ENZIMOINMUNOANÁLISIS
ENZIMOINMUNOANÁLISIS
ENZIMOINMUNOANÁLISIS
ENZIMOINMUNOANLISIS HETEROGNEO.
FUNDAMENTO:
Desventajas:
ENZIMOINMUNOANLISIS HOMOGNEO.
Cuando el antgeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso del sustrato al
centro activo de la enzima, por lo que anula su actividad.
A mayor concentracin de la molcula problema, menor cantidad de antgeno marcado
se unir al anticuerpo, quedando mayor cantidad de antgeno libre con la enzima activa dando
una mayor actividad.
En resumen, a mayor concentracin mayor actividad, sin necesidad de separar las
fracciones.
FUNDAMENTO
Consiste en utilizar una enzima o conjugado tal que su propia incorporacin al complejo
antgeno-anticuerpo lleve asociada una modificacin (activacin o inhibicin) de la
actividad enzimtica ya sea porque se produzca un impedimento fsico para el posterior
acceso del sustrato al centro activo de la enzima, ya sea por un cambio conformacional en
esta. El caso es que la modificacin sea proporcional a la cantidad de complejo formado y,
por tanto la medida de la actividad enzimtica en el medio de reaccin indicar la
concentracin del componente problema sin necesidad de separar previamente el conjugado
no unido.
La mayora de los EIA homogneo son rpidos y sencillos de realizar y se adaptan muy
bien a la automatizacin; inicialmente fueron diseados para la detencin de molculas de
bajo peso molecular como hormonas y drogas, en actualidad se utilizan para molculas ms
complejas como protenas.
Ventajas:
Ms preciso.
Son ms rpido y sencillos de realizar.
Ms utilizados en drogas de abuso y monitoreo de frmacos que se adaptan a la
automatizacin.
Sin pasos de separacin no se requiere la separacin del antigeno unido del no unido.
Pueden desarrollarse anlisis sensibles por el efecto de amplificacin de las enzimas.
Los reactivos son relativamente baratos y alcanzan una larga vida media de
conservacin.
Pueden desarrollarse mltiples anlisis simultneamente
Se pueden realizar una amplia variedad de configuraciones analticas.
El equipo utilizado es relativamente barato y accesible.
No hay riesgos de radiacin durante el marcado ni en la eliminacin de los productos
de desecho.
Desventajas:
Fue el primer tipo de EIA homogneo desarrollado, en esta tcnica la unin del ligando
marcado con la enzima al anticuerpo origina un cambio en la actividad de la enzima, el cual
generalmente consiste en una disminucin de la misma. Aunque se piensa q en la mayora
de estos casos la inhibicin de la enzima es debida a un impedimento estrico que bloquea
fsicamente el acceso del sustrato al centro activo de la enzima, la inhibicin de ciertas
enzimas puede ser debida a cambios conformacionales inducidos en esta por la unin de
anticuerpos.
Cuando mayor es la concentracin del ligando problema en el espcimen, mayor es la
concentracin del ligando marcado no unido al anticuerpo en el medio de reaccin ,
aumentando simultneamente la actividad cataltica en el mismo. La mxima activida
cataltica se alcanza cuando todo el ligando marcado se encuentra en forma libre (no
unido al anticuerpo), o todo el anticuerpo esta unido al ligando presente en el espcimen.
ECIA
EEIA
Esta tcnica es til para medir anticuerpos y antgenos polivalentes y evita la necesidad
de disponer de antgenos marcados. Consiste bsicamente en que una cantidad limitada
de anticuerpos marcados con una enzima (B -galactosidasa) y un exceso de anticuerpo
sucinilado (cargado negativamente) forma un complejo antgeno-anticuerpo con
el ligando antignico polivalente presente en el espcimen la enzima unida al complejo
transforma un sustrato en producto que, en este ambiente cargado negativamente, queda
insolubilizado formando una segunda fase.
EIA homogneo con anticuerpos bioespecficos.
Puesto que la calidad de los mtodos EIA dependen en gran medida de las enzimas
utilizadas, estas han de cumplir ciertos requisitos para que puedan ser utilizadas como
marcadores. La actividad cataltica es medida bsicamente mediante la medida
espectromtrica, fluorimtrica o luminimetrica del producto formado. Aunque las
fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rbano pueden ser medidas con mayor
detectabilidad por fluorimtria y luminomtria que es espectrometra, el lmite de
deteccin global del EIA disminuye solo de 2 a 10 veces como mximo. A pesar de
ello, la medida espectromtrica del producto es, salvo excepciones, el mtodo de
deteccin ms frecuente para EIA.
INTERFERENCIAS COMUNES:
Interferencia exgenas:
CONCLUSIONES
El enzimoinmunoanlisis (EIA), est conformado por aquellas reacciones
serolgicas que utilizan conjugados enzimticos, para poder visualizar la reaccin
Antgeno-Anticuerpo. Se basa en la deteccin de un antgeno o anticuerpo inmovilizado
sobre una fase slida que mediante sus formas complementarias, directa o
indirectamente producen una reaccin cuyo producto, por ejemplo un colorante,
puede ser medido espectrofotomtricamente.
La EIA utiliza las propiedades catalticas de las enzimas para detectar y
cuantificar las reacciones inmunolgicas. Una sola molcula de enzima puede
catalizar la conversin de millones de molculas de sustrato en millones de
molculas en productos. Esta capacidad de amplificacin hace posible detectar la
presencia de una pequea cantidad de enzimas y, como consecuencia, de pequeas
cantidades de los complejos marcados formados. Consta de dos etapas: en la primera
etapa se produce la reaccin del antigeno y el anticuerpo marcado. En la segunda etapa
se aade el sustrato y se termina la actividad enzimtica de la enzima marcadora.
Para determinar las actividades de las enzimas marcadoras pueden utilizarse
diversos sustratos. Inicialmente, se utilizaron sustratos de las enzimas que producan
compuestos medibles fotomtricamente. Sin embargo, en los ltimos aos se estn
utilizando sustratos que dan compuestos fluorescentes o luminescentes, lo que a
incrementado la sensibilidad de prueba.