ltima variable
citada, hay dos tendencias: por una parte hay autores que la mantienen constante durante toda
la fermentacin (Souw y Demain, 1980; Pinches y Pallent, 1986; Shu y Yang, 1990 y 1991),
mientras que otros la van aumentando a medida que aumenta la viscosidad del caldo (Rogovin
y col., 1961 y 1965; Moraine y Rogovin, 1971; Cadmus y col., 1978; Kennedy y col., 1982;
Funahashi y col., 1987; De Vuyst y col., 1987a y b; Schweickart y Quinlan, 1989; Pons y col.,
1990).
En la literatura, sin embargo, existe tambin un gran nmero de trabajos en los que
se realiza la fermentacin sin llevar a cabo el control del pH (Rogovin y col., 1961 y 1965;
fvloraine y Rogovin, 1966; Suman y Rogovin; 1970 y 1972; Souw y Demain, 1979; De Vuyst
y col., 1987a y b; Funahashi y col., 1987). Santos (1993) y Garca-Ochoa y col. (1997)
proponen realizar la produccin sin control de pH pues no resulta beneficioso para la
produccin. Durante el periodo de crecimiento, el pH del medio prcticamente se mantiene
constante en este valor, pero al llegar a la fase estacionaria de crecimiento el pH disminuye,
si se controla esta variable la produccin se detiene.
64
Introduccin
65
!ntoduccon
Tabla 1.5.- Produccin de xantano y rendimientos obtenidos por los diferentes autores
trabajando en tanque agitado y aereado
66
Introduccin
Por otra parte, teniendo en cuenta que, para efectuar cambios de escala en
fermentaciones aerobias, uno de los criterios ms ampliamente utilizado es el de mantener
valores similares de la concentracin de oxgeno disuelto o su velocidad de transferencia, se
entiende que la determinacin de este parmetro sea de gran inters.
Las tcnicas de medida indirecta son aquellas que se llevan a cabo en sistemas donde
no se est produciendo una biotransformacion. Los valores de kLav obtenidos en medios
artificiales que simulan los caldos de fermentacin se emplean, generalmente, para realizar
comparaciones entre diferentes biorreactores que operan en condiciones similares o en la
obtencin de correlaciones empricas que permitan estimar el coeficiente de transporte y poder
describir la transferencia de materia gas-lquido (Dussap y col., 1985; Vlaev y Valeva, 1990;
Yasukawa y col., 1991 a; Leckie y col., 1 991b; Garca-Ochoa y Gmez, 1988).
ecuacin:
dC0, =kLaV.(CO C0) [1.61]
dt
68
Introduccin
1970) o la oxidacin de la hidracina (Onken y col., 1985). Los mtodos fisicos utilizan la
respuesta de un electrodo de oxgeno, a los cambios en la concentracin de este gas en el
medio, en condiciones no estacionarias o dinmicas. Este ltimo tipo de mtodo es el ms
ampliamente utilizado y se basa en la medida de la concentracin del oxgeno disuelto durante
la absorcin o desorcin de oxgeno de la disolucin (Dussap y col., 1985; Costa y col., 1982a
y 1982b; Merchuk y col., 1994; Arranz, 1993; Gmez, 1995, Garca-Ochoa y Gmez, 1998).
Su aplicacin presenta ciertas restricciones que es necesario tener en cuenta para la obtencin
de valores correctos, como son la adecuada disposicin en el reactor del electrodo de medida
del oxgeno disuelto, el tiempo de respuesta y la linealidad del mismo (Nocentini y col., 1993;
Merchuck y col., 1994).
Las tcnicas de medida directa son aquellas en las que se determina la velocidad de
transferencia de materia en presencia de microorganismos, es decir, en la fermentacin real por
lo que el valor obtenido es ms representativo del sistema en estudio. La medida de la
variacin de la concentracin de oxgeno en el biorreactor puede realizarse en condiciones
estacionadas o no estacionarias o dinmicas.
dc
0,
dt ~~1o. C\ [1.62]
C 02 ~ 02 _ k,a,
______
Co2 *
Co2 AIRE
ETENIDO
e AIREACIN
* ~c
)
q0, 1-.
dt
FASE 11
Ccrit 1 FASE 1
Figura 1.13.- Esquema de la tcnica dinmica (rgimen no estacionario) para la medida del
coeficiente de transferencia de materia.
70
Introduccion
q
0, C~ (t~lm)+(Co, ~Cm) kLaVIj (C0, *C02).dt [1.64]
ecuacin, que una vez integrada, permite calcular el valor de kLav a partir de la variacin de
la concentracin de oxigeno con el tiempo, una vez conocido el valor del consumo del
microorganismo, q0 C,<, de la pendiente de la primera parte de la curva.
Este elevado nmero de variables hace que existan numerosas correlaciones empricas
para predecir el valor de kLaV que podemos clasificar en dos categoras. Unas tienen una
forma dimensional, correlacionando kLav con la velocidad de agitacin (o potencia por unidad
de volumen, la velocidad superficial del gas y, en caso de que el fluido sea no-Newtoniano,
con la viscosidad. Segn una expresin del tipo:
kLaV Pi?
=C,V~(-) -p~ 11.661
Tabla 1.7.- Valores de los exponentes encontrados por distintos autores en correlaciones
dimensionales.
72
Introduccin
[1.68]
Los valores obtenidos son acordes con los propuestos en la bibliografia. En la Figura
1.14 se comparan los valores obtenidos a partir de la ecuacin [1.69] con las correlaciones
propuestas por otros autores para sistemas anlogos y en el mismo mtervalo de condiciones de
operacin. En la misma se observa, que los valores obtenidos por Ogut y Hatch (1988) son
significativamente superiores al resto de los trabajos, siendo las diferencias tanto ms
significativas cuanto menor es la velocidad de agitacin. La presencia de electrlitos y la
aplicacin de una tcnica poco adecuada (el mtodo qumico del sulfito) que proporciona
valores muy superiores, no comparables a los obtenidos mediante mtodos fisicos. Las
diferencias obtenidas por otros autores y las calculadas con la ecuacin [1.69]
se explican por
el efecto de los parmetros geomtricos sobre el coeficiente de transporte en el biorreactor
usado en el estudio (altura, tipo de agitador, tipo de difusor, etc.) y las propiedades fisicas del
fluido.
0,1
~iz 0.01
.2
0.001
0,000 1
2 4 6 8 10
N (r.p.s.)
eliminar cerca del 95% del caldo. Para conseguir este fin se pueden emplear tanto mtodos
fisicos como qumicos (Kennedy y Bradshaw, 1984), dentro de los que se encuentran:
Otros autores (Patton y Holman., 1968; Pace y Righelato, 1981; Albretch y col,
1964; Kenedy y col., 1981) han propuesto la adicin de cationes polivalentes a las
soluciones de xantano, realizndose la precipitacin del xantano debido al carcter
polelectrolitico del polisacrido. Se puede realizar la precipitacin por la adicin de sales
de calcio (Patton y Holman, 1968; Macneely y OConell, 1966) a pH bsico (entre 8,5 y 12)
o por sales de aluminio (Albretch y col., 1962 a pH cido (entre 4 y 4,5). De este modo se
obtiene una sal de xantano insoluble, que debe de ser transformado en un compuesto
soluble, en forma de sal sdica o potsica, para su empleo comercial.
75
Introduccin
Las etapas finales empleadas dependen de las propiedades comerciales y los usos a
los que se vaya a dedicar el xantano purificado.
realizar el proceso, ya que evitan la etapa posterior de conseguir que la sal de xantano
insoluble, obtenida en el caso de emplear sales de cationes polivalentes sea transformada en
soluble por cambio del catin.
77
Introdccn
a>
y
(~0 o a6 1,0
MODELO FUNCION
tYp
Ostwald- de Waele y = k y
0 = 1< yfl~I)
E
2
roo
11
lo-; 1
lo
-2
lo2 lo
io~ 102 102
4-y ls-)
80
Introduccin
1 1
<A u 0C
E T0 60C 25
792s
o Y 7.92r o y -
2
lo
Key C,(><
a
o 15
o
3 r
o3 20 1
~C 601
80 o
20 26080
TMUC) e TM(C)
8]
Jniroduccz<vn
(Kg/ms>
SO
1, rc
La reologa del xantano cambia con la naturaleza del polmero, es decir, depende de
su peso molecular y del nivel de acetilacin de la molcula (Tako y Nakamura, 1984) y del
grado de piruvatizacin (Peters y col., 1993; Kang y Pettit, 1993). Estos niveles en el
contenido de acetato y piruvato varan con las condiciones en las que crece la bacteria
(Souw y Demain, 1979; Cadmus y col., 1978; De Vuyst y col., 1987), con las condiciones
82
Introduccin
de operacin (Trilsbach y col., 1984; Peters y col., 1993) y con la especie de Xanthonionas
sp empleada (Cadmus y col., 1976; Kennedy y Bradshaw, 1984; Tait y col., 1986).
84
2. - PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Procedimiento Experimental
2.1.- EQUIPOS
85
Procedirnieu/o Experimental
FERMENTADOR COMERCIAL
86
Procedimiento Experimental
Sistema de medida y con trol de oH: El pH del medio de cultivo es analizado en lnea
mediante un electrodo esterilizable fabricado por INGOLD. Opera en un rango de
medida de 2 a 12 unidades de pH, disponiendo de una compensacin manual o
automtica de temperatura. La seal de medida, previamente amplificada, es
alimentada a un controlador de tipo PI. Una vez fijado el valor de pH al que se desea
trabajar es mantenido por la accin del controlador sobre sendas bombas de
alimentacin de lcali o cido, como se muestra en la Figura 2.5.
87
P-ocedinienw Experimental
Fermernador comercial de 2 1.
88
Procedimiento Experimental
89
Pocedniieno Experimental
SEAL CONTROLADOR DE
CONSIGNA TENFERATURA
SALIDA DE AGIlA
90
Procedimiento Experimental
AMPLIFICADOR
DE SEAL
COUTROLADOR
F~LTRO
AIRE
RO! AMETRO
AIRE
ELECTRODO
DE Di
~.~J~jjjjjj--
SEAL
CONSIGNA 1
---e- WQROLAOOR
OC VELOCIDAD
9
Procedimiento Evpcrirnental
92
Procedimiento Experimental
~--2
CONTROLADOR
DUR AO O N
DOS IP OAGIO N
TIEMPO GE
DOSIFICACION
SUSTANGIA
ANTIE SP UMA NTE
93
Procedimiento Experimental
INCUBADORA ORBITAL
ESTUFA DE CULTIVO
CAMARA DE FLUJO
94
Procedimiento Experimental
BALANZA DE PRECISIN
CENTRIFUGAS
Para la centrifugacin de las muestras se han empleado dos tipos de centrfugas, una
de la firma HERMLE, modelo Z 230, con capacidad para ocho tubos de 10 ml cada uno;
alcanza un mximo de 5000 r.p.m.- lo que corresponde a 2000 g- durante un tiempo
controlado de hasta una hora.
Para la preparacin de las muestras para citometra de flujo, la centrfuga empleada fue
de la marca SELECTA, modelo Centrolit con una capacidad para 30 Eppendorf, alcanza una
velocidad fija de 10000 r.p.m. (18000 g) durante un tiempo que puede ser programado.
URMIETRO
VISCOSIMETRO
95
Procedimiento Experimental
ESPECTROFOTMIETRO de FLUORESCENCIA
AUTOCLAVE
ELECTRODO de AMONIO
96
Procedimiento Experimental
97
)
Procedimiento Experimental
Filtro
u
Precolumna
Reserva de Bomba
disolvente Inyector automtico
Columna
CONTADOR de PARTCULAS
Para el contaje del nmero de clulas, necesario para el procesamiento de las muestras
por Citometra de Flujo, se emple un contador COULTER modelo ZM empleando un tubo
de 30 ~tmy un canalizador acoplado marca COULTER, modelo CHANNELIZER 256.
CITOMETRO DE FLUJO
98
Procedimiento Experimental
99
Procedimiento Experimental
r 1
W Suspensin
celular
Agua
presurizadalE*
, , fluorescente
Detector
Flujo N .
NS
Detectbr,~
de luz NS
disnersa NS
Mistogramas
4
1~
cg
1
100
Procedimiento Experimental
2.21.- Nlicroor2anismo
101
Procedimiento Experimental
Figura 2.9.- Fotografla de las colonias formadas por Xantho,nonas campestris sobre YMagar.
102
Procedimiento Experimental
En la Tablas 2.1 a 2.6 aparecen los reactivos empleados, tanto para la preparacin de
los medios de cultivo como aquellos que se han ido utilizando en el anlisis de los diferentes
componentes del sistema.
103
Procedimiento Experimental
Qumica
Cloruro de Magnesio PROBUS 120410
Puro
Acido Ctrico Crista/Lado PROBUS 11510
Puro
cido Brico PANREAC 23687
Puro
cido Clorhdrico PANREAC 141019
35%
Nitrato de Amonio PROBUS 21310
Puro
Carbonato Clcico PROBUS 1092 1
Puro
Cloruro de Hierro (III) PROBUS 91410
Puro
Oxido de Zinc PANREAC 15682
Puro
Fosfato Potasio Mono-bsico PANREAC 141509
98%
Hidrxido de sodio PANREAC 141687
970
Sacarosa PANREAC 176820
Puro
Tabla 2.3.- Reactivos empleados para la precipitacin y extraccin del producto obtenido.
VIUDA e HIJOS de
isopropanol Puro
MANUEL RIESGO
104
Procedimiento Experimental
Qumica
Tris (hidroximetil) aminometano PANREAC Puro 131940
Cloruro Sdico PANREAC Puro 141659
Glutaraldehdo RIEDEL-DE HAEN 25% 62621
Deoxiribonucleasa 1 SIGMA 90 % DN-25
Ribonucleasa A SIGMA 85 % R5503
loduro de Propidio SIGMA 95-98% P-4170
Isotiocianato de Fluorescena SIGMA 90 % F-7250
Rojo Nilo SIGMA - N-3013
Albmina de Suero de Bovino BOEHRINGER-MANNHEIN - 10222
DNA de Timo de Bovino BOEHIRIINGER-MANNHEIN - 109223
RNA de Levadura BOEHRIINGER-MANNHEIN - 104175
los
Procedimiento Experimental
MEDIO de CRECIMIENTO
VM Extracto de Levadura 3 g/L
Extracto de Malta 3 g/L
Glucosa Anhidra 10 gIL
MEDIO de PRODUCCIN
MEDIO A
Acdo Brico 0,006 g/L
Acido Ctrico 2,100 g/L
Acido Clorhdrico 0,130 mL
Carbonato Clcico 0,020 g~L
Cloruro de Hierro (III) 0,0024 g/L
Oxido de Zinc 0,0060 g/L
Fosfato Potsio Mono-Bsico 2,866 g/L
Cloruro de Magnesio 0,507 gIL
Sulfato Sdico 0,089 gIL
Nitrato Amnico 1,1440 gIL
Sacarosa 40,00 gIL
Se ajusta el pH a 7 con una disolucin de NaOH.
106
Procedimiento Experimental
DISOLUCIONES TAMPN
TAMPN TRIS
Tris Hidroximetil Aminometano 0,1M
Cloruro Sdico 0,IM
Se ajusta el pH a 7,5 con HCI
TAMPN B
Dodecil Sulfato Sdico 1 ,5%(w/v)
Tris Hidroxim. Amino Met. 10 mM
Citrato Sdico lmM
Cloruro Sdico 10 mM
Se ajusta el pH a 8 con HCI
LOWRY A
Carbonato de Sodio 2 % (w/v)
Hidrxido Sdico 0,1 N
LOWRY B
Sulfato de Cobre 0,5%(w/v)
Tartrato de Sodio y Potasio 1 ,O%(w/v)
107
Procedituienbo Experimental
2.3.-REALIZACIN de un EXPERIMENTO
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin del inculo, se lleva ste a la cmara de flujo
-previamente esterilizada con alcohol- y se toma, de modo estril, una pequea cantidad para
realizar diluciones y conocer la concentracin de biomasa obtenida. Este ltimo detalle es
inprescindible para la repetitividad de los resultados obtenidos en diversos experimentos.
El ferinentador se debe esterilizar con el medio a emplear dentro, por lo que se deben
pinzar todas las gomas de salida y entrada para evitar prdidas. Cuando el medio que se va a
emplear en el experimento no se puede esterilizar todo junto -por contener la mente carbonada
y sales inorgnicas-, se introduce en el reactor una parte del mismo, conteniendo todos los
componentes excepto la mente de carbono. El sustrato carbonado se prepara en un frasco
aparte -de los preparados para control del pH, con salida al fermentador- y se esteriliza unido al
mismo, tomando la precaucin de pinzar la goma que los une, para evitar que haya paso de
liquido de uno a otro.
/08
Procedimiento Experimental
Una vez introducido todo en el autoclave, se esteriliza a 1200C durante 30 minutos. Despus
de la esterilizacin, se quita la cinta adhesiva y el papel de aluminio y se conecta el
ferinentador al cuerpo del mismo; tambin se conecta la entrada y la salida de agua de la
camisa y se abre la vlvula de llenado. Se conectan el agitador, los tres electrodos la bomba
y
Para llevar a cabo el seguimiento de la evolucin de este sistema durante el proceso, sc realiza
la toma de las muestras a distintos tiempos, as como el anlisis de las mismas. En el
fermentador, la toma de muestras se realiza por la salida superior. Una vez tomada la muestra
se pinza la goma y se introduce alcohol por el extremo inferior, hasta la siguiente muestra, para
evitar contaminaciones.
Las muestras deben ser tomadas en condiciones lo ms aspticas posibles, por lo que los tubos
donde van a ser almacenadas deben ser esterilizados previamente. Una vez tomada la muestra,
es centrifugada a 4000 rpm. <2860 g> durante 30 mlii. con el fin de separar el caldo de las
clulas, y de esta forma parar el crecimiento y la evolucin de sustratos y productos. Una vez
centrifugadas son almacenadas a C para el posterior anlisis de cada compuesto.
40
Preparaciones especiales de las muestras, como las necesarias para contar el nmero de
clulas, o analizar por fluorescencia, citometra de flujo o microscopia electrnica, se detallan
en puntos siguientes, dentro de los protocolos especficos para el anlisis de cada componente.
109
P,-ocedmicn/o Experimental
El calibrado del mtodo se realiz en un trabajo previo (Santos, 1993). El ajuste de los
datos experimentales por regresin lineal a la expresin de Lambert -Beer aparece en la
ecuacin [2.1].
Se toma una muestra del biorreactor y se diluye con agua destilada, de modo que la
alisorbancia medida entre dentro de la regin lineal de la curva de calibrado. El valor de
absorbancia obtenido a 540 nm es convenido en concentracin mediante la ecuacin
[2.1], que luego es corregida de acuerdo a la dilucin realizada previamente.
110-
Procedimiento Experimental
.4
Q5 1,0 1,5
20
Abs(S~ mi)
7 fl$>
~1 ~
Proccdim en/o Experimental
AA = AA9- AM [2.5]
= /000 [2.6]
1/2
Procedimiento Experimental
filtro Millipore de 0,2 ~tm. Como ya se ha comentado, para este anlisis se ha utilizado un
cromatgrafo marca KONTRON, modelo SEDEX 45, con detector de dispersin de luz. Las
condiciones utilizadas han sido las siguientes: la columna empleada ha sido tipo Nucleosil
NH2 de Sgm, con unas dimensiones de 250 x 4,6 mm. Se ha empleado como eluyente una
[2.7]
.4
~oo
A
113
Procedimiento Experimental
Sc toma una muestra de 10 mL y se adiciona una disolucin de NaOH, hasta alcanzar valores
de pH superiores a lo (momento en el que el indicador suministrado por el fabricante, azul de
timol. vira de incoloro a azulado); a pH alcalino se libera el nitrgeno amnico presente en la
muestra, pasando a amonio gaseoso. El amoniaco generado atraviesa la membrana
semipermeable del electrodo y produce una seal en el detector. Esta seal se compara con los
datos del calibrado y~ automticamente, aparece en la pantalla del aparato la concentracin de
nitrgeno presente en la muestra. El calibrado se realiza introduciendo dos patrones de
concentracin conocida (10 y 100 p.p.m.). El intervalo de concentracin de calibrado es de O a
00 p.pm. l~os patrones son analizados del modo indicado y la pendiente es calculada y
almacenada por e] aparato de modo que, una vez realizado el calibrado, la concentracin es
leida directamente en el aparato.
El anlisis del xantano se llev a cabo estableciendo una relacin entre la viscosidad
del caldo y la concentracin de xantano en una muestra dada. La viscosidad se mide
generalmente a 30 r.p.m. entre 25 y 300C (Silman y Rogovin, 1970 y 1972; Cadmus y col.,
1976 y 1978: Souw y Demain, 1979; Tait y col., 1986; De Vuyst y col., 1987a y 1987b). En el
presente trabajo, el anlisis del contenido en xantano de las muestras se realiz mediante la
determinacin_de la viscosidad, medida a 25 0C y 30 r.p.m. , de acuerdo a un procedimiento
previamente establecido (Santos, 1993).
114
Procedimiento Experimental
= a 4 [2.8]
La relacin entre la viscosidad aparente del xantano (g~) con su concentracin (gIL)
de acuerdo con la Ecuacin [2.8]
para cada experimento, se muestra en la Tabla 2.7.
Tabla 2.7- Valores de los parmetros a y b de la ecuacin [2.8] para los diferentes
experimentos realizados en los que se varian las condiciones que se indican
en la primera columna.
Experimento b
115
Procedimiento Experimental
La Citometra de Flujo (CMF) parece ser la mejor tcnica para poder realizar un
seguimiento del proceso, teniendo en cuenta los cambios producidos intracelularmente
cuando el microorganismo se encuentra bajo diferentes condiciones ambientales.
La CMF presenta importantes ventajas con respecto a otras tcnicas analticas, por
ejemplo permite la caracterizacin de clulas individuales en trminos de distribucin de sus
componentes, tales como DNA, RNA, y proteinas, o bien de sus propiedades tales como
viabilidad, tamao, variacin morfolgica (complejidad), etc.; adems, permite anlisis
multiparamtricos con alto grado de precisin. En la Tabla 2.8 se muestran algunos de los
principales parmetros biolgicos ana]izables por CMIF, tanto mediante el uso de
fluorocromos como sin ellos, siendo posible tambin el anlisis simultneo de varios de
estos parmetros.
116
Procedimiento Experimental
PARMETROS PARMETROS
ESTRUCTURALES FUNCIONALES
SIN Volumen Celular Potencial REDOX
FL UOROCROMO Complejidad Celular Viabilidad celular
Pigmentos
Esta tcnica ha sido habitualmente utilizada para analizar clulas eucariotas (Hullet y
col., 1969; Criasman y col. 1975), especialmente clulas sanguneas. Su aplicacin para el
anlisis de clulas procariotas es menor, debido a que el contenido en constituyentes objeto
de anlisis (componentes intracelulares), en dichas clulas procariotas, es de dos a cuatro
rdenes de magnitud inferior que en eucariotas, lo cual hace que se requieran equipos
mucho ms sensibles (Steen y Boye, 1980; Steen y col., 1982).
A. pesar de las enormes ventajas de la CMIF frente a otras tcnicas, como las
microbiolgicas o bioqumicas convencionales, esta tcnica presenta inconvenientes a la
hora de emplear los datos necesarios para la formulacin de Modelos Cinticos, debido a
117
Procedim lento Experimental
Basados en el trabajo llevado a cabo por Agar y Bailey (1982), se abord el estudio
para establecer una correlacin entre los datos obtenidos mediante CMF con otras tcnicas
de anlisis.
un mtodo colorimtrico basado en el hecho de que los grupos fenlicos de las tirosinas
presentes en las protenas reducen el reactivo de Folin, dando un complejo de color azulado
cuya intensidad es proporcional a la concentracin de protena. Para la formacin del
complejo azulado es necesario que las tirosinas estn accesibles al reactivo de Folin, para lo
cual se aaden iones calcio que se unen a las protenas dando complejos protena calcio. -
El primer paso a realizar es el lavado y rotura de clulas, con esta etapa se pretende
obtener el homogeneizado de la muestra sobre el que se va a realizar el anlisis. Para ello,
se toma un volumen determinado de muestra y se centrifuga durante 30 minutos a 4000
r.p.m. (2860 g) con el fin de separar las clulas del medio de cultivo. Se resuspende el
precipitado en tampn Tris. Esta operacin se debe realizar al menos cinco veces, con el
fin de eliminar todo el polisacrido que pudiera estar pegado a las clulas, lo cual
introducira un error enorme en este ensayo en concreto, debido a la interferencia entre el
vantano con el reactivo de Folin.
119
Procedimiento Experimental
La Ecuacin [2.9] es la obtenida mediante ajuste por regresin lineal de los valores de la
absorbancia con la concentracin, el valor del coeficiente de correlacin obtenido de este
ajuste es r0,998. En la Figura 2.12 se muestran los resultados obtenidos.
0,16
A(500nm)
120
Procedim lento Experimental
0.6
0,4
0,2
0
O lO 20 30 40 50 60
t(h)
Figura 2.13.- Evolucin de protenas intracelulares de Xanthomonas campestris por
anlisis con el mtodo Lowry.
El anlisis requiere de la digestin enzimtica con RNAasa para la medida del DNA
y con DNAasa para el anlisis de RNA, pues ambos componentes interfieren en el anlisis
debido a que la tcnica se basa en la absorbancia a 260 nm que es la longitud de onda
caracterstica de los cromforos de los cidos nucleicos, esto es, de las bases nitrogenadas.
121
Procedimiento Experimental
En primer lugar debe realizarse el lavado de las clulas mediante centrifligacion a 4000
r.p.m. (2860 g) durante 30 minutos y resuspensin del precipitado en el tampn Tris. Esta
operacin se repite 5 veces para eliminar el xantano adherido a las clulas. A
continuacin se procede al fijado de las clulas, con ello se pretende abrir poros en la
pared de la bacteria para permeabilizarla a las enzimas que se van a emplear. Para ello,
una vez lavadas las clulas se centrifugan a 4000 r.p.m. (2860 g) durante 15 minutos y se
resuspenden en 3 mL de la disolucin de glutaraldehido al 3% en Tris 0.1 M NaC 0.1 -
M. se agita y sonica durante 1 minuto para disgregar los agregados de clulas, que se
forman con frecuencia, y finalmente se incuba durante 4 horas a 40C.
Pasado el tiempo de incubacin, las clulas son tratadas para conseguir su rotura. Para
eflo, se centrifuga a 10000 r.p.m. (18000 g) durante 10 minutos y se resuspende el
precipitado en una solucin de lisozima lO mg/mL se agita e incuba durante 15 minutos
a 37 T y, a continuacin, se aade lOO gL de tampn 3, se incuba durante 15 minutos
a 370 C y se mezcla cada 5 tninutos por inversin.
nucleico, para lo cual se aaden 400 gL de fenol (equilibrado en tampn Tris), se agita
suavemente y se centrifuga durante 5 minutos a 10000 r.p.m. con esto se consigue la
desproteinizacin, quedando el cido nucleico en la fase superior. Dicha fase se pasa a un
Eppendorf limpio, aadindose 400 .ii de una disolucin de cloroformo - alcohol
isoamulico. se agita y centrifuga a 10000 r.p.m. durante 5 minutos. Se pasa la fase
superior a Eppendorf limpio y se repite esta operacin 2 3 veces (fenol, cloroformo-
alcohol isoarnilico). Finalmente se pasa la fase superior a un tubo de vidrio estril y se
aaden 2 mL de etanol al 90 % (a 40C) dejndolo resbalar por las paredes para que
queden dos fases. Se deja precipitar de 1 a 4 horas a -700C.
122
Procedimiento Experimental
Los resultados experimentales del anlisis de las muestras tomadas del fermentador
se muestran en la Figura 2.14 para el DNA y en la Figura 2.15 para el RNA. Como se
puede observar, los valores obtenidos en cada ensayo son bastante diferentes y, por tanto, el
mtodo no permite obtener resultados repetitivos. La dispersin obtenida en los resultados
proporcionados por el anlisis descrito hace que este mtodo no sea aplicable para conseguir
datos utilizables en el desarrollo de modelos cinticos, ya que en ocasiones el error llega al
70%. No obstante, hay que comentar que desde un punto de vista cualitativo los resultados
son buenos, debido a la buena purificacin del cido nucleico.
0,4
0,2
0.0
0 0 20 30 40 50 60
t (h)
223
Procedimiento Experimental
.4
30
(h)
124
Procedimiento Experimental
Por ello, la tcnica que se emple fUe la Espectrofluorimetra (EFM), que se basa, al
igual que la CMI, en la medida de la intensidad de fluorescencia de los fluorocromos
unidos de forma especfica al componente objeto de anlisis. La gran ventaja ofrecida por
esta tcnica es que la preparacin de las muestras es idntica a la seguida para Citometria de
Flujo, es decir no implica rotura celular ni extraccin del componente. Adems permite
obtener curvas patrn para la correlacin entre la intensidad de fluorescencia con la
concentracin del componente.
125
Procedimiento Experimental
MUESTRA
Cenrijugacon :000 r.p.m.
10 mnuut
SOBRENADANTE PELLET
(Clulas)
110
mm
CELULAS LAVADAS
}
4/r 40(
AJUSTE CONCENTRClON
~NAS
LAVAR
I Incubar 4 C
40 mm
E
DICESTION RNA asa DIGESTIN DNA aso
(1 mg/LI, 37 C, 4Omin) <1 mg/mL. 37(, 40 mm.)
Incubar 4 C, /0
MEDIDA en CITMETRO DE FLUJO y en FLUORMETRO
126
Procedimiento Experimental
Para la tincin con ITCE se centrifuga a 10000 r.p.m. (18000 g) durante 10 minutos. El
precipitado es resuspendido en una disolucin de ITCF de 0,1 mg/mL se agita e incuba a
durante 1 hora, posteriormente se lavan las clulas tres veces en Tampn Tris, para
0C
4
0,8
0.4
0.
(It
Para llevar a cabo el calibrado de los datos obtenidos por CMF con los obtenidos
por EFM se emplearon 50 muestras, las cuales se obtuvieron a lo largo de un proceso
fermentativo con el fin de obtener datos a lo largo de toda la fase de crecimiento del
microorganismo y as obtener todo el intervalo de concentracin posible de protenas. La
Figura 2.18 muestra la relacin entre el valor de Mean (intensidad media de fluorescencia
por clula) con el contenido por clula (g/clula) de protena obtenido al extrapolar los datos
de IFF en la Ecuacin [2.10]. La curva de calibrado se ha obtenido con muestras con un
nmero de clulas comprendido entre 200 a 2000 cel! gL. La Ecuacin [2.111 muestra la
correlacin obtenida de esta forma:
128
Procedimiento Experimental
15,
20 30 40 60 60 70 80
IF (nnn)
Se pueden emplear tambin fluorforos especficos para cada tipo de cido nucleico,
por ejemplo naranja de acridina para RNA y DAPJ para DNA (Mafiah y col., 1993), pero,
en principio, se decidi realizar el estudio con IP, por ser uno de los fluorforos ms
habitualmente empleados.
129
Procedimiento Experimental
En primer lugar, debe de realizarse el lavado y fijado de las clulas, siendo esta etapa
idntica a la va descrita en el apartado anterior. Con ello, adems de eliminar el xantano
pegado a las clulas, se consigue la permeabilizacin de la pared del microorganismo
para que entren tanto los fluorocromos como las enzimas.
Debido a que cliP se une tanto a DNA como a RNA, debe hacerse un tratamiento previo
con DNAasa o RNAasa, segn el componente a analizar (Petit y col., 1993). Las etapas a
seguir, una vez fijadas las clulas, son las siguientes:
Para la lectura fluorescencia de las muestras teidas con IP deben emplearse las
siguientes condiciones de anlisis en el Espectrofluorimetro: longitud de onda de
excitacin de 536 nin y una rendija de 19. Para la emisin se emple una longitud de
onda de 623 nm y una rendija de 5. La temperatura empleada durante el anlisis fue de
Los resultados obtenidos del ajuste por regresin lineal de los datos de concentracin de
las disoluciones patrn con los valores de Intensidad de Fluorescencia (1pE), se muestran
Para el anlisis de las muestras en el Citmetro de Flujo las condiciones empleadas son:
Filtro para la excitacin de 488 mn, mientras que para emisin el filtro empleado fue de
600 nm. La fuente de iluminacin fue una lmpara de xenon de 75 W.
Una vez preparadas las muestras procedentes del fermentador, siguiendo el protocolo
que se ha indicado ms arriba, se obtuvieron los resultados tanto de su anlisis mediante
EFM como por CMF.
En el caso del anlisis utilizando CMI, se obtiene un histograma por muestra, con
una serie de datos estadsticos, como son la media de la intensidad de fluorescencia por
clula (Mean) y el coeficiente de variacin (CV), adems de indicar el nmero de clulas
por unidad de volumen. Los histogramas obtenidos en el anlisis de muestras lo han sido de
forma monoparamtrica para cada componente. La abcisa representa la distribucin de la
seal de fluorescencia en canales y la ordenada el nmero relativo de clulas. En la Figura
2.19 se muestra un histograma tipo, de los obtenidos para una muestra analizada mediante
CMF. Se muestra en la citada figura un histograma correspondiente a la fluorescencia verde
(F LI) que es la fluorescencia emitida por las protenas teidas con isotiocianato de
fluorescena. El otro histograma muestra la fluorescencia roja (FL2) que es la fluorescencia
emitida por los cidos nucleicos (DNA y RNA> teidos con loduro de propidio. En ambos
casos la fluorescencia media por clula aporta el valor Mean, necesario para realizar la
cuantificacin del componente correspondiente.
Las Figuras 2.20 y 2.21 muestran la evolucin de DNA y RNA obtenidas mediante
espectrofluorimetria a lo largo de la fermentacin. Los datos son expresados en
concentracin por extrapolacin de la intensidad de fluorescencia de acuerdo a las
131
Procedimiento Lrperimental
ecuaciones [2.12] y [2.13], para DNA y RNA, respectivamente. Los resultados obtenidos
para los dos ensayos realizados son repetitivos y evitan los problemas encontrados con los
mtodos basados en la espectrofotometra de absorcion.
FL2
FLI 2 2170
4
4. ~~1
4,
2 c.
2
o. 0
0~ (-y
54;?
156
Figura 2.19.- Histograma tipo de una muestra obtenida mediante CMF. FI] es la
fluorescencia verde (protenas) y FL2 la fluorescencia roja (cidos
nucleicos).
0,4
10
7
0,0
132
Procedimiento Experimental
0,4
0.2
rj~
0,0
O lO 20 30 40 50 60
t (h)
tiempo no superior a 5 horas, para evitar posibles errores como consecuencia de la prdida
de fluorescencia. Es importante llevar al citmetro muestras con un nmero de clulas por
unidad de volumen muy similar, prcticamente igual, con el fin de que los histogramas
fuesen siempre comparables, por lo que las muestras analizadas tenan todas tina
concentracin celular comprendida entre 200 a 2000 eel/gL. Otro aspecto importante a tener
en cuenta, a la hora de realizar el caJibrado, es el intervalo de concentracin de cada tipo de
cido nucleico pues era absolutamente necesario cubrir todo el intervalo que permitiese
posteriores anlisis, durante todo el ciclo celular de la bacteria. Para ello, las 50 muestras
analizadas fueron tomadas durante las diferentes etapas de la fase de crecimiento de
Xanthomonas campestris y, de esta forma, se obtuvo todo el intervalo de concentracin
posible. En la Figura 2.22 aparece reflejada la relacin entre las medidas conseguidas por
CMF y EFM para cidos nucleicos. Como puede verse en dicha figura, las pendientes
obtenidas al representar concentracin por clula vs. mean son iguales para ambos tipos
de cidos nucleicos, por tanto, el ajuste por regresin lineal se realiz uniendo lo obtenido
para el DNA y lo obtenido para el RNA. El resultado de este ajuste aparece reflejado en la
ecuacin [2.13]., en la que es necesario conocer el nmero de clulas (NC); este dato, como
ya se ha comentado, es obtenido tambin mediante Citometra de Flujo. El coeficiente de
regresin obtenido en este ajuste es r0,996.
y.,
20 30 40 50 60 70
IF(n~n)
Figura 2.22.- Relacin entre IF obtenida CMF y concentracin obtenida por EFM
234
Procedimiento Experimental
y
t=1 ~yexp Yeor Y -4 mnimo [2.15]
En los casos en los que se ha empleado este tipo de regresin, para describir el grado
de ajuste se ha tenido en cuenta el coeficiente de regresin, r.
135
Procedimiento Experimental
En el caso de que el ajuste realizado con los modelos cinticos a los diferentes
experimentos llevados a cabo proporcione una evoLucin lgica de los parmetros que
136
Procedimiento Experimental
contienen, se lleva a cabo de nuevo el ajuste de todos los datos de los diferentes
experimentos introduciendo, en el lugar de los parmetros del modelo la expresin que
corresponda segn la evolucin observada en los ajustes previos.
Las simulaciones o predicciones que se llevan a cabo con los diferentes modelos a
los que se han ajustado los datos experimentales sirven para comprobar qu influencias son
capaces de predecir en cada caso. Para ello, nicamente es necesario realizar la integracin
conjunta de todas las ecuaciones diferenciales que forman las velocidades de produccin del
modelo cintico del que se trate. Los programas desarrollados para realizar las simulaciones
necesitan nicamente el algoritmo de Runge-Kutta de cuarto orden para la integracin del
modelo y proporcionar los valores de las concentraciones de los diferentes componentes
clave del sistema, una vez introducidos los valores de los parmetros a emplear en la
simulacin, as como los valores de las variables a emplear (temperatura, agitacin, caudal
de aire, etc.) y los valores de las concentraciones iniciales de los nutrientes y de la biomasa.
En la Figura 2.25 se recoge el diagrama de flujo general de los programas empleados para
realizar la simulacin con los modelos cinticos.
137
Procedimiento Experimental
NO
k INVER
Clculo de inversa
1
s RUNOE N
Ecuaciones
diferenciales
Figura 2.23.- Diagrama de flujo del programa de regresin no lineal en mltiple respuesta
empleado basado en el algoritmo de Marquardt (1963).
138
Procedimiento Experimental
Figura 2.24.- Diagrama de flujo del programa de regresin no lineal en simple respuesta
empleando el mtodo en velocidades de reaccin con el algoritmo de
Marquardt (1963).
139
Procedimiento Experimental
INICIO
DIMENSIN
RLTNOKN RUNGFN
Algoritmo Ecuaciones
Runge-Kutta diferenciales
RESULTADOS
ARCHIVO
RESULTADOS
140
3.- RESULTADOS EXPERIMENTALES
Resultados Experimentales
141
Resultados Experimentales
142
Resultados Experimentales
nmero de componentes a seguir y/o analizar aumente con el grado de complejidad del
modelo. En los modelos cinticos ms complejos aplicados, los denominados Estructurados
o de Clula, es necesario realizar el anlisis de componentes intracelulares.
Por ello, desde el principio se realiz el seguimiento y anlisis del mayor nmero de
componentes con el fin de aplicar los diferentes tipos de modelos propuestos para los
mismos experimentos. Adems, todos los experimentos fueron repetidos dos veces con el
fin de tener el mayor nmero de datos a lo largo del tiempo de fermentacin. Debido a que
el tiempo a que se tomaron algunas de las muestras en las dos fermentaciones realizadas en
las mismas condiciones coinciden, los valores obtenidos se presentan como la media entre
ambos en la tabla correspondiente. Los resultados de los distintos experimentos se
representan en las Tablas 3.2 a 3.8, una para cada experimento.
Medio A Temperatura
Experimento Concentracin NH4~ (0C)
(p.p.m.)
1 257 25
2 257 28
3 257 31
4 257 34
5 65 28
6 130 28
7 475 28
43
Resultados E?vperimentales
44
Resultados Experimentales
0,00 0,070 100,0 210 0,309 36,5 2,19 0,017 0,0 12 0,035
2,00 0,084 73,0 210 0,300 36,4 2,19 0,03 1 0,020 0,039
4,00 0,099 59,0 210 0,298 36,0 2,19 0,037 0,021 0,044
7,00 0,130 34,0 210 0,287 36,0 2,19 0,042 0,030 0,050
9,00 0,156 24,0 210 0,280 35,9 2,23 0,049 0,035 0,05 8
12,00 0,209 16,5 210 0,275 35,7 2,29 0,065 0,042 0,069
13,00 0,229 10,5 210 0,269 35,0 2,33 0,085 0,048 0,089
14,50 0,2 88 8,0 210 0,266 34,7 2,39 0,120 0,054 0,092
16,00 0,300 5,0 210 0,254 34,0 2,59 0,137 0,081 0,115
16.50 0,350 35,0 310 0,247 33,8 2,62 0,165 0,088 0,129
19,50 0,480 25,0 310 0,220 33,5 2,99 0,199 0,110 0,135
23,50 0,620 15,0 310 0,190 32,9 3,90 0,235 0,149 0,210
24,00 0,663 5,0 310 0,166 32,0 5,82 0,240 0,160 0,250
24,50 0,790 28,0 380 0,140 31,8 6,21 0,250 0,170 0,3 20
28,00 0,910 19,0 380 0,100 28,7 7,30 0,290 0,199 0,480
32,00 1,220 15,4 380 0,082 26,0 7,59 0,330 0,215 0,600
33,50 1,252 10,2 380 0,073 25,0 7,78 0,33 5 0,229 0,7 10
34,00 1,350 24,5 550 0,05 5 24,0 8,10 0,3 50 0,230 0,720
38,00 1,400 18,5 550 0,045 23,0 8,40 0,3 70 0,255 0,760
38,50 1,450 10,0 550 0,025 21,0 8,90 0,3 75 0,260 0,765
39,50 1,500 5,0 550 0,0 13 20,2 10,48 0,3 80 0,265 0,772
41,50 1,548 17,0 650 0,00 1 18,0 11,20 0,3 90 0,269 0,775
42,00 1,560 28,0 650 0,000 17,2 12,00 0,395 0,270 0,780
43,75 1,580 21,8 650 0,000 12,0 13,28 0,395 0,270 0,780
48,00 1,580 20,3 750 0,000 10,6 14,90 0,395 0,270 0,780
48,50 1,580 30,0 850 0,000 10,6 15,13 0,3 95 0,270 0,780
52,00 1,580 28,0 890 0,000 10,6 15,22 0,3 95 0,270 0.780
59,00 1,580 21,0 890 0,000 10,6 15,20 0,395 0,270 0,780
14S
Resultados Experimentales
0,00 0.130 90.0 210 0,220 40,0 0,39 0.0 12 0,003 0,010
0,50 0,150 59,0 210 0,2 19 40,0 0.39 0,0 12 0,004 0.0 12
1,15 0,158 46.0 210 0,212 40,0 0,39 0,0 12 0,006 0,0 14
3,00 0,169 34,1 210 0.200 39,9 0.46 0,0 13 0,007 0,025
3.50 0,173 23,0 210 0,197 39,9 0,47 0,015 0,010 0,027
6,00 0,199 14,5 210 0,190 39,9 0,53 0,018 0,0 16 0,050
8.00 0,230 35.0 350 0.189 3 9.89 0,60 0,021 0.0 10 0,078
8,50 0,25 1 22.0 350 0,180 39,80 0,67 0,02 8 0,021 0,086
9,00 0,304 12,8 350 0.172 39.50 0,87 0,030 0,024 0,095
10,00 0,385 10.0 350 0,170 38,20 0,87 0,032 0,030 0.116
12,00 0,420 6,0 350 0,084 38,00 0,91 0,036 0,03 3 0.160
14.50 0,550 32,0 450 0,064 36,50 0,99 0.048 0,040 0,230
15,00 0,590 20,0 450 0,057 36,00 1,10 0,067 0,05 5 0.250
16.00 0,600 12,0 450 0,056 34,00 2,30 0,072 0,065 0,280
18,50 0,680 8,0 450 0,050 33,00 3,20 0,082 0,078 0,3 20
20,00 0.700 4,0 450 0,048 32,00 3,50 0,100 0,099 0,400
23,50 0,890 22,0 500 0.030 30,00 4,30 0,126 0,116 0.470
24,00 0.900 18,8 500 0,027 29,70 4,80 0,129 0,122 0.500
24,50 0,950 17,0 500 0,025 29,20 5,20 0,130 0,126 0.530
25,00 0,985 10,0 500 0.0 15 28,30 5,90 0,132 0,129 0,564
26.50 0.990 20,0 580 0,010 27,00 6,20 0,143 0.13 1 0,580
27,00 1,026 1 8,0 580 0,000 26,02 7,00 0.145 0,13 3 0,590
28,00 1.026 15,0 580 0,000 25,60 7,21 0,152 0,13 8 0.590
30.00 1,07 3 20,4 700 0,000 25,00 8,07 0,158 0,142 0,5 90
31,75 1,058 16,3 700 0,000 24,60 8,67 0,160 0,143 0,590
35,00 1,05 8 15,0 700 0,000 24,20 8,60 0,160 0,143 0,590
146
Resultados Experimentales
0,00 0,045 97,70 210 0,202 40,0 0,94 0,011 0,008 0,020
3,00 0,087 81,00 210 0,175 39.8 0,99 0,021 0,015 0,043
6,00 0,104 70,00 210 0,161 38,9 1,00 0,026 0.019 0,520
9,00 0,122 60,00 210 0,156 38,3 1,13 0,030 0,022 0,061
12,00 0,135 67,50 250 0,148 37,9 1,16 0,033 0,024 0,067
14,00 0,191 50,00 250 0,147 36,8 1,20 0,047 0,034 0,095
14,50 0,200 45,00 250 0,145 35,7 1,30 0,100 0,036 0,102
18,00 0,280 30,00 250 0,143 34,1 1,50 0,070 0,050 0,140
20,00 0,320 29,00 250 0,142 34,2 1,90 0,080 0,057 0,160
24,00 0,407 41,20 280 0,140 33,0 2,05 0,101 0,073 0,203
24,50 0,496 32,30 280 0,139 32,5 2,20 0,124 0,089 0,248
30,00 0,698 28,10 280 0,133 31,4 4,47 0,174 0,125 0,349
33,00 0,739 20,50 280 0,127 30,5 4,98 0,184 0,133 0,369
36,00 0,820 45,00 350 0,125 28,9 5,75 0,205 0,147 0,410
36,50 0,890 40,00 350 0,122 28,0 6,50 0,220 0,160 0,440
40,00 0,950 38,00 350 0,120 27,9 7,50 0,237 0,171 0,475
42,00 1,090 43,00 350 0,119 27,8 8,00 0,272 0,196 0,540
45,00 1,089 42,00 350 0,110 27,5 8,12 0,272 0,196 0,540
48,00 1,089 45,00 350 0,110 27,2 8,12 0,272 0,196 0,540
147
Resultados Experimentales
7~iacinNH
Tiempo Biomasa O-> 4~ Sacarosa Xantano DNA RNA Protenas
(h) ( IL) (%) fL~~L1J~2 (g/L) ~ (g/L) ( L) ( /L)
0,00 0.00853 99.80 210 0,0650 40,00 0,402 0,00 1 0.0008 0,003
1,50 0,0093 8 93.90 210 0,0620 39,86 0,402 0,002 0,0009 0,004
3,00 0,00980 92.82 210 0,0600 39,68 0,402 0,003 0,00 1 0,004
4,50 0,0110 91,20 210 0,05 50 39,42 0,5 12 0,005 0,00 1 0.006
6,00 0,0 140 87,30 210 0,0500 39,00 0.6 18 0,006 0,002 0,007
8,50 0,0330 82,50 210 0,0400 38,63 0,72 1 0,0 10 0.003 0,0 17
12,00 0,05 20 72.00 210 0,0330 37,50 0,980 0,0 12 0,004 0,029
16,00 0,1250 56.00 210 0.0220 36.25 1,230 0,030 0,004 0,073
20,00 0,290 35.00 210 0.0 180 35.00 2,700 0,041 0,010 0,142
23,50 0,640 22,10 210 0,0 120 34,18 3,520 0,054 0,0 18 0,258
24,50 0,660 19,10 210 0,0 lO 33,87 4,680 0,056 0,026 0,330
25.25 0,680 45,00 250 0,008 3 3,654 6,120 0,05 8 0.030 0,3 50
26,00 0,690 32,00 250 0,007 33,39 6,850 0,060 0,03 4 0,372
27.50 0,700 25,00 250 0,005 32,50 7,220 0.065 0,03 8 0,400
31,00 0,700 19,00 250 0,004 28,00 8,112 0,065 0,038 0,420
32,50 0,700 54,00 400 0,0009 27,55 9,850 0,065 0,03 8 0.420
33,00 0,700 43,00 400 0,0008 26,25 10,12 0,065 0,03 8 0,420
35,00 0,700 42.00 400 0,0008 26,00 10,12 0,065 0,03 8 0,420
40,00 0.700 40,00 400 0,0008 26,00 10,12 0.065 0,03 8 0.420
40.50 0,700 3 8.00 400 0,0008 26,00 10,12 0,065 0,03 8 0,420
43.00 0,700 38,50 400 0,0008 26,00 10,12 0,065 0.038 0,420
47,50 0.700 39,00 400 0,0008 26,00 10,12 0,065 0,03 8 0,420
50.50 0,700 40,00 400 0,0008 26,00 10,12 0,065 0.03 8 0,420
55,00 0,700 41,00 400 0,0008 26,00 10,12 0,065 0,03 8 0,420
148
Resultados Experimentales
0,00 0,011 100,0 210 0,130 39,7 0,521 0,001 0,00 1 0,006
2,50 0,0 15 98,0 210 0,129 39,5 0,52 1 0,002 0,00 1 0,008
3,50 0,017 93,0 210 0,129 39,3 0,52 1 0,002 0,002 0.010
5,50 0,026 86,0 210 0,128 39,0 0,54 1 0,004 0,003 0,0 14
7,50 0,027 78,0 210 0,128 38,7 0,56 1 0,005 0,003 0,015
8.50 0,034 70,0 210 0,127 38,5 0,58 1 0,006 0,004 0,0 19
9,25 0,055 67,0 210 0,127 38,0 0,623 0,008 0,006 0,027
10,50 0,07 5 55,0 210 0,126 37,7 0,792 0,012 0.009 0,03 2
16.00 0,098 35,0 210 0,120 36,7 1,480 0,0 15 0,020 0,056
20.00 0,300 26,0 210 0,110 35,9 1,980 0,045 0,036 0,174
24,25 0,5 80 18,0 210 0,063 34,9 2,3 50 0,079 0,069 0,336
25.00 0,654 45,0 310 0,044 34,6 2,297 0,082 0,07 8 0,379
26,50 0,69 1 33,0 310 0,020 33,3 3,297 0,103 0,083 0,400
28,50 0,703 32,0 310 0,012 32,5 4,016 0,105 0,084 0,405
30,50 0,706 29,0 310 0,009 31,0 5,105 0,105 0,084 0,409
31,50 0,708 25,0 310 0,007 30,2 5,920 0,106 0,085 0,4 10
32,00 0,709 23,0 310 0,004 29,0 7,080 0,106 0,085 0,4 13
33,50 0,710 20,0 310 0,003 27,5 8,939 0,106 0,085 0,413
38,00 0,712 19,0 310 0,002 26,0 10,300 0,106 0,085 0.415
45,00 0,712 30,0 450 0,002 24,0 11,200 0,106 0,085 0,4 15
49,00 0,7 12 21,0 450 0,002 23,5 11,500 0,106 0,085 0,4 15
50,00 0,712 19,0 450 0,002 21,7 12,000 0,106 0,085 0,4 15
51,00 0,712 18,0 450 0,002 21,0 12,900 0,106 0,085 0,4 15
149
J?esidtalos E.vperimenudes
150
Resultados Experimentales
Para el Experimento n0 2:
0 70
Cp(g/LO,34p< (cp) [3.2]
Para el Experimento n0 3:
Para el Experimento n0 4:
Para el Experimento n0 5:
Para el Experimento n0 6:
C~(g/L) = 0,77 ,u 03(cp) [3.6]
0
Para el Experimento n0 7:
151
4.- MODELO CINTICO
NO ESTRUCTURADO
Modelo Cintico No Estructurado
153
Modelo Cintico No Estructurado
154
Modelo Cintico No Estructurado
0.35
.8
[.6 0,30
025
.2
~L0 0,20
U 0.8 0,15 U
0,6 ojo
0.4
0,2 0,05
0.0 0,00
2.0
30 z
st,
20
U o
1,0
U
0.5
0,0
30
~ifl
Al primer grupo citado pertenecen los modelos propuestos por Moraine y Rogovin
(1966 y 1971), y por Quinlan y colaboradores (Quinlan y col., 1986; Schweickart y Quintan,
155
1Jode/o (Putico No Estruciurado
1989>. La diferencia entre ellos est en el tipo de ecuaciones cinticas empleadas para la
evolucin del crecimiento y la descripcin de la produccin.
Moraine y Rogovin (1966 y 1971) emplean ecuaciones tipo Monod (Ecuaciones (4.1]
y (4.3]). para describir la evolucin de xantano y biomasa, considerando el nitrgeno como
limitante del crecimiento, ecuacin (4.1] y la fuente de carbono limitante para la produccin
de xantano, ecuacin [4.3]. La evolucin de los dos sustratos con el tiempo vienen expresados
utilizando dos coeficientes estequiomtricos (ecuaciones [4.2) y [4.4)) denotados por Yp~5 e
YXN. Este modelo puede ser expresado por el siguiente sistema de ecuaciones:
dC~ _ C~ C
~ [4.1]
dt K~+ (j
di X y - k Y.
ecuacin logstica, pues esta funcin presenta una tendencia similar a la curva de crecimiento
del microorganismo, ecuacin [4.8]. La produccin de xantano y el consumo de la fuente de
carbono viene dado por ecuaciones tipo Luedeking-Piret (ecuaciones [4.9) y [4.10]). Sin
embargo, estos autores no tienen en cuenta la fuente de nitrgeno. Por tanto, este modelo
viene expresado por las siguientes ecuaciones:
dC~ Cx [4.8]
dt
dC~ _ _ .cn.dQ [4.9]
dr dt
dC~ a.c<~.dCx [4.10]
dr di
Ninguno de estos autores emplea tcnicas de regresin para obtener el valor de los
parmetros que aparecen en las ecuaciones anteriores, por el contrario emplean tcnicas de
estimacin por simplificacin de ecuaciones en puntos singulares, obteniendo unos valores
de los parmetros que proporcionan un ajuste experimental de forma aceptable, aunque solo
para un experimento en cada caso.
157
Gr
o
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Modelo Cinhco No Esiructurado
= Cx + [4.12]
dC\. -~ C1C<j
Ir 1 [4.13]
di YI%v>) C~, + li~ C~
159
Modelo Cintico No Estructurado
ky >x<> +C~.
- )~iv
j . <y 3
[4.15]
IC.~ )l 1
dC0 * un0 dE
di = kLaU (E0 C<3)
- - C~. + y0,1~ ~it [4.16)
Esta ecuacin [4.16] incluye un trmino para la transferencia de oxgeno desde el gas
y otro para el consumo de oxgeno tanto para mantenimiento como para crecimiento- tal y
-
como fue propuesto por Pinches y Pallent (1986). Para ello, es necesario emplear una
expresin para el coeficiente de transferencia de oxgeno, para lo cual se ha utilizado la
expresin dada en la ecuacin [4.17] (Gmez, 1995):
4V%43 N175 ~ -0>39 [4.17]
k1a~=3 ,08IcY
dE
di ~ (Z~ -k<C>~..m
8
< + C~ [4.18]
~\IV
160
Modelo Ciniico No Estructurado
Una vez calculados estos parmetros (kx e YxN), son sustituidos en la ecuacin
[4.13], emplendose,junto con las ecuaciones [4.14] y [4.16], para el clculo de los
parmetros ni5, Yxs y k~, por aplicacin de una regresin no lineal en multi-
respuesta acoplada al algoritmo de Runge-Kutta de cuarto orden (para la integracin
de las ecuaciones diferenciales sin integracin analtica posible).
161
Modelo Cintico No Estructurado
En las Tablas 4.2 a la 4.8 se recogen los valores calculados de los parmetros fisicos
y estadsticos obtenidos de la aplicacin del Modelo Cintico No Estructurado a los datos de
los experimentos realizados (experimentos del 1 al 7). As mismo, las Figuras 4.2 a 4.8
muestran la reproduccin de los datos experimentales con el MCNE aplicado. En todas las
figuras, la lnea continua corresponde a los valores proporcionados por el modelo MCNE,
y los simbolos a los datos experimentales obtenidos del anlisis de los diferentes
componentes durante la fermentacin.
162
Modelo Cintico No Estructurado
La Tabla 4.2 muestra los parmetros obtenidos del ajuste de] experimento n0 1,
realizado a 250 C y con 257 p.p.m de amonio inicial , todos los valores de los parmetros
cumplen las restricciones estadsticas, esto es, ninguno incluye el cero en sus intervalos de
confianza y se observa que los valores obtenidos de la t de Student ms bajos corresponden
a los parmetros obtenidos del ajuste de la concentracin de oxigeno (m
0 , Y0j, y los
valores ms altos, a los obtenidos del ajuste de la concentracin de azcar ( ms, Yxs y kv).
En la Figura 4.2-a, se muestra el ajuste de la evolucin de la biomasa a la ecuacin logstica,
donde se observa la buena reproduccin de los datos experimentales a esta funcin; sin
embargo, en la misma grfica se muestran los resultados obtenidos en el ajuste de la
evolucin del nitrgeno, donde puede observarse que este modelo es incapaz de predecir un
buena evolucin de este componente. En cuanto a la evolucin del resto de componentes,
tanto la evolucin de la sacarosa y como la del xantano son buenos, mientras que para el
oxgeno no se consigue un buen ajuste (Figura 4.2-b).
Los parmetros obtenidos del ajuste al MCNE del experimento n 2 realizado a 280
C y con 257 p.p.m de amonio inicial, son recogidos en la Tabla 4.3, donde se puede
observar que los intervalos de confianza de los parmetros obtenidos del ajuste al MCNE no
incluyen el cero y que, al igual que en el experimento anterior, se observan unos valores
muy bajos de la t de Student para los parmetros correspondientes a la evolucin de
oxgeno disuelto, quedando reflejado en la mala reproduccin de este componente, tal como
muestra la Figura 4.3-b; mientras que para las concentraciones de sacarosa y xantano los
resultados del ajuste son buenos. En la Figura 4.3-a se muestra la excelente reproduccin de
la concentracin de la biomasa con la ecuacin logstica, mientras que la reproduccin de la
evolucin del amonio de nuevo es defectuosa, aunque es mejor que la obtenida en el
experimento anterior. Se reproduce bien el consumo de la fuente nitrogenada durante la fase
exponencial, no siendo bueno el ajuste en la fase estacionaria del crecimiento.
163
Modelo Einiico No Estructurado
indicara que a esta temperatura este parmetro no tiene influencia y, fisiolgicamente, que
el microorganismo no consume azcar para su mantenimiento. Para poder realizar el ajuste
posterior de la evolucin del oxgeno en simple respuesta, es necesario emplear los
parmetros ms, Yxs y k~ obtenidos del ajuste en mltiple-respuesta del xantano y la
sacarosa. Debido a que no es posible introducir un valor de m~ negativo, se volvi a realizar
el ajuste fijando m8 en valor cero, obtenindose as nuevos valores de Yxs y k~, los cuales
se muestran en la Tabla 4.5-b. Estos nuevos valores de los parmetros freron utilizados para
la obtencin de los correspondientes para el oxigeno disuelto. Las restricciones estadsticas
se cumplen para todos los parmetros, los intervalos de confianza son estrechos, siendo algo
ms amplios para el parmetro Y~~,parmetro que a su vez presenta un valor de la t de
prcticamente en el lmite del valor terico, tabulado para un 95% de confianza. La Figura
4.6-a muestra la buena reproduccin de la biomasa con la ecuacin logstica, mientras que
la evolucin de nitrgeno, muestra un mal resultado en cuanto a la reproduccin de los
resultados experimentales. En la Figura 4.6-b aparece el ajuste de la evolucin de xantano y
de sacarosa, en los que el resultado es aceptable, mientras que para la concentracin de
oxgeno la reproduccin obtenida no es suficientemente buena.
164
Modelo Cintico A~o Estructurado
Por ltimo, la Tabla 4.8 muestra los valores fisicos y estadsticos obtenidos por
0 6 realizado a 28 0C y con 475 p.p.m. de
ajuste a este modelo para el experimento n
amonio. Tanto los parmetros representativos de la biomasa, como los correspondientes a
la sacarosa y xantano cumplen tas restricciones estadsticas impuestas. El parmetro mox
proporciona un valor que incluye el cero, obtenindose un valor de la t de Student que est
por debajo del tabulado. En cuanto al parmetro Y
0~, posee un valor de t de Student
muy bajo, prcticamente en el lmite del valor tabulado al 95% de confianza. La evolucin
de oxigeno disuelto (Figura 4.8-b) obtenida de este ajuste, al igual que en todos los
experimentos anteriores, no es buena, sin embargo, tambin como en casos anteriores, la
reproduccin obtenida para evolucin de sacarosa y xantano es aceptable. La reproduccin
de la evolucin de la concentracin de biomasa (Figura 4.8-a) de este experimento, al igual
que en todos los anteriores, es muy buena. En cambio, para la evolucin del amonio, la
reproduccin obtenida no se corresponde bien con los valores experimentales, tal como se
ha ido viendo en el ajuste del resto de los experimentos.
165
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Modelo Cintico No Estructurado
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O lO 20 30 40 50 60
(h)
Figura 4.2- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 1 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 250 C, 257 p.p.m. de
amonio y programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
167
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Modelo Cintico No Estructurado
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O lO 20 30 40 50 60 70
t(h)
Figura 4.3- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 2 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 280 C, medio A (257 p.p.m.
de amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
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Figura 4.4- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 3 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 310 C, medio A (257
p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
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Figura 4.5- Ajuste de los datos experimentales del experimento u
temperatura de 340 C, medio A (257
con Xanihomonas campesiris a la
p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
1 74
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Figura 4.6- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 5 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 28 C, medio A (65 p.p.m.
de amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
176
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Modelo Cintico No Estructurado
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Figura 4.7- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 6 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a a temperatura de 280 U, medio A (136
p.p.ni. de amonio), programacton de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxigeno disuelto
178
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Modelo Cintico No Estructurado
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Figura 4.8- Ajuste de los datos experimentales del experimento 7 al MCNE, realizado con
Xanthomonas campestris a la temperatura de 28~ C, medio A (475 pp.ni. de
amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
180
Modelo Cintico No Estructurado
4.3.- DISCUSIN
En las Figuras 4.9 y 4.10 se muestran las evoluciones de los parmetros obtenidos del
ajuste al MCNE para los experimentos realizados a diferentes temperaturas.
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Tcq,erat,ira (~Q Terq,emtura (C)
Figura 4.9.- Evolucin de los parmetros con la temperatura obtenidos por ajuste con la
ecuacin logstica.
181
Modelo Cintico No Estructurado
En la Figura 4.10 (a, ti, c) se muestran las evoluciones de los parmetros relacionados
con las ve!ocidades de produccin del xantano y consumo de azcar en fimcin de la
temperatura. La tendencia de m8 y Yxs presenta un valor mximo a 310 C, mientras que el
tienen una tendencia ms o menos lineal con dicha variable; m0 muestra una evolucin
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Figura 4.10.- Evolucin de los parmetros del MCNE con la temperatura. La lnea discontinua
indica la tendencia terica de los parmetros y la continua el ajuste del modelo
en funcin de la temperatura (MCNE(T)).
(a) m~ (b) Yxs (c) k~ (d)m02 (e) Y01.
182
Modelo Cintico No Estructurado
parmetros tienen una tendencia ms o menos lineal con dicha variable. rn0, presenta una -
= ( C1 . (T Tmrn) [1 exp(C% (T
- . - [4.23]
Y (T)=C3 [4.24]
xs
La Tabla 4.9 muestra los parmetros obtenidos del ajuste de los cuatro experimentos
realizados a distintas temperaturas a este modelo en funcin de dicha temperatura. Como
puede observarse, los parmetros correspondientes al parmetro m5 dan un resultado
estadstico aceptable al igual que sucede con el parmetro Yxs donde se observa el valor
elevado de la t de Student. En cuanto a los parmetros C y C,, correspondientes al ajuste del
83
Modelo Cintico Nro Estructurada
parmetro k~ a una funcin de tipo Ratkowsky. se observa que ambos incJuyen el cero y
ninguno supera el valor de t de Student tabulado.
= a+fiT [4.26]
184
Modelo Cintico No Estructurado
185
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Modelo Cintico No Estructurado
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Modelo Cintico No Estructurado
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Modelo Cintico No Estructurado
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189
- Vot/e/o Cintico No Estructurado
Ninguno de los parmetros del MCNE muestra una tendencia clara ni lgica en
funcin de la concentracin de amonio. Por ello, en este caso no es posible siquiera plantear
ecuaciones matemticas para proponer un modelo cintico en funcin de la variable
estudiada, tal como se intent en el caso de la temperatura. Adems, con este modelo no fue
posible obtener una buena reproduccin de la evolucin del amonio, tal como fue mostrado
en las Figuras 4.2a a 4.Ba. Por tanto, es lgico pensar que el modelo es incapaz de mostrar
una evolucin de parmetros en funcin de esta variable.
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192
Modelo Cintico No Estructurado
Simulacin Valores
C50 10g/L
Influencia de la concentracin Cso = 20 g/L
azcar inicial C50 = 40 g/L
Cso SOgfL
193
Modelo Cintico No Estructurado
alcanzada, puesto que sta se estabiliza cuando se acaba el azcar. El consumo de sacarosa,
como es lgico. es ms rpido cuanto ms rpida es la produccion.
194
Modelo Cintico No Estructurado
3 0,3
2 0,2
cf
(3<
o,
o 0.0
0 20 40 60 80
t(h)
Figura 4.17.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico no estructurado: influencia de la
concentracin inicial de biomasa sobre la evolucin de biomasa.
40
t(h)
195
Modelo Cintico No Estructurado
25
2,5
20
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(h)
196
Modelo Cintico A~o Estructurado
En la Figura 4.21 puede verse como influyen las diferentes concentraciones de azcar
sobre la evolucin de la biomasa durante el proceso. El modelo predice que cuanto mayor es
la concentracin de sacarosa mayor es la concentracin de xantano, siendo capaz de predecir
que la produccin cese cuando la concentracin de azcar es cero, debido a que la ecuacin
correspondiente a la velocidad de produccin de xantano aparece la concentracin de azcar.
2,0 0,3
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0,2
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cf
0,1
0,5
0,. 0,0
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197
Modelo Cintico No Estructurado
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Modelo Cintico No Estructurado
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199
Modelo Cintico No Estructurado
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0 20 40 60 80 (jo
t(h)
200
Modelo Cintico No Estructurado
A lo largo de este apartado se han ido exponiendo los diferentes resultados obtenidos
con el MCNE propuesto, tanto en ajustes a datos experimentales como en las distintas
simulaciones. Se ha visto que se ha conseguido un buen resultado al aplicar el MCNE a los
diferentes experimentos realizados en este trabajo en las evoluciones de biomasa, xantano y
sacarosa; sin embargo, este modelo es incapaz de predecir una buena evolucin del oxigeno y
del amonio.
Las simulaciones fueron realizadas tomando como parmetros los obtenidos por ajuste
del experimento central aquel realizado con las condiciones ptimas (Santos,1993)-.Se han
realizado las simulaciones oportunas con el fin de observar la validez del modelo planteado.
Al comparar los resultados obtenidos a partir de las diferentes simulaciones con los
resultados experimentales, se ha podido llegar a las siguientes conclusiones respecto a lo que
el Modelo Cintico No Estructurado es capaz de predecir:
201
liodelo Cintico No Estructurado
Por todo ello, se puede concluir que el modelo cintico no estructurado permite
predecir bien la influencia de azcar inicial en el medio, y la influencia de la biomasa inicial,
en cambio no permite obtener buenas predicciones de la evolucin de oxgeno disuelto,
variable se suma importancia en este proceso. As pues, el Modelo Cintico No Estructurado
no es suficiente para la descripcin de la produccin de xantano. Se hace, pues, necesario
mejorar el modelo de modo que se consiga una mejora en las predicciones de las
evoluciones de os componentes. Ello implica tener en cuenta en el modelo factores que
influyen en el proceso y, que no han sido considerados hasta el momento. En cl prximo
apanado se aplicar un modelo cintico ms complejo, esto es un Modelo Cintico
Metablico que, es de esperar, mejore significativamente la descripcin de la produccin de
xantano.
202
5.- MODELO CIN mo
METABLICO
Modelo Cintico Metablico
Como ya se ha visto, los modelos cinticos no estructurados son buenos para describir
el sistema cuando la composicin celular est aproximadamente en estado estacionario o no es
necesario tener en cuenta la influencia de ciertas variables en los valores de los parmetros. Sin
embargo, en una situacin en la tienen lugar cambios en la composicin celular, los modelos
no estructurados proporcionan una pobre aproximacin a la realidad. Por otra parte, es lgico
pensar que los modelos no estructurados no sean capaces de reflejar la influencia de ciertas
variables, fundamentalmente la composicin del medio, tal como ha quedado reflejado en el
apartado anterior. Para salvar estas debilidades en este tipo de casos, hay que recurrir a los
modelos estructurados.
Estos ltimos fueron clasificados por Nielsen y Villadsen (1992) en varios tipos, tal
como se detall en el primer captulo de esta Memoria. Dentro de esta clasificacin, se
encuentran los Modelos Cinticos Metablicos (MCM), los cuales no estructuran la biomasa,
pero plantean relaciones estequiomtricas definidas para el metabolismo del sustrato carbonado
(Kogaycol. 1969; HallyBarford 1981; Barfordy col. 1992).
203
Modelo Cintico Metablico
20~
Modelo Cintico Metablico
LIPIDO-P
UDP- GLc .~1
GIc
Gle SP .GIc1P
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IDP-GIc
14UMP
LIPIDO-P-P-G(c
IDP
UDP-Ac Gle LIP!DO-P-P-GIc-GIc
LIPIDO-Gle-Gle-Man-Ac-GIc
PVR= Man
Gte Gle
Man
Ac Gte
Man= Pyr
MONOMERO DE XANTANO
Figura 5.1.- Rutas del catabolismo de glucosa y sntesis de xantano empleadas por
Xanthomonas campestris.
205
Modelo Cintico Meablicc
Las relaciones estequiomtricas planteadas por estos autores para la evolucin de los
diferentes componentes son las siguientes:
Las ecuaciones [5.1] y [5.3] son multiplicadas por los coeficientes estequiomtricos
que estos autores han extrado de la literatura, y se muestran la siguiente ecuacin:
206<
Modelo Cintico Metablico
qg = qj +5,49 qx [5.8]
207
Modelo Cintico Metablico
_ [5.15]
q ~
~ATP
____ _
89+ E [5.16]
2 08a
Modelo Cintico Metablico
Por tanto, el modelo propuesto por Pons y col. (1989) se puede escribir, adaptndolo a]
mtodo utilizado en esta Memoria:
209
klodelo Cintico Aetablk~
Evolucin de biomasa:
dCb
=/; [5.20]
dt
Evolucin de xantano:
dCx
= [5.21]
Evolucin de glucosa:
dCg
[5.22]
It
Evolucin de oxgeno:
dC0
= kLaV(C * Co:) ros [5.231
dt
dC<
dt [5.24]
Las velocidades de reaccin planteadas para las reacciones del esquema, en el que
intervienen la biomasa, el sustrato carbonado, oxgeno y dixido de carbono son:
Para la biomasa:
(1 +4. Y? -
rx = Ch qr. [5.25]
(3,58 + 4~ Yr - ArZ)
Para la glucosa:
Yx - MP
(5,49 + 20,77 Y~ p + - (----)
Kg = C8 qr
________________ 3 [5.26]
(3,58+4Yr-ATP)
Para el oxgeno:
r o~ = 0,5 Ch qr [5.27]
lCt [5.29]
rh=/JMCh.( )
Ch,.
qr = qrM Co: (Kc Coz) [5.301
Pons y col. (1989) slo realizan ajuste de datos experimentales de la biomasa para la
cual emplean la ecuacin logstica. Para el resto de componentes realizan slo una simulacin.
Para la integracin de las ecuaciones diferenciales emplean el algoritmo de RungeKutta de
cuarto orden. Al comparar los resultados obtenidos de la simulacin del modelo con los
resultados experimentales confirman la validez del modelo propuesto.
Pons y col. (1989) plantean el modelo que se ha descrito para un reactor tipo columna
de burbujeo, por ello, no es posible la aplicacin directa de este modelo propuesto a los datos
experimentales obtenidos en el presente trabajo. unido a esto, tampoco realizaban un ajuste de
los datos experimentales para obtener los parmetros del modelo. Por esto, se ha formulado un
modelo cintico metablico para la produccin de xantano en un tanque agitado, teniendo en
cuenta para ello algunas de las consideraciones planteadas en el Modelo Metablico propuesto
por Pons y col. (1989).
21]
Modelo Cintico Metablico
Por tanto, las velocidades de produccin de los componentes, suponiendo que toda la
sacarosa -sustrato carbonado empleado en este trabajo- es asumido en las ecuaciones como
glucosa, son:
dC
3 5,49 rir~ [5.34]
It
dC~ = ri [5.35]
dt
= 10,89ri+3re--r3 rs [5.36]
It
212
Modelo Cintico ;Vletablico
Segn Pons y col (1989) la cintica de la reaccin dada por la ecuacin [5.7] es:
k4Co:
r4= ______ Cx [5.39]
K4+ Co:)
Sustituyendo en esta ltima ecuacin las ecuaciones [5.39] y [5.40] y despejando r2, se
obtiene:
1 k4~Co
r2 = . _________ CxI1 [5.451
12 K4+Co, YA TPPjI ji
Los valores de Y,~, y YATPP se han fijado en los propuestos porPons y col. (1989):
Yrp W,2~
Co
[5.46]
K4 + Co.
YATPP 34 [5.47]
213
Modelo Cintico Metablico
Para la biomasa:
dOy (Cv 6 Cx
Para el azcar:
dCs
___ =180
J 5,94
____ ___
dO 1 MCc, F(
Cx.tl358d
1+4Yrp Ml
LK
. -. -
Para el producto:
k4 Co, ( 14Y
1~
___ r:923,2. K4CO, K3, Cx [5.50]
It 58 + 4. YATPP
Por tanto, el Modelo Cintico Metablico propuesto tiene de siete parmetros, los
representativos de la biomasa : k~ y YxN -obtenidos de la misma forma que en el MINE- y los
parmetros correspondientes a la evolucin de azcar, xantano y oxgeno disuelto: k4, 1<4, Y~<5,
Yox. En este caso, la aplicacin del MCM a los datos experimentales para la obtencin de los
parmetros se realiz de la siguiente forma:
21~
Modelo Cintico Metablico
215
Modelo Cintico Metablico
Para la aplicacin del modelo cintico metablico planteado se han realizado los ajustes
de los experimentos del 1 al 7. Al efectuar el ajuste de los datos experimentales obtenidos, se
observ que el modelo era incapaz de ajustar los datos de ciertos experimentos debido a la falta
de convergencia del algoritmo. En la Tabla 5.1 se muestran los resultados de los parmetros
fisicos y estadsticos de los experimentos donde se pudo aplicar el MCM.
Todos los ajustes realizados han proporcionado niveles de confianza superiores al 950~,
hay que apuntar que los valores obtenidos para el parametro K4 son mucho ms altos que la
concentracin de oxgeno disuelto, por lo que las ecuaciones [5.39] y [5.46], pueden ser
simplificadas a orden 1 de la siguiente manera:
k4Co
Cx~kCo Cx [5.52]
KqCo
Yrp=L2 Co, kCo, [5.53]
K4Co, -
En las Tablas 5.2 a 5.8 se recogen los valores de los parmetros fisicos y estadsticos
obtenidos de la aplicacin del MCMS a los experimentos del 1 al 7. Las Figuras 5.2 a 5.8
muestran las reproducciones del modelo correspondientes a cada experimento al realizar dicho
ajuste. En estas figuras, la lnea continua representa la reproduccin obtenida de la aplicacin
del modelo mientras que los smbolos indican los puntos experimentales.
En la Tabla 5.2 se muestran los parmetros obtenidos por ajuste del experimento no i,
0C y con 257 p.p.m. de amonio inicial, como puede observarse, todos los
realizado a 25
parmetros obtenidos cumplen las restricciones estadsticas impuestas, todos los parmetros
presentan intervalos de confianza estrechos, presentando valores tanto de la t de Student como
de la F de Fischer elevados. En cuanto a la reproduccin de Jos datos experimentales reflejada
en la Figura 5.2, se observa que para este experimento el modelo predice de forma adecuada
216
Modelo Cintico Metablico
Los parmetros obtenidos del ajuste del experimento n0 2, es decir el realizado en las
condiciones ptimas de produccin: 28 0C y 257 p.p.m de amonio (Santos, 1.993), aparecen en
la Tabla 5.3. Todos los parmetros obtenidos rinden intervalos de confianza superiores al 95%,
si bien hay que apuntar que el valor de t de Student del parmetro Yox es relativamente bajo.
El ajuste de los datos experimentales obtenido para este experimento es significativamente
mejor que el que se obtuvo para el mismo experimento con el MCNE. Para este experimento,
el MCMS muestra una excelente reproduccin de la evolucin de los tres componentes
(sacarosa, xantano y oxigeno disuelto) tal como se observa en la Figura 5.3.
En la Tabla 5.6 aparecen los valores de todos los parmetros obtenidos al aplicar el
MCMS al experimento n~ 5, realizado a 28 0C con 65 p.p.m. de amonio. En dicha tabla
puede apreciarse que se cumplen las restricciones estadsticas, siendo el valor ms bajo de t de
Student el obtenido para el parmetro Yox. En cuanto a la reproduccin de la evolucin de los
los componentes con este modelo, se obtiene una evolucin de la concentracin de sacarosa
aceptable mientras que la evolucin de la concentracin de xantano y oxgeno disuelto
difieren bastante de las obtenidas experimentalmente, tal como muestra la Figura 5.6.
217
Modelo Cintico Metablico
La Tabla 5.8 muestra los parmetros obtenidos del ajuste al modelo para el
experimento realizado a 28 0C con 514 p.p.m. de amonio (experimento n0 7). Hay que
destacar el valor significativamente alto del parmetro k, el cual es aproximadamente 2
rdenes de magnitud superior al obtenido en el resto de experimentos. Adems, el valor
obtenido para la t de Student no supera el valor tabulado con un 95% de confianza. Otro
parmetro en el que se obtiene un valor bajo de la t de Student es k, este parmetro entra
dentro del limite terico pero el valor es bajo en comparacin con los experimentos anteriores.
En cuanto a la reproduccin de los datos experimentales, en la Figura 5.8 se observa una
reproduccin aceptable para la evolucin de sacarosa, no siendo tan buena para la
concentracin de xantano ni para el oxgeno disuelto.
2/8
Modelo Cintico Metablico
Tabla 5.1. -Valores fisicos y estadsticos de los parmetros obtenidos mediante el ajuste de los
datos de los experimentos 2,3, y 4 al MCM.
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219
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Modelo Cintico Metablico
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Figura 5.2.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento n0 1, realizado con Xant/zotnonas carnpestris a la temperatura
de 250 C, medio A (257 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210
r.p.m. inicial).
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Figura 5.3.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento n0 2, realizado con Xanthotnonas campestris a la temperatura
de 280 C, medio A (257 p.p.ni. de amonio), programacin de agitacin (210
r.p.m. inicial).
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Modelo Cintico Metablico
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Figura 5.4.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento no 3, realizado con Xanthomonas campestris a la temperatura
de 310 C, medio A (257 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210
r.p.m. inicial).
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Figura 5.5-- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento n0 4, realizado con Xanthomonas carnpestrs a la temperatura
de 340 C, medio A (257 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210
r.p.m. inicial).
228
Modelo Cintico Metablico
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Figura 5.6.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento n0 5, realizado con Xanthornonas campestris a la temperatura
de 280 C, medio A (65 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210
r.p.m. inicial).
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Figura 5.7.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento ~0 6, realizado con Xanthomonas campestris a la temperatura
de 280 C, medio A (130 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin
(210 r.p.m. inicial).
229
Modelo Cintico Metablico
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Figura 5.8.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento n0 7, realizado con Xantho,nonas campestris a la temperatura
de 280 C, medio A (475 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210
r.p.m. inicial).
230
Modelo Cintico Metablico
5.3. DISCUSIN
En la Figura 5.9 se muestran las tendencias de los parmetros del modelo (MCMS) con
la temperatura. No se han considerado los parmetros correspondientes al crecimiento debido a
que la biomasa se ha considerado sin estructuracin y, por tanto, los resultados son los mismos
que en el MCNE. vistos en el captulo anterior.
De acuerdo con estas tendencias, los cuatro experimentos han sido ajustados
conjuntamente al MCMS, teniendo en cuenta la influencia de los parmetros con la
temperatura, de la misma forma que se realiz para los parmetros del modelo MCNE, visto en
el captulo antenor.
231
Modelo Cintico Metablico
kYT)=a/3-T [5.57]
Este modelo MCMS(T), tiene doce parmetros: C1, Tmin, C2, Tn,a,c, C, Tmin, C2, Ti,,a<,,
a, fl, a y fl, tal como se indica en las ecuaciones anteriores. En la Tabla 5.9 aparecen los
valores de los parmetros y sus estadsticas, obtenidos del ajuste de los cuatro experimentos
realizados a diferentes temperaturas, donde los parmetros relativos a la frente carbonada, al
xantano y al oxigeno disuelto han sido puestos en funcin de la temperatura de la forma
indicada. Como se observa, para todos los parmetros se cumplen las restricciones estadsticas
superando siempre el valor terico de t de Student y de F de Fischer.
Las tendencias obtenidas para estos cuatro parmetros cuando son ajustados
conjuntamente, se mostraron en la Figura 59, donde el resultado de este ajuste era el
representado por la lnea continua. Este ajuste es el resultado de sustituir los valores de
temperatura en las ecuaciones [5.54] a [5.57] con los valores de los parmetros obtenidos,
de la siguiente forma:
232
Mode/o Cintico Metablico
140
120- 120
1007 100-
80- ~,, 80
60 ~ 60
Sr
40- ~ 40-
207
o 20-
20 25 30 35 o
T(0C) 20 25 30 35
T<0C)
180 0,25
160
0,2 ,% -
140
120 045 1~>
GO
x 100 x
o
>- 80 0,1
60
40 0,05
20
o o
25 30 35 20 25 30 35
20
Tc7C)
T (OC)
Figura 5.9- Evolucin de los parmetros del MCMS con la temperatura. La lnea
discontinua indica la tendencia de los parmetros obtenidos experimento a
experimento, la lnea continua representa el ajuste a las ecuaciones [5.54] a
[5.58].
233
la
e-
la
~Jt
H o
[4.
2- o-.> [4 0 o-.> 0 L 4 -O
4 [4O 0 $. -~ L <DO
4- La [4 00 Os -0 4- [4 00 La 4- - -t -t
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la
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-4 -e
0 1, o
o
O
-j
<o
la
CD
U,
O-
o-.> Qn
o
00
o e
Modelo Cintico Metablico
2,5
40
35
2,0
30
15~
25
(-5- 20- o
-4 1,0:
15
cf
un 0,5
0,0
O 10 20 30 40 50 60
t (h)
2,5
2,0
1,5?
(-5- ib-
1,0 ~
4$9
(y
0,5
0,0
t(h)
235
Modelo Cintico Metablico
40
2,0
35
30
1.5
25
-2
(-5- 20
$9 1~0
cf I5
(-y
I0~
0,5
5
o
0,0
20 40
t (h)
2,5
40
35
2,0
30
25
l,5~
20 ib-
$9 3-
U
z [5
1,0
lo
5 0,5
t (h)
Figura 5.13.- Reproduccin de los datos del experimento ~0 4 realizado a 340 C, medio
A (con 257 p.p.m. de amonio) y programacin de agitacin (210 r.p.m.) al
MCMS (T).
236
Modelo Cintico Metablico
Los experimentos llevados a cabo con 130 p.p.m. y 257 p.p.m. de amonio rendan
buenos resultados, tanto desde un punto de vista estadstico, como en la reproduccin de los
resultados experimentales.
237
Modelo Cintico Metablico
so 1,1111
5)00
(a) (b)
-1)00 - 60-
,,
x00 -
-40-
~oo -
~1~
A
20 0
-1-
1000 -
O ~
0 O -:
n y
0 lOO 200 300 400 500 0 100 200 300 400 500 600
Amonio (ppm) Amonio (ppm)
600-
c
1~
300
tOi5 3$ ~
20<1 - 1- -H It
1(X)
1 1)10
1)
0 [00 200 300 400 500 600 1 i 1 i
Figura 5.14.- Evolucin de los parmetros del MCMS con la concentracin de amonio inicia].
La lnea discontinua indica la tendencia de los parmetros obtenidos
experimento a experimento.
238
Modelo Cintico Metablico
En este captulo se ha visto que el MCM ha podido ser obtenido en funcin de una
de las variables estudiadas, concretamente, de la temperatura. En cambio no se ha planteado
un modelo que tenga en cuenta la variacin de la concentracin inicial de amonio, lo cual es
lgico si se tiene en cuenta que la concentracin de amonio slo influye en el crecimiento -
Las simulaciones realizadas en este captulo son las mismas que en el captulo
anterior. Se han realizado aquellas con las que, en principio, cabra esperar mayor influencia
en la evolucin de componentes, como biomasa inicial, concentracin de azcar inicial y
concentracin de oxigeno disuelto.
239
Modelo Cintico Me/abdico
Por el contrario, en la evolucin del producto no debe de influir, pues la ecuacin que
expresa la citada evolucin (ecuacin [5.50]), no presenta en su expresin la concentracin
del azcar.
Simulacin Valores
Cso IOg/l
Influencia del azcar inicial Cso = 20 gIl
40 gIl
CsoSOg/l
240
Modelo Cintico Metablico
241
Modelo Cintico Metablico
0.30
025
020
0,1 5
4 j
u
0.10
0.05
0,00
t <h)
(3-
a
cf
30 60
t (Fi)
242
Modelo Cintico Metablico
25
2,5
20
2,0
15-y
6
(4,
1
>1
lo
(-3
5
0,5
o o
0 20 40 60
t (h)
243
Modelo Cintico Metablico
En la Figura 5.19 puede verse como influyen las diferentes concentraciones iniciales
de azcar sobre la velocidad de produccin de xantano durante el proceso. El modelo es
incapaz de predecir la influencia del azcar en la evolucin del producto, ya que la cantidad
de xantano obtenida es siempre igual, independientemente de la concentracin de azcar de
la que se parta.
244
Modelo Cintico Metablico
2,0 0,3
1,5
0,2
1,0
cf cf
0,I
0,5
0,0 0,0
loo
t (h)
(-y-
(-y.>
0 10 20 30 40 50 60 70
t (Ii)
Figura 5.19.- Simulacin MCMI con diferentes concentraciones iniciales de
sacarosa, influencia en la evolucin de sacarosa y xantano.
245
A-/adela Cintico Metablica
2,5 25
2.0 20
-5 I5
-t
O ,0 I
0-i
(-3
0,5
5
0,0
o
0
t (h>
246
Modelo Cintico Metablico
40
1,5 35
30
25~
Z 10
u
4
s u
u
5
0,5
lo
0,0 o
70
t (h)
Figura 5.21.- Simulacin MCMST con valores de kLav, influencia en la evolucin de la
biomasa, xantano y evolucin de azcar.
247
Modelo Cintico Metablico
2- 45
40
1,5-
30
25~
~ tO (-5-
202
(3<
0,5 10
0,0 0
t (h)
248
Modelo Cintico Metablico
A lo largo de este apartado se han ido exponiendo los diferentes resultados obtenidos
con el MCMT propuesto, tanto los obtenidos en ajustes a datos experimentales como en las
distintas simulaciones realizadas.
No fue posible obtener una relacin de los parmetros cinticos calculados para
experimentos realizados con distintas concentraciones de amonio, debido a que los parmetros
obtenidos no presentaban una tendencia lgica respecto de la concentracin inicial de dicho
sustrato nitrogenado.
Por todo esto, el Modelo Cintico Metablico permite una buena reproduccin de
datos experimentales de la concentracin de xantano, sacarosa y oxigeno disuelto. Este
ltimo componente no pudo ser reproducido de forma adecuada por el MCNE.
250
r
6.- MODELO CINE liCO
DE CLULA
Modelo Cintico de Clula
Todos los modelos de este tipo existentes en la literatura explican slo el crecimiento
de microorganismos, y estn desarrollados para aquellos muy conocidos como la bacteria
Escherichia coli o la levadura Saccharomyces cerevisiae. Los modelos de clula se
caracterizan por tener un elevado nmero de parmetros (entre 74 y 200), los cuales son
obtenidos siempre de datos de la bibliografia. En ningn trabajo se presentan valores de los
parmetros calculados mediante ajuste de datos experimentales. Esto es debido
fundamentalmente a dos razones: una con relacin al elevado nmero de parmetros que
presentan los modelos cinticos de clula, lo que implica una gran dificultad a la hora de
abordar matemticamente el problema; la otra, tiene relacin con el anlisis de los
componentes clave del sistema. El seguimiento de componentes intracelulares presenta una
especial dificultad para obtener datos fiables que puedan ser utilizados en el modelo cintico.
251
Modelo Cintico de C.lula
252
Modelo Cintico de Clula
,4TP
NAD~
Glucosa-6P
IMP (iMP
Ac 6 Fosfoglucnico
IMP GMP
4
ATP
4, GTP
4,
ir 14TP NAD~
Piruvato ir
k AMINOCIDOS
OXIDACIN-REDUCCIN
,4cet1 coA
Oxaacetato Isocilrato
dATP dGTP dCTP dUMP
dTTP
CO2 ATP
253
Modelo Cintico de (u/a
Se han intentado varios caminos para realizar este anlisis cintico. Fundamentalmente
dos (Garca-Ochoa y Romero, 1993):
Estudiar una a una las reacciones del esquema, para reducir la complejidad del problema a
una suma de reacciones simples, si bien no siempre es posible aplicar este procedimiento.
254
Modelo Cintico de Clula
En consecuencia las etapas a seguir en la formulacin del modelo cintico de clula son
las siguientes:
Una vez conocidas las especies quimicas, se debe plantear un esquema simplificado de
reaccin. Para llegar a l, se debe realizar un anlisis exhaustivo de los datos experimentales.
Adems, se aplicar lumping de las especies qumicas que forman este sistema, llegando,
posteriormente, a la formulacin de las ecuaciones de filiacin (o relaciones estequiomtricas
defmidas) de los diferentes compuestos que intervienen en las reacciones.
Una vez calculados los parmetros, es necesario comprobar la reproducibilidad del modelo.
Para ello debe formularse el modelo cintico, mediante combinacin de las ecuaciones
cinticas para determinar las velocidades de reaccin. Si ste no es aceptable, es necesano
recurrir a otro modelo, siendo primordial el establecimiento de criterios para realizar la
discriminacin en esta etapa (Garca-Ochoa y Romero, 1993).
El estudio estequiomtrico del sistema objeto de estudio puede ser de notable ayuda en
los primeros pasos de la formulacin de la red de reaccin. La infonnacin que se debe obtener
es:
- El nmero de componentes clave.
- El nmero de relaciones independientes entre las especies qumicas que participan.
- Cmo pueden calcularse los cambios en la composicin del sistema conociendo los cambios
en la concentracin de los componentes clave.
255
Modelo Cintico de Clula
Esta informacin es muy importante para la determinacin del mtodo analtico capaz
de seguir los cambios en la composicin. Adems, puede ser de gran utilidad para la propuesta
del esquema de reaccin debido a que el nmero mnimo de reacciones que deben incluirse en
el esquema debe coincidir con el nmero de variables independientes y con el nmero de
componentes clave. En este caso, en principio, se ha optado por asumir la biomasa por tres
especies intracelulares: protenas RNA y DNA. Esta hiptesis se contrastar ms adelante.
- El nmero de reacciones y de especies implicadas varian segn los casos, desde cuatro
a cinco especies hasta cientos de ellas, aunque como se ver ms adelante es muy
conveniente que coincidan el nmero de componentes clave y el de reacciones del
esquema.
256
Modelo Cintico de Clula
Al analizar una red compleja de reacciones, como debe ser el esquema simplificado
propuesto en el apartado anterior, las ecuaciones que ligan las magnitudes medibles
(velocidades de produccin o concentraciones) con las magnitudes que hay que determinar, en
funcin de las condiciones de operacin (velocidades de reaccin), son (Garca-Ochoa y
Romero, 1993):
NR
i1
dC NR
R~= ~=Zv,1.k,.fi(Cx);(C1=1...NC) [6.3]
257
Modelo Cintico de Clula
vr [6.4]
Clculo de las velocidades de produccin Rj, para los NC componentes clave. Este clculo
se realiza por ajuste de los datos experimentales a una funcin del tiempo conocida y
posteriormente se deriva analticamente, obtenindose los valores discretos de las
velocidades citadas si, como es habitual, se trata de datos integrales, composicin ,s
tiempo.
Clculo de los parmetros cinticos del sistema; para ello, se pueden realizar diferentes tipos
de regresin lineal o no lineal y, adems se puede realizar empleando simple o mltiple
respuesta.
u~ r5 [6.6]
donde r5 representa el producto de las integrales por las constantes de la ecuacin [6.5].
Clculo de las integrales de las velocidades de reaccin r5, para las NR reacciones que
tienen lugar. Este clculo se puede realizar mediante el ajuste de los datos a una funcin
conocida y posterior integracin analtica, obtenindose los valores discretos necesarios de
dichas integrales.
Clculo de los parmetros cinticos del modelo. Para ello, pueden ser aplicados tanto la
regresin lineal como la no lineal, como en el caso anterior.
258
Modelo Cintico de Clula
r y. R [6.7]
r5 =v -C [6.8]
259
Modelo Cintico de Clula
Una vez conocidas las cinticas aplicando mtodos como el de las velocidades de
reaccin, es necesario calcular los parmetros realizando un ajuste en mltiple respuesta, es
decir no obteniendo los parmetros de las reacciones individuales, sino de forma conjunta
mediante clculo por regresin de los datos experimentales.
Los modelos propuestos pueden obtenerse por combinaciones entre distintas cinticas
dentro del mismo esquema de reaccin propuesto al formular el modelo. Muchas veces ocurre
que varios modelos son capaces de describir el sistema, de forma que, en este punto, es
primordial el establecimiento de criterios de discriminacin.
260
Modelo Cintico de Clula
261
1VIodelo Cintico de Clula
g componentel caldo
Figura 6.2.- Unidades de los datos obtenidos a partir del Citmetro de Flujo y su conversin
en otras para aplicar en el modelo cintico
Como ya se ha indicado, el nitrgeno (en forma de amonio) que ser consumido por el
microorganismo, ir a frmar los componentes intracelulares, pero adems parte de ste
nitrgeno puede ser empleado para sintetizar otras protenas que no quedarn en el interior
262
Modelo Cintico de Clula
celular sino que sern excretadas al caldo, Estas protenas (protenas extracelulares) no han
sido analizadas, pero su evolucin puede ser obtenida realizando el balance de nitrgeno antes
comentado.
Para realizar dicho balance de nitrgeno, hay que calcular previamente la concentracin
de nitrgeno que hay en la molcula de amonio (que es como se mcorpora en el medio de
cultivo); se emple la siguiente ecuacin:
14
3 75~ 14
Cvg~~(g/L) =C~4(g/L)~
491,16 [6.11]
La relacin entre la concentracin de nitrgeno y la concentracin de DNA
(C95H1 201 335N3q5P3), es:
486,41
En las Tablas 6.1 a 6.7 se muestran las concentraciones de nitrgeno empleadas por
el microorganismo en la sntesis de los componentes intracelulares en los distintos
experimentos realizados en este trabajo. En las citadas tablas se muestran las evoluciones de
nitrgeno (por molcula de amonio) CNA, as como las cantidades de nitrgeno en DNA
(CN DNA), RNA (CN,RNA) y protenas intracelulares (CN,PRJ). Adems, se ha realizado la
suma de estos tres componentes (CNT), con el fin de compararlo con la concentracin inicial
263
Modelo Cintico de Clula
aadida y la que todava no ha sido consumida (en caso de que todava quede). De esta
manera, se puede calcular la cantidad de nitrgeno que emplea la bacteria, en cada caso,
para la sntesis de protena extracelular, cuyo anlisis no fue realizado, pero que puede
deducirse de acuerdo a la ecuacin [6.14], asumiendo que la cantidad de amonio consumido,
no inmovilizado como componente, va a parar a protenas extracelulares:
En la Tabla 6.1 se muestran los resultados del experimento realizado con 65 p.p.m.
05). Si comparamos la cantidad de nitrgeno total con la
de amonio inicial (experimento n
aadida inicialmente en el medio de cultivo (0,0506 g/L de nitrgeno), se observa que la
cantidad de nitrgeno encontrada como suma de DNA, RNA y protenas intracelulares es
mayor que la cantidad inicial de nitrgeno, llegndose a obtener 0,083 gIL de nitrgeno
rnmovilizado en componentes intracelulares. Este balance podra indicar que el
microorganismo puede sintetizar estos componentes empleando otra fuente de nitrgeno,
por ejemplo aminocidos procedentes de! medio YM, que es el medio empleado para
realizar el inculo en el biorreactor. O bien, podra ser que el microorganismo estuviera
empleando este amonio en fabricar componentes con una composicin diferente a la que
tiene cuando la concentracin de amonio es mayor, o lo que es lo mismo, con una
estequlometra diferente. Adems, se observa en la tabla que no hay sntesis de protena
extracetular, salvo la que aparece entre las 3 a 16 horas de la fermentacin, pero en la fase
estacionaria de crecimiento no parece que exista excrecin de este tipo de protenas.
Para el experimento realizado con 130 p.p.m. (experimento n0 6), que aparece en la
Tabla 62, el balance del nitrgeno indica que el nitrgeno inicial aadido 0,1011 g/L se
encuentra en los componentes intracelulares hasta una cantidad mxima 0,084 gIL
(observada en la fase estacionaria de crecimiento), teniendo en cuenta que se ha consumido
completamente el nitrgeno a lo largo de la fermentacin, el nitrgeno que falta estar
formando parte de la protena extracelular, como refleja la ltima colunma de la citada tabla.
264
Modelo Cintico de Clula
g/L, considerando que tambin ha habido un consumo total de nitrgeno, la ltima columna
indica la cantidad de nitrgeno que formar parte de protena extracelular.
Para el experimento realizado con 475 p.p.m. y 280 C (experimento n0 7), que
aparece en la Tabla 6.4, la cantidad de nitrgeno inicial es muy elevada (0,369 g/L), no
obstante slo aparece en forma de componente intracelular la cantidad de 0,1147 gIL. El
microorganismo, en este caso, no consume todo este nitrgeno, quedando una cantidad
residual al final de la fermentacin de 0,062 gIL. Al realizar el balance de la misma forma
que en experimentos anteriores, se obtiene cierta cantidad de nitrgeno en forma de
protena extracelular. como indica la ltima columna de la tabla. El hecho de que en este
experimento no haya consumo total de amonio indica que en este caso el sustrato
nitrogenado no est siendo el nutriente limitante del crecimiento, como ocurre en los
demas.
Por ltimo, en la Tabla 6.7 aparece el balance para el experimento realizado a 340C y
con una concentracin de amonio inicial de 257 p.p.m (experimento n0 4). En este caso, no
llega a consumirse todo el nitrgeno aadido inicialmente (0,157 gIL) pues queda una
cantidad residual de 0,077 gIL. En este experimento, todo el nitrgeno consumido se
encuentra inmovilizado como componentes intracelulares, y un porcentaje de nitrgeno se
emplear para la sntesis de protenas extracelulares en la fase estacionaria de crecimiento,
como indica la ltima columna de la Tabla 6.7.
265
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.1.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xandzoinonas canipestris durante la
fermentacin en el experimento n0 5, llevado a cabo con 65 p.p.m. de amonio y
280C.
266
Modelo Cintico de C/ula
Tabla 6.2.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campestris durante la
fermentacin en el experimento n0 6, llevados a cabo con 130 p.p.m. de
amonio y 280C.
267
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.3.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campestris durante la
fermentacin en el experimento n0 2, llevados a cabo con 257 p.p.m. de
amonio.y 28~ C
268
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.4.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthononas campestris durante la
fermentacin en el experimento n0 7, llevados a cabo con 475 p.p.m. de
amonio y 280C.
269
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campestris durante la
fermentacin en el experimento n0 1, llevados a cabo con 257 p.p.m. de
amonio y 250 C.
270
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.6.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas catnpestris durante la
fermentacin en el expenmento n0 2, realizado con 257 p.p.m. de amonio y 310 C.
271
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.7.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campes/Rs durante la
fermentacin en el experimento n0 4, llevados a cabo con 257 p.p.m. de
amonio y 340 C.
272
Mode/o Cintico de Clula
Se puede observar que las evoluciones de todos los componentes (en g/l..) en todos los
experimentos es similar. El contenido en protenas es siempre mayor que el contenido en
cidos nucleicos y, dentro de stos, la cantidad de DNA es siempre mayor que la de RNA. Por
otm lado, se observa la estrecha relacin entre la sntesis de estos componentes y e] consumo
de nitrgeno, es decir, cuando el sustrato nitrogenado se agota, el microorganismo no puede
seguir sintetizando nuevas molculas, por lo que la sntesis de aminocidos se detiene y, en
consecuencia, la sntesis de cidos nucleicos, lo que provoca que el microorganismo entre en la
fase estacionaria del crecimiento. Una excepcin a esta afirmacin es la correspondiente al
experimento realizado con una concentracin de amonio inicial de 0,475 gIL; en este caso,
cuando el microorganismo entra en la fase estacionaria del crecimiento, todava queda una
concentracin elevada del sustrato nitrogenado en el medio, por lo que la entrada en esta Ibse
se debe, probablemente, a otro nutriente que se ha agotado y no al nitrgeno. Adems, en todas
las grficas se ha representado la suma de los componentes intracelulares (DNA, RNA y
protenas), que se ha llamado biomasa terica (Cxr~), se aprecia que esta suma en todos los
casos es semejante al valor de la biomasa obtenida experimentalmente, existiendo una
diferencia -no muy significativa- en la fase estacionaria del crecimiento, debido a que no se han
considerado otros componentes, como lpidos o hidratos de carbono, que, aunque en mucha
menor cantidad, se encuentran en la biomasa, y pueden ser los responsables de esa pequea
diferencia entre la biomasa experimental y la terica (DNA, RNA y protenas intracelulares).
273
Modelo Cintico de Clula
0,8
ex
V
A # -s - - a -u. ----3.
0,6~
~ %rot,, +CRNA+CDN
0,4- 2,
y. ~gt - 0Q~ O - - -
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1~ 20 30 40
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0 10 20 30 40 50 60
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274
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Modelo Cintico de Clula
2.0
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O
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o
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0,0
o 20 30 40
t(h)
Figura 6.6. Evolucin de componentes intracelulares, fuente de nitrgeno y biomasa del
experimento n0 7. Condiciones experimentales: CNO=475 p.p.m., T= 28 0C, N=
variable (210 r.p.m. inicial).
275
Modelo Cintico de Clula
2,0
A CRNA
1,5 9
u. uo
O
.0
o
5
1,0 TM
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u... U
UD O ~00
u
u
o o-
0,5
o0
0,0 ~1~ Y
o 10 20 30 40 50 60
t (Ii)
2, 1
CN
A C~A
9
1,5
O
a (
-4
o u.....
1,0 n-o o
Eo
u
u
0,5 u 0~ O- O
~
q50 ~~AAA A
~ WVV7 9
0,04 a
a a- ---- -
O I0 20 30 40
t (h)
276
Modelo Cintico de Clula
2.0
CN
A
V C~
1.5 o
CYSi,ten
ocxT~ u ~ a.
O ~ O O O
I,0
E Esa
ca
u SO 0 0 0 00
0,5
~ 0 ~
~x
e.
x~X X
O
.~~~- a
XX
0,0
o lo 20 30 40
t (h)
277
Modelo Cintico de Clula
Aminocidos no
formadores de bases
PROTEINA
INTRACELULAR
]
[ PROTEINA
EXTRACELULAR
1
FI~7flEZZZZ4~NA
278
Modelo Cintico de Clula
- En la sntesis de las bases que forman RNA slo ceden tomos de carbono los que se han
denominado aminocidos formadores de bases, cuya sntesis se muestra en la ecuacin
(6.15]; mientras que el resto de aminocidos que intervienen en la reaccin slo ceden
grupos amino (NI-lfl, por lo que no se han considerado como frmula molecular en la
citada reaccin de sntesis de bases de RNA.
- En la sntesis de bases del DNA, a partir de las bases del RNAm, se tiene en cuenta que
se produce el mismo consumo de nitrgeno que si se estuviese sintetizando RNA. Si bien,
se conoce que, en la formacin de DNA a partir de RNAm, se produce una transformacin
en la base nitrogenada, es decir, el uracilo que forma parte de los nucletidos del RNA, se
transforma en timina en el DNA, para lo que es necesario un aporte de carbono e
hidrgeno, que se supone que viene de la frente de carbono original empleada (sacarosa).
Adems, es necesaria la presencia de un intermedio reducido (IntRed) que realice la
reduccin para pasar la ribosa a desoxiribosa (ribonucictidos a desoxirribonucletidos).
Por tanto, el metabolismo del sustrato nitrogenado supone una estructuracin de este
componente en la biomasa, ya que es el citado compuesto nitrogenado el que produce
aminocidos y stos dan lugar a protenas y bases nitrogenadas, precursoras, de los cidos
nuccicos. Si se aplica lumping en el sistema, englobando aminocidos, bases del RNA y bases
del DNA en compuestos con frmulas moleculares medias del total de molculas que los
forman, las reaccIones globales, que tienen lugar en la ruta metablica del nitrgeno, se pueden
plantear las siguientes relaciones estequiomtrieas (ecuaciones de filiacin):
279
,Vfodelo Cintico de Clula
L0W~H,O6 C3H5
503N+2,74N1-4 +3,5A TP3.5IN,4L1 +0,2 SGTI 3C101-112013N5P3zt
Q5J-I~ 75O~ ~75iV375P3
5,34H20+3,5(ADP+Pi) 3,5yN>4DHi- 5 ) + [6.18]
O,2YGDPPO3C10H1=010N5P2
280
Modelo Cintico de Clula
dt R~A
puesto que
RRNAm =r4r5 [6.21]
se obtiene: [6.22]
dt aa~/ffi
281
Modelo Cintico de Clula
puesto que
R =r,r3 r4 [6.24]
se obtiene:
r,= [6.25]
dcNR4>
r, 2,75r3 2,75 r4 [6.26]
It
dC VR 1,4
r1 3,75r3 3,75~ [6.27]
It
dC RNA =
[6.28]
It
dCD =
[6.29]
It
dCPRE
=13~ [6.30]
It dt
282
Modelo Cintico de Clula
Simplificacin 2 (MCC-2
Se asume estado pseudoestacionario slo para RNAm (ecuaciones [6.201a [6.22], en este
caso no se supone esta simplificacin para los aminocidos no formadores de bases, por lo que
la velocidad de consumo de amonio vendr dada de forma diferente al modelo MCC- 1, mientras
que el resto de velocidades (para RNA, DNA y Protenas intracelulares) son las mismas que en el
caso anterior.
Para el amonio:
Una vez propuestas las velocidades de produccin para cada componente clave es preciso
plantear estas ecuaciones en trminos de velocidades de reaccin, para ello se aplica la ecuacin
[6.8] para obtener de forma individual cada una de estas velocidades.
Simplificacin 1 (MCC-1):
= frl.It#CppuCPRJ)+(CPE) [6.32]
283
Modelo (lutico dc Clula
Simplificacin 2 (MCC-2):
Tanto rs corno r53 y rs5 vienen dadas de la misma forma que en MCC- 1, es decir por las
La diferencia entre las dos simplificaciones la marca la ecuacin cintica r2. la cual viene
dada por la siguiente expresin obtenida al despejar de la ecuacin [6.31]:
2,75.(CDNACDN#O )+l,4( C~
S2 = fri di (2, YS(CPVA CItVO)+ 1~ C~I?I0)) [6.35]
La aplicacin de este mtodo a los datos experimentales obtenidos en este trabajo fUe
realizada en simple respuesta empleando el mtodo de integral, con una subrutina tipo
Simpson. Las funciones (f(Cj)) que se han probado para cada una de las velocidades de reaccin
han sido:
Para las ecuaciones r1, r3, y r5, (ecuaciones [6.32], [6.33] y [6.34], respectivamente),
vlidas tanto para MCC-l como para MCC-2, se han probado tres cinticas diferentes:
- Potencial 1:
- Potencial 2:
- Hiperblica:
Para ri, calculada slo para la simplificacin 2 (MCC-2), como ya se ha indicado, se han
realizado ajustes con dos cinticas potenciales del tipo que indica la ecuacin [6.36] y la (6.37].
Debido a que todos los experimentos presentan resultados similares, se han elegido dos
experimentos como representativos para observar los resultados de la aplicacin de esta
metodologa, y para evitar alargar excesivamente el desarrollo de la exposicin de este capitulo.
284
Modelo Cintico de Clula
Todos los parmetros cumplen las restricciones estadsticas impuestas, se observa que el
valor de SRC (suma de residuos al cuadrado) es menor para las cinticas hiperblica y
potencial 2. Esto se corrobora observando que las formas de las curvas, tanto en forma integral
(Figuras 6.11 y 6.12), como derivadas (Figura 6.13 y 6.14) se asemejan mucho ms a la fUncin
que para el caso de la cintica potencial 1, cuya suma de residuos al cuadrado es mucho mayor.
Las Figuras 6.11 y 6.12 muestran los resultados, por tanto, para el valor de la integral de
0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y el experimento n0 4 (340C y 257
r1 para el experimento n
p.p.m.), respectivamente. Las ecuaciones hiperblica y potencial 2 son las que permiten
obtener mejor resultado respecto al acercamiento de las curvas a la de la funcin.
En cuanto al valor de r
1 ya derivado (Figuras 6.13 y 6.14), se observa que la forma de la
curva que corresponde a la ecuacin potencial 1 presenta una forma descendente, indicando
que no es posible considerar esta cintica en el modelo propuesto, mientras que las cinticas
hiperblica y potencial 2 reproducen bien la forma que presenta la funcin, siendo, en
principio, posible considerar cualquiera de las dos cinticas para el modelo cintico.
0 1.
Tabla 6.8.- Parmetros cinticos de r1 calculados por ajuste de los
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. datos del experimento n
Condiciones
experimentales: T=250 C, CN=257 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
inicial) modelo de clula.
285
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.9.- Parmetros cinticos de r1 calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T=280 C, CN257 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
inicial).
k
1 c~ k,=0.44 k1=0.43 k1=0.45 8.3.10 2.074 1332 4.54 0.092
c~ k
1=0,237 k1=0,150 k1=0,063 6.3.10~ 2,060 2432 4,35 1.23
286
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.12.- Parmetros cinticos de r calculados por ajuste de los datos del experimento n0
1 a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
2. en simple respuesta 0 C, CN65 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
experimentales: T=28
inicial), al modelo de clula.
k
1 C\ k,=0.18 k,=0,131 k1=0.082 4.3.10~ 211 925 4,38 2.95
(i<+K K1=0.010
k1=0,069 k=0.069
K,=0,010 k1=0,069
K1=0,010 3.102 2.074 1325 3,34 0.12
modelo de clula
0,30
1 IttEnc,a1 1 ~ 3 -.
2 bn~c,ai 2
0.25- SI bpcrliolica 2
e
-- --u- --
020-
u
0.15
/IP
0.10-
o
1
0,05 e
<u
,1
0.00 u 1-~-u- 4
o lo 20 30
40 50 60
t(h)
Figura 6.11.- Evolucin mostrada por la integral de r1 con el tiempo para el experimento n0
2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes
cinticas y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
0.8
0 0 20 30 40 50
(h)
Figura 6.12.- Evolucin mostrada por la integral r1 con el tiempo para el experimento n0 4,
realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
288
Modelo Cintico de Clula
0014
0012
0010
oms
0036
0032
a, O lO 20 30 40 50 60
O,)
Figura 6.13.- Evolucin mostrada por rsi con el tiempo para el experimento n0 2,
realizado a 280C y 257 p.p.n. de amonio inicial probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
O lO 20 30 40 50
t (h)
289
Alodelo Cintico de Clula
aplicando este mtodo y probando las cinticas que se han indicado, se muestran en las Tablas
6.1 5 a ~ 1 donde se observan los valores obtenidos para los parmetros dc cada una de las
fimoiones probadas. En todos los experimentos se superan los valores estadsticos tericos de lii
Student y de la E de Fischer, obtenindose valores significativamente bajos de SRC. La
cintica potencial 1 es la que muestra valores ms altos de la suma de residuos al cuadrado, lo
que indica que describe peor la forma de la funcin para r3, que las otras dos cinticas probadas.
Los resultados de la integral de r53 para cada uno de los experimentos tomados como
0 2 y n0 4), se muestran en las Figuras 6.15 y 6.16, mientras que
representativos (experimento n
la frmncin r
3. para dichos experimentos, aparecen en las Figuras 6.17 y 6.18. Donde se puede
observar algo similar a lo que ocurra con [a velocidad de reaccin r4 esto es, las cinticas que
-
0
Tabla 6.15.- Parmetros cinticos de ~3 calculados por ajuste de los datos
1. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. del experimento n
Condiciones
experimentales: T250 C, CNzz257 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
inicial).
k u, u ,~ k,=0.295 I<~=0.259 k
1=0,223 7.3.10~ 2.086 3332 4.35 0.08
290
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.16.- Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento n0
2. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T280 C, CN257 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
Valores de los parametros t Student E Fischer
Cintica SRC
Mix pt Mm Obt. flor. Obt. flor.
k
1 c~ k=0,152 k1=0,045 k1=0,148 1,1.102 2,074 1120 4,54 1,8
0
Tabla 6.18.- 4.
Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. del experimento n
Condiciones
experimentales: T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
k
1 c~, k1=0,039 k1=0,039 k1=0,039 1,2.10 2,060 725 4.35 2.5
29]
Modelo Cintico de Cl.La
ti Q ~< k
1=0.454 k1=O.454 k1=0,454 2.3.10 2,11 1536 4.38 0.22
Tabla 6.20.-
Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento n
6. en simple respuesta a diferentes
0 C, CN43O p.p.m ecuaciones
dc amonio, cinticas.
N= variable Condicione~
(210 r.p.m
experimentales:
inicial). T=28
A
1 - ~-- Lis k=0.02I3 k~=0.0212 k=0,021 2.10 2.074 2325 3.34 0.03
Tabla 6.21.- Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento u o
7. en simple
respuesta a diferentes
0 C, CN~475 p.p.m ecuaciones
de amonio, cinticas.
N variable Condicione~
(210 r.p.m
experimentales:
inicial). T28
=-l
k - k
1=0.0417 k1~0.0417 k,=0,0417 2.10 2.080 725 4,30 4,2
292
Modelo Cintico de Clula
O lO 20 30 40 50 60
t (h)
para el experimento
Figura 6.15 Evolucin mostrada por la integral de r con el tiempo
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de 3amonio inicial probando diferentes
ncinticas y su comparacin con la funcin correspondiente.
O lO 20 30 40 50
t(h)
Figura 6.16.- Evolucin mostrada por la integral de r
0 4, realizado a 340C y 257 p.p.m. de 3amonio
con el tiempo
inicial para el experimento
probando diferentes
ncinticas y su comparacin con la funcin correspondiente.
293
Modelo Cintico ce Clula
0014
0012
0.01&
0.038
0.01>6
0.0)4
0032
O lO 20 30 40
50 60
t(h)
Figura 6.17.- Evolucin mostrada por r53 con el tiempo para el experimento n0 2, realizado
a 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes cinticas y su
comparacin con la funcin correspondiente.
0.0116
0,004
0,092
O,cr~9
O lO 20 30 40 50
ti (h)
294
Modelo Cintico le Clula
el mtodo de las velocidades de reaccin para determinar las cinticas que pueden ser
empleadas en el modelo cintico de clula planteado, se muestran en las Tablas 6.22 a 6.28,
donde se presentan los valores obtenidos para los parmetros de cada una de las funciones
probadas. En todos los experimentos se superan los valores estadsticos tericos de t Student
y de E de Fischer de los parmetros de cada cintica, siendo algo peor las estadsticas
obtenidas para los parmetros correspondientes a la ecuacin potencial 1.
Las formas de las curvas para cada una de las cinticas, en comparacin con la
funcin se muestran en las Figuras 6.19 y 6.20 (para la integral de rs) y las Figuras 6.21 y
6.22 para r5 (derivada). Tal como ocurra en los dos casos anteriores se observa que las
cinticas que mejor describen la forma de la funcin (f(Cj)) son las correspondientes a la
ecuacin hiperblica y a la potencial 2.
Los resultados que se muestran, como en los casos anteriores, son los
0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y al experimento n0 4
correspondientes a 1 experimento n
(340C y 257 p.p.mj. Al igual que en las dos velocidades de reaccin anteriores los
resultados son similares para todos los experimentos, por lo que se muestran unos resultados
representativos.
k~=0,l52 k
1=0,0922 k10,148 4.1.102 2,086 850 4,35 0.11
295
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.23.- Parmetros cinticos de r5 calculados por ajuste de los datos del experimento
0 2 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
nexperimentales: T280 C, Cre257 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
inicial).
c~ lt=O629 k,=0,629 k
1=0.629 3.3.10 2,060 3282 4.35 0.11
A> <.~ k,=0,078 k=0.078 k,=0.078 7.1.10 2.064 2241 3,52 0.12
CV>KI I<,=0,063 K,=0,063 K,=0.063
296
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.26.- Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento
0 5. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
nexperimentales: T280 C, CN65 p.p.m de amonio, N~ variable (210 r.p.m.
inicial).
k=0.054 k
1=0.054 k1=0.054 2.1.10 2080 3078 4,30 3.4
1 +K~
A1 k,=0,078 k,=0,078 k1=0,078 7,1.10 2,086 2241 32,37 0,5
K,=O,063 i(,=0,063 K,=0,063
297
Modelo Cintico ce Clula
3
- 1 Rflo~4 1 - -u
2 R,t~,&a1 2
3 H~,al~lica
0,3- ~1----
1
gro 0.2 1 1
1
4
1
1
0. 1 -
<1.
<~
--a>.
0.0
lo 20 30 40 50 60
O
(h)
Figura 6.19.- Evolucin mostrada por la integral de r5 con el tiempo para el experimento
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas
uy su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
035
Jr~
O lO 20 30 40 50
(h)
Figura 6.20.- Evolucin mostrada por la integral de r
5 con elprobando
0 2, realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio tiempo para el experimento
diferentes cinticas
n
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
298
Modelo Cintico de Clula
O lO 20 30 40 50 60
ti (h)
0,0100
1 Potenca 1 2
2Potendaj 2
3 H~potIca
0,0075
1-te
0,0050
0,0025
0,0030
o lO 20 30 40 50
t(h)
Figura 6.22.- Evolucin mostrada por r55 con el tiempo para el experimento n0 4, realizado
a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas y su
comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
299
Modelo Cintico ce Clula
de reaccin para determinar las cinticas que pueden ser aplicadas en el modelo planteado, se
muestran en las Tablas 6.29 a 6.35, donde se pueden observar los valores obtenidos para los
parmetros de cada una de las funciones probadas, en este caso slo potenciales, as como los
valores estadsticos de dichos parmetros. Como puede apreciarse, la cintica que permite
obtener mejor resultado es la potencial 1, es decir, la que viene en funcin slo de la
concentracin de nitrgeno, pues como puede apreciarse en las tablas, en la cintica potencial
2, el valor del parmetro obtenido (k2) para muchos de los experimentos incluye cl cero en su
intervalo de confianza y la suma de residuos al cuadrado tiene valores significativamente mas
altos en todos los experimentos, que los obtenidos con la ecuacin cintica potencial 1.
Las Figuras 6.23 y 6.24 muestran las evoluciones de las curvas para la integral de la
0
ecuacin r2 para los experimentos que se han tomado a modo de ejemplo (experimentos n
2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y n0 4 (340C y 257 p.p.m.). Las Figuras 6.25 y 6.26,
muestran estos mismos resultados para la ecuacin correspondiente a r
2, para los
0 2 y n0 4, respectivamente. En estas ltimas figuras se puede apreciar la
experimentos u
clara diferencia entre las dos cinticas potenciales probadas para esta ecuacin, siendo
significativamente mejor la obtenida con la ecuacin potencial 1.
300
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.30.- Parmetros cinticos de r2 calculados por ajuste de los datos del experimento
0 2 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
nexperimentales: T~280 C, CN257 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
t, ~ k,~0,152 k
1=0,0168 k,~0,148 3,1.102 2.074 1120 2.080 0.18
~> u~- cj k,=0,440 k1=0.175 k,=-0,090 62.5 2,074 83,5 2,086 1.95
t - y k~=0.061 k
1=0,055 k,=0,048 1110 2060 1225 4,35 0,5
30]
Modelo Cintico le Clula
Tabla 6.33.- Parmetros cinticos de r2 calculados por ajuste de los datos del experimento
0 4 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
nexperimentales: T~2S0 C, CN65 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
k <y k> =0.560 k>=0,350 k>=0,140 i,i.i03 2,11 552 4.38 0,2
=0,158 k
1=0,125 k,=0,092 ij.o~ 2.069 878 3,68 0,23
302
Modelo Cintico de Clula
O iO 20 30 40 50
60
t (h)
Figura 6.23.- Evolucin mostrada por la integral de r2 con el tiempo para el experimento
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas
n
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
0,150
0,125
0, l03 -
r, ~
a~o
a(25
0,030
o io 20 30 40 50
t (h)
303
Modelo Cintico de Clula
0,
(>035
0,030
0.025
0+
0,020
(9,015
0,0>0
0,C05
0(1190
0 lO 20 30 40
ti (h)
Figura 6.25.- Evolucin mostrada por r52 con el tiempo para el experimento no 2, realizado
0C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas y su
acomparacin
28 con la funcin correspondiente a protenas.
016
0,14
0,12
0,10
: 0.08
0,06
0.04
0.02
0.09
O lO 20 30 40 50
t (h)
304
Modelo Cintico de Clula
De todo lo visto, se puede concluir que el mtodo aplicado para obtener las
velocidades de reaccin del modelo de clula planteado permite discernir qu tipo de
cintica se puede emplear para cada una de las reacciones del esquema elegido.
Se ha observado que las ecuaciones reacciones cinticas r1, r3 y r5 (vlidas tanto para
el modelo MCC-l como para el MCC-2), presentan mejores resultados con ecuaciones
cinticas de tipo hiperblico (ecuacin [6.38]) o tipo potencial 2 (ecuacin [6.37]), no
siendo posible discriminar mediante criterios estadsticos cul de las dos ecuaciones puede
ser la ms adecuada para el modelo planteado. Por este tipo de criterio se ha desechado la
ecuacin potencial 1 (ecuacin [6.361) para estas reacciones pues, aunque cumpla las
restricciones estadsticas impuestas para sus parmetros, presentaba valores de la t de
Student y de la E de Fischer significativamente ms bajos, y valores de suma de residuos al
cuadrado (SRC) ms altos, lo que indica un peor ajuste a la funcin con la que se realiza la
comparacin; esto ltimo se vea corroborado a la vista de las formas de las curvas
correspondientes para cada velocidad de reaccin, donde la tendencia en el error es
evidente. Qued patente que con la cintica potencial 1 se obtenan curvas con forma
descendente y no la curva sigmoidal que presentan estas funciones f(C,) para cinticas tipo
hiperblico y potencial 2.
305
Modelo Cintico de Clula
Las ecuaciones cinticas a probar en primer lugar sern las de tipo potencial 2, de
acuerdo a lo visto en el apartado anterior y vienen dadas por las siguientes expresiones:
A, C,- - CV [6.39]
= A, - [6.40]
Los parmetros obtenidos, por ajuste al MCC-1 con cinticas dadas por las
0 1 realizado a 250C y 257 p.p.m.,
ecuaciones [6.39] a [6.41], para el experimento n
cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.36), si bien presentan un valor de
SRC (suma de residuos al cuadrado) relativamente alto, indicativo de que la reproduccin
de datos experimentales es poco aceptable, tal como puede comprobarse, a la vista de la
evolucin de componentes, en la Figura 6.27.
306
Modelo Cintico de Clula
Los parmetros obtenidos para el experimento n< 3 realizado a 310C y 257 p.p.n.,
de nuevo cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.38), pero la
reproduccin de los datos experimentales (Figura 6.29) no es buena.
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-1 con cinticas potenciales para el
experimento n0 7 realizado a 28C y 475 p.p.m., tambin cumplen las restricciones
estadsticas impuestas (Tabla 6.42) pero no penniten una buena reproduccin de los datos
experimentales, tal como muestra la Figura 6.33.
307
Modelo Cintico de (lula
Tabla 6.36.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.
Condiciones experimentales: T=250 C, CN~=25I p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
Anulo A ~
A RN
.5 7
O u
Iixx~a
1,0 u ,
a
u
0000 o
uO,Q~7
~ ~ 50 ~ ~AAA A
e. a
- 1~~~ ~
0 10 20 30 40 50 60
t (ti)
Figura 6.27.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1 (250C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-1.
308
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.37.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: Th280 C, CN257 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
1~
t(h)
Figura 6.28.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (280C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-1.
309
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.38.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: Th310 U, CN=257 p.p.ni de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
(12
O lO 20 30 40
1(h)
Figura 6.29.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (310C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-!.
310
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.39.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: T340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N=
variable (216 r.p.m. inicial), al modelo MCCI.
1,2
Lo
QS
1 Q
Q4 -
00 O lO 20 30 40 50
t(b)
311
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.40.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 5.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=65 p.p.m de amonio, N variable
(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
0,8
u ~. u
Amiio u
A RN~ a
y DN~
o
l1r~a
1 04-
(12
<
A~A
o
A
- -v
A
00
O lo 20 30 40 50 60
t(li)
Figura 6.31.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 5 (28 oc y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-1.
312
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.4 1.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.
Condiciones experimentales: Th280 U, CN=l30 p.p.m de amonio,
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student
1 F Fiseher
Mx pt Mo
0,286 0,23 0,174 8,1.10
0,326 0,324 0,322 2,l.10~ 723,75
Y 0,761 0,761 0,761 5,9.10~
de Student (95% conflanzay 2,O&O
F de Eischer ( 95% de confianza 2,49 SRC= 0,92
i
0 10 20 30 40 50 60
t (h)
Figura 6.32.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 oc y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-!.
313
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.42.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=475 p.p.ni de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
25
1
O lO 20 30 40 50
t (h)
Figura 6.33.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7 (28 oc y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-!.
314
Modelo Cintico de Clula
De todo lo visto en este apartado, podemos concluir que, en vista de los resultados
obtenidos con MCC- 1 en mltiple respuesta, no se ha conseguido un buen resultado en el
ajuste de los datos de los experimentos realizados, si bien hay algn experimento
(experimento n0 5), donde se ve una buena reproduccin de las evoluciones de los
componentes del sistema.
A pesar de que los resultados estadsticos del ajuste de las reacciones individuales al
aplicar simple respuesta eran indicativos de que el MCC-l era un modelo, en principio,
adecuado para la descripcin del sistema, no es as cuando se aplica esta suposicin en
mltiple respuesta, por lo que, en adelante ya no se considerar esta simplificacin y se
tendr en cuenta slo la simplificacin 2 (MMC-2), que, como se ver, es la que mejor
resultado permite obtener para la reproduccin de los datos experimentales del crecimiento
de Xnthomonas can-ipestris.
MCC-3
En este caso, el modelo MCC-3, se consideran 4 respuestas y 4 parmetros. El ajuste
es realizado empleando regresin no lineal en mltiple respuesta de la forma ya indicada.
Los resultados del ajuste a este modelo se muestran a continuacin.
El ajuste de los datos expernentales al MCC-3 con las cinticas probadas en esta
caso para el experimento n0 5 realizado a 28C y 65 p.p.m., muestra que los parmetros
obtenidos cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.47) pero no se
consigue una buena reproduccin de los datos experimentales, tal como muestra la Figura
6.38, probablemente debido a que, en este experimento, la estequjometria supuesta no debe
ser cierta en este caso.
El ajuste del experimento n 6, realizado a 28C y 130 p.p.m., muestra que los
parmetros obtenidos cumplen las condiciones estadsticas tericas, como se muestra en la
Tabla 6.48, y reproduce de forma adecuada la evolucin de los componentes del sistema
con el MCC-3, tal como indica la Figura 6.39.
Tabla 6.43.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.
Condiciones experimentales: Th250 C, Crc257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
-o
-t
Q)
t (h)
Figura 6.34.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1 (25 0C y257 p.p.ni. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
318
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.44.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
1
(5
60
t(h)
Figura 6.35.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (28 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
319
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.45.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: Th310 C, p.p.m de amonio, N=
C~~257
1,25
1,00
0,75
c
0,50
o
025
0,00
20
t (Ii)
Figura 6.36.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (31 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
320
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.46.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
nE
e
t (h)
Figura 6.37.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
321
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.47.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 5.
Condiciones experimentales: Th280 C, C~65 p.p.m de amonio, N variable
(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
1
5
u
30
t(h)
Figura 6.38.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 5 (28 oc y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
322
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.48.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.
Condiciones experimentales: T280 C, CNl3O p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
1~
60
t (h)
Figura 6.30.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
323
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.49.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, Ge475 p.p.m de amonio, N=
variable <210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Ee
o
2)
t (h)
Figura 6.40.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
324
Modelo Cintico de Clula
MCC-4
En este caso, el modelo considera 4 respuestas y 7 parmetros, debido a las cinticas
supuestas en cada velocidad reaccin, es decir las reacciones r1, it3 y r5. que se consideran
hiperblicas, mientras que la r2 se considera potencial 1, como en los modelos anteriores.
325
Mo co Cintico de Clula
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-4 con las cinticas probadas en esta
caso para el experimento n0 5 realizado a 280C y 65 p.p.m., tambin cumplen las
restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.54) pero no permiten una buena reproduccin
de los datos experimentales, tal como ocurra con el modelo anterior a ste, y se muestra
en la Figura 6.45.
326
Modelo Cintico de Clula
o
Tabla 6.50.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n 1.
Condiciones experimentales: T250 C, CN~2S7 p.p.nl de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
1,75
1,50
1,25
1,00
e 0,75
o
0,50
025
0,00
t (Ii)
Figura 6.41.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1(25 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
327
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.51.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento u0 2.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al MCC-4.
60
t (h)
Figura 6.42.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento no 2 (28 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
328
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.52.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: T310 C, C,~257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
1,25
1,00
0,75
8
0,50
0,25
0,00
40
t (h)
Figura 6.43.- Evolucin de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del experimento
n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
329
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.53.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
- 0,058 - 8.23.10~
de Student ( 95% confianza> 2,12
E de Fiseher ( 95% de confianza> 2,66 SRC= 0,061
75
1,50
.25
1,00
0,75
u
0,50
0,25
0,00
O lO 20 30 40
t(h)
Figura 6.44.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
330
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.54.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 5.
Condiciones experimentales: T2S0 C, CN65 p.p.m de amonio, N= variable
(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
fi
e!
30
t (ti)
Figura 6.45.- Evolucin de los componentes del sistema obtenidos porajuste del experimento
n0 5 (28 0C y 65 p.p.n. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
33
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.55.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento u0 6.
Condiciones experimentales: Th280 C, C\130 p. n.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), a] modelo MCC-4.
Mx pt Mm
30 60
t (ti)
Figura 6.46.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
332
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.56.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, C,r475 p.p.m de amonio, N= variable
(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
1,75
t(h)
Figura 6.47.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7(28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
333
Modelo Cintico de Clula
MCC-5
Ya se ha comentado que, debido a que podan ser empleadas tanto las ecuaciones
cinticas potenciales como hiperblicas en las velocidades de reaccin para protenas (r),
para RNA (r3) y para DNA (r5), se han realizado ajustes con cintica potenciales en estas
El modelo considera, al igual que en los dos casos anteriores, 4 respuestas, pero
consta de 5 parmetros. El ajuste es realizado empleando regresin no lineal en mltiple
respuesta. Los resultados del ajuste a este modelo (MCC-5) se muestran a continuacin.
0 5 (28C, 65 p.p.m. de
En este caso no se va a considerar el experimento n
amonio), pues como ya se ha visto no se obtienen buenas reproducciones de los datos
experimentales con ninguno de los modelos anteriores, debido, probablemente, a que la
estequiometra supuesta no es vlida para esta concentracin tan baja de amonio.
Para el experimento n0 6, realizado a 280C y 130 p.p.ni., se puede observar que los
parmetros obtenidos cumplen las condiciones estadsticas tericas (Tabla 6.61). El MCC-
5 permite, tambin para este experimento, la reproduccin de forma adecuada los datos de
este experimento, tal como indica la Figura 6.52.
335
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.57.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.
Condiciones experimentales: T250 C, CN=2S7 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-S.
1,75
1,50
1,25
-4
11)0
0,75
e
u
0,50
0,25
0,00
t (ti)
Figura 6.48.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1 (25 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5.
336
Modelo Cintico de Clula
del experimento n0 2.
Tabla 6.58.- Parmetros calculados por ajuste de los datos
C, C~=257 p.p.m de amonio, N=
Condiciones experimentales: T=280
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
t (ti)
Figura 6.49.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (28 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5.
337
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.59.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: T=310 C, CN=257 p.pan de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
.4
20 40
t (ti)
Figura 6.50.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (31 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5..
338
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.60.- Paranietros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: Th340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
1,75
1,50
1,25
1,00
1~
0,75
0,50
0,25
0,00
t (ti)
Figura 6.51.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento no 4 (34 C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5..
339
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.61.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=13O p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
O.
0.50
025
O.
30 60
t (ti)
Figura 6.52.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5..
340
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.62.- Parmetros calculados por ajuste de los datos de] experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T=280 C, CN=475 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
1,75
1,50
1,25
1,00
1~
0,75
0,50
0,25
0,00
t (ti)
34
Modelo Cintico de Clula
MCC-6
342
Modelo Cintico de Clula
343
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.63.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.
Condiciones experimentales: T250 (2, C~=257 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-6.
60
t (ti)
344
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.64.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: T280 (2, (2NC57 p.p.ni de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial> al modelo M(2(2-6.
175
1.50
125
-4
1,00
E
0,75
u
0,50
0,25
0,00
O
t (ti)
Figura 6.55.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (2S 0(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo M(2(2-6.
345
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.65.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: T310 (2, CN=257 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
1,75
1,50
1,25
1,00
E
0,75
u
0,50
0,25
0,00
t (ti)
Figura 6.56.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (31 0(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MC(2-6..
346
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.66.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: T=340 (2, (2r~e2S7 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
1,25
1
u.
t(b)
Figura 6.57.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 4 (34 0(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo M(2C-6..
347
Modelo Cinlico de Clula
Tabla 6.67.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.
Condiciones experimentales: T280 (2, (2N=130 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MC(2-6.
1 flO
-4 0.75
0.50
025
ono
t (ti)
Figura 6.58.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (280(2 y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo M(2(2-6..
348
Modelo Cintico de Clula
n o 7.
Tabla 6.68.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento
p.p.m de amonio,
Condiciones experimentales: T~280 (2, (2N475
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
13
1,50
1,25
1,00
n
e 0,75
0,50
0,25
0,00
t(h)
Figura 6.59.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n~ 7 (280(2 y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo M(2(2-6.
349
Modelo Cintico nc Clula
En el apanado anterior se han mostrado los ajustes de los datos experimentales a los
diferentes modelos propuestos para el crecimiento de la bacteria Xanthomonas campestris, a
continuacin se va a tratar de seleccionar el modelo de acuerdo a los criterios antes
comentados.
Entre los dos esquemas de reaccin simplificados propuestos, que corresponden a los
modelos MCC-l y MCC-2, se ha observado que el primero no permite obtener una
reproduccin de las velocidades de produccin de los diferentes componentes clave de los
distintos experimentos realizados, por lo cual el citado modelo ha sido descartado segn un
criterio estadstico, considerando que el valor de SRC es significativamente alto, lo que se
traduce en una mala reproduccin de los datos experimentales de todos los experimentos
ajustados con el MCC- 1-
pues, como ya se vi, parece ser la nica cintica con la que se obtienen parmetros con
valores estadsticos aceptables.
indicativos de las buenas reproducciones que se han obtenido en todos los ajustes; no
obstante, puesto que este valor es una forma de medir la reproducibilidad de los datos
experimentales, se muestran en la Tabla 6.69 los distintos valores de SRC obtenidos en cada
uno de los experimentos, para los cuatro modelos, con el fin de analizar si este puede ser un
criterio de discriminacin entre ellos.
Tabla 6. 69.- Valores de SRC (suma de residuos al cuadrado) obtenidos en los ajustes a
diferentes modelos de clula para cada uno de los experimentos realizados.
35
Modelo Cintico de Clula
Por otro lado, el modelo MCC-4 que posee Y parmetros, no presenta valores de
SRC significativamente inferiores a los obtenidos con MCC-3, a pasar de que sera de
esperar un mejor ajuste debido a que este modelo dispone de ms grados de libertad. Los
valores de la suma de residuos al cuadrado, presentados en la Tabla 6.69, son muy
semejantes entre ambos modelos, solo se obtiene un valor inferior de SRC respecto al
modelo MCC-3 para el experimento n06, en el resto, son superiores a los presentados por el
MCC-3.
352
Modelo Cintico de Clula
6.2.4.2.- Discriminacin por Criterios Fsicos: variacin de los parmetros con las
variables
En este apartado se comparan las distintas tendencias que presentan los parmetros
en funcin de las variables: temperatura y concentracin inicial de nitrgeno. Se van a
analizar las tendencias para cada una de los parmetros en los modelos que han sido
finalmente considerados: MCC-3 y MCC-4, aunque tambin se incluyen los otros dos
modelos MCC-5 y MCC-6.
Como ya ha sido expuesto, este modelo consta de cuatro parmetros, debido a las
cinticas potenciales supuestas en este caso. En las Figura 6.60 se muestran las evoluciones
de los parmetros correspondientes a cada una de las velocidades de reaccin.
353
Modelo Cintico de Clula
354
Modelo Cintico de Clula
potencial tipo 1. Como se aprecia en la Figura 6.63, el parmetro k1, muestra una tendencia
similar a una hiprbola invertida. Funcin muy diferente a la obtenida en los modelos
anteriores y poco explicable
De nuevo puede afirmarse que los modelos MCC-5 y MCC-6 no aportan nada sobre
el MCC-3, ya que [a variacin dc parmetros con la temperatura es ms razonable en [os
modelos MCC-3 y MCC-4.
355
Modelo Cintico de Clula
0 6 -i a
:61
o
0
1
vi.
06
1 ________________________
:4 26 II 60
TOTIVCntIta
~
1
3 6161
~1 SO II 60
-0
[oir cntira
(03<
420-j
630.]
c -
0101
O
6. -
0.10-
0440.
o :6 SO lo
1.011, criC
Ienhientllra
Figura 6.60.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-3 con la
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad r~ ti) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad y5 d) parmetro para la velocidad r2
356
.
Modelo Cintico de Clula
0,12
u
ojo
.--...
0,08
~1 -
~~~>-
2 0,08-
//Y a
11,04-
0.02-
4
0.00-
26 28 30 32 34
Tenperatra
0.12
ti
0.10
O .08
o .i
.04
0.02
090
36 28 311
24 32 34
renperawa
020
0.1 11
E 0.10-
0,05
0.00-
Tenvedira
j 0.03 -
23 16 SO 30 32 34
TeripcriC ir a
Figura 6.61.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-4 con la
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad r1 b) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
357
;tIodeio Cintico de Clula
14.:J o -
26 j -A &
5 a
25
iJ
4.140.] - ~ 4>
-a-
/0< <O
or\-g--r - - -
0.456
0,454
.025
4.4>0
14> 54 4
54
CflpOriCiiriI
036
30-
4=11-
44=4-
t
--- -~- -
.
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0 24 :8 34
42 34
>4.25
11
.4>
4- 4---
4.
si 28 44
2-8 62 64
cnt u-a
-a--O
0-Ii
~-61
~0 2
0.015 -
u
1,
4.06 0-
2-.. o
44425-
24 28 14 2 44
Icnpert ura
Figura 6.62.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MC(2-5 con la
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad ~L ti) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
358
Modelo Cintico de Clula
~1
0 -. 4>
0.8
0?
0.6
.5
~ :731 >4.-sn -
0.2-]
0.!
0.0 26 28 30 33 34
Tcnpetittra
006-
o 004
3 0
000
lenvenhira
. k
0.00, -A 4
--A -. .
A
E 0.04
0.02 u .--.
4400 24 26 28 30 32 34
1cnpcitta
0. Co
44015-
4.050 -
1 0.025
1
24 28 28
Tenpera ira
30
Figura 6.63.- Variacin dc los parmetros del modelo cintico de clula MCC-6 con la
32 34
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad r1 b) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
359
Xh)cleo <jintico (le (lula
En la Figura 6.64 se muestra que, para todos los parmetros de este modelo, no hay
una tendencia, el valor es constante. Es decir, su valor no varia con la concentracin de
amonio inicial, por lo que se concluye que la concentracin de amonio inicial no influye en
la variacin de los parmetros del modelo, tal como caba esperar.
En este caso se puede asumir que la tendencia de los parmetros con la variacin de
la concentracin inicial de amonio es constante, al igual que en el caso anterior.
Como se aprecia en la Figura 6.67, la tendencia de todos los parmetros del modelo
es constante, es decir, el valor de los parmetros no cambia significativamente con la
concentracin inicial de amonio, al igual que en los casos anteriores.
360
Modelo Cintico de Clula
4< -
08.- ~.. .
.--~ L____ -
.4 4 a
.4
4.3 -
41-
CM(P.P.m)
:1
45.
.
b
6,
II
0.2
4,1
0.4 [r,7
4>..
4.6
0.4 c
1 0.4
0.3
_________ 4
02 -
0.
C<ppno)
0,
0.20
rn4
d
4.45
0-lo
0.05
no)
Figura 6.64.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-3 con la
concentracin inicial de amonio.
a) parmetro para la velocidad r1 b) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
36]
Modelo Cintico de Clula
6 6
ti - Ajo
1 4
- - -~
i-~- -
-~
A
a
4>
AK
--4
A -
Qj(P p no>
- 2
.61 e
11
tuis
444 <<4
4-04>
4>.->
<44>76
4,4)50
--4>
240 =00 -4>44> 6<44>
44
4? ~6.9pm>
-
Figura 6.65.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-4 con la
concentracin inicial de amonto.
a) parmetro para la velocidad r1 b) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
362
Modelo Cintico de Clula
0=4
<0
a
4>35
4.14> ~
e-
<0
4.140
404> 40 304> 400 4030
C>4ppm)
4.50
415
4> b
4.3,
4434
1
4
4=44
0.35
0,44>
44.45
441.
440 200 44>0 4410 400,
9.03,
<--4
446
e
0.5
3--
1 4>-;
0.2
0.4
0.0
400 200 3110 400 500
C~<p.p.m)
-E 4>,
442
1 0.4
C%(P.P.J30)
Figura 6.66.- Variacin de tos parmetros del modelo cintico de clula M(2C-5 con la
concentracin inicial de amonio.
a) parmetro para la velocidad r1 b) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
363
3leUdo (ztco de Clula
- I-.k>
a
4--
~~~~~2-
4-
.7
114>4 44>>>
y
_ a-
ti
<5
A- ~ A
A
4444
4<> =41<> 4444> 4=4 $4144
-.
4=41
Liii
c
--A-
40 .,--.4< ~
A - A
0--~
--1
454--
44 2450 lOO -400 6<34=
44,1 ,
4>2
.418
d
-c
41.410
.5
44.44=
Figura 6.67.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-6 con la
concentracin inicial de amomo.
a) parmetro para [a velocidad rj b) parmetros pata la velocidad r3
c) parmetros para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
364
Modelo Cintico ce Clula
Al aplicar, por tanto, los diferentes criterios de discriminacin sobre los cuatro
modelos considerados, se concluye que los modelos MCC-3 y el MCC-4 parecen ser los que
mejor resultado permiten obtener.
A pesar de que todos los modelos presentan una tendencia aceptable de los
parmetros con las variables, hay que destacar que el MCC-6 presenta el parmetro
correspondiente a r2 con una tendencia con la temperatura que no parece muy clara. El
MCC-~5, en la variacin de parmetros con el amonio presenta mnimos para r3 y r5, lo cual
no parece ser muy lgico.
Hay que recordar que ambos modelos poseen un nmero ms elevado de parmetros
que el MCC-3, en cambio los valores de SRC eran mayores y, como se acaba de ver, la
evolucin de parmetros de estos modelos con las variables no es indicativa de que se
mejore el resultado obtenido con MCC-3 y MCC-4.
Por tanto, y debido a que se ha optado por el MCC-3, se pueden plantear ahora
parmetros como funciones de la temperatura para este modelo. Las funciones se pueden
obtener por observacin de la forma de las curvas de la Figura 6.62; tanto k3 como
presentaban una tendencia constante con la variable, mientras que r2 parece responder a una
funcin tipo Ratkowsky, y r1 una variacin lineal descendente, de la siguiente forma:
365
Modelo Cintico le Clula
k1(T) = C1 ~2 ~ [6.42]
k3(T) = C3 [6.43]
k3(T) C5 [6.44]
A lo largo del apartado anterior se han ido exponiendo los resultados obtenidos al
aplicar diferentes modelos para la descripcin del crecimiento de Xanthornonas can-ipestris.
Se ha decidido discriminar el MCC-3 frente al resto de los modelos planteados, los cuales
tambin permitan obtener buenos resultados en la reproduccin de los datos
experime nta les
366
Modelo Cintico de Clula
0,833C<~ H~ O~ NH4t]NAD+0,]4CoASH+ATPrt7
dC = 18 (6 3 [6.47]
)2,75
de - /70,5 /03,5 - 491/6 486,4
368
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.70.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: T=280 C, CN=65 p.p.m de amonio, N variable
(210 r.p.m. inicial), al MCC-3
t(h)
Figura 6.68.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 5 (28 0C y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3,
con cambio en la estequlometra de los componentes.
369
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.71.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: 1=280 C, CN=S p.p.m de amonio, N variable
(210 r.p.m. inicial), al MCC-4.
125
J
A
Anunio
RNA
1,00 .4 y DNA
O Pruteina
non~a
-4 0,75-~
.s u
o
1. 030-
o OtO ~
0,25-
0,00 r ~~1
0 0 20 30 40 50 60
t (h)
Figura 6.69.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento it 5 (28 ~C y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4
con cambio en la estequiometra de los componentes.
370
Modelo Cintico de Clula
eMejora del ajuste del experimento n0 7 (28~ C y 475 p.p.m. de amonio inicial)
Una explicacin a lo observado, podra ser el efecto txico del amonio para el
crecimiento del microorganismo a partir de cierta concentracin. En la literatura aparecen
referencias sobre el efecto txico de este compuesto en el crecimiento de microorganismos
(Cid y col., 1996).
dC~ Fji_.c 1
tt LK-c?8 k/ (C~ Csc))jCx :. C~ =C~ [6.49]
371
Modelo Cintico de Ctu/a
Para el ajuste con el modelo MCC-4, los valores de los parmetros obtenidos se
muestran en la Tabla 6.73, Los valores estadsticos de los parmetros superan los tericos
de la t de Student y de la E de Fisclier. La Figura 6.71 muestra de nuevo la clara mejora en
la reproduccin de los datos experimentales al incluir el trmino de inhibicin por sustrato,
al comparar con la Figura 6.47 correspondiente al ajuste realizado con este mismo modelo
(MCC-4) sin considerar la inhibicin por sustrato. Adems se consigue un significativo
descenso del valor de SRC.
372
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.72.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, C,e475 p.p.n de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3 con trmino de Inhibicin.
1,75
1,50
1,25
1,00
1~
u
0,75
0,50
0,25
0,00
50
t (b)
Figura 6.70.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC4,
con trmino de inhibicin.
373
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.73.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, CN475 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4 con trmino de inhibicin.
1.75
1,50
1,25
1,00
0,75
o
u
0.50
0,25
0,00
50
t(h)
Figura 6.71.- Evoluciones 0 de los0Ccomponentes
7 (28 y 475 p.p.m.del amonio obtenidos por ajuste del
de sistema
experimento n inhibicin. inicial) al modelo MCC4,
con trmino de
374
Modelo Cintico de Clula
Es necesario ahora unir este modelo de clula -el cual permite predecir cambios en la
composicin del medio considerando el metabolismo del nitrgeno estructurado en la
biomasa (DNA, RNA y protenas)- con el modelo cintico metablico, el cual aport
resultados muy buenos para la parte correspondiente a produccin del polisacrido, tal como
se vi en el Captulo 5 de la presente Memoria.
375
7.- MODELO CIN rico
QUMICAMENTE ESTR UCTURADO
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Los modelos ms complejos vistos hasta ahora han sido los modelos de clula, con los
que poda realizarse una buena descripcin del crecimiento del microorganismo teniendo en
cuenta la evolucin de una serie de componentes intracelulares que constituyen la biomasa del
mismo. En la literatura existe escasa informacin sobre este tipo de modelos, solo se han
realizado intentos por describir el crecimiento utilizando estos modelos sobre sistemas muy
conocidos como Escherichia coli o Bacillus subtillis y, en ningn caso, sobre
microorganismos de inters industrial.
377
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
A pesar de las grandes ventajas que pueden ofrecer los modelos qumicamente
estructurados, no existe en la literatura ningn precedente en la lnea indicada. La modelizacin
ms compleja vista hasta ahora se ha quedado al nivel de modelos de clula, donde tampoco
existen muchos trabajos. y donde se realiza nicamente, como ya se ha comentado, la
estimacin de parmetros sin ajuste de datos experimentales.
378
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Para la biomasa:
dC~ ~ ~ Cx [7.!]
di +
4.
Para el azcar:
di
~180L 923,2 di
12 K4C0, Cx ji 3.5818
Velocidades
[7.2]
de 1 dC~
Produccin Yv~ d~
Para el producto:
L~ [731
E
dC1. 1+4
923,2
7A 7?!
di + $~ 8+4
Para la evolucin de oxigeno disuelto:
dCx
.(cc0, )~
[7.4]
dr 923,2 di + ~y +I<LCIV 1 di
>ox
Cx C
[7.5]
l~ C 1
Y u NN
[7.6]
+ Co l+4Y;p j
3~~8~447P)
2 Y
ti 3,581~3,58+1 4~4 LiYrp
Ecuaciones
Cinticas
r
1
12
k4C0,
K,, C0, +
A + TPP
ji [7.7]
Co,
[7.8]
yrp y +
Li TPP~34 [7.9]
379
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Para La biomasa:
dCA. RNA dCD4tA
+
di tt
+
<It tt [7.14]
RNA
[7.15]
di
Velocidades DNA
de dc /~j4.\,.j
Produccin = y.
[7.16]
dr
Protenas intracelulares
dCPPJ=y1~ dC~~
[7.17]
tt di
Para el amonio:
dC~~4. =1811,4 1$ 12
,..,
275 ~) [7.18]
C.C [7.19]
Parmetros
k~(T)=0.198 [7.25]
con la
Temperatura k,(77) = ( 0,041 iT 21)/I -evxp(O,352 (T- 3508)4<
-
[7.26]
380
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Se realizar, por tanto, la unin de los dos modelos de este tipo que ya han sido
aplicados en el presente trabajo. Al unir ambos modelos, la parte correspondiente a biomasa del
modelo metablico (ecuacin [7.1]) queda ahora desglosada en las expresiones del modelo
cintico de clula (ecuaciones [7.14] a [7.17]). Adems, es necesario cambiar el trmino
correspondiente al rendimiento de azcar en biomasa(Yxs) de la ecuacin [7.2], que debe ser
ahora desglosado en los trminos correspondientes al azcar que va a parar a biomasa, de
acuerdo a las relaciones estequiomtricas entre el azcar y los componentes del sistema, vistas
en el captulo anterior (ecuaciones [6.15] a [6.19]),los cambios se destacan en negrita:
dC8 5,94
dr 180< 923,2
dCl,
dr
1 kjC0 (1 [
12 Ki + C0, Cx .[I~3.58j3s8+
.
+ ~
~. Y,~JJJ
381
;Vfodelo Cintico Oihnicamenre Esuzcturado
Por tanto, se van a emplear los parmetros obtenidos de cada uno de los modelos,
con el fin de observar si el Modelo Cintico Qumicamente Estructurado planteado es capaz
de reproducir los resultados experimentales de cada uno de los experimentos llevados a cabo
en este trabajo. En la Tabla 7.3 aparecen las ecuaciones con el valor de los parmetros del
modelo en funcin de la temperatura.
Tabla 7.3.- Valor de los parmetros en funcin de la temperatura empleados para el Modelo
Qumicamente Estructurado.
k,(T)={0,041(T-21)fI-exp(0.352(T-3S,O8))] [7.35]
382
Modelo Cintico Quimicamente Estructurado
En las Figuras 7. 1 y 7.2 se muestran los resultados de las reproducciones con ambos
modelos para el experimento u0 1, llevado a cabo a 250 C y con 257 p.p.m. de amonio
inicial. En la Figura 7.1 se comparan estos resultados para la evolucin de la biomasa y de
amonio. Se puede apreciar que el MQE (lnea continua) predice una concentracin de
biomasa en la fase estacionaria algo inferior a la obtenida con el MMET. Adems, se
observa la clara mejoria que introduce el MQE en la reproduccin de la evolucin de
amonio. En la Figura 7.2 aparece la reproduccin con ambos modelos de la velocidad de
formacin de xantano, de consumo de azcar y evolucin de oxgeno disuelto. En la citada
figura se puede ver que el MQE predice una concentracin de xantano inferior a la que
predice el MMET, con lo que se explica la menor velocidad de consumo de azcar y
oxgeno con este modelo en comparacin con el modelo metablico. Estas diferencias son
seguramente debidas a la inferior cantidad de biomasa que predice el MQE.
En las Figuras 7.3 y 7.4 se muestran estos mismos resultados para el experimento
u0 2, realizado a 280 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.3 se observa
que MQE (lnea continua), de nuevo, predice una concentracin de biomasa en la fase
estacionaria de crecimiento algo inferior a la obtenida con el MMET, no siendo as durante
la fase exponencial. Adems se observa la mejor reproduccin de la evolucin de amonio
introducida por el MQE. En la Figura 7.4 aparece la reproduccin con ambos modelos de la
velocidad de formacin de xantano, de consumo de azcar y la evolucin de oxgeno
disuelto. El MQE predice tambin en este caso una concentracin de xantano ms baja que
la que se obtiene con el MIPvIIET y, en consecuencia, una menor velocidad de consumo de
azcar y oxgeno.
383
Modelo Cintico Quiniicamente Estructurado
Las Figuras 7.5 y 7.6 muestran las reproducciones de los datos experimentales obtenidas
con ambos modelos comentados, para el experimento n0 3. llevado a cabo a 3I~ C y con
257 p.p.m. de amonio inicial. Los resultados obtenidos para la biomasa y la evolucin de
amonio aparecen en la Figura 7.5. En este caso las diferencias entre ambas velocidades de
formacin de biomasa no son muy significativas, si bien es ligeramente mayor la
concentracin de la biomasa que predice el MMET. Adems, se observa la clara mejora
que introduce el MQE en la reproduccin de la evolucin de amonio. En la Figura 7.6
aparece la reproduccin con ambos modelos de la velocidad de formacin de xantano, de
consumo de azcar y evolucin de oxigeno disuelto. En la citada figura se puede ver que la
evolucin de los componentes citados es muy similar, siendo ligeramente inferior la
velocidad de formacin de xantano en el MQE.
En las Figuras 7.7 y 7.8 se muestran estos mismos resultados con el experimento n0
4, llevado a cabo a 340 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.7 se puede
ver que no hay diferencias significativas en la evolucin de biomasa que predicen ambos
modelos; sin embargo, hay cierta diferencia, como se ha ido viendo, en la reproduccin de
la evolucin de amonio introducida por el MQE. En la Figura 7.8 aparece La reproduccin
con ambos modelos de la velocidad de formacin de xantano, de consumo de azcar y la
evolucin de oxgeno disuelto. Se puede apreciar que apenas hay diferencias en la evolucin
de estos componentes en los dos modelos que se estn comparando.
En las Figuras 7.9 y 7.10 se muestran las reproducciones de los datos experimentales
para el experimento n0 5, realizado a 280 C y con 65 p.p.m. de amonio inicial. Hay que
destacar que, en este caso, se emplea el cambio de estcquiometra para el amonio (ecuacin
[6.47]), que ya fue visto en el capitulo anterior. En la Figura 7.9 se observa que la biomasa
obtenida con el MQE es significativamente menor que la obtenida con e] MMET. En la
Figura 7.10 aparece la reproduccin con ambos modelos de la velocidad de formacin de
xantano, de consumo de azcar yla evolucin de oxigeno disuelto, observndose que
tambin la produccin de xantano es menor en el caso del MQE que en el MMET, lo que de
nuevo parece relacionado con la infraestmacin de biomasa.
384
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Si bien las diferencias en las reproducciones de los datos de cada uno de los
experimentos no son muy significativas, se observa que el modelo qumicamente
estructurado predice, salvo en el experimento n0 6, una menor concentracin del
polisacrido. Esto parece ser debido a que la biomasa que predice el MQE es tambin
inferior a la que predice el MIEMy a la obtenida experimentalmente. Como ya se ha visto, la
curva de evolucin de biomasa obtenida con el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado es, en casi todos los experimentos, inferior a la obtenida con el Modelo
Cintico Metablico. Esta pequefla diferencia en la biomasa es la que provoca, por tanto, la
diferencia en la prediccin de algunos otros componentes (xantano y azcar) en la parte
correspondiente a la produccin.
385
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,0
1,0
0,5
Ox)
60
t(h)
25
40
2.0
15
.4
ti.
1.0 t
=9
5
05
0~O
O lO 20 30 40 50 60
(h)
386
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
~0
1,2
5 1,0
.4
0
=9
uz
0,6
0,4
0,2
0,0 30
60
t(h)
2,5
2,0
(5. o
a lo ~
u
0,5
0,0
0 10 20 30 40 50 60
t (h)
387
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
9
=9
u
=9
u
t(b)
Figura 7.5- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio de]
experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
45 2,5
2,0
-4
(1
-4 x
1,0
=9 u
5
0,5
0,0
03
388
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,0
1,5
5
.4
=9
5
0,5
O. O lO 20 30 40
t(h)
2,5
2,0
I,5~
t.
(5-
lo
1
5
0,5
0,0
t (h)
389
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2.0
c~
.5
O 1.0
5 I~ U u
u
0.5
0.0 tu e
o I0 20 30 40 50 60
t (h)
2,5
z0
5;
(5-
t
u toQ=
cts
QO
t (h)
390
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,0
1.5
5 1,0
=9
6<
0.5
0,0
60
t(h)
2,5
2,0
(5.
1,5
o
.4
=9
u u
1,0
0,5
0,0
t(h)
391
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,0
5
.4
4
u
0 lO 20 30 40
t(h)
2,5
40
35 24
30
E5
25
4 20 o
rs I5 CF
lo.
cts
O 00
O lO 20 30 40 50
L (h>
392
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Puede ser que el microorganismo, segn las condiciones en las que se realice el
proceso. acumule otro compuesto intracelularmente, probablemente hidratos de carbono, los
cuales no han sido analizados experimentalmente. De esta forma, segn Las condiciones a
las que se haya realizado la fermentacin, la diferencia entre la biomasa terica (suma de
DNA, RNA y protenas intracelulares) y la experimental puede ser mayor o menor.
393
VIoc/ele Cintico Qumicamente Estructurado
En la Tabla 7.4 se muestran los valores obtenidos del parmetro kHc por ajuste en
mltiple respuesta con el modelo MQE para cada uno de los experimentos realizados en este
trabajo.
Tabla 7.4.- Valor del parmetro kuc obtenido por ajuste del MQE a los datos de los
experimentos llevados a cabo en este trabajo. ________________
Panmetro t Student
Experimento Max. Opt. Mm Obt. Teor
4
4.2. 0
To TTif5,1.i0~ 2.9
2 302.10 3.0110 Tbi0t5IO~ 2,92
3 1.51.10 TIbio 1,49.10~ 4.2.1O~ 2.73
Por tanto, se concluye que al incluir el trmino de hidratos de carbono como otro
componente ms de la biomasa se mejora significativamente la reproduccin de los datos
experimentales con el Modelo Qumicamente Estructurado.
394
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,0
1,5
u 1,0
-4
=9
6<
0,5
0,0 r
O lO 20 30 40 50
60
t(h)
Figura 7.15- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n0 1 (25 C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
2.5
2.0
1.5;
(3. t.
4.59 1.0 .s
u
0.5
0.0
O lO 20 30 40 50 60
t (ti)
395
Viodelo Cintico Qumicamente Estructurado
2.0
5 LO
.4
0,5
0.0
60
t(h)
2,5
2,0
1<
(5.
o
=9
IOy
cf
0,5
0,0
0 lO 20 30 40 50 60
tQ,)
396
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
5
.4
.59
.5
O lO 20 30
40
t(h)
2,5
2,0
l,5
1
o
4.59
u CF
0,5
-y- 0,0
0 10 20 30 40
t (ti)
Figura 7.20.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.n. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
397
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2.5
2,0
5
.59
.4
0,5
0.0
t(l)
2.5
2,0
I,59
ci. o
.4 4
.59 1,0 ~
u u
0,5
0,0
(lii
398
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,5
2.0-
.5
1.0-
u
- r~4f~.~ .- n9mp mp 3
0.0
o lo 20
30
T
40 50 60
2,5
a;;
4Q4
a;,
4 u 4 2,0
4
30-
u.
U LS;
u
20 J 4 4 5
u
4
4 AA
lO-, .. e
0
a
A
nfl..-& .A........A-- -
o -
ao
1> 10 20 30 40 50 60
jo,)
Figura 7.24. - Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n0 5 (28 C y 65 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
399
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,5
2.0
cf
tt
=9 1,0
6<
U.U
0.SJ -<l
0,0 1~
lo 20 30 40 50
o 60
t(h)
2,5
40
35 2,0
30
(Y 25 1,5
o
-4
=9 20
cf u
5.
lo
0,5
0 0,0
0 10 20 30 40 50 60
Figura 7.26.- Comparacin de la reproducciv~tle la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
400
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2.5
5
=9
6<
O lO 20 30 40
t(h)
2,5
2,0
(Y
ti
u
A
0
A.
0
AA A
-r QO
0 10 20 30 40 50 60
o,)
Figura 7.28.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontnua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
401
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
En la Figura 730 aparece representada la evolucin del parmetro kHc con respecto a
la concentracin inicial de amonio. Como se puede apreciar, se puede asumir, que la
tendencia es a un valor ms o menos constante, como indica la lnea discontinua.
Por tanto, el Modelo Qumicamente Estructurado viene dado por las ecuaciones
[7.15] a [7.17] para DNA, RNA, protenas intracelulares, respectivamente. Para la parte
correspondiente a la produccin, las ecuaciones [7.2] a [7.4] expresan la evolucin de
sacarosa, xantano y oxgeno disuelto. Finalmente la biomasa vendr dada por la ecuacin
[7.35~, donde, a su vez, el parmetro kHc viene, en funcin de la temperatura, por la
siguiente ecuacin:
kuc(T) ~ [7.36]
402
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
5 1
e--Kl.
4
o 3
o 1 1
24 26 28 30 32 34
Tenperaura
Figura 7.29.- Variacin del parmetro kHc del Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con la Temperatura.
u
3 u
e
co
1
z
It
O -J
loo 200 300 400 500
S(Ppm)
Figura 7.30.- Variacin del parmetro kHc del Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con la concentracin inicial de amonio.
403
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Una vez planteado el modelo MQE definitivo, con los valores de los parmetros en
funcin de la temperatura, se puede emplear para realizar simulacin de distintas
operaciones. Como ya se ha comentado a lo largo de esta Memoria, las simulaciones
permiten estudiar la influencia de ciertos factores sobre el sistema considerado sin
necesidad de realizar la experimentacin oportuna para ello.
Esto ltimo no haba sido conseguido hasta ahora, es decir, ni con el modelo cintico
no estructurado ni con el modelo cintico metablico se pudo obtener relacin de
parmetros con la variable concentracin inicial de amonio. La razn de ello es que el
sustrato nitrogenado era abordado, en ambos casos, de forma no estructurada, por lo que
estos modelos no eran capaces de predecir la influencia de cambios en la composicin del
medio, como, por ejemplo, de la concentracin inicial de amonio sobre la produccin del
polisacrido.
404
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Aunque solo se muestra la evolucin de biomasa, no hay que olvidar que sta es, en
realidad, la suma de componentes intracelulares: DNA, RNA, protenas intracelulares e
hidratos de carbono, cuyas evoluciones con el tiempo de fermentacin pueden ser predichas
con este modelo.
405
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2.5
2,
1,5
4
=9
4
o
0,5
o.,
t (h)
45
40
2
35
30 Clave Ce..,
C.c 70 pprfl
1~
ZC,.c200ppm C,
~25- 3 C,.
0.250ppm Cp
c~J,. - 4 C,.r 350 ppm
220-
00
cf 5-
lo
4
3
5
2.
o
20 40 80
t(h) 60
406
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,5 25
20
o
lOO
t (h)
Por tanto, se puede concluir que el modelo qumicamente estructurado permite una
adecuada prediccin del proceso de produccin de xantano. De la misma manera que ya
fue vista para el modelo cintico metablico, el MQE permite una adecuada reproduccin
de la evolucin del consumo de azcar, produccin de xantano y de la evolucin del
oxgeno disuelto Se obtiene una significativa mejora en la prediccin de la evolucin del
sustrato nitrogenado, gracias a la estructuracin de este compuesto en el crecimiento del
microorganismo.
Parece necesario, por tanto, estructurar el metabolismo, tanto del sustrato carbonado
(en el modelo cintico metablico) y como del sustrato nitrogenado (modelo cintico de
clula), tanto en la parte correspondiente al crecimiento como en la produccin del
producto de inters industrial, con el fin de predecir la influencia de cienos cambios que,
de otra forma, no seria posible llevar a cabo.
407
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
408
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
16
14
12
lo-.
ti
6
2 &at&WT paaTnoSpartCWfl
2 Siwu]aoT t*n~s ga1eI~
o- ~
50 lOO 150 200 250 300 350 400 450 500
C~
4 (p.p.nv)
409
8.- RESUMEN Y CONCLUSIONES
Resumen y Conclusiones
8.1- RESUMEN
Las reacciones que tienen lugar dentro de los microorganismos para que se produzca
el crecimiento o reproduccin de los mismos, se han considerado aisladamente, proponiendo
un Modelo Cintico de Clula; es decir, se ha desarrollado un modelo en el que no se tiene
en cuenta la parte correspondiente a la produccin de xantano, sino nicamente la parte
correspondiente al crecimiento, considerando la biomasa microbiana constituida por
componentes intracelulares como son protenas y cidos nucleicos (RNA y DNA),
proponiendo un esquema de reaccin simplificado. Se considera adems que parte de las
protenas que produce el microorganismo van a ser secretadas al medio, esto es son
protenas extracelulares.
Se llev a cabo el ajuste de Los datos experimento a experimento con este modelo,
obtenindose valores de los parmetros para cada uno de dichos experimentos. Los citados
valores son capaces de describir de forma satisfactoria la evolucin de la biomasa, el
sustrato carbonado y el producto en todos los casos, pero la descripcin de la evolucin de
oxigeno disuelto y la prediccin del consumo del sustrato nitrogenado obtenidos no son
aceptables. La simplicidad de este modelo hace que presente varias deficiencias, ya que con
l no es posible tener en cuenta las influencias en la produccin de xantano ni del oxigeno
disuelto, ni de la cantidad de sustrato nitrogenado suministrado al sistema y, adems, los
parmetros obtenidos mediante este modelo no son relacionables con la temperatura. Por
tanto, este modelo sencillo parece til nicamente para la descripcin de experimentos
aislados.
con una elevada precisin y rapidez. En este sentido, es necesario realizar un especial
esfuerzo para la conversin de los datos obtenidos por esta tcnica (datos cualitativos o
semicuantitativos) en datos cuantitativos (necesarios para la aplicacin de los modelos
cinticos), obteniendo curvas patrn, empleando otra tcnica de fluorescencia para el
calibrado: Espectrofluorimetria. En el presente trabajo se ha desarrollado un procedimiento
para el anlisis cuantitativo de protenas intracelulares, RNA y DNA, mediante tincin con
fluorforos especficos (Isotiocianato de Fluorescena e loduro de Propidio) y su posterior
anlisis en el citmetro de flujo.
Una vez planteados los posibles esquemas de reaccin, es necesario conocer qu tipo
de ecuaciones cinticas son las ms apropiadas en cada caso. El mtodo empleado para
determinar qu expresiones cinticas pueden ser utilizadas ha sido el mtodo de las
velocidades de reaccin (Garca-Ochoa y Romero, 1993), en el que se pueden aislar las
citadas expresiones cinticas siempre que el nmero de componentes clave del sistema
coincida con el nmero de relaciones independientes, es decir, que la matriz de los
coeficientes estequiomtricos sea cuadrada. En todos los casos, se probaron ecuaciones
tanto tipo potencial de primer y segundo orden como tipo hiperblico o Monod. Los
resultados de aplicar el mtodo de velocidades de reaccin sobre las dos simplificaciones
416
Resumen y Conclusiones
propuestas llevaron a plantear una cintica de primer orden para la velocidad de reaccin de
aminocidos formadores de bases, y cinticas de segundo orden e hiperblicas para el resto
de las velocidades de reaccin.
4/7
Resumen y Conclusiones
Este modelo cintico de clula presenta una evolucin coherente de los parmetros
con las variables estudiadas. Con la concentracin de nitrgeno, la tendencia de todos los
parmetros es a un valor constante, con la temperatura pueden ser ajustados a diferentes
funciones, por tanto se puede obtener un modelo de clula en funcin de la temperatura.
Con ello, es posible tener un modelo cintico que explique la influencia, tanto en
crecimiento como en produccin, de variables como la temperatura o cambios en la
composicin del medio, sobre la evolucin de los principales componentes del sistema, algo
sin precedentes en la literatura.
4/8
Resumen y Conclusiones
8.2.- CONCLUSIONES
dCN _ 1 dC
It 6,07 It
dcx 1 J(7y
di 0,139 di
dCP=
0o147.c .c
di ~ X
419
Resumen y Conclusiones
k~ 9
-
r,=k ~ ~, ~
~ 3,58+4.Y~>j
1 k<C0 (6 1+tYrp
C~ 41358.1
12 K4 C02 yy 3~58+4.Y1~~))
C
?~ATPP
=1,2
420
Resumen y Conclusiones
Y~ftT) =0,340+(6,1.]0<T
30-
20
lo-
o.
25 30 35
421
Resumen y Conclusiones
30
a
>0.4
lo
lO YO
l ~(h)
10
00 03 [0 lO 20
0<LiJnin>
422
Resumen y Conclusiones
423
Resumen y Conclusiones
C%
1(g/L) = 3,46 ~1< . FD (xexc=494; xenh=52o)
424
Resumen y Conclusiones
It It It It
ICR\04
It
dCDNA
di
dCPR ICPRE
It It
dC
NII4~ = 18(1,4. 2,75 2,75 )
It 136,5 103,5 478,6 491,7
425
Resumen> Conclusiones
Siendo:
rJ=lqC\ C~
/?4.C
.2 .5
C Y
(m =k C~
5.1.- El modelo de clula predice de forma adecuada la evolucin de la los
componentes que constituyen la biomasa, siendo capaz de predecir la
evolucin de la concentracin del sustrato nitrogenado en los diferentes
experimentos ajustados de forma satisfactoria.
k3<T) = 0,150
k5(T) =0,1 98
-y
kJTt { 0,041 (T- 21)11- expj0,352 (7- 35,08))J
426
Res umeny Conclusiones
It K4 CQ y3,58+4Y~~~)
IC0, _ 0,3 dC~ ~o,s 1c4C0 .Q +k~a< (C * CQ ~-- ICx
dr 923,2 Ir + CQ ~ It
k~C
K O2CI 141%,
~ C 3,584.YTPJ
0,
1 k4C0, ~13S8( 14Yrp
2 = 12K4C0, 37 . ~ 3,584Y4~
427
Res unen y Conclusiones
= ~ 2
y, ~34
41p1>
Siendo:
r1=k,C C~
r3=k3 C ,~,
r2m =k, C
N
k, (7) = 0,150
<(7) = 0,198
k,1~(T) = 0,001080,00003T
428
Resumen y Conclusiones
30-
25
20
o.
O 00 200 300 400
9. ~~,pm>
Figura 8.3.- Evolucin de la concentracin de xantano alcanzada a las 60 horas
de fermentacin con diferentes concentraciones iniciales de amonio.
429
9.- NOMENCLA TURA
Nomenclatura
9.- NOMENCLATURA
A : Absorbancia (u.a.).
Compartimento en los modelos de Bijkerk y Hall (1977) y de Nielsen y col.
(1991a y 1991b).
C2,
Parmetros del modelo de Matsumura y col. (1981).
3).
Parmetro del modelo de Wayman y Tseng (1976) (kg~/m
Concentracin de oxigeno en el momento en que se inicia la aireacin (04).
Cm
Citometra de Flujo.
CMiF
Dimetro de la hifa (m).
d
Compartimento del modelo de Ramkrishna y col. (1967).
D
431
Nomenclatura
E : Enzima de la ruta
ED : Factor de Dilucin.
k
0, ,k02 Factores preexponenciales en la ecuacin de Esener y col. (1983).
Factores preexponenciales en la ecuacin de Shu y Yang (1991).
3).
Parmetro ecuacin de Monod (1949,1950) (kg5/m
1hgu : Unidad de crecimiento hifal referida a la longitud de la hifa (mlpuntas).
432
Nomenclatura
NC : Nmero de Clulas.
Nmero de componentes clave.
Pl : Controlador proporcional-integral.
Tiempo (h).
Parmetro estadstico, t de Student.
T : Temperatura (0C).
V : Volumen (L).
433
Ao,nenclatu, a
YE : Extracto de levadura.
Letras Griegas
A : Incremento.
2. : Longitud de onda.
-y
Tensin tangencial (Nm2) (kg/ms).
434
Vomenclauua
Subndices
b Referido a biomasa.
O Condiciones iniciales.
ef Eficaz o medio.
exp Experimental.
O, Referido al oxgeno.
PR Referido a Proteinas.
435
jVomencaturo
x Referido a la biomasa.
Referido a xantano (modelo de Pons y col., 1989).
Superindices
A Referido a absorbancia.
E Referido a Fluorimetra.
* Valor de saturacion.
436
10.- BIBLIOGRAFA
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10.- BIBLIOGRAFL4
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