Recomendaciones para Lab. Que Realizan La Técnica de PCR Áreas y Flujos v1

D E PA RTA M E N T O L A B O R AT O R I O B I O M D I C O N A C I O N A L Y D E R E F E R E N C I A
Instituto de
Salud Pblica
Ministerio de Salud
DOCUMENTOS TCNICOS PARA EL LABORATORIO CLNICO
RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS

QUE REALIZAN LA TCNICA DE REACCIN
EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
REAS Y FLUJOS DE TRABAJO
ENERO, 2017 | VERSIN 1
RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE REALIZAN LA TCNICA
DE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): REAS Y FLUJOS DE TRABAJO
AUTORES
Biol. Jorge Fernndez Ordenes. PhD.
Jefe Subdepartamento Gentica Molecular.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
BQ. Soledad Ulloa Urrutia.
Profesional Subdepartamento de Gentica Molecular.
Subdepartamento de Gentica Molecular.
REVISORES INSTITUTO DE SALUD PBLICA REVISORES EXTERNOS

Winston Andrade Lillo. PhD. Dra. Marcela Lagos Lucero.
Profesional Seccin Virus Respiratorios y Exantemticos. Jefe de Laboratorio de Biologa Molecular y Citogentica.
Subdepartamento de Enfermedades Virales. Departamento de Laboratorios Clnicos.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia. Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Catlica de Chile.
Dra. Gabriela Muoz Gmez.
BQ. Pamela Araya Rodrguez. Jefe de Laboratorio de Biologa Molecular.
Jefe de Seccin Bacteriologa. Servicio de Laboratorio Clnico.
Subdepartamento Enfermedades Infecciosas. Hospital Clnico Universidad de Chile.
BQ. Monserrat Balanda Apey.
Profesional Seccin Virus Oncognicos.
Subdepartamento Enfermedades Virales.
BQ. Rodrigo Fasce Pineda.
Jefe Subdepartamento de Enfermedades Virales.
Dr. Juan Carlos Hormazbal Opazo.
Jefe Subdepartamento Enfermedades Infecciosas.
Biol. Daniel Ibez Cabrera.
Profesional Seccin Bacteriologa.
Subdepartamento Enfermedades Infecciosas.
Dra. Vernica Ramrez Muoz.
Jefe Subdepartamento Coordinacin Externa.
BQ. Javier Tognarelli Santiago.
Profesional Subdepartamento de Gentica Molecular.
Subdepartamento de Gentica Molecular.
RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE
REALIZAN LA TCNICA DE REACCIN EN CADENA DE
LA POLIMERASA (PCR): REAS Y FLUJOS DE TRABAJO
RESUMEN Mullis como una amplificacin enzimtica espec-

fica de ADN realizada in vitro, es decir, donde un
El siguiente documento entrega recomenda- segmento particular de ADN es copiado y espec-
ciones sobre las reas y flujos de trabajo para los ficamente amplificado al ser delimitado por un par
laboratorios que realizan tcnicas de PCR, conside- de partidores (oligonucletidos) que lo flanquean.
rando principalmente dos elementos que se deben El copiado se logra de forma exponencial a travs
tener en cuenta al disear e implementar un labo- de repetidos ciclos de diferentes etapas y tempe-
ratorio de PCR: la separacin de reas de trabajo raturas de incubacin en presencia de una enzima
con sets independientes de equipamiento, que no ADN-polimerasa termoestable.
se comparten entre reas, y el flujo unidireccional La PCR es una tcnica rpida y verstil, convir-
de trabajo desde el rea ms limpia (Pre-PCR) hacia tindose hasta la fecha en una tcnica comnmente
la ms sucia (Post-PCR). La rigurosa aplicacin de utilizada en diversos laboratorios. Tiene ventajas ta-
las medidas presentadas en este documento per- les como requerir una cantidad mnima de templado
mitir un control efectivo de la contaminacin con en la reaccin, el cual no necesariamente debe estar
cidos nucleicos, asegurando resultados confiables puro, permitiendo una fcil y rpida obtencin de
en laboratorios que realizan la tcnica de PCR. Cabe resultados. Sin embargo, la experiencia ha permi-
destacar que, tanto la infraestructura y disposicin tido identificar una gran limitante, como es la alta
de las reas en el laboratorio como el entrenamiento susceptibilidad de contaminacin en alguna de las
que reciba el personal dedicado a realizar esta tcni- etapas de la tcnica: la extraccin del templado, la
ca, son fundamentales para el xito en la aplicacin preparacin de reactivos, la dispensacin o carga
de estas recomendaciones. del templado y la etapa de electroforesis (slo para
el PCR de punto final).
Para minimizar este problema existen cier-
ALCANCE tas condiciones que deben ser controladas, tales
Estas recomendaciones aplican a los laborato- como: separar reas de trabajo contaminadas con
rios que realizan tcnicas de PCR de punto final y templado de aquellas reas libres de l con sets
de tiempo real. Se excluyen de estas recomenda- independientes de equipamiento que no se deben
ciones aquellos formatos de PCR automatizados compartir entre reas (micropipetas, gradillas,
que realizan el proceso completo desde extraccin delantales, guantes, coolers, toalla absorbente,
a deteccin. alcohol, lpices marcadores, microtubos, mini-
centrfugas, refrigeradores, etc) y mantener un flu-
jo unidireccional de trabajo desde las reas ms
INTRODUCCIN limpias hacia las ms sucias.
Este documento est dedicado a describir las
La Reaccin en Cadena de la Polimera- recomendaciones de consenso a nivel internacio-
sa (PCR) fue descrita en el ao 1986 por Kary nal sobre cmo establecer un laboratorio de PCR

Instituto de Salud Pblica de Chile. 3
con condiciones fsicas ptimas para el control donde la acumulacin de amplicones generados se
de la contaminacin y obtencin de resultados visualiza al final de un nmero predeterminado de
confiables. ciclos, generalmente mediante electroforesis.
Muchas veces, algunos de los recursos necesa- PCR de tiempo real: Permite detectar la cintica
rios para el ptimo desarrollo de las actividades ya de la acumulacin de amplicones durante cada ciclo
estn presentes, por lo que el proceso de conver- inmediatamente, sin necesidad de una electrofore-
sin es ms fcil. Sin embargo, es preciso mencio- sis posterior mediante la deteccin y cuantificacin
nar que cada laboratorio de PCR tiene sus propios en cada ciclo de una seal de fluorescencia emitida
requisitos, los cuales deben ser cuidadosamente por una molcula reportera: sonda (TaqMan, FRET,
considerados cuando se evala lo necesario para Scorpion, Molecular Beacons, etc), Primers (Ampli-
iniciar y operar este tipo de laboratorio con xito. fluor, D-Lux) intercaladores de cidos nucleicos
En cuanto al personal encargado de realizar en- (SYBR-Green, Yoduro de propidio,etc).
sayos de PCR, ste debe estar capacitado en el co-
rrecto uso de los implementos, reactivos, equipos Templado: cido nucleico (ADN o ARN) utilizado
y todo aquello que est relacionado con la tcnica. como molde para la PCR, es decir, a partir de esta
molcula sern sintetizadas las copias idnticas co-
nocidas como amplicones.
DEFINICIONES Termociclador: Equipo que permite realizar de
forma automtica los ciclos de temperatura necesa-
Amplicn: Conjunto de molculas de ADN idnti-
rios para una PCR. El termociclador es diferente si
cas, resultado de una reaccin en cadena de la po-
se realiza una PCR de punto final o una PCR de
limerasa (PCR). Tambin se conoce como producto
tiempo real, ya que este ltimo debe detectar fluo-
de PCR, producto amplificado o amplificado.
rescencia y en diferentes canales de absorcin.
rea limpia: Espacio fsico libre de amplicones,
Fluorforo: Molcula o parte de ella que emite
templados de ADN y de muestras biolgicas que
fluorescencia luego de ser excitada con luz.
pudieran contaminar futuras PCR. Corresponde al
rea de preparacin de reactivos, tambin llamada
Pre-PCR.
DESARROLLO
rea sucia: Espacio fsico donde existe presen-
cia y manipulacin de amplicones, ADN/ARN y/o I.- REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERA-
muestras biolgicas. Comprende las reas de Ex- SA (PCR)
traccin del templado, rea de Carga dispensacin Esta tcnica se realiza en un equipo Termocicla-
del templado, rea de Amplificacin (donde estn dor y consta, generalmente, de tres etapas:
los termocicladores) y, para el caso de PCR de pun- 1.- Denaturacin inicial.
to final, el rea de Electroforesis.
2.- Amplificacin, en una treintena de ciclos repe-
Mezcla de PCR: Preparacin y mezcla de los titivos.
componentes necesarios para que ocurra una reac-
cin de PCR tales como agua libre de nucleasas, 3.- Elongacin final, si es PCR de punto final.
tampn (buffer), Mg+2, dNTPs, partidores, sondas A su vez, cada uno de los ciclos repetitivos de la
(para PCR de tiempo real) y enzima polimerasa ter- etapa 2 est conformado por 3 subetapas:
moestable (Taq polimerasa, Pfu).
i. Denaturacin a 94C-96C, que provoca
PCR de punto final: Tambin conocido como la ruptura de los puentes de hidrgeno y
PCR convencional permite visualizar, mediante una la separacin de la doble hebra del ADN
electroforesis, la acumulacin de amplicones ge- en simple hebra, quedando expuestas las
nerados al final de un nmero predeterminado de bases nitrogenadas del templado.
ciclos. Tambin conocido como PCR convencional,

4 Instituto de Salud Pblica de Chile.
ii Hibridacin de los partidores (y la sonda si sntesis o extensin de la cadena. Esto provoca

es PCR de tiempo real) a una temperatura la liberacin del fluorforo y su separacin del
que oscila entre 45C-65C (que depende apagador, producindose fluorescencia.
del contenido y proporcin de nucletidos 3.- Sondas Molecular Beacons: oligonucletido
de los partidores). En esta etapa ocurre la que contiene un fluorforo en su extremo 5 y
hibridacin de los partidores especficos un apagador (quencher) en su extremo 3. Los
con su regin complementaria en el tem- extremos de esta molcula son complementa-
plado. La temperatura de esta etapa es rios entre s, encontrndose en forma de hor-
variable, y es dependiente de la tempera- quilla y el fluorforo apagado. Al unirse la son-
tura de fusin (Tm) de los partidores. En da al templado, fluorforo y apagador se alejan,
el caso de la PCR de tiempo real realizada producindose la fluorescencia.
con sondas TaqMan (las ms comunes),
esta etapa generalmente se realiza a 60C Para diagnstico clnico, se recomienda la utili-
e incluye la hibridacin y elongacin junto zacin de sondas (puntos 2 y 3) dadas su alta es-
con la lectura de la fluorescencia. pecificidad.
iii. Elongacin a 68C-72C, temperatura a la
que la polimerasa va aadiendo los dife-
rentes nucletidos libres, en el orden que III.- CONTAMINACIN DE LA PCR
le va dictando la secuencia de nucletidos La contaminacin de las reacciones de PCR es
de la cadena que acta como templado, un problema inherente para los laboratorios que
desde el extremo 3` de los partidores. realizan este procedimiento. Sin embargo, hay una
serie de medidas para controlar o minimizar esta
Una vez finalizada la reaccin en el termocicla- contaminacin, y el grado de rigor que se requiere
dor, se obtienen millones de copias de amplicones. en un laboratorio a menudo se determina segn el
Si ha ocurrido contaminacin durante la prepa- formato de PCR y de extraccin que se utilice.
racin de la PCR, podran obtenerse amplicones Antes de planificar el diseo del laboratorio es
inespecficos, es decir, que no correspondan al ADN primordial conocer las fuentes y las vas comunes
diana requerido, o bien falsos positivos por conta- de contaminacin:
minacin con templado o amplicones, alterndose
la confiabilidad de los resultados. 1.- Fuentes de contaminacin:
Corresponden a templados y amplicones.
Las fuentes de contaminacin pueden provenir
II.- FLUORFOROS PARA PCR DE TIEMPO de las muestras biolgicas que se manipulan
REAL durante la etapa de extraccin y/o la etapa de
carga o dispensacin durante la preparacin de
1.- SYBR Green: fluorforo que es capaz de unirse la reaccin de PCR, y en el caso de la PCR de
a cualquier molcula de ADN de doble hebra punto final, de los amplicones manipulados en
(amplicn especfico, amplicn inespecfico el rea de Post-PCR.
y dmeros de partidores). Por lo tanto, es una Ellas pueden ser muy problemticas debido a
tcnica menos especfica y no se recomienda su gran estabilidad, contaminando equipos,
su uso en diagnstico clnico, ya que puede superficies, micropipetas, microtubos, solu-
producir falsos positivos. ciones, guantes, delantales, gradillas, coolers
2.- Sondas TaqMan: oligonucletido que contiene y lpices marcadores.
un fluorforo en su extremo 5 y un apagador 2.- Vas de contaminacin:
(quencher) en su extremo 3. Durante la PCR, - Generacin de Aerosoles
la sonda se une al templado y luego es hidro- La formacin de estas microgotas con
lizada por la enzima Taq polimerasa durante la cidos nucleicos puede originarse por la

apertura de tubos que contengan: partido- IV.- Recomendaciones para disminuir la

res, sondas (PCR en tiempo real), templa- contaminacin:
dos y/o amplicones. Los aerosoles son de 1.- Generales
fcil dispersin y pueden contaminar los
materiales (guantes, gradillas, tubos) y las 1.1 Limpiar las reas de trabajo antes y des-
superficies de trabajo. pus de su uso con Etanol 70%
- Derrame de soluciones 1.2 Utilizar guantes (sin talco) durante todos

El contacto de soluciones que contengan los procedimientos
cidos nucleicos (partidores, templado 1.3 No tocar reactivos, tubos y/o equipos con
y amplicones) con la superficie de traba- las manos descubiertas (sin guantes)
jo es una va comn de contaminacin. 1.4 No almacenar en un mismo refrigerador/
Esto puede ocurrir por volcamiento de congelador, reactivos libres de templado
microtubos (y el consecuente derrame de junto con cidos nucleicos purificados y/o
la solucin) o por la disposicin de tapas con muestras biolgicas. Los refrigerado-
de microtubos y puntas de micropipeta ya res/congeladores deben encontrarse en el
utilizadas sobre las superficies, que dejan rea designada (sucia o limpia) para evitar
residuos contaminantes. el traslado de muestras o reactivos de un
lugar a otro dentro del laboratorio.
Las fuentes de contaminacin pueden prove-
nir de las muestras biolgicas que se manipulan 1.5 Eliminar cualquier reactivo donde se de-
durante la etapa de extraccin y/o la etapa de car- tecte o sospeche contaminacin: partidor,
ga o dispensacin durante la preparacin de la sonda, agua, enzima, etc. Para evitar pr-
reaccin de PCR, y en el caso de la PCR de punto didas de los stocks de reactivos por con-
final, de los amplicones manipulados en el rea taminacin, se recomienda preparar al-
de Post-PCR. cuotas previo a su uso, de manera de slo
Ellas pueden ser muy problemticas debido a eliminar la alcuota en uso si se detecta
su gran estabilidad, contaminando equipos, su- contaminacin.
perficies, micropipetas, microtubos, soluciones, 1.6 Centrifugar brevemente (spin) los tubos
guantes, delantales, gradillas, coolers y lpices que contengan cidos nucleicos y luego
marcadores. abrirlos cuidadosamente (sin tocar la zona
Para disminuir los riesgos de contaminacin interna de tapas y tubos) para evitar conta-
en esta metodologa, debe realizarse un cuidadoso minar los guantes y las superficies.
estudio de la ubicacin de las diferentes reas del
1.7 Descontaminar la superficie utilizada para
proceso. A su vez, es fundamental el uso exclusi-
preparar las reacciones de PCR y los
vo de equipamiento, guantes sin polvo, soluciones
materiales (gradillas, micropipetas, lpi-
descontaminantes y material de laboratorio en cada
ces, contenedores de desechos, coolers,
rea. En caso de disear una nueva infraestructura,
guantes) con soluciones descontaminan-
es recomendable considerar los flujos de aire con
tes como DNAZap (Invitrogen), RNase
presiones positiva en el rea limpia y negativa en el
Away (Ambion), DNA Away (VWR),
rea sucia, as como el uso de cabinas de PCR que
DNA Remover (Minerva Biolabs), entre
posean luz ultravioleta.
otras, con radiacin ultravioleta 15 a 30
min (degrada cidos nucleicos) y/o Eta-
nol al 70% (alto poder germicida) antes y
despus de la preparacin. Si se sospecha
contaminacin, adicionalmente, una vez
terminado el trabajo, pueden limpiarse las

superficies con una solucin de 0,5- 1,0 % controles antes mencionados, se sugiere
de hipoclorito de sodio, que luego debe ser trabajar cada muestra utilizando rplicas
removido con etanol 70%. para descartar posibles falsos positivos,
1.8 Mantener siempre un flujo de trabajo uni- dada la alta sensibilidad de la tcnica.
direccional. 2.2- Degradacin de contaminantes
Para la PCR de punto final, la adicin de
1.9 Las puntas para micropipetas utilizadas en Uracil-N-Glicosilasa (UNG) en conjunto
todas las reas deben tener filtro para evitar con dUTP (en lugar de dTTP) a la mezcla
la contaminacin de las mismas por forma- de PCR, permite inactivar enzimticamente
cin de aerosoles. los amplicones de amplificaciones anterio-
res para evitar que sean futuras fuentes de
2.- Especficas contaminacin. Durante la PCR, los ampli-
2.1.-Controles del proceso cones sern sintetizados utilizando dUTP
Incorporar uno o ms de los siguientes en vez de dTTP; para una prxima PCR, en
controles, para tener un mejor control y de- caso de haber contaminacin por amplico-
teccin oportuna de las contaminaciones. nes (contaminacin carry-over), la previa
Cada uno de los controles mencionados incubacin con enzima UNG degradar los
debe trabajarse en un tubo separado y ser productos que contengan dUTP, inactivn-
sometido a PCR. dolos como templado.
a.- Control de extraccin:
Utilizar un reactivo, por ejemplo agua
estril libre de nucleasas, y manipularlo V.- INHIBICIN DE LA PCR
como una muestra biolgica ms durante Existen diversas causas por las que se puede
el proceso de extraccin de cidos nu- inhibir una reaccin de PCR provocando resultados
cleicos. Luego de la PCR y electroforesis falsos negativos:
debe arrojar un resultado negativo.
b.- Control de reactivos: 1.- Sustancias inhibidoras de la PCR
Preparar la mezcla de reactivos en el rea 1.1 Sustancias de origen biolgico presentes en la
limpia y mantener el tubo cerrado durante matriz de la muestra. Se han descrito muchas
el resto del proceso. Permite chequear los sustancias inhibidoras de la reaccin de PCR
reactivos que se estn utilizando para la dependiendo del material del cual proviene la
preparacin de las mezclas de PCR. Lue- muestra a testear como sales biliares y poli-
go de la PCR y electroforesis debe arrojar sacridos complejos de las heces; colgeno
un resultado negativo. de tejidos animales; grupo hem, hemoglobina,
c.- Control de manipulacin: lactoferrina e inmunoglobulina G de sangre;
melanina y eumelanina de pelo y piel; miog-
Agregar agua en uno o ms microtubos
lobina del tejido muscular; iones calcio de la
en lugar de templado durante el proceso
leche y huesos; urea de la orina, entre otros,
de carga en la preparacin de la PCR.
que pueden disminuir en distintas medidas la
Permite chequear la manipulacin, por
eficiencia de la PCR. Otras sustancias como la
parte del operador, de las muestras con
heparina tambin inhiben una PCR.
templados. Luego de la PCR y electrofo-
resis debe arrojar un resultado negativo. 1.2 Sustancias qumicas de uso comn en los la-
d.- Control de rplica: boratorios. Fenol, SDS, el polvo de los guan-
tes, fijadores a base de mercurio, detergentes
Para todo laboratorio que trabaje con PCR
como Tritn X-100, ditiotreitol, EDTA, filtros
de tiempo real, adems de utilizar los
de nitrocelulosa, formaldehido, dicromato de

potasio, entre otros, se han descrito como inhi- e.- Controlar las condiciones de conservacin de
bidores de la PCR. las muestras desde su toma hasta su procesa-
Para evitar que esto ocurra es crucial utilizar un miento.
buen mtodo de extraccin de cidos nuclei-
cos, especfico para cada tipo de muestra, que
asegure la eliminacin de tales compuestos. VI.- FLUJOS Y REAS DE TRABAJO
Durante el desarrollo de una PCR se recono-
cen diferentes reas, limpias o sucias, segn su
2.- Degradacin de cidos nucleicos potencial de contaminacin, las que deben ser
La principal causa de degradacin de los cidos consideradas en el diseo del laboratorio y en el
nucleicos es la presencia de nucleasas (ADNasas flujo de trabajo, para la obtencin de resultados
y ARNasas) provenientes de tejidos/organismos de PCR confiables.
contaminantes, as como esporas de bacterias y Cada vez que un operador ingrese a un rea
hongos, fluidos corporales y las clulas muertas de de trabajo diferente debe ponerse guantes nuevos
las propias manos del operador de la tcnica, que y delantal exclusivo, y utilizar slo los equipos y
pueden contaminar micropipetas, gradillas, coolers, materiales disponibles en esa rea. Los delantales,
superficies y reactivos, destruyendo los partidores guantes, gradillas, lpices, contenedores de dese-
y/o las sondas de la reaccin de PCR y el templado chos, papel absorbente, micropipetas, soluciones
de la muestra, ocasionando como resultado falsos descontaminantes y etanol 70% presentes en cada
negativos. Otra causa de degradacin es la mala rea son exclusivos y no son intercambiables, es
conservacin de las muestras: (a) a mayor tempera- decir, los insumos utilizados para trabajar en un
tura ambiente hay mayor degradacin y (b) a mayor rea sucia deben ser distintos a los utilizados en
nmero de congelaciones y descongelaciones su- un rea limpia. Para esto, es necesario disponer de
cesivas hay mayor degradacin. percheros y un set de materiales ubicados en las
Para evitar estas degradaciones se recomienda: distintas reas de trabajo:
a.- Usar guantes en todo momento, los cuales de- - rea limpia: una vez que se ha ingresado a esta
ben ser libres de polvo (el polvo de los guantes rea, el operador debe vestir inmediatamente
inhibe tambin la PCR). Cambiarse de guantes un delantal exclusivo. Antes de retirarse, el de-
de rea en rea, y/o ante cualquier sospecha de lantal utilizado debe ser colgado en un perche-
contaminacin. ro para que permanezca en esta rea.
b.- Limpiar con soluciones descontaminantes las - rea sucia: siempre que el operador trabaje en
superficies, guantes, gradillas, micropipetas, un rea sucia debe vestir un delantal exclusivo.
coolers, vrtex, etc. antes y despus de usar - rea de carga o dispensacin de muestras: una
el rea. Hay soluciones que slo degradan AR- vez que se ha ingresado a esta rea, el ope-
Nasas, pero son ms eficientes aquellas que rador debe vestir inmediatamente un delantal
degradan ARNasas, ADNasas, ADN y ARN, evi- exclusivo. Antes de retirarse, el delantal utiliza-
tando tambin la posible contaminacin. do debe ser colgado en un perchero para que
c.- Todas las soluciones a utilizar (buffers, enzi- permanezca en esta rea y los guantes deben
mas, agua) deben ser certificadas libres de nu- ser eliminados.
cleasas.
Antes de salir del rea limpia, rea de carga o
d.- Todos los materiales plsticos utilizados: tubos salir del laboratorio, el delantal utilizado debe ser
de reaccin, puntas de micropipetas, tapas de colgado en un perchero para que permanezca en
tubos, placas tiras de tubos deben ser certifi- esta rea y los guantes deben ser eliminados.
cados libres de nucleasas. Los delantales deben ser renovados permanen-

temente (o lavados frecuentemente) para asegurar trasladados a otro espacio del laboratorio.
la eliminacin de contaminantes (delantales rea Cabe destacar que las puntas para micropipetas
sucia) y mantencin de la limpieza (delantales rea utilizadas en todas las reas deben tener filtro para
limpia). Por esta razn, es altamente recomendable evitar la contaminacin de las mismas por forma-
el uso de delantales desechables y, en lo posible, cin de aerosoles.
manguillas desechables. El personal, una vez finalizada su tarea en cada
rea, debe sacarse los elementos de proteccin (de-
lantal, guantes y manguillas desechables) antes de
1.- FLUJO DE TRABAJO moverse al rea que el flujo unidireccional le indica.
UNIDIRECCIONAL
Figura 1: 2.- REAS DE TRABAJO
Esquema de trabajo, en un laboratorio de PCR, con flujo uni-
direccional. 2.1. rea de Extraccin y Purificacin de
Templado
En este espacio deben realizarse las extracciones
y/o purificaciones de cidos nucleicos que luego
sern utilizados como templado para las reacciones
de PCR. El almacenamiento de este material debe
En la Figura 1 se resume el flujo de trabajo uni- realizarse en un congelador exclusivo ubicado den-
direccional que debe seguirse al realizar las activi- tro de este espacio. La extraccin debe realizarse
dades propias de un laboratorio de PCR, de manera en un gabinete de bioseguridad clase II, de forma
de trabajar siempre desde el rea ms limpia ha- que el personal que manipule muestras biolgicas
cia las reas ms sucias: Preparacin de reactivos, se mantenga protegido y, al mismo tiempo, se asle
Carga o dispensacin del templado, Amplificacin y el templado de posibles contaminaciones externas.
Deteccin (tanto para PCR de punto final como para El equipamiento de esta rea es exclusivo y no
PCR de Tiempo Real). puede ser usado en otra rea del laboratorio. El per-
El rea de procesamiento de las muestras (Ex- sonal, al ingresar, debe utilizar delantal y guantes
traccin de templado) debe estar separada del rea exclusivos de esta rea y no puede trasladarlos a
de amplificacin y deteccin. otra rea del laboratorio.
Para mantener el flujo unidireccional de trabajo,
y evitar retroceder desde reas sucias hacia reas
limpias, cada una de las reas de trabajo debe con- 2.2. rea de Preparacin de Reactivos
tar con recursos exclusivos tales como: agua libre (Pre-PCR)
de nucleasas, centrfugas, vrtex, refrigeradores/ El rea de preparacin de reactivos se define
congeladores, micropipetas, puntas para micropi- como aquella rea limpia donde se utilizan proto-
petas y todo lo que sea necesario para la realizacin colos y equipamientos para preparar las mezclas
de la tcnica. Se incluye adems, elementos adicio- de reaccin que sern utilizadas en la PCR. Todo
nales como computadores, lpices y calculadoras equipamiento de esta rea es exclusivo y no se pue-
que deben ser exclusivos de cada rea y no inter- de utilizar en otra rea del laboratorio. En este lugar
cambiables. Asimismo, debern mantenerse canti- debe haber un congelador de -20C de uso exclusi-
dades suficientes de guantes y delantales en cada vo para almacenar los reactivos utilizados para pre-
rea, de forma que su uso sea exclusivo en cada parar reacciones de PCR, y nunca mezclarlos con
una de ellas y se disminuya al mnimo el riesgo de material biolgico (extractos de ADN o ARN, culti-
contaminacin. vos, material clonado y amplicones). Los stocks de
Todos estos elementos deben estar rotulados partidores (oligonucletidos) y los reactivos de PCR
segn el rea a la que pertenezcan y no deben ser nuevos deben almacenarse en una ubicacin dife-

rente, dentro del mismo congelador, con respecto a 2.4. rea de Amplificacin y Deteccin
los reactivos de uso diario (alcuotas), para evitar su (Post-PCR)
posible contaminacin. Antes de entrar a esta rea sucia, el personal
Como se mencion anteriormente, los delan- debe vestir guantes y delantal exclusivos de este
tales y guantes utilizados en esta rea deben ser sector.
exclusivos, ya que no debe existir contaminacin En el caso del PCR de punto final, al finalizar
desde otras reas. Por lo tanto, el personal que in- la reaccin en el termociclador, los amplicones son
grese a esta sala debe sacarse previamente los ele- manipulados en el sector de electroforesis para la
mentos de proteccin que est utilizando, y vestir verificacin de resultados, el cual debe contar con
elementos de proteccin exclusivos una vez dentro cmaras de electroforesis, fuentes de poder y los
de esta rea. materiales requeridos para su funcionamiento.
Este espacio debe contar con una cabina de
PCR cerrada que posea luz ultravioleta. Dentro de
esta cabina deben manipularse todos los reactivos 3. FLUJOS DE AIRE AMBIENTAL
para preparar mezclas de PCR. En su interior de-
ben mantenerse las micropipetas, tubos y gradillas Las diferencias de presin del aire pueden usarse
de uso diario. para inhibir el pasaje de contaminantes entre reas:
La cabina cerrada va a permitir: presiones ms altas se utilizan en reas limpias que
se encuentren prximas o contiguas a reas sucias
Irradiar la superficie de trabajo dentro de la
a fin de minimizar las contaminaciones.
cabina con luz ultravioleta previo a su uso, de
Por esta razn, las reas de Pre y Post-PCR
forma que las pirimidinas de cualquier traza de
idealmente deben contar con presiones de aire dis-
cido nucleico presente en la cabina formen
tintas y controladas individualmente. Mientras el
dmeros entre s (cross-link) bloqueando el
rea limpia de Preparacin de reactivos debe tener
paso de la polimerasa en una futura reaccin
una ligera presin positiva, entre 5-20 Pa por sobre
de PCR.
la presin existente en el pasillo de conexin entre
reas, las otras reas deben tener una ligera presin
negativa para ingresar aire desde el exterior y, por
2.3. rea de Carga o Dispensacin de Tem-
ende, prevenir el escape de contaminantes hacia
plado
otros lugares del laboratorio.
En esta rea deben dispensarse los templados Es necesario, adems, que los controladores de
a las mezclas de PCR que han sido preparadas en presin estn conectados a conductos de escape de
el rea limpia. El personal debe ingresar y utilizar aire separados, de forma que cada uno lleve el aire
los elementos de proteccin exclusivos de esta rea. extrado/ingresado a lugares distintos y no exista
Adems, debe contar con cabina de PCR cerrada contaminacin por esta va.
que posea luz ultravioleta, micropipetas, gradillas y
microcentrfuga de uso exclusivo. Antes de abrir los
tubos que contienen el ADN templado, debe reali- CONCLUSIONES
zarse una breve centrifugacin (spin) para evitar el
escape de aerosoles al abrir el tubo. Una vez adicio- La rigurosa aplicacin de las medidas pre-
nado el cido nucleico templado, cerrar hermtica- sentadas en este documento permitir un control
mente los tubos y llevar al rea de amplificacin. efectivo de la contaminacin y la obtencin de re-
Al terminar este proceso, el personal nuevamen- sultados confiables en laboratorios que realizan la
te debe quitarse guantes y delantal (exclusivos de tcnica de PCR.
esta rea) y dirigirse a los termocicladores para dar Cabe destacar que tanto la infraestructura y dis-
inicio a la reaccin de PCR. posicin de las reas en el laboratorio como el en-

trenamiento que reciba el personal dedicado a reali- 12.- Schrader C. et al. PCR inhibitors ocurren-
zar esta tcnica, en el contexto de un slido sistema ce, propierties and removal. J Appl Microbiol.
de calidad, son fundamentales para el xito en la 2012; 113 (5): 1014-1026.
aplicacin de estas recomendaciones. 13.- Scherczinger C.A. et al. A systematic analysis
of PCR contamination. J Forensic Sci. 1999; 44
(5): 1042-1045.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:
14.- Standards Unit, Microbiology Services Divi-
1.- De Lomas, JG et al. False-negative results by sion. Good laboratory practice when perfor-
polymerase chain reaction due to contamina- ming molecular amplification assays. Quality
tion by glove powder. Transfusion. 1992; 32 Guidance. 2010; 1 (4): 1-13.
(1): 83-85.
15.- Viana, R and Wallis, C. Good Clinical Labora-
2.- Dieffenbach,CW and Dversler G.S. Setting up a tory Practice (GCLP) for Molecular Based Tests
PCR laboratory. Genome Res. 1993; 3 (2): S2-S7. Used in Diagnostic Laboratories. InTech. 2011:
3.- Espy, MJ. et al. Real-Time PCR in Clinical Mi- 29-52.
crobiology: Applications for routine laboratory 16.- Wilson I. Inhibition and Facilitation of Nucleic
testing. Clin Microbiol Rev. 2006: 19 (1): 165- Acid Amplification. Appl Environ Microbiol.
256. 1997; 63 (10): 3741-3751.
4.- Kwok, S. Procedures to minimize PCR-product 17.- MM3-P2. Molecular diagnostic methods for
carry-over. Academic Press Inc. Ltd. 1990; infectious diseases: proposed guideline, se-
142-145. cond edition: Laboratory Design and practices.
5.- Lo, Y.M. et al. False-positive results and the Clinical and Laboratory Standards Institute.
polymerase chain reaction. The Lancet. 1988; 2 USA. 2006.
(8612): 679. 18.- MM05-A2. Nucleic Acid Amplification assays
6.- Mifflin, Th. E. Control of contamination asso- for molecular hematopathology; approved gui-
ciated with PCR and other amplification reac- deline second edition. .Clinical and Laboratory
tions. Molecular Bioproducts, Inc. 1997: 1-20. Standards Institute. USA. 2012.
7.- Mifflin, Th.E. Setting up a PCR Laboratory.

Cold Spring Harb Protoc. 2007; 2 (1): 5-10.
8.- Moia, E. and Wheeler, F. The design criteria of a
pharmaceutical clean room. Ingeniera Qumi-
ca. 2000; 32: 65-82.
9.- Mullis, K. et al. Specific enzymatic amplifi-
cation of DNA in vitro: the polymerase chain
reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol. 1986; 51 (1): 263-273.
10.- Mullis, K. and Faloona, FA. Specific synthe-
sis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed
chain reaction. Methods Enzymol. 1987; 155:
335-350.
11.- Newton, C.R. Setting up a PCR laboratory.
PCR: Essential data. 1995: 216.


Recomendaciones para Lab. Que Realizan La Técnica de PCR Áreas y Flujos v1

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Recomendaciones para Lab. Que Realizan La Técnica de PCR Áreas y Flujos v1

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Recomendaciones para Lab. Que Realizan La Técnica de PCR Áreas y Flujos v1

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

D E PA RTA M E N T O L A B O R AT O R I O B I O M D I C O N A C I O N A L Y D E R E F E R E N C I A

DOCUMENTOS TCNICOS PARA EL LABORATORIO CLNICO

RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS

REVISORES INSTITUTO DE SALUD PBLICA REVISORES EXTERNOS

RESUMEN Mullis como una amplificacin enzimtica espec-

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

ii Hibridacin de los partidores (y la sonda si sntesis o extensin de la cadena. Esto provoca

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

apertura de tubos que contengan: partido- IV.- Recomendaciones para disminuir la

- Derrame de soluciones 1.2 Utilizar guantes (sin talco) durante todos

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

7.- Mifflin, Th.E. Setting up a PCR Laboratory.

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

También podría gustarte