Estudio de la gelificación de alginatos para

encapsulación: caracterización, preparación y

aplicaciones en alimentos funcionales
Bryshila Lupo Pasin

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 Programa de Doctorado: “Ciència i Tecnologia de Materials”

Estudio de la gelificación de alginatos para encapsulación:

caracterización, preparación y aplicaciones en alimentos

funcionales.

Bryshila Lupo Pasin

Dra. Alicia Maestro Garriga Dra. Carme González Azón

Departament d´Enginyeria Química Departament d´Enginyeria Química

Departament d´Enginyeria Química. Facultat de Química.

Universitat de Barcelona

1
2
 AGRADECIMIENTOS

“No puede responder otra cosa que gracias y gracias”

William Shakespeare

Esta Tesis Doctoral es el fruto, no sólo del trabajo y la dedicación de la

doctoranda sino también del esfuerzo y colaboración de numerosas personas.
Aunque estas líneas no puedan compensar todo lo que cada una de ellas ha
aportado a esta etapa de mi vida, espero que al menos sirvan para expresar mi más
sincero agradecimiento.

A mis Directoras de tesis, Dra. Carme González y Dra. Alicia Maestro por
guiarme en este largo proyecto, dedicar su tiempo a pesar de sus muchas otras
ocupaciones y por sobre todo haberme dado la oportunidad de disfrutar de un
periodo de aprendizaje que me ha hecho crecer como persona. Me gustaría
agradecer a la Dra. Montse Porras por sus consejos y enriquecedoras aportaciones
al inicio de la tesis y, al Dr. José M. Gutiérrez por su colaboración especial durante
todo el desarrollo de este trabajo.

Gracias a Blaia y a Esther por su amabilidad y ayuda en los diferentes

trámites requeridos durante toda mi estancia y para la finalización de la tesis.

Agradezco a las personas del CSIC, especialmente a Susana Vílchez por su

dedicación y ayuda en la realización de diferentes análisis, también a María y
Jonathan por sus buenos consejos. Quiero dar las gracias al personal del CCiT por
sus servicios y excelencia profesional, en especial a la plataforma de microscopía
electrónica, poliformismo y calorimetría, resonancia magnética nuclear y técnicas
separativas. Mi más sincero agradecimiento a la Dra. Elvira López y Dra. Montse Riu
por sus importantes aportaciones y especial apoyo para la realización de la
evaluación sensorial.

A mis compañeros del laboratorio, con los que tantas horas he compartido,
gracias a ellos por hacer de este camino un trayecto más fácil y divertido, lleno de
momentos gratos que han formado parte de una hermosa etapa de mi vida, en
especial a Esther, Mabel, Anna, María, Marta, Ricard, Xavi y Blanca.

A la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado por su apoyo institucional,

especialmente al personal del DFPA y a mis compañeros de labores del Dpto. de
Procesos Agroindustriales.

Agradezco al proyecto Europeo de Movilidad Académica, Erasmus Mundus

Ánimo, ¡Chévere! por la beca otorgada para la realización de mis estudios
doctorales. A la oficina de Movilidad y Programas Internacionales de la UB por sus
servicios, amabilidad y disposición en todo momento, en especial a Marta y a Esther.

3
 AGRADECIMIENTOS

A mis amigos y compadres del alma por creer en mí, motivarme y apoyarme
siempre en mis decisiones: Flavia, Erika, Daniel, Carolina, Erich, Jorge, Meilin y
Juviely. Gracias a Montse, Lucia, Karla, Ira y Bruno por estar cuando necesité ser
escuchada.

A mis padres, quienes me infundieron la ética y el rigor que guían mi transitar

por la vida, les tengo que agradecer su apoyo incondicional. A mi madre que es el
ser más maravilloso de todo el mundo, gracias por el apoyo moral, tú cariño y
comprensión. A mi padre, para mí un gran hombre al que siempre he admirado.
Gracias, ambos han hecho que sea lo que soy.

A mis hermanas por darme su cariño, palabras de aliento y mostrarme que la

vida siempre te recompensa gratamente cuando te has esforzado. Gracias, porque
me conocen tal y como soy, porque me aceptan a pesar de todas mis faltas, porque
son Uds. mis mejores amigas.

A mis abuelos, que hoy ya no están en esta tierra pero que han sido ejemplo
de constante lucha, fortaleza y trabajo, a ellos dedico esta tesis. Los llevo siempre
en mi corazón.

A mi familia, mi maravilloso marido, amigo y compañero de vida, eres el pilar

fundamental de éste gran logro, este trabajo es producto de tu inmensa paciencia, tu
tiempo, tu incondicional amor hacia mí y, a mi hijo, un ser tan especial que solo con
una sonrisa llena mi vida de motivación y profunda alegría. Por Uds. Todo, con Uds.
al infinito y más allá…

DIOS, cada vez que me caí, cada vez que me sentí atrapada, siempre me
mostraste la luz que me guiaría a la salida. Un “gracias” no basta para mostrarte mi
gratitud. Gracias por ser mi padre y no abandonarme.

Y finalmente, a todos aquellos que no hayan visto sus nombres escritos en

estas líneas, pero que saben que de una u otra manera han estado presente durante
estos años de mi vida.

“La Ciencia es parte de nuestra naturaleza en la vida”

Anónimo

4
 ÍNDICE

RESUMEN……………………………………………………………………………. 9
1. OBJETIVOS………………………………………………………………………. 13
2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………. 17
2.1 Alginatos……………………………………………………………………. 20
2.1.1 Fundamentos Teóricos: Alginatos……………………………………… 20
2.1.2 Mecanismos de gelificación…………………………………………….. 28
2.1.3 Caracterización del Gel………………………………………………….. 31
2.2 Tensioactivos……………………………………………………………… 40
2.2.1 Definición………………………………………………………………….. 40
2.2.2 Clasificación………………………………………………………………. 41
2.2.3 Balance hidrofílico-lipofílico (HLB) de los tensioactivos……………… 42
2.2.4 Tensioactivos de uso alimentario………………………………………. 43
2.3 Emulsiones…………………………………………………………………. 44
2.3.1 Conceptos y propiedades……………………………………………….. 44
2.3.2 Métodos de preparación de emulsiones………………………………. 47
2.3.3 Estabilidad de las emulsiones…………………………………………… 48
2.4 Encapsulación……………………………………………………………… 49
2.4.1 Encapsulación y sus técnicas: Generalidades……………………….. 50
2.4.2 Técnicas de encapsulación con alginato……………………………… 53
2.4.3 Antecedentes: aplicaciones de encapsulación con alginato………… 56
2.5 Diseño Experimental……………………………………………………… 59
2.5.1 Diseño factorial……………………………………………………………. 60
2.6 Modelos para ajustes cinéticos de liberación………………………. 62
2.6.1 Modelos matemáticos mecanicistas o realistas………………………. 63
2.6.2 Modelos matemáticos empíricos……………………………………….. 68
2.7 Alimentos Funcionales………………………………………………….. 72
2.7.1 Tendencias en el desarrollo de alimentos funcionales………………. 73
2.7.2 Compuestos bioactivos: Polifenoles……………………………………. 74
2.8 Análisis Sensorial………………………………………………………… 79

5
 ÍNDICE

2.8.1 Aspectos Generales……………………………………………………… 80

2.8.2 Métodos de Evaluación Sensorial……………………………………… 81
2.8.3 Análisis de Perfil de Textura (TPA)…………………………………….. 83
2.8.4 Ensayo de Resistencia…….…………………………………………….. 88
3. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………. 91
3.1 Materiales…………………………………………………………………….. 93
3.2 Equipos………………………………………………………………………. 95
3.3 Técnicas de análisis y caracterización………………………………… 97
3.4 Métodos de preparación…………………………………………………. 101
3.4.1 Caracterización del alginato de sodio…………………………………. 101
3.4.2 Preparación de los geles de alginato…………………………………… 103
3.4.3 Preparación de las microesferas de alginato en emulsión………….. 108
3.4.4 Preparación de las esferas por extrusión……………………………… 118
3.4.5 Métodos de determinación de la liberación del principio activo…….. 122
3.4.6 Preparación y análisis de gelatinas para la aplicación de un alimento
funcional…………………………………………………………………………… 125
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………….…………..…………………………. 133
4.1 Caracterización del alginato de sodio…………………………………. 135
4.1.1 Determinación de la composición química……………………………. 135
4.1.2 Determinación de otros compuestos…………………………………… 138
4.2 Caracterización reológica de los geles de alginato obtenidos con
diferentes sales de calcio y mecanismos de gelificación………………….. 141
4.2.1 Influencia de la concentración de calcio en los geles preparados por
gelificación externa……………………………………………………………… 141
4.2.2 Influencia de la fuente de calcio y la concentración en los geles
preparados por gelificación interna……………………………………………. 145
4.2.3 Comparación de las propiedades reológicas entre los geles de
alginato obtenidos por gelificación externa y gelificación
interna……………………………………………………………………………… 152
4.3 Estudio del método de preparación de las microesferas de alginato
en emulsión por gelificación interna…………………………………………. 155

6
 ÍNDICE

4.3.1 Obtención de las microesferas de alginato con diferentes sales de 155

calcio y concentraciones en emulsión por gelificación interna……………..
4.3.2 Estudio de estabilidad de las emulsiones para la obtención de las
microesferas de alginato……………………………………………………….. 162
4.3.3 Estudio de las variables de composición y preparación para la
obtención de las microesferas en emulsión por gelificación interna con el
principio activo a encapsular…………………………………………………… 169
4.3.4 Estudio del mecanismo de liberación del principio activo desde las
microesferas……………………………………………………………………… 188
4.4 Estudio de las esferas de alginato con principio activo preparadas
por extrusión con diferentes mecanismos de gelificación…………………. 191
4.4.1 Influencia del mecanismo de gelificación, concentración del extracto
de cacao y sal de calcio en el tamaño, morfología y textura de las esferas
obtenidas por extrusión…………………………………………………………. 192
4.4.2 Estudio del mecanismo de liberación del principio activo desde las
esferas preparadas por gelificación externa y gelificación interna………… 205
4.5 Estudio de un producto alimentario de aplicación funcional con la
incorporación de los encapsulados…………………………………………… 218
4.5.1 Evaluación sensorial de las gelatinas enriquecidas con los
encapsulados…………………………………………………………………….. 219
4.5.2 Estudio comparativo de las texturas de las gelatinas con y sin la
incorporación de encapsulados y su evolución con el tiempo de
almacenamiento………………………………………………………………….. 220
4.5.3 Evolución de la concentración del principio activo en las gelatinas
con el tiempo……………………………………………………………………… 229
4.5.4 Influencia del principio activo en la presencia de microorganismos en
las gelatinas………………………………………………………………………. 231
5. CONCLUSIONES………………………………………………………………… 233
6. RECOMENDACIONES………………………………………………………….. 241
7. BIBLIOGRAFÍA……………..……………………………………………………. 245
8. GLOSARIO………………………………………………………………………… 263
9. APÉNDICES………………………………………..………………….………… 273
9.1 Datos para la caracterización del alginato sódico: RMN, CET, DSC y
refractometría……………………………………………………………………… 275
9.2 Propiedades reológicas de los geles de alginato preparados con
diferentes fuentes de calcio y mecanismos de gelificación……………… 279

7
 ÍNDICE

9.3 Datos para la caracterización de las microesferas de alginato en

emulsión por gelificación interna………………………………………………. 288
9.4 Datos para la caracterización del extracto de cacao…………………… 294
9.5 Viscosidad de la fase dispersa para el estudio de preparación de las
microesferas en emulsión por gelificación interna…………………………. 296
9.6 Caracterización de las esferas de alginato/cacao preparadas por
extrusión con diferentes mecanismos de gelificación: diámetros,
morfología y textura………………………………………………………………. 297
9.7 Publicaciones..………………………………………………………………… 301

8
 RESUMEN

La industria alimentaria ha estudiado en los últimos años la encapsulación de

compuestos bioactivos para su aplicación en el diseño de alimentos funcionales. Por
ello, diferentes trabajos han utilizado los biopolímeros como agentes encapsulantes,
ya que proporcionan matrices biodegradables, no tóxicas y versátiles tanto para el
consumo humano como para su utilización industrial. El alginato gelificado puede
emplearse como encapsulante de compuestos activos, resultando en un producto
final que proteja a éstos de factores adversos como el calor y la humedad, mejore su
estabilidad y biodisponibilidad, e incluso enmascare o preserve sabores y aromas al
hacer funciones de aislante.
En este trabajo se han analizado los mecanismos de gelificación del alginato y
las técnicas derivadas para la encapsulación de principios activos en estos geles. En
primer lugar, se caracteriza el alginato sódico utilizado y los geles de alginato cálcico
preparados por gelificación externa (GE) y gelificación interna (GI). Estos resultados
son considerados para el estudio de las diferentes técnicas de encapsulación. Para
ello, se ha estudiado cómo formar una emulsión estable que proporcione las
microesferas de menor tamaño por GI, así como la encapsulación de compuestos
activos en ellas, a través de un diseño experimental. En segundo lugar, se han
analizado esferas obtenidas por extrusión con diferentes formulaciones,
comparándose su tamaño, morfología y textura. También se ha estudiado la
liberación de los polifenoles desde los encapsulados hacia el medio que los rodea y
se ha ajustado la curva de liberación a varios modelos propuestos en la bibliografía.
Finalizando se han incorporado las esferas más idóneas según las características
deseadas en un alimento para su evaluación sensorial.
Del estudio experimental, se concluye que la estructura polimérica del alginato
sugiere una contribución equilibrada de sus monómeros con una distribución por
bloques heterogénea que proporciona mayor flexibilidad al gel formado. Su alto peso
molecular promedio e índice de polidispersidad indican que éste contiene una amplia
distribución de diferentes alginatos. Las características viscoelásticas de los geles
obtenidos, en general, muestran que un incremento de la [Ca +2] proporciona geles
más compactos. Las diferencias observadas entre sus propiedades indican una
influencia de la fuente de calcio al utilizar GI, que resulta en geles débiles cuando se
forman a partir de CaCO3 atribuido a la presencia de poros debido a la liberación del
CO2 durante la gelificación, geles fuertes pero de estructura irregular a partir de
Ca(OH)2 y geles de viscoelasticidad intermedia, aspecto homogéneo y compacto

9
 RESUMEN

cuando son formados a partir de citrato cálcico para un determinado rango de

concentración de calcio. Para la [Ca+2] mayor utilizada las características reológicas
se presentan independientes del tipo de sal. Para esta última [Ca +2] el gel formado
por GE muestra un gran carácter sólido atribuido al proceso de formación que tiene
lugar en la superficie, donde van llegando los iones calcio desde el exterior y, en
consecuencia, se forma una capa externa muy reticulada que ralentiza la difusión de
los iones calcio hacia las partes más internas del gel. Los geles formados por GI no
muestran propiedades viscoelásticas tan acusadas, pero sí son más homogéneos,
mostrando un grado de reticulación similar en la superficie y en el interior del gel,
debido a que en este mecanismo de gelificación el calcio ya se encuentra distribuido
inicialmente en toda la masa de alginato a gelificar.
Las microesferas de alginato preparadas en emulsión por GI evidencian un
efecto de la fuente de calcio en sus tamaños, siendo sensiblemente menores las
obtenidas a partir de citrato cálcico. Éstas muestran una superficie uniforme. Por el
contrario, las microesferas formadas con el carbonato cálcico presentan una
superficie de aspecto poroso atribuido al CO2 liberado durante la gelificación, lo que
podría ocasionar una liberación prematura del compuesto activo encapsulado si se
utiliza esta sal.
Las emulsiones preparadas con distintas concentraciones de tensioactivos
tipo Spans se presentan muy inestables, mientras que las formadas con PGPR se
muestran estables y con un grado de coalescencia considerablemente menor. La
distribución de tamaños de las microesferas obtenidas a partir de las diferentes
emulsiones y citrato cálcico indican que las microesferas de menor tamaño y
polidispersidad se producen con PGPR, debido precisamente a que este
tensioactivo forma las emulsiones más estables. Además, se obtiene una correlación
entre el tamaño de gota de las emulsiones y las microesferas que indica una
contracción importante producto del fenómeno de sinéresis. Al encapsular el extracto
de cacao en las microesferas, el diseño experimental muestra que la cantidad de
fase dispersa influye significativamente en el porcentaje retenido de polifenoles y
que la velocidad de agitación afecta al diámetro medio y la polidispersidad de las
microesferas. El aporte de acidez por parte del extracto de cacao induce una
pregelificación del alginato antes de la emulsificación lo que lleva a resultados poco
reproducibles, cosa que se subsana con un control del pH de la fase dispersa. La
encapsulación del compuesto puro no indica efecto alguno de las variables

10
 RESUMEN

analizadas en las propiedades de las microesferas dentro del rango estudiado. Por
otro lado, el porcentaje retenido de éste sugiere que una cantidad importante se
encuentra entre los polifenoles encapsulados en las microesferas con extracto de
cacao al considerar que la catequina es uno de sus principales constituyentes
fenólicos.
Todas las esferas obtenidas por extrusión se ven afectadas por el aumento de
la [Ca+2] al producirse una disminución en sus diámetros, efecto reportado por otros
autores y atribuido a la formación de un gel más compacto que produce más
sinéresis. La estructura interna de las esferas confirma la influencia del tipo de
gelificación, siendo las esferas obtenidas por GE heterogéneas con una capa
externa tipo cáscara, mientras que las formadas por GI se presentan más
homogéneas. Sus propiedades texturales indican que son más duras las esferas
preparadas por GE que las formadas por GI, lo que evidencia la existencia de una
capa más rígida en la superficie de éstas cuando se utiliza la GE. Las esferas
preparadas por GI muestran una cohesividad superior dada su estructura más
homogénea, son más elásticas según la cantidad de extracto utilizada para una
misma [Ca+2] y para todas las formulaciones son menos gomosas por lo que
requieren menor energía para su ruptura en boca durante la masticación.
La liberación de los polifenoles desde los diferentes encapsulados muestra los
mejores ajustes al modelo de Peppas-Sahlin, lo que sugiere una cinética dominada
por la difusión del compuesto activo a través de los poros de una matriz hinchada
producto del mecanismo disolución/relajación. Un aumento de la [Ca+2] induce un
retraso en la liberación de los polifenoles desde las diferentes esferas siendo más
notable en las obtenidas por GI.
La incorporación de esferas más suaves, menos gomosas con un alto
contenido de extracto de cacao y [Ca+2] a un producto alimentario como la gelatina
muestra a través de una evaluación sensorial que el sabor astringente y amargo del
extracto natural es satisfactoriamente enmascarado debido a su encapsulación al no
ser percibido por la mayoría de los panelistas. El análisis del perfil de textura y la
prueba de ruptura de las diferentes gelatinas y su evolución con el tiempo de
almacenamiento indican que el extracto no se puede añadir directamente a la
gelatina sin ser encapsulado, ya que entonces ésta no se forma adecuadamente y,
además el contenido fenólico se degrada rápidamente. La incorporación de esferas
con extracto de cacao en gelatinas aporta una dureza inferior que las esferas sin

11
 RESUMEN

aditivo, cosa que se atribuye a la formación de puentes entre iones calcio y

polifenoles que impiden mayores puntos de gelificación en el gel. Las diferencias de
dureza y cohesividad entre la gelatina tipo postre y la natural neutra se atribuyen a
los ingredientes añadidos donde la fructosa contribuye a una mayor consistencia
debido a su capacidad para retener el agua expulsada por parte de las esferas. El
contenido fenólico total difundido desde las esferas con cacao a la gelatina es
pequeño, evidenciando que una cantidad significativa permanece encapsulada.

12
 HOJA PRESENTACIÓN OBJETIVO

1. OBJETIVOS

13
 HOJA PRESENTACIÓN OBJETIVO

14
 OBJETIVOS

La evolución humana ha generado cambios en el estilo de vida y en sus

hábitos alimentarios y de consumo. Actualmente la elección racional de los
alimentos se fundamenta no sólo en satisfacer las necesidades básicas (hambre y
proporción de nutrientes), sino también en prevenir las enfermedades relacionadas
con la nutrición y mejorar el bienestar físico y mental. En tal sentido, los alimentos
denominados funcionales constituyen el segmento del mercado alimentario de
mayor crecimiento. En los últimos años, su mayor interés se ha enfocado en el
desarrollo de compuestos activos encapsulados para así ofrecer sus múltiples
beneficios sin ser dañados por las agresiones del entorno durante el procesado y
almacenamiento de los alimentos. Estos encapsulados deben estar formados por
matrices biodegradables, no tóxicas y versátiles tanto para el consumo humano
como para su utilización industrial. En virtud de las nuevas tendencias alimentarias
este trabajo surge por la necesidad de profundizar en el conocimiento de los
mecanismos de gelificación de alginatos y las técnicas derivadas para la
encapsulación de principios activos en estos geles. El objetivo global de este trabajo
es el estudio de la gelificación de alginatos para encapsulación: caracterización,
preparación y aplicaciones en alimentos funcionales. Para llevar a cabo este estudio
se plantean objetivos específicos los cuales se desglosan a continuación:

Objetivos Específicos.

- Caracterización del alginato sódico como material de partida para la preparación de

los geles de alginato de calcio.

- Caracterización de las propiedades viscoelásticas de los geles de alginato

producido con diferentes sales de calcio y rango de concentraciones empleando
diferentes mecanismos de gelificación, así como la influencia del pH en las
propiedades del gel.

- Estudio del método de preparación de microesferas de alginato en emulsión por

gelificación interna.

- Estudio de la influencia de las diferentes variables de composición y preparación de

las microesferas de alginato con el principio activo encapsulado en el tamaño y
propiedades de dichas esferas, preparadas por emulsificación y gelificación interna.

15
 OBJETIVOS

- Estudio y caracterización de las esferas de alginato con el principio activo

encapsulado, preparadas por el método de extrusión utilizando diferentes
mecanismos de gelificación.

- Estudio del mecanismo de liberación del principio activo desde los encapsulados
obtenidos con las diferentes técnicas de encapsulación.

- Estudio y evaluación de un producto alimentario funcional.

16
 HOJA PRESENTACIÓN INTRODUCCIÓN

2. INTRODUCCIÓN

17
 HOJA PRESENTACIÓN INTRODUCCIÓN

18
 INTRODUCCIÓN

La industria alimentaria y nutracéutica ha estudiado en los últimos años la

encapsulación de compuestos bioactivos como herramienta para la aplicación de
éstos en alimentos y en la formulación de preparados de liberación controlada a
objeto de diseñar alimentos funcionales y/o ingredientes alimentarios. Para ello,
diferentes trabajos han estudiado el uso de los biopolímeros como agentes
encapsulantes y su efecto sobre la estabilidad e interacción polímero-activo. Estos
encapsulados deben estar formados por matrices biodegradables, no tóxicas y
versátiles tanto para el consumo humano como para su utilización industrial. En tal
sentido, el alginato ha sido utilizado debido a sus múltiples ventajas tanto para el
consumo humano como en aplicaciones industriales. Tales aspectos han sido
compilados en la literatura por Imeson (2010) resaltando el efecto prebiótico de los
alginatos de bajo peso molecular, los beneficios de su ingesta como fibra diaria para
la reducción de los niveles de azúcar y colesterol en sangre, así como, la capacidad
para prolongar la vida útil en productos. Las nuevas tendencias tecnológicas se han
enfocado en la producción de alimentos estructurados y funcionales mediante la
adición de compuestos activos como antioxidantes, vitaminas, aminoácidos,
minerales e incluso de pequeñas moléculas como células, enzimas y
microorganismos probióticos beneficiosos para la salud. Estos compuestos activos
deben conservarse manteniéndose sus propiedades beneficiosas en los alimentos
durante el procesamiento y almacenaje (Parra-Huertas, 2010). El alginato gelificado
puede utilizarse para ello, a través de las técnicas de encapsulación, resultando en
un producto final que permite proteger a los compuestos encapsulados de factores
adversos como el calor y la humedad, mejorando así su estabilidad y
biodisponibilidad. Además, la encapsulación puede ser usada como medio para
enmascarar o preservar sabores y aromas al hacer funciones de aislante (Lupo et
al, 2012).
Los antioxidantes como fenoles, flavonoides y proantocianidinas retardan o
inhiben la oxidación de los lípidos y previenen ciertas enfermedades (Woodside et
al., 1999; Owen et al., 2000; Kris-Etherton et al., 2004), tales como el cáncer,
arterosclerosis neurodegenerativa o inflamatoria y las enfermedades
cardiovasculares (Prior y Gu, 2005). Teniendo en cuenta los beneficios anteriores y
nuevas ideas para reducir el uso de antioxidantes comerciales sintéticos, surge la
utilización de extractos naturales ricos en polifenoles como ingredientes activos que
pueden ser incorporados en alimentos.

19
 INTRODUCCIÓN

La encapsulación, aplicada con el objetivo de producir alimentos funcionales

debe considerar, entre otras cosas, la influencia de la incorporación de las partículas
o cápsulas a los alimentos desde el punto de vista organoléptico. Asimismo, el
tamaño de éstas podrá afectar a la textura final del alimento. En este orden de ideas,
la aplicación de diferentes técnicas de encapsulación debe ser tomada en cuenta
dependiendo del producto final deseado. La preparación de microcápsulas o
microesferas puede proporcionar tamaños lo suficientemente pequeños para no
interferir con la textura y sabor original del alimento. Por otro lado, el uso de
cápsulas o esferas perceptibles fácilmente por el consumidor puede ser un factor
favorable o no dependiendo del aspecto y textura final que se pretenda dar al
producto.

2.1 Alginatos.

El alginato es un componente de la pared celular de las algas pardas

(Phaeophyceae). Sus propiedades varían de una especie a otra, por tanto su
selección para la cosecha se basa tanto en la disponibilidad de la especie como en
las propiedades del alginato que contiene (McHuge, 1987). Se encuentra formando
un complejo insoluble del ácido algínico y sus sales cálcica, magnésica, de estroncio
y bario en diferentes proporciones. Su función biológica en las algas consiste en
permitir la formación de una estructura intracelular cuya matriz de gel confiere a la
planta resistencia mecánica y flexibilidad. Es a causa de su capacidad para retener
agua, sus propiedades gelificantes, su acción espesante y estabilizante por lo que es
ampliamente empleado industrialmente. La producción global anual de alginato se
estima aproximadamente en 38000 toneladas (Draget, 2000).

2.1.1 Fundamentos Teóricos: Alginatos.

Los alginatos son considerados hidrocoloides debido a su afinidad por el agua

y propiedades reológicas. La composición y arreglo secuencial en la cadena
polimérica de los alginatos se relaciona con el origen, de manera que existe una
influencia tanto ambiental como genética en su conformación estructural. En
consecuencia, su geometría y composición específica proveen propiedades
diferentes al polímero. Por ello, la importancia de conocer la distribución de sus

20
 INTRODUCCIÓN

monómeros a lo largo de la cadena y peso molecular promedio, parámetros que

están estrechamente relacionados con la funcionabilidad de los alginatos, tales
como: solubilidad, viscosidad, estabilidad y formación de geles.

2.1.1.1 Definición de Hidrocoloide.

Los hidrocoloides son macromoléculas con una gran afinidad por el agua
donde se disuelven en mayor o menor medida, modificando su reología,
aumentando la viscosidad del líquido e, incluso, llegando a gelificar dando un
aspecto sólido al líquido inicial.
Las fibras con mucha capacidad de absorción de agua, clasificadas como
aditivos (agar, alginato, goma arábiga, pectina, entre otros) son cadenas más o
menos largas, lineales o ramificadas, de diferentes azúcares y derivados. Según las
características de sus cadenas (longitud, ramificaciones y cargas eléctricas), los
hidrocoloides pueden ser solubles en frío o pueden requerir un previo tratamiento
térmico para que se puedan solubilizar. Estos se clasifican según su origen en
naturales o modificados, lo cuales son codificados para ser utilizados como
hidrocoloides alimentarios.

- Hidrocoloides solubles en frío: no requieren un tratamiento térmico para dar

viscosidad o gelificar. Por ejemplo: alginato (E-400 al E-404), goma guar (E-412),
goma arábiga (E-414) y goma xantana (E-415).
- Hidrocoloides solubles con pretratamiento térmico: necesitan un
tratamiento térmico para dar viscosidad o gelificar. El efecto es más apreciable
cuando la solución se enfría. Por ejemplo: agar (E-406), pectina (E-440),
carragenato (E-407), goma garrofín (E-410), entre otros.

La mayoría de los hidrocoloides son de origen vegetal y se trata de fracciones

de fibras más o menos purificadas mediante procesos fisicoquímicos que
posteriormente, pueden ser modificadas químicamente para mejorar sus
características. Otros, se obtienen por biotecnología, cultivando en grandes
reactores algunas especies de microorganismos que secretan mucílagos o gomas.

2.1.1.2 Estructura del alginato.

21
 INTRODUCCIÓN

El alginato se ha descrito como un polisacárido lineal poliónico conformado en

su estructura por copolímeros binarios no ramificados del ácido urónico, los cuales
son bio-sintetizados mediante enzimas específicas que catalizan la formación de los
monómeros de ácido α-L-gulurónico (G; 1-4 enlace ácido α-gulopyranosyluronic C4)
y el ácido β-D-manurónico (M; 1,4-enlace ácido β-D-mannopyranosyluronic C1). En
la estructura en bloques se encuentran generalmente tres tipos de enlaces
glucosídicos, incluyendo el diecuatorial (MM), diaxial (GG), y ecuatorial-axial (MG).
El bloque-G es más rígido y el más extendido en la configuración de la cadena
respecto al bloque-M (Funami et al., 2009).
Los bloques G o M, se distribuyen en secciones constituyendo
homopolímeros tipo bloques-G (-GGG-), bloques-M (-MMM-) o heteropolímeros
donde los bloques M y G se alternan (-MGMG-) como se aprecia en la Figura 2.1
(Pawar y Edgar, 2012). Tanto la distribución de sus monómeros en la cadena
polimérica como la carga y volumen de los grupos carboxílicos confieren al gel
formado características de flexibilidad o rigidez dependiendo del contenido en G. En
alginatos de alto contenido en M, las cadenas son lineales, y tienen la función de
ayudar a dar conformación tridimensional aguantando las cadenas G. Por esta razón
dan lugar a un tipo de gel dúctil, flexible, elástico y con poca sinéresis. Mientras que,
en alginatos de alto contenido en G, las cadenas tienen estructura de zig-zag y
permiten una unión más fácil del calcio dándose la forma conocida como “caja de
huevos” que proporciona un gel consistente, rígido, quebradizo y con sinéresis
(Cubero et al., 2002).

Figura 2.1 Distribución por bloques de los monómeros constituyentes en el polímero de alginato. Tipo
de bloque-G, bloque-M y bloque-MG alternado (Power y Edgar, 2012).

22
 INTRODUCCIÓN

Diversas investigaciones han demostrado que la distribución de sus

monómeros (secuencia) a lo largo de la cadena polimérica no puede describirse de
manera suficiente empleando modelos estadísticos. Una información más detallada
respecto a la secuencia de sus monómeros, llegó a estar disponible con la
introducción de la espectroscopía de alta resolución o resonancia magnética nuclear
(NMR) (Grasdalen et al., 1977, 1981; Grasdalen, 1983). Esta técnica ha permitido
determinar la frecuencia mónada (FM y FG), la frecuencia díada (FGG, FGM, FMG y FMM)
y las frecuencias tríadas (FMGM y FGGM). El conocimiento de ello, por ejemplo, permite
el cálculo de la longitud media de bloques-G mayores de 1 (Ec. 1), la cual se ha
demostrado que correlaciona bien con las propiedades de gelificación (Draget,
2000).

(𝐹𝐺 − 𝐹𝑀𝐺𝑀 )
𝑁𝐺>1 = ⁄𝐹 (1)
𝐺𝐺𝑀

Durante el proceso de extracción del alginato, éste puede sufrir degradación

en la longitud del polímero debido a las altas temperaturas o por exposición a los
rayos UV durante el lavado, lo que puede ser desventajoso para su uso como
material de encapsulación al considerar que su biocompatibilidad aumenta con el
aumento de la masa molar. Además, durante la producción del alginato comercial
suele emplearse mezclas de algas como materia prima. De todo ello, se desprende
la importancia de determinar la relación M/G, estructura secuencial y tamaño, al
considerar las diferencias existentes entre especies de algas e incluso la presencia
de impurezas, información que generalmente no es proporcionada por los
fabricantes pero cuyos parámetros dictan las propiedades fisicoquímicas y
gelificantes de los alginatos (Storz et al., 2009).

2.1.1.3 Solubilidad y Viscosidad.

En general, hay tres parámetros esenciales que determinan y limitan la

solubilidad en agua de los alginatos. El pH del medio es importante debido a la
necesidad de cargas electrostáticas en los residuos de ácidos urónicos. Un
descenso abrupto del pH puede causar la precipitación del ácido algínico (Draget,
2000). También es determinante la fuerza iónica del medio y la presencia de iones
gelificantes en el disolvente lo que limitaría la solubilidad de los alginatos (Pawar y

23
 INTRODUCCIÓN

Edgar, 2012). Este último aspecto, pudiera ser un problema en términos de “dureza”
del agua debido al contenido de iones Ca+2. El alginato, en forma de sal sódica,
potásica o magnésica es soluble en soluciones acuosas a pH superior de 3,5. Las
sales de cationes monovalentes (Na+, K+, NH4+, (CH2OH)3 NH4+) del ácido algínico y
su éster de propilenglicol son solubles en agua y pueden actuar como espesantes
tixotrópicos o pseudoplásticos en ausencia de iones calcio en el medio. Por el
contrario, el ácido algínico y sus sales divalentes o trivalentes son insolubles en
agua (Cubero et al., 2002).
La viscosidad es la característica principal de las soluciones de alginato y
junto a su reactividad frente a los cationes polivalentes, es la que genera
características como espesante, estabilizante y gelificante. Con el fin de preparar
soluciones efectivas de alginato, es necesario dispersar y disolver completamente
las partículas de alginato en el sistema, lo que puede lograrse mediante la adición
lenta y progresiva del polímero durante un mezclado con alta cizalladura (Imeson,
2010). Una solución viscosa de alginato exhibe un comportamiento pseudoplástico.
Esto es una consecuencia de las largas cadenas de polímero y la rigidez de las
moléculas hidratadas. A bajas velocidades de cizalla, como por ejemplo durante el
almacenamiento o muy baja velocidad de agitación, las moléculas de alginato se
encuentran distribuidas al azar debido al movimiento browniano. Al aumentar la
velocidad de cizallamiento, las moléculas comienzan a ubicarse en forma paralela
ordenándose en la dirección del flujo y disminuyendo, por tanto, la resistencia al fluir.
Como resultado, la viscosidad aparente disminuirá cuando la velocidad de
cizallamiento se incrementa más allá de la zona newtoniana primaria del sistema
(Imeson, 2010). Por consiguiente, las soluciones de alginato tienen un
comportamiento no newtoniano de tipo pseudoplástico, es decir, que la viscosidad
decrece al aumentar el gradiente de velocidad. Este efecto es reversible excepto a
velocidades de corte muy elevadas, y es más marcado en soluciones de alginato de
alto peso molecular.
El comportamiento del alginato se ve afectado, en general, por los siguientes
factores (Cubero et al., 2002):
- Temperatura: la viscosidad de las soluciones de alginato decrece en
aproximadamente un 2,5% por cada grado de incremento en la temperatura, siendo
el proceso reversible. Si a este aumento de temperatura se le suma un aumento del
pH y del tiempo se consigue una despolimerización de la molécula, lo cual baja la

24
 INTRODUCCIÓN

viscosidad. Tras un proceso de congelación/descongelación se mantiene la

viscosidad inicial.
- pH: la viscosidad es casi independiente del pH en un rango entre 5 y 10
debido a un efecto repulsivo de los grupos carboxilos cargados negativamente, los
que mantienen extendidas las cadenas del polímero e incrementan su capacidad de
unión con las moléculas del agua. A pH entre 3 y 3,5 el alginato es insoluble y
precipita en forma de ácido algínico, mientras que un incremento del pH por encima
de 10 causaría una despolimerización.
- Fuerza iónica: la viscosidad de las soluciones del alginato de sodio decrece
levemente con la presencia de sales con cationes monovalentes, debido a que, el
polímero tiende a contraerse en solución al aumentar la fuerza iónica, efecto que se
hace máximo en concentraciones salinas de 0,1 N.
- Concentración y peso molecular: la viscosidad de las soluciones de
alginato varía con la concentración, incrementándose la viscosidad a mayor cantidad
del hidrocoloide. Por otra parte, se ha observado que mayores pesos moleculares el
poder espesante resulta mayor. Por ello, la importancia de conocer éstas
características a fin de ser mejor aprovechadas al momento de formular un producto
(Imeson, 2000).

2.1.1.4 Estabilidad de las soluciones de alginatos.

El alginato de sodio puro en polvo puede tener una vida útil de varios meses
si se almacena en un lugar seco, fresco y sin exposición a la luz solar. En
congelación incluso se conserva varios años sin una reducción significativa del peso
molecular. Por el contrario, el ácido algínico seco tiene una estabilidad limitada a
temperaturas ordinarias debido a su condición de ácido débil lo que cataliza su
degradación. Respecto a las soluciones acuosas de alginato, su estabilidad se ve
limitada por diversas causas de degradación. Por ejemplo, a pH muy ácido o alcalino
se produce una reducción severa de la viscosidad, que también se observada con la
presencia de radicales que oxiden al polímero. Además, debido a que los alginatos
son productos naturales, éstos pueden ser atacados por microorganismos para su
digestión. El empleo de tratamientos térmicos y de esterilización también propicia el
proceso de despolimerización, lo que se evidencia no sólo en la reducción de la

25
 INTRODUCCIÓN

viscosidad relativa sino en la pérdida de la resistencia del gel si ha habido

gelificación (Draget, 2000).
Las soluciones de alginatos neutras de baja a media viscosidad pueden ser
conservadas a 25 ºC durante muchos años sin apreciarse pérdidas en la viscosidad
siempre que se añada un antimicrobiano. La adición de pequeñas cantidades de
calcio puede incrementar la estabilidad de las soluciones de alginato de sodio. Una
combinación con ácido fuerte puede causar la precipitación del ácido algínico,
mientras que la presencia de álcalis fuertes facilita el rompimiento de la cadena
polimérica, degradándola. Las soluciones de alginato de propilenglicol son estables
a temperatura ambiente a pH entre 3 y 4, a pH por debajo de 2 y por encima de 6
pierden viscosidad rápidamente (McHuge, 1987).

2.1.1.5 Formación del gel.

El proceso de gelificación ocurre en presencia de cationes multivalentes

(excepto el magnesio), de los cuales el ion calcio es el más empleado por la
industria alimentaria. La gelificación tiene lugar al producirse una zona de unión
entre un bloque-G de una molécula de alginato que se enlaza físicamente a otro
bloque-G contenido en otra molécula de alginato a través del ion calcio, formando
una configuración espacial tipo bucle en cuyas cavidades se acomodan los cationes
divalentes. Esta enlace tipo quelato forma así una red intermolecular de tipo
matricial. Los bloques-M y bloques-MG no participarán en las zonas de unión, sino
que forman los llamados segmentos elásticos en la red del gel. Por ello la proporción
de los bloques-G determina la rigidez del gel, como se mencionó anteriormente. La
visualización de la estructura física, denominada modelo “caja de huevos” por
Draget (2000), se muestra en la Figura 2.2.

26
 INTRODUCCIÓN

Figura 2.2 Gelificación del alginato con calcio. Modelo “caja de huevos” (Imeson, 2000).

El modelo de “caja de huevos” puede modificarse durante el proceso de

formación del gel debido a la proximidad de dos bloques-G. Esta unión originaría
zonas de múltiples capas tal como se aprecia en la Figura 2.2. Por tanto, el gel
formado sería más resistente. En este sentido, un mayor contenido en G y bloques-
G más largos hace al alginato más reactivo y por tanto podrá admitir mayor cantidad
de calcio. Por ello, es importante considerar la disponibilidad de iones calcio e
incluso el peso molecular de la cadena a fin de formar geles más o menos fuertes,
según convenga (Imeson, 2010).

2.1.1.6 Estabilidad del gel.

En contraste con la mayoría de los polisacáridos gelificantes, los geles de

alginato tienen la característica particular de ser preparados en frío. Además, los
geles de alginatos son termoirreversibles, no obstante resisten bien temperaturas
relativamente elevadas (≈100 ºC). Esta resistencia a la temperatura junto con su
poder espesante y rápida gelificación, ha permitido su amplio uso en la elaboración
de productos alimentarios, tales como: cremas para hornear, pastelería, postres
congelados, jaleas, entre otros (Draget, 2000).
Los alginatos están sujetos a procesos de degradación química. Un
tratamiento térmico prolongado a pH bajo o alto puede desestabilizar el gel (Mancini
et al., 1999; Soares et al., 2004). Por otra parte, ya que el gel retiene agua a través

27
 INTRODUCCIÓN

de enlaces de hidrógeno, una vez que éste se contrae entonces expulsa agua. Este
efecto denominado sinéresis, es observado comúnmente en diversos sistemas de
geles obtenidos de biopolímeros. En los geles de alginato, la sinéresis depende de
parámetros tales como el ratio M/G, la concentración de calcio, el mecanismo de
gelificación y el peso molecular. El control de estos factores es importante para
evitar o disminuir un fenómeno de sinéresis indeseable (Imeson, 2010).
Los geles preparados a partir de alginatos de menor peso molecular muestran
menor sinéresis respecto a los geles de mayor peso molecular. Esto es
probablemente debido a un menor número de segmentos elásticos intactos entre
zonas de unión, lo que resulta en una menor capacidad de la red para reorganizarse
y contraerse durante el proceso de gelificación. De hecho, los alginatos con altos
niveles de bloques-MG, por poseer segmentos elásticos más flexibles, exhiben un
mayor grado de sinéresis (Draget et al., 2001). En una formulación equilibrada
(calcio/alginato) con suficiente calcio para saturar todos los bloques-G, la sinéresis
suele ser insignificante, mientras que un exceso de calcio puede agravar el
fenómeno. El mecanismo de gelificación interna tiende a dar geles con menos
sinéresis en comparación con los preparados por gelificación externa, debido
fundamentalmente a que la relación calcio/alginato es más fácil de distribuir en forma
más homogénea (Imeson, 2010).

2.1.2 Mecanismos de Gelificación.

El proceso de formación del gel se inicia a partir de una solución de sal de

alginato y una fuente de calcio externa o interna desde donde el ion calcio se difunde
hasta alcanzar la cadena polimérica. Como consecuencia de esta unión se produce
un reordenamiento estructural en el espacio resultando en un material sólido con
características de gel. El grado de gelificación depende de la hidratación del
alginato, la concentración del ion calcio y el contenido de los bloques-G (Funami et
al., 2009). La transición sol-gel se ve esencialmente controlada por la habilidad de
introducir el ion vinculante entre las moléculas de alginato. También se ha observado
que la cinética de gelificación y las propiedades del gel pueden depender del tipo de
contraión. De hecho, se ha encontrado que los alginatos de potasio presentan un
proceso de transición sol-gel más rápido respecto a los alginatos de sodio
preparados a bajas concentraciones calcio, probablemente debido a la mayor

28
 INTRODUCCIÓN

afinidad del sodio respecto al alginato, comparada con la de potasio. Y a pesar de

que los geles de alginato de calcio obtenidos mostraron semejante estabilidad a
simple vista, al ser analizadas sus propiedades reológicas se evidenciaron marcadas
diferencias en los módulos elásticos; siendo menores los valores de módulos
elásticos para los geles preparados a partir del alginato de sodio que en aquellos
con alginato de potasio. En este sentido, se ha señalado que este aspecto de las
propiedades viscoelásticas de los geles puede ser contrarrestado utilizando
alginatos con mayor composición de ácido gulurónico en su estructura (Draget,
2000). La gelificación iónica se ha llevado a cabo fundamentalmente por dos
mecanismos: la gelificación externa y la gelificación interna.

2.1.2.1 Gelificación Externa.

El proceso de gelificación externa ocurre al introducir la solución de alginato

en otra con presencia de iones calcio. Así se produce la difusión del ion calcio desde
dicha solución externa hacia la solución de alginato, de pH neutro. La formación del
gel se inicia en la interfase y avanza hacia el interior a medida que la superficie se
encuentra saturada de iones calcio, de manera que el contraión proveniente de la sal
de alginato es desplazado por el catión divalente solubilizado en agua. Éste
interacciona con los bloques-G de diferentes moléculas poliméricas, enlazándolas
entre sí. Aunque, la fuente de calcio más usada ha sido el CaCl 2 debido a su mayor
porcentaje de calcio disponible y bajo coste, existen otras sales empleadas con
menor frecuencia tales como el acetato monohidratado y el lactato de calcio
(Helgerud et al., 2010).

2.1.2.2 Gelificación Interna.

El proceso de gelificación interna consiste en la liberación controlada del ion

calcio desde una fuente interna de sal de calcio insoluble o parcialmente soluble
dispersa previamente en la solución de alginato de sodio. La liberación del ion calcio
puede ocurrir mediante dos mecanismos: si se tiene una sal de calcio insoluble a pH
neutro pero soluble a pH ácido, se puede adicionar un ácido orgánico a una fase
orgánica externa que está en contacto con la solución acuosa de alginato. De este
modo, al difundirse los protones hasta la fase acuosa permiten la acidificación del
medio, consiguiendo solubilizar los iones calcio. En este caso, las sales de calcio

29
 INTRODUCCIÓN

más empleadas son el carbonato de calcio y el fosfato tricálcico, y en casos

específicos el fosfato dicálcico y el citrato tricálcico. Para la acidificación del medio
se cuenta con ácidos orgánicos como el acético, adípico y el glucono delta-lactona.
Por otro lado, si la sal de calcio es parcialmente soluble, el proceso de gelificación
interna se lleva a cabo mediante la adición a la mezcla alginato-sal de calcio de un
agente secuestrante como el fosfato, sulfato o citrato de calcio. La adición de un
secuestrante evita la formación previa del gel, al producirse un enlace entre dicho
agente y el calcio. De este modo, al adicionarse el ácido orgánico se produciría la
liberación de los iones calcio y, por tanto, la formación de un gel más homogéneo. El
sulfato de calcio ha sido comúnmente el agente secuestrante más empleado debido
a su bajo coste y conveniente solubilidad. Los mecanismos de gelificación iónica son
descritos en la Figura 2.3.

Figura 2.3 Mecanismos de gelificación iónica. Gelificación externa y Gelificación interna: sal
insoluble, (a) y sal parcialmente soluble, (b) (Helgerud et al., 2010).

La principal diferencia entre el mecanismo de gelificación externa e interna es

la procedencia de la fuente calcio. Si lo que se pretende es el control de la transición
sol-gel, en el proceso de gelificación externa los factores a manipular son la
concentración de calcio y composición del polímero, mientras que para el proceso de
gelificación interna se deben considerar la solubilidad y concentración de la sal de

30
 INTRODUCCIÓN

calcio, concentración del agente secuestrante y del ácido orgánico empleado

(Draget, 2000).

2.1.3 Caracterización del Gel.

Un gel es un sistema coloidal donde la fase continua es sólida y la dispersa es

líquida. Al tener esta consideración, se entiende que los geles presentan una
densidad similar a los líquidos, aunque su estructura se asemeje más a un sólido.
Por ello, es importante estudiar las características del gel mediante el uso de la
Reología como ciencia que estudia la deformación y flujo de los materiales
sometidos a fuerzas externas. El comportamiento reológico de un material, puede
predecir su flujo en distintas condiciones, e incluso relacionarse con su
microestructura. En este sentido, son de gran importancia las técnicas
viscoelásticas. Idealmente, los sólidos se deforman elásticamente y la energía de
deformación se recupera totalmente al desaparecer la fuerza externa, regresando a
su forma original, mientras que los fluidos se deforman irreversiblemente, es decir,
su energía se disipa en forma de calor y, por tanto, no recuperan su forma inicial. En
la mayoría de los casos, los materiales presentan en mayor o menor grado ambas
características simultáneamente, lo que se conoce como características
viscoelásticas.

2.1.3.1 Reología.

La Reología es la ciencia que estudia el flujo y deformación de un material al

ser sometido a esfuerzos externos. En concreto analiza la relación existente entre
las variables de esfuerzo cortante (𝜎), deformación (y) y gradiente de velocidad (dV /
dy), mostradas en la Figura 2.4. En este sentido, se aplica una fuerza en una
dirección sobre una superficie. El cociente entre dicha fuerza y la superficie en la
que aplica se define como el esfuerzo cortante. El cambio de velocidad de los
elementos del fluido en la dirección perpendicular de las placas (dirección y) es el
gradiente de velocidad. Dependiendo de cómo sea esta relación los materiales
presentan comportamientos reológicos diferentes y únicos.

31
 INTRODUCCIÓN

Figura 2.4 Flujo entre dos placas paralelas (Maestro, 2002).

Las propiedades reológicas de los materiales son producto del

comportamiento del material. El estudio reológico de un material permite
caracterizarlo, y por tanto, determinar su comportamiento en distintas condiciones
durante su fabricación, transporte, almacenamiento o utilización (Maestro, 2002).
Como fluido se entiendo toda porción de materia capaz de deformarse
continuamente cuando es sujeta a una fuerza o deformación, a diferencia de los
sólidos que no se deforman o sólo se deforman hasta cierto punto. En tal sentido, el
comportamiento de los fluidos se puede acotar en dos casos. En los fluidos
puramente viscosos donde la energía de deformación no se recupera al desaparecer
la fuerza aplicada sino que se disipa completamente en forma de calor por lo que no
recuperan su forma inicial. Este comportamiento sigue la ecuación de la ley de
Newton:

𝑑𝑉
𝜎 = 𝜂 𝑑𝑦 = 𝜂. 𝛾̇ (2)

Donde 𝛾̇ es el gradiente de velocidad o velocidad de deformación y 𝜂 la viscosidad.

En un sólido puramente elástico, la energía de deformación se recupera

totalmente al desaparecer la fuerza, recuperándose la forma inicial. Este
comportamiento sigue la ecuación de la ley de Hooke:

𝜎 = 𝐺. 𝛾 (3)

Donde 𝐺 es la constante de proporcionalidad o módulo elástico y 𝛾 la deformación

instantánea.

32
 INTRODUCCIÓN

En esta clasificación de los comportamientos reológicos de los materiales con

relación a sus respuestas respecto a los esfuerzos aplicados se ha de introducir un
nuevo parámetro que es la escala del tiempo en la cual se aplica la deformación.
Para ello, se define una magnitud que tenga en cuenta el tiempo de observación o
experimental y el tiempo de relajación o tiempo que requiere un material para
adaptarse a una deformación. La relación entre el tiempo de relajación y el de
observación es el número de Deborah (D). Este este sentido se puede decir que los
sólidos tienen un tiempo de relajación infinito, y, por tanto, un D muy grande que
podría definirse como un comportamiento elástico. Mientras que en un líquido este
valor se aproxima a cero y, por tanto, el D es muy pequeño lo que podría describirse
como un comportamiento de tipo viscoso.
Los materiales viscoelásticos tienen un comportamiento intermedio que se
puede modelizar como una combinación de los anteriores casos. Al margen de ello,
es importante destacar que los materiales pueden ser clasificados según su
comportamiento reológico como fluidos newtonianos y fluidos no newtonianos. Estos
son descritos desde el punto de vista de la dependencia de su viscosidad en estado
estacionario con el gradiente de velocidad o el esfuerzo aplicado (Ferry, 1980).

- Fluidos Newtonianos: son fluidos en los que el esfuerzo cortante es una

función lineal de la velocidad de corte, es decir, siguen la ecuación de Newton, y su
viscosidad es por tanto una magnitud de estado, constante y dependiente sólo de
presión y temperatura. Este comportamiento es propio de fluidos no estructurados.
Su comportamiento reológico, suele representarse mediante el gráfico que relaciona
los valores de 𝜏 con el gradiente de velocidad. En este caso, el reograma es una
simple línea recta que pasa por el origen y el valor de su pendiente es μ, conocido
como viscosidad dinámica.
- Fluidos no Newtonianos: son fluidos cuyo comportamiento no se ajusta al
de un líquido newtoniano, sino que la viscosidad cambia con el gradiente de
velocidad, al menos en un cierto rango de esfuerzos. Estos fluidos suelen ser
sistemas estructurados, dispersos (emulsiones) o soluciones de macromoléculas
(plásticos, fluidos biológicos). Un fluido no newtoniano puede tener comportamiento
newtoniano en un cierto rango de esfuerzos lo suficientemente bajos como para no
modificar su estructura. Sin embargo, la aplicación de un esfuerzo superior a un
esfuerzo crítico modifica la estructura y, por lo tanto, la viscosidad del fluido. Por ello,

33
 INTRODUCCIÓN

el concepto de viscosidad como propiedad intrínseca desaparece y, en todo caso,

puede hablarse de una viscosidad aparente (𝜂´ = 𝜎⁄𝛾̇ ). Se distinguen dos grandes

grupos de fluidos no newtonianos: los independientes del tiempo y los dependientes

del tiempo.

Independientes de tiempo: son aquellos para los que la viscosidad aparente sólo
depende del esfuerzo cortante o el gradiente de velocidad aplicado. Por tanto,
necesitan un mínimo valor de esfuerzo para que el fluido se ponga en movimiento.

La gran mayoría de fluidos no newtonianos son de tipo pseudoplástico, donde

la viscosidad aparente disminuye a medida que aumenta el esfuerzo cortante o el
gradiente de velocidad a fin que fluya. Sin embargo, pueden presentar una zona de
comportamiento newtoniano a esfuerzos o gradientes bajos, los suficientemente
pequeños como para no modificar la estructura interna del material.

Los fluidos dilatantes son menos comunes y en ellos su viscosidad aumenta

con el esfuerzo cortante o el gradiente (Malkin y Isayev, 2006). Estos fluidos siguen
la ley de la Potencia:

𝜎 = 𝑘𝛾̇ 𝑛 (4)

Donde 𝑘 es el índice de consistencia y 𝑛 es el índice de comportamiento. Si 𝑛 es

menor que la unidad el fluido es pseudoplástico, y la viscosidad aparente del mismo
disminuye con el aumento del esfuerzo o del gradiente (comportamiento de shear
thinning). Si 𝑛 es mayor que la unidad el fluido es dilatante y su viscosidad aparente
aumenta al aumentar el esfuerzo o el gradiente (comportamiento shear thickening).

Los plásticos de Bingham la única diferencia con los newtonianos es que la

relación entre el esfuerzo y la velocidad de corte no pasa por el origen debido a que
se presentan un esfuerzo umbral por debajo del cual no fluyen. Los fluidos
denominados plásticos generales se ajustan a la ecuación:

𝜎 = 𝜎𝑜 + 𝑘𝛾̇ 𝑛 (5)

Los plásticos generales incluyen, naturalmente, a todos los demás fluidos de menos
parámetros (si 𝜎0 = 0 se trata de un seudoplástico o dilatante, si 𝑛 = 1 es un plástico
de Bingham y si se dan ambas cosas a la vez es un fluido newtoniano).

34
 INTRODUCCIÓN

Dependientes del tiempo: son aquellos en los que la viscosidad varía con el tiempo,
así como con el gradiente de velocidad y la temperatura, debido a que su estructura
depende de su historia o de sus deformaciones anteriores. Se trata de los fluidos
cuya estructura no se adapta instantáneamente a la deformación aplicada, sino que
tarda un tiempo en alcanzarse la estructura en equilibrio, variando mientras tanto sus
propiedades reológicas. Este tipo de fluido presenta una propiedad denomina
tixotropía (Malkin y Isayev, 2006). Dicha propiedad se produce cuando bajo la
acción de un esfuerzo cortante constante, alguna de sus propiedades decrece
isotérmicamente, y con capacidad de recuperar su valor inicial una vez cese dicha
acción. La propiedad de más interés sujeta a estos cambios es la viscosidad.

2.1.3.2 Comportamiento Viscoelástico de los fluidos.

Como se ha dicho, la reología implica relacionar el esfuerzo cortante, la

deformación y el tiempo mediante una ecuación reológica de estado. Los materiales
viscoelásticos se caracterizan por mostrar un flujo viscoso combinado con
deformación elástica, cuando se les somete a un esfuerzo. Puede expresarse
matemáticamente el comportamiento viscoelástico de los fluidos mediante análogos
mecánicos que se combinan de diversos modos, las ecuaciones expresadas por la
ley de Newton (Ec. 2) y ley de Hooke (Ec. 3).
Los modelos más sencillos empleados para explicar el comportamiento de
materiales viscoelásticos son los modelos de Maxwell y Kelvin simples. En el modelo
de Maxwell, cuyo análogo mecánico consta de un muelle ideal de tipo Hooke
conectado en serie a un amortiguador de Newton, la aplicación de un esfuerzo
causa un alargamiento instantáneo, correspondiente al muelle, seguido de la
respuesta lenta del pistón en el cilindro del amortiguador. En contrapartida, el
modelo de Kelvin consta de una conexión muelle-amortiguador en paralelo donde la
respuesta elástica se retrasa debido a la resistencia viscosa del fluido del
amortiguador (Seymour y Carraher, 2002). En general, el modelo de Maxwell se
utiliza para describir el comportamiento de los líquidos viscoelásticos, mientras que
el modelo de Kelvin se ajusta mejor a sólidos viscoelásticos.
Para el modelo de Maxwell, la deformación total será la suma de las
deformaciones de los elementos muelle y amortiguador colocados en serie. Si esto

35
 INTRODUCCIÓN

se expresa de modo diferencial se obtiene para la velocidad de deformación la

expresión:
σ 𝜎̇
γ̇ = +G (6)
𝜂

Donde 𝐺 es el módulo de elasticidad que describe el componente elástico y 𝜂

es la viscosidad relacionada con el componente viscoso.

En el caso del modelo de Kelvin, en el que el muelle y el amortiguador están

situados en paralelo, la deformación total es igual a la deformación de cada
elemento individual, mientras que el esfuerzo total es la suma de cada uno de los
dos esfuerzos. La ecuación resultante es:

𝜎 = 𝐺𝛾 + 𝜂𝛾̇ (7)

En el caso de que tanto el esfuerzo como la deformación sean lo

suficientemente pequeños como para que ambas magnitudes se puedan describir a
lo largo del tiempo mediante ecuaciones diferenciales lineales de coeficientes
constantes, el material se encuentra dentro del rango de viscoelasticidad lineal. En
este rango la relación entre el esfuerzo y la deformación sólo es función del tiempo o
de la frecuencia, pero no depende de la magnitud del esfuerzo o deformación
aplicados, porque éstos no son lo suficientemente grandes como para modificar la
estructura del material. Por ello, el comportamiento viscoelástico lineal de los
materiales puede relacionarse con su estructura interna, si se utilizan ensayos de
viscoelasticidad lineal para caracterizar los materiales. En este caso particular, las
ecuaciones de estado pueden ser relativamente sencillas. Ahora bien, si las
deformaciones son grandes, de manera que la relación entre el esfuerzo cortante y
la deformación depende de este esfuerzo, entonces el material tiene
comportamiento viscoelástico no lineal y su ecuación de estado se complica
(Maestro, 2002).

2.1.3.3 Caracterización de materiales viscoelásticos.

Las funciones viscoelásticas que se utilizan para describir el comportamiento

de los materiales dependen del sistema experimental que se dispone. Los ensayos
de caracterización viscoelástica se describen a continuación (Ferry, 1980):

36
 INTRODUCCIÓN

- Ensayo de fluencia: consiste en aplicar un esfuerzo cortante constante a un

material inicialmente en reposo y medir cómo varía la deformación con el tiempo. La
función viscoelástica obtenida en este ensayo es la capacitancia 𝐽(𝑡), que se define
como el cociente entre la deformación y el esfuerzo.
- Ensayo de relajación del esfuerzo: consiste en aplicar una deformación de
forma instantánea, como función escalón, y medir la variación del esfuerzo cortante
con el tiempo.

Las propiedades viscoelásticas de los geles pueden describir tanto el proceso

de gelificación como las propiedades finales de un gel. Es necesario que el método
utilizado permita una medida rápida sin alterar el sistema en el intervalo de
respuesta lineal. Estos requisitos hacen que en algunos casos no sea adecuado
usar métodos transitorios como las medidas de fluencia o relajación explicadas
anteriormente. Los métodos reológicos dinámicos, donde se aplica un esfuerzo o
deformación oscilatoria, se pueden usar de forma alternativa.

- Ensayos oscilatorios: consisten en aplicar al material un esfuerzo o

deformación que pueda variarse periódicamente, siguiendo una función sinusoidal a
una determinada frecuencia. Las deformaciones deben ser de pequeña amplitud
para mantenerse en el rango de respuestas lineales. Por ejemplo, la deformación de
tipo sinusoidal puede seguir la siguiente función.

̇
γ(t) = γ0 Sen(ωt) (8)

Donde, 𝛾0 es la amplitud de la deformación y 𝜔 la frecuencia de oscilación. Lo

que se mide es el esfuerzo cortante necesario para aplicar esta deformación y su
variación con la frecuencia. En el caso de un sólido elástico, el esfuerzo cortante
será máximo cuando la deformación sea máxima, es decir, cuando Sen (ωt)=1 y, por
tanto, ωt sea un número impar de veces 𝜋⁄2. Por tanto, la respuesta del material
estará en fase con la perturbación aplicada:

𝜎 = 𝜎0 𝑆𝑒𝑛(𝜔𝑡) (9)

Si el material es viscoso puro, el esfuerzo cortante será máximo cuando sea

máxima la velocidad de deformación, que, al ser la derivada de la deformación
respecto al tiempo, viene dada por la expresión:

37
 INTRODUCCIÓN

𝑑𝛾
𝛾= 𝑑𝑡
= 𝛾0 𝜔 𝐶𝑜𝑠 (𝜔𝑡) (10)

Es decir, que sigue la función:

𝜋
𝜎 = 𝜎0 𝐶𝑜𝑠 (𝜔𝑡) = 𝜎0 𝑆𝑒𝑛 (𝜔𝑡 + ) (11)
2

Se observa, por tanto, que en el caso de un sólido elástico el esfuerzo

cortante está en fase con la deformación, mientras que en el caso de un líquido
viscoso existe un desfase de 𝜋⁄2 radianes (Figura 2.5). Por lo tanto, un fluido
viscoelástico presentará un desfase entre 0 y 𝜋⁄2, y el ángulo de desfase indicará la
relación entre elasticidad y viscosidad, y dependerá de la frecuencia de oscilación.
Por ejemplo, a frecuencias muy altas, correspondientes a tiempos de ensayo muy
cortos (inverso de la frecuencia), el material no tiene tiempo de relajarse y su
comportamiento se acerca al de un sólido elástico, con ángulo de desfase pequeño.
Por el contrario, a frecuencias bajas, el material tiene tiempo de relajarse y fluir y,
por tanto, su comportamiento es más viscoso, lo que implica un ángulo de desfase
mayor.

Figura 2.5 Ensayo oscilatorio (Maestro, 2002).

Si 𝛿 es el ángulo de desfase, que dependerá de 𝜔, y se tiene en cuenta que

𝜎0 es proporcional a 𝛾0 y depende de 𝜔 se puede expresar la respuesta 𝜎 como:

𝜎 = 𝐺 ∗ 𝛾0 𝑆𝑒𝑛(𝜔𝑡 + 𝛿) (12)

38
 INTRODUCCIÓN

Donde, 𝐺 ∗ es la constante de proporcionalidad entre las amplitudes del

esfuerzo y la deformación, y se denomina módulo complejo. No obstante, son más
usados los módulos de almacenamiento 𝐺 ´ y de pérdidas 𝐺 ´´ dados por las
expresiones:

𝐺` = 𝐺 ∗ 𝐶𝑜𝑠 𝛿 (13)
𝐺`` = 𝐺 ∗ 𝑆𝑒𝑛 𝛿 (14)

𝐺 ´ y 𝐺 ´´ se relacionan, por tanto, con el esfuerzo cortante mediante la ecuación:

𝜎 = 𝐺`𝛾0 𝑆𝑒𝑛(𝜔𝑡) + 𝐺``𝛾0 𝐶𝑜𝑠(𝜔𝑡) (15)

Estas funciones presentan la ventaja de tener sentido físico. Así, el módulo de

almacenamiento (𝐺 ´ ) está relacionado con la respuesta 𝜎 en fase con 𝛾 y, por tanto,
con la parte de energía que queda almacenada y puede recuperarse. Es decir, es
una medida de la elasticidad. El módulo de pérdidas (𝐺 ´´ ) indica la parte de 𝜎
desfasada 𝜋⁄2 radianes respecto a 𝛾 y está relacionado con la energía que se
disipa. Es, por tanto, una medida del carácter viscoso del material. 𝐺 ∗ se puede
expresar en función de 𝐺 ´ y 𝐺 ´´ tal como muestra la Ec. 16:

𝐺 ∗ = 𝐺` + 𝑖𝐺`` (16)

Asimismo, el 𝐺 ∗ se puede expresar gráficamente como función de la frecuencia

(Figura 2.6).

Figura 2.6 Ensayo oscilatorio para un fluido de Maxwell (Maestro, 2002).

39
 INTRODUCCIÓN

2.2 Tensioactivos.

Este apartado pretende introducir el uso de los compuestos tensioactivos

como estabilizantes en las emulsiones, considerando que parte del estudio de
encapsulación con alginatos, tiene como objetivo estudiar la formación de
microesferas en emulsión por gelificación interna. En el proceso de formación de las
microesferas por GI la reacción de gelificación ocurre en las pequeñas gotas de
alginato dispersas en aceite. Para estabilizar estas gotas en el seno de la fase
orgánica se utilizan tensioactivos. En este sentido, a continuación se introducen
definiciones básicas, propiedades, su clasificación y aplicaciones para uso
alimentario.

2.2.1 Definición.

La mayoría de emulsiones estables se consiguen por la presencia de agentes

emulsionantes que se sitúan en la interfase líquido-liquido. Estos agentes
emulsionantes o tensioactivos juegan un papel importante en la formación y
estabilidad de las emulsiones. Los tensioactivos son sustancias con una estructura
molecular que consta de una parte hidrófila y una parte hidrófoba. La parte hidrófoba
o lipófila suele estar formada por una cadena hidrocarbonada (lineal o ramificada),
mientras que la parte hidrófila está constituida por grupos iónicos o polares (Falbe,
1987). Se representan esquemáticamente con formas similares a la mostrada en la
Figura 2.7. El hecho de que coexistan estas dos porciones estructuralmente
diferentes en una misma molécula constituye lo que se conoce como estructura
anfifílica.

Figura 2.7 Esquema de una molécula de tensioactivo y gota de aceite estabilizada por un
tensioactivo. “Obtenida de http://www.sciencelearn.org.nz ” (2012).

40
 INTRODUCCIÓN

Debido a dicha característica anfifílica, tienden a situarse en las interfases,

con la parte hidrofílica hacia el agua y la hidrofóbica hacia el aire (superficie) o hacia
la fase aceite, disminuyendo la tensión superficial e interfacial. El exceso de
tensioactivo forma micelas o agrupaciones en las que en fase acuosa las cabezas
hidrofílicas del tensioactivo se orientan hacia el agua y las colas hidrofóbicas de los
tensioactivos se agrupan entre sí para no estar en contacto con el agua, además, la
cadena hidrófoba tiene que poseer ocho o más átomos de carbono (hidrofobicidad
mínima).
La naturaleza dual (polar-apolar) de los tensioactivos y en particular el
equilibrio entre las porciones hidrófoba e hidrófila de la molécula se conoce como
balance hidrófilo-lipófilo (HLB). Es la característica responsable de los fenómenos de
actividad superficial y de agregación supramolecular de los tensioactivos. Estas
características proporcionan a los tensioactivos sus numerosas aplicaciones y
permiten el desarrollo de productos industriales (Rosen, 2004).

2.2.2 Clasificación.

Dependiendo de la naturaleza de la fracción polar los tensioactivos se

clasifican en aniónicos, catiónicos, anfóteros y no iónicos.

- Tensioactivos aniónicos: contienen un grupo hidrófobo hidrocarbonado

conectado con uno o más grupos hidrofílicos. En solución acuosa, el grupo hidrófilo
presenta carga negativa. Todos ellos poseen un contraión que suele ser de Na+.
- Tensioactivos catiónicos: contienen un grupo hidrófobo hidrocarbonado
conectado con uno o más grupos hidrófilos. En este caso, el grupo hidrófilo resulta
cargado positivamente en solución acuosa.
- Tensioactivos anfóteros: en ellos el grupo hidrofílico puede presentar carga
positiva o negativa en función del pH del medio.
- Tensioactivos no-iónicos: son sustancias activas superficialmente que, sin
ionizarse, se solubilizan. La solubilidad de estas sustancias en agua viene dada por
el grupo hidrófilo de carácter polar.

41
 INTRODUCCIÓN

2.2.3 Balance hidrofílico-lipofílico (HLB) de los tensioactivos.

El balance hidrofílico-lipofílico de los tensioactivos es una medida de su

anfifilidad, que es una medida de la eficiencia y fuerza relativa entre las partes
polares y apolares de la molécula. El concepto de HLB se introdujo por Griffin
(1949) como una escala empírica que proporciona información del comportamiento
hidrofílico o lipofílico del tensioactivo para su aplicación en campos tales como la
detergencia o la estabilización de emulsiones. Originalmente fue utilizado para
clasificar los tensioactivos de la serie “Span” y “Tween”. El sistema HLB ha sido
aplicado a muchos otros tensioactivos, incluidos los tensioactivos iónicos y
anfóteros.
Este balance, se basa en asignar a cada tensioactivo un número
adimensional, denominado número HLB, de valores comprendidos entre 0 y 20 para
los tensioactivos no iónicos que proporciona información sobre la solubilidad en
agua y aceite. Los tensioactivos con un HLB < 9 son tensioactivos solubles en
disolventes apolares, es decir, tensioactivos lipofílicos, por lo que se suelen usar
para estabilizar emulsiones agua en aceite (W/O). Por el contrario, los tensioactivos
con valores de HLB altos presentan afinidad por disolventes polares y se usan para
estabilizar emulsiones aceite en agua (O/W). En general, se obtienen emulsiones
W/O con tensioactivos de HLB comprendidos entre 3 y 8; y emulsiones O/W con
tensioactivos de HLB comprendidos entre 8 y 18 (Schramm, 2005).
Para tensioactivos no iónicos el parámetro HLB se puede calcular como:

𝐻
𝐻𝐿𝐵 = 𝐻+𝐿 . 20 (17)

Donde, 𝐻 es la masa molecular de los grupos hidrofílicos de la molécula tensioactiva

y 𝐿 es la masa molecular de los grupos lipofílicos de la molécula tensioactiva. En la
Tabla 2.1, se muestra la relación existente entre el valor del HLB, la solubilidad del
tensioactivo en agua y su aplicación (Rosen, 2004).

42
 INTRODUCCIÓN

Tabla 2.1 Relación valores HLB, solubilidad y aplicaciones.

HLB Aplicaciones Solubilidad en agua Estado del tensioactivo en agua

3–6 Emulsiones W/O 1–4 No dispersable

7–9 Agente humectante 3–6 Poco dispersable

8 – 15 Emulsiones O/W 6–8 Dispersión turbia inestable

13 – 15 Detergente 8 – 10 Dispersión turbia estable

10 – 13 Dispersión traslucida

15 - 18 Solubilizador 13 Solución transparente

Un HLB adecuado puede conseguirse mezclando tensioactivos con distintos

HLB en proporciones diversas o mezclando tensioactivos con otros compuestos,
denominados cotensioactivos. El HLB de la mezcla de tensioactivos se determina
mediante la regla lineal introducida por Huibers (1997) en la que las fracciones en
peso de cada componente se multiplica por el HLB correspondiente, expresada
como:

𝐻𝐿𝐵𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 = 𝑤𝐴 . 𝐻𝐿𝐵𝐴 + 𝑤𝐵 . 𝐻𝐿𝐵𝐵 (18)

Donde, 𝑤 es la fracción en peso.

2.2.4 Tensioactivos de uso alimentario.

La industria alimentaria es una de las muchas industrias que dependen en

gran medida del uso de emulsiones y tensioactivos. Los productos tales como,
refrescos, leche, cremas, aderezos para ensaladas, mayonesa, salsas, sopas,
mantequilla y margarina son ejemplos de emulsiones. Los tensioactivos más
utilizados son los anfifílicos naturales como las proteínas, polisacáridos y fosfolípidos
(Guzey y McClements, 2006). Una visión general de tensioactivos alimentarios y su
número de identificación según el estatus legal se presenta en la Tabla 2.2 (Friberg
et al., 2005).

43
 INTRODUCCIÓN

Tabla 2.2 Tensioactivos alimentarios.

Nombre Químico Abreviación CAD Código

Lecitina - No limitado E-322

Monodiglicéridos MAG No limitado E-471

Éster Monoglicérido del ácido acético ACETEM No limitado E-472a

Éster Monoglicérido del ácido láctico LACTEM No limitado E-472b

Ácidos grasos de ésteres poliglicerol PGE 0 - 25 E-475

Poliricinoleato de poliglicerol PGPR 0 – 7,5 E-476

Monoestearato sorbitán SMS 0 - 25 E-491

Triestearato sorbitán STS 0 – 15 E-492

Polisorbato 60 PS 60 0 – 25 E-435

Polisorbato 65 PS 65 0 – 25 E-436

Polisorbato 80 PS 80 0 - 25 E-433

CAD: consumo aceptable diario en mg/kg peso corporal por día (a). Generalmente
reconocido como seguro (b).

2.3 Emulsiones.

Este apartado pretende justificar el uso de las emulsiones como medio para el
proceso de gelificación de pequeñas gotas de alginato. En este sentido, el apartado
anterior hizo mención al empleo de tensioactivos como compuestos estabilizantes de
las emulsiones. Por tanto, primeramente se hace una breve reseña de conceptos y
propiedades. Seguidamente, de los métodos de preparación de las emulsiones y por
último, de la importancia de la estabilidad de las emulsiones y los fenómenos más
comunes de desestabilización que sufren con el tiempo.

2.3.1 Conceptos y propiedades.

Una de las definiciones más precisa y completa ha sido la propuesta por

Becher (1972): “Una emulsión es un sistema heterogéneo termodinámicamente
inestable, formado al menos por dos fases líquidas no miscibles, de las cuales una
está dispersa en la otra bajo forma de pequeñas gotas cuyo diámetro es en general

44
 INTRODUCCIÓN

superior a 0,1 µm. Tal sistema posee una estabilidad mínima que puede aumentarse
por adición de agentes estabilizantes o tensioactivos”.
Las emulsiones tienen importancia en muchas aplicaciones de diversos
campos como pueden ser la alimentación o la industria farmacéutica. Las
emulsiones pueden estar constituidas por dos o más fases líquidas donde una de
ellas, denominada fase dispersa, se encuentra finamente dividida en el seno de la
otra fase, denominada fase continua. Se pueden formar dos tipos de emulsiones.
Como se puede observar en la Figura 2.8, las emulsiones cuya fase continua es
agua se llaman emulsiones O/W, y si por el contrario tienen como fase continua el
aceite se llaman emulsiones W/O.

Figura 2.8 Representación de diferentes tipos de emulsiones. Emulsión aceite en agua (O/W), a;
emulsión agua en aceite (W/O), b; emulsión agua en aceite en agua (W/O/W), c y emulsión aceite en
agua en aceite (O/W/O), d.

También se pueden encontrar emulsiones múltiples, es decir, emulsiones de

aceite en agua en aceite (O/W/O) y agua en aceite en agua (W/O/W). El tipo de
emulsión que se forma depende de distintos factores. Si la relación de volúmenes de
las fases es muy grande o muy pequeña, la fase que tiene el volumen más pequeño
normalmente es la fase dispersa, pero no siempre es así, dependiendo de la
naturaleza del tensioactivo y del modo en el cual se ha preparado la emulsión
(Schramm, 2005). La Figura 2.9, muestra la clasificación que reciben las emulsiones
en función de la fracción de volumen ocupada por la fase dispersa (𝜑) según sea el
caso:

45
 INTRODUCCIÓN

- Emulsiones diluidas, sí 𝜑 < 0,2.

- Emulsiones concentradas sí 0,2 < 𝜑 < 0,74.
- Emulsiones altamente concentradas con > 𝜑 0,74.

Figura 2.9 Tipos de emulsiones en función de la fracción volumen (𝜑). Emulsiones diluidas, a;
emulsiones concentradas, b y emulsiones altamente concentradas, c.

La fase interna de una emulsión se dispersa en gotas de un diámetro en

general menor de 0,25 µm. Las gotas de mayor tamaño encontradas en emulsiones
estables han sido aproximadamente 100 veces mayores, es decir, sobre 25 µm
(Becher, 1972). La Tabla 2.3, muestra el efecto del tamaño de la gota en la
apariencia de las emulsiones planteado por Griffin:

Tabla 2.3 Apariencia de la emulsión según tamaño de la partícula.

Tamaño Apariencia

Macroglóbulos Se pueden distinguir dos fases

∅ > 1 µm Emulsión blanco-lechosa

1 < ∅ > 0,1 µm Emulsión blanco-azul

0,1 < ∅ > 0,05 µm Gris transparente (seca con brillo)

∅ < 0,05 µm Transparente

Diámetro, ∅.

46
 INTRODUCCIÓN

Las emulsiones, a diferencia de las microemulsiones, son sistemas

termodinámicamente inestables, tienden a su estado de equilibrio, es decir, tienden
a reducir el área interfacial hasta alcanzar la completa separación de fases. Para
estabilizar la emulsión se puede añadir emulsionantes tales como moléculas
tensioactivas, polímeros o sólidos finamente divididos (Scharamm, 2005). Los
emulsionantes se adsorben en la interfase, reducen la tensión interfacial y suponen
un impedimento estérico al paso de componentes a través de la interfase.
El tipo de emulsión que se forma al mezclar las dos fases depende de
diferentes factores (Kruglyakov, 2000):

- Volumen de las dos fases: normalmente la fase con menos volumen es

la fase dispersa, exceptuando las emulsiones altamente concentradas.
- Viscosidad de las dos fases: la resistencia a la fluencia de las
emulsiones es una propiedad importante, las medidas de viscosidad
permiten obtener información sobre la estructura de las emulsiones y su
estabilidad.
- Naturaleza y concentración de los agentes tensioactivos utilizados.
- Temperatura.
- Método de preparación de la emulsión: al ser sistemas de no equilibrio,
sus propiedades dependen no solo de su formulación, sino de las
variables de preparación.

En presencia de tensioactivos, los dos primeros factores no son determinantes ya

que incluso es posible que la fase continua sea la fase de menor volumen, como es
el caso de las emulsiones altamente concentradas.

Probablemente, la propiedad más importante de una emulsión es su

estabilidad. Los tensioactivos, entre otros, favorecen esta estabilidad en las
emulsiones mediante distintos mecanismos. Además, la naturaleza de los
tensioactivos puede determinar la distribución de cada fase (Goodwin, 2009).

2.3.2 Métodos de preparación de emulsiones.

Cuando se realiza una emulsión se dispersa una fase líquida finamente

dividida en otra fase liquida en la cual es inmiscible. La mayoría de emulsiones

47
 INTRODUCCIÓN

tienen una distribución de tamaño de gota por encima del rango de tamaño de las
dispersiones coloidales. Por tanto, requieren energía para su formación al ser
sistemas termodinámicamente inestables. En el caso de las emulsiones, la energía
libre de Gibbs es positiva, lo que informa que es un proceso no espontáneo y que
requiere energía para su formación. Dependiendo del origen de esta energía
requerida, se distinguen dos categorías de métodos de formación: métodos de alta
energía o de dispersión y métodos de baja energía o de condensación (Walstra,
1996).

- Métodos de dispersión o de alta energía: se refiere a la aportación de

energía por medios mecánicos con el fin de romper la interfase líquido-líquido inicial
y forman las gotas durante el proceso de emulsificación, y, por tanto, crear nueva
área interfacial (Ej: agitadores a altas revoluciones, homogeneizadores de alta
presión, generadores de ultrasonidos).
- Métodos de condensación o baja energía: se fundamenta en la utilización
de la energía química almacenada en los componentes del propio sistema con el fin
de producir la emulsificación. Se libera la energía contenida en el sistema mediante
transiciones de fases, bien manteniendo la composición constante y variando la
temperatura (Phase Inversion Temperature Method, PIT), o bien variando la
composición a temperatura constante (Phase Inversion Composition Method, PIC).

2.3.3 Estabilidad de las emulsiones.

El término estabilidad indica la habilidad de una emulsión de resistirse a

cambios en sus propiedades en el transcurso del tiempo, en el caso de las
emulsiones, implica términos cinéticos debido a su carácter de inestabilidad. Ahora
bien, esto puede retrasarse mucho en el tiempo: una emulsión es más estable
cuanto más lentamente cambien sus propiedades una vez formada (Hunter, 2001).
Los principales mecanismos de desestabilización de las emulsiones son
sedimentación y cremado y la variación de tamaño de partícula o agregación
(floculación, maduración de Ostwald y coalescencia). La rotura de un sistema
disperso puede estar provocada por estos mecanismos de manera aislada,
simultánea o consecutiva. En la siguiente Figura 2.10, se muestra un esquema de
los diferentes mecanismos de rotura de los sistemas dispersos.

48
 INTRODUCCIÓN

Figura 2.10 Mecanismos de desestabilización de las emulsiones (Walstra, 1996).

- Sedimentación y cremado: se produce debido a la diferencia de densidades

entre la fase continua y la dispersa que forman la emulsión. Es un proceso reversible
ya que la identidad original de las gotas se mantiene. En la sedimentación las gotas
de la fase dispersa migran hacia la parte inferior, mientras que en el cremado las
gotas se desplazan hacia la superficie.
- Floculación: consiste en la agregación de gotas de una emulsión pero sin
romper la interfaz de la gota. Como se puede ver en la Figura 2.10 las gotas siguen
manteniendo su identidad. Por tanto, también se trata de un proceso reversible.
- Coalescencia: es un proceso irreversible mediante el cual dos o más gotas
se unen para formar una nueva gota. En este caso, sí que se ha perdido la
identidad, rompiendo la gota para formar una de mayor tamaño.
- Maduración de Ostwald: es un proceso de difusión molecular en el cual las
gotas grandes crecen a expensas de las pequeñas, que van perdiendo volumen
hasta que solamente quedan gotas de gran tamaño.

2.4 Encapsulación.

El presente estudio tiene como objetivo general la encapsulación con alginato

de principios activos para la elaboración de alimentos funcionales. De acuerdo con
ello, en este apartado se describe el proceso de encapsulación, así como las

49
 INTRODUCCIÓN

técnicas más utilizadas en los últimos años con el objetivo de proteger compuestos
bioactivos de las agresividades del medio que los rodea o enmascarar su olor y
sabor. Seguidamente, se presentan de forma más amplia las técnicas de
encapsulación con alginato como material polimérico. Por último, se presenta una
breve reseña de los antecedentes referentes a aplicaciones de encapsulación con
alginato.

2.4.1 Encapsulación y sus técnicas: Generalidades.

La técnica de encapsulación ha sido descrita como un proceso en donde

pequeñas partículas o gotas son rodeadas por un recubrimiento homogéneo o
heterogéneo integrado a las cápsulas con variadas aplicaciones (Borgogna, et al.,
2010). Una definición general de encapsulación dada por Desai y Park (2005) se
refiere al empaquetado de materiales sólidos, líquidos o gaseosos mediante
cápsulas que liberan su contenido de forma controlada bajo condiciones
determinadas.
Estas especificaciones han llevado a describir la encapsulación como la
técnica de obtención de una barrera que retarda la interacción de un determinado
producto con el medio que lo rodea promoviendo un aumento en la vida útil del
mismo, la liberación gradual del compuesto encapsulado e incluso facilitando su
manipulación al convertir un material líquido o gaseoso a una forma sólida llamada
cápsula, microcápsula, nanocápsula, entre otras dependiendo de su tamaño. (Fang
y Bhandari, 2010).
Una cápsula consiste en una membrana semipermeable, delgada y fuerte que
rodea un núcleo sólido o líquido. El núcleo que compone la cápsula es también
denominado fase interna o principio activo, así como la membrana se puede
denominar capa externa o matriz. Se definen como microcápsulas aquéllas con un
diámetro que varía de pocos micrones a 1000 µm. En este sentido, las
micropartículas, microcápsulas o microesferas son definidas como el producto del
proceso de microencapsulación dependiendo de cuál sea su morfología y estructura
interna (Anal y Singh, 2007; Saez et al., 2007). Las microcápsulas se han
diferenciado de las microesferas principalmente por la distribución del principio
activo. En el primer caso, el núcleo puede ser de naturaleza líquida o sólida incluido
en una especie de reservorio recubierto por una película del material. Mientras que,

50
 INTRODUCCIÓN

en las microesferas, el principio activo se encuentra altamente disperso en forma de

partículas o moléculas en una matriz que no ocupa solo la superficie sino toda la
esfera. La obtención de un tipo de estructura u otra depende de las propiedades
físico-químicas del principio activo y de la matriz, así como de la técnica empleada
para su preparación (Lopretti et al., 2007).
Las cápsulas en general, pueden tener forma esférica o irregular. Asimismo,
pueden estar constituidas por una membrana simple, múltiples capas e incluso
núcleos múltiples cuya matriz puede ser del mismo material o una combinación de
varios tal como se muestra en la Figura 2.11. Según el tamaño deseado, se
denominarán nanopartículas, nanocápsulas o nanoesferas por debajo del micrón. Y
aunque el término cápsula, puede emplearse de manera genérica para nombrar
tanto a las nano como las microcápsulas, también, puede referirse a cápsulas de
mayores tamaños por encima del milímetro.

Figura 2.11 Tipos de Cápsulas (Gibbs et al., 1999).

Entre las técnicas más empleadas para formar las cápsulas, mostradas en la
Tabla 2.4, se tienen: secado por atomización, enfriamiento por atomización,
extrusión, recubrimiento en lecho fluidizado, atrapamiento con liposomas,
coacervación, formación de complejos de inclusión, extrusión centrífuga y la
suspensión por rotación-separación, entre otras (Gibbs et al., 1999).

51
 INTRODUCCIÓN

Tabla 2.4 Técnicas de encapsulación y su proceso.

Técnica Etapas del proceso

Secado por Preparación de la dispersión; Homogenización de la dispersión;

atomización
Atomización de la dispersión; Deshidratación de las partículas
atomizadas.

Enfriamiento por Preparación de la dispersión; Homogenización de la dispersión;

pulverización
Atomización de la dispersión.

Recubrimiento en lecho Preparación de la solución de recubrimiento; Fluidización de las

fluidizado partículas; Recubrimiento de las partículas.

Extrusión Preparación de la solución de recubrimiento; Dispersión del

principio activo en el material; Paso de la mezcla por el dispositivo
extrusor.

Extrusión centrífuga Preparación de la solución principal; Preparación de la solución de

recubrimiento; Co-extrusión de la solución principal y de
recubrimiento a través de boquillas.

Atrapamiento con Microfluidización; Ultrasonidos; Evaporación en fase inversa.

liposomas

Coacervación Formación de tres fases químicas inmiscibles; La deposición de la

capa; La solidificación de la capa.

Liofilización Mezcla del principio activo en una solución de recubrimiento;

Secado por congelación de la mezcla.

Suspensión por Mezcla del principio activo en un material de recubrimiento;

rotación- separación
Verter la mezcla sobre un disco giratorio para obtener pequeñas
partículas encapsuladas; Secado.

Hay un número de materiales de recubrimiento aprobados comercialmente y

disponibles para producir diversos encapsulados de uso alimentario (Tabla 2.5). No
todos los materiales tienen las propiedades necesarias, por lo que se utilizan a
menudo en combinación con otros materiales modificadores tales como,
eliminadores de oxígeno, antioxidantes, agentes quelantes y tensioactivos.

52
 INTRODUCCIÓN

Tabla 2.5 Materiales de encapsulación de grado alimentario.

Polisacáridos Grasas y Ceras Proteínas

Goma Arábica Aceites vegetales Gelatinas

hidrogenados

Almidones modificados Cera de abeja Proteína del suero

Maltodextrinas Proteína de soja Caseinatos de sodio

Alginatos

Pectinas

Carragenatos

En contraste con la mayoría de los polisacáridos, el alginato forma geles

prácticamente independientes de la temperatura, aspecto que lo ha hecho atractivo
en la elaboración de cremas, quesos, salsas, y aderezos. Sin embargo, la exposición
prolongada a tratamientos de calor y variaciones extremas de pH degrada al
polímero, presentando como consecuencia pérdidas de las propiedades del gel
(Mancini et al., 1999; Soares et al., 2004). Adicionalmente, la condición de
polielectrolito le confiere la capacidad de interaccionar con otras moléculas
permitiendo formar sistemas mixtos que muestran mejoras en las propiedades
estructurales del gel de alginato. Al seleccionar una matriz polimérica para la
microencapsulación deben considerarse sus propiedades físico-químicas,
solubilidad, transición sol-gel (cinética) y permeabilidad (Champagne y Fustier,
2007).

2.4.2 Técnicas de encapsulación con alginato.

La encapsulación de principios activos puede realizarse por diferentes

técnicas. La selección de la técnica de encapsulación adecuada se ve determinada
por las propiedades físico-químicas del material soporte y la aplicación final deseada
con el objeto de asegurar la biodisponibilidad de los compuestos, su funcionalidad e
incluso su fácil incorporación en los alimentos sin la alteración de sus propiedades
sensoriales (Pal, et al., 2009). Al emplear el alginato como matriz polimérica, las
técnicas de encapsulación en aplicaciones alimentarias se reducen a: emulsión,
extrusión y secado por atomización. Considerando, que las técnicas empleadas en

53
 INTRODUCCIÓN

este estudio han sido en emulsión y por extrusión, se realiza en este apartado una
explicación ampliada de ambas.

2.4.2.1 Encapsulación en emulsión.

La técnica de encapsulación en emulsión consiste en la dispersión de un

líquido en otro líquido inmiscible donde la fase dispersa contiene la solución de
alginato que formará la matriz polimérica, así como el componente a encapsular. La
adición de un tensioactivo mejora la formación y estabilidad de la emulsión, así como
la distribución de tamaño de las gotas (Poncelet, 2001; de Vos et al., 2010), que se
convertirán en microcápsulas o microesferas cuando la gelificación del alginato
tenga lugar, por lo que el tamaño de las gotas determinará el tamaño de las
partículas formadas. En este sentido, la encapsulación en emulsión permite la
preparación de microcápsulas o microesferas empleando para ello dos posibles
mecanismos: la gelificación externa (GE) y la gelificación interna (GI). La gelificación
externa en emulsión consiste en la dispersión de una solución acuosa de alginato-
componente activo a encapsular en una fase continua no acuosa, seguida de la
adición de una fuente de calcio que al difundirse a la fase dispersa inicie la
gelificación permitiendo la encapsulación. A continuación, la emulsión se
desestabiliza para la separación de las cápsulas formadas. En la gelificación interna
la fuente se calcio se encuentra en la misma fase dispersa, pero en forma de sal o
complejo insoluble o parcialmente soluble en cuyo caso se adiciona un agente
secuestrante (Gouin, 2004; Chan et al., 2006). La liberación del ion calcio ocurre
con la adición de un ácido orgánico soluble en la fase continua que al difundirse
hacia la fase dispersa disminuye el pH del medio solubilizando la sal de calcio y
produciendo la gelificación. Las técnicas de microencapsulación en emulsión se
describen en la Figura 2.12. Para ambos casos, dichas microcápsulas pueden ser
denominadas microesferas al considerar que el principio activo se encuentra
altamente disperso en la matriz polimérica.

54
 INTRODUCCIÓN

Figura 2.12 Técnica de microencapsulación en emulsión (Champagne y Fustier, 2007).

2.4.2.2 Encapsulación por extrusión.

Esta técnica consiste en la formación de gotas de la solución de alginato que

contiene el componente a encapsular al hacer pasar dicha solución por un
dispositivo extrusor de tamaño y velocidad de goteo controlado. Estas gotas caen
sobre un baño que contiene la fuente del ion divalente, quien induce la gelificación
mediante el mecanismo de gelificación externa (Chan et al., 2009). La principal
limitación presentada por esta técnica es el gran tamaño de las cápsulas o esferas
formadas, comparado con aquél obtenido por emulsificación, y que depende
fundamentalmente del diámetro de la boquilla del dispositivo extrusor, además
existe, la dificultad de producción a gran escala debido a que la formación de las
cápsulas se logra una a una o de pocas en pocas lo cual trae como consecuencia
largos tiempos de gelificación (Mofidi et al., 2000). Adicionalmente, hay que
considerar aspectos que influyen en la forma esférica y tamaño de las esferas, como
la distancia de separación de la boquilla al baño, el efecto de la gravedad y la
tensión superficial de la solución que induce la gelificación (Chan et al., 2009). A
pesar de todos estos factores, la técnica de encapsulación por extrusión ha sido
empleada tradicionalmente al permitir la producción de cápsulas o esferas con
tamaños uniformes, empleando desde una simple jeringa hasta dispositivos
extrusores más sofisticados.

55
 INTRODUCCIÓN

Recientes estudios demuestran que la aplicación de esta técnica mejora

notablemente al incorporar dispositivos extrusores como boquillas múltiples y discos
aspersores (Champagne et al., 2000), inyectores con impulsos vibratorios (Dohnal
y Štěpánek, 2010) e incluso con flujo de aire incorporado (Mark et al., 2009), todos
diseñados con el mismo objetivo, la producción masiva de cápsulas. Como ejemplo,
en la Figura 2.13 se muestran diferentes tipos de dispositivos extrusores para la
preparación de cápsulas.

Figura 2.13 Tipo de dispositivos extrusores. Atomizador con corte sistemático del chorro, a; Boquilla
vibratoria, b; Disco atomizador, c; Flujo de aire coaxial, d y Potencial electroestático, e. (Zuidam y
Shimoni, 2010).

2.4.3 Antecedentes: aplicaciones de encapsulación con alginato.

La mayoría de las aplicaciones encontradas, se han realizado encapsulando

microorganismos probióticos. Estas bacterias se han venido adicionando
directamente en productos alimentarios debido a sus beneficios probióticos. Sin
embargo, el mayor problema se presenta en la supervivencia de los
microorganismos durante el procesado y almacenaje de los alimentos e incluso en
procesos posteriores a su consumo como las agresivas condiciones
gastrointestinales. Las últimas tendencias alimentarias hacen referencia a la
incorporación de compuestos antioxidantes a la dieta diaria. En este sentido, han
surgido recientes investigaciones con la finalidad de proteger las propiedades

56
 INTRODUCCIÓN

funcionales de estos compuestos activos a objeto de evitar su degradación química

(Lupo et al., 2012).

2.4.3.1 Encapsulación de microorganismos probióticos.

La microencapsulación ha permitido inmovilizar bacterias probióticas en una

matriz de alginato debido a la simplicidad del proceso de preparación de las
microcápsulas, su biocompatibilidad y alta retención de microorganismos como
consecuencia del tamaño de poro mostrado por la matriz estimado en 17 nm,
mientras que el tamaño promedio de las bacterias oscila entre 1-3 µm. Por estas
razones, la microencapsulación de probióticos ha sido investigada con la finalidad de
proteger y mejorar la biodisponibilidad de los microorganismos (Krasaekoop et al.,
2003; 2004). Por otra parte, se han encontrado trabajos donde el objetivo ha sido
producir mayor cantidad de biomasa para mejorar el proceso de fermentación, así
como la obtención de metabolitos secundarios de interés industrial, tal como la
vitamina B12 (Gardner y Champagne, 2005).
La técnica por extrusión ha sido la más empleada para la encapsulación de
bacterias probióticas en hidrocoloides. Diferentes estudios obtuvieron diámetros de
cápsulas superiores a 2 mm al inmovilizar diversas bacterias ácido lácticas. Los
resultados mostraron una influencia importante de la viscosidad de la solución de
alginato, la distancia desde el dispositivo extrusor al baño de calcio y el diámetro del
orificio en el tamaño y esfericidad de las cápsulas. Por el contrario, al aplicar la
técnica en emulsión se lograron producir microcápsulas con tamaños entre 25 µm y
2 mm, donde la velocidad de agitación y el tipo de tensioactivo mostraron ser las
variables de influencia significativa sobre la distribución de tamaño (Krasaekoop et
al., 2003). En un estudio posterior sobre microencapsulación de B. longum por
extrusión, se evidenció una mayor cantidad de bacterias existentes en un ambiente
gástrico simulado frente a las células libres. Este índice de resistencia se incrementó
con la concentración de alginato y el tamaño de las cápsulas. Por otra parte, las
microcápsulas con Lactobacillus preparadas en emulsión presentaron tamaños
inferiores a 100 µm y poca supervivencia de las células frente a fluidos gástricos.
Parece que debido al gran tamaño de las bacterias, las microcápsulas han de ser
moderadamente grandes para encapsularlas de forma efectiva. Aun así, al ser
agregadas en productos refrigerados como yogurt y crema agraria mostraron

57
 INTRODUCCIÓN

estabilidad durante el almacenamiento (Chandramouli et al., 2004). No obstante al

éxito alcanzado por diferentes investigaciones, se han encontrado variados estudios
que han empleado tratamientos especiales para elevar la eficiencia de
encapsulación, empleando sistemas combinados de matrices, como
almidón/alginato y proteína del suero/alginato (Dembczyński y Jankowski, 2000;
Chen y Subirade, 2006; Jayalalitha et al., 2012).

2.4.3.2 Encapsulación de compuestos activos no microbianos.

Con el objetivo de mantener las propiedades funcionales de los principios

activos y enmascarar sabores amargos o astringentes, se ha utilizado la técnica de
encapsulación para evitar la degradación causada por factores químicos y externos
como la oxidación e hidrólisis. Diversos trabajos hacen referencia a la encapsulación
de ácidos grasos como el omega-3 y omega-6, aplicados tradicionalmente para el
enriquecimiento de productos alimenticios, los cuales son altamente oxidables y de
sabor desagradable (Champagne y Fustier, 2007; Sanguansri y Augustin, 2010).
Compañías como Denomega Nutritional Oils (Denomega Pure Health, Sarpsborg,
Noruega) y GAT Food Essentials (Ebenfurth, Austria) han encapsulado aceite de
pescado en microesferas de alginato con tamaños entre 1 y 30 µm usando la técnica
en emulsión y un recubrimiento de goma xantana.
La vitamina E (α-tocoferol) un antioxidante usado frecuentemente por la
industria farmacéutica y de gran interés para los procesos alimentarios pero de
aplicación limitada debido a su carácter lipofílico, alta sensibilidad al calor y a la luz.
Ha sido encapsulado utilizando la técnica por extrusión y un dispositivo especial con
doble boquilla para extruir la solución (Helgerud et al., 2010). A este respecto, un
trabajo previo refiere la preparación de microcápsulas con vitamina E empleando
mediante la formación de una emulsión O/W, donde la emulsión es a su vez extruida
por atomización con aire comprimido sobre una solución de calcio para conseguir la
gelificación de las gotas (Yoo et al., 2006). Levi y colaboradores (2001)
encapsularon el aroma de limoneno ampliamente usado por la industria de bebidas
refrescantes en un sistema alginato-alcohol polivinílico. Los resultados señalaron
una alta resistencia frente a temperaturas por encima de las presentadas como
críticas para el limoneno sin encapsular.

58
 INTRODUCCIÓN

En la última década, las investigaciones han mostrado un interés creciente

por la encapsulación de extractos naturales con alto contenido en polifenoles
provenientes de plantas medicinales, hierbas, flores y semillas. Dicho manifiesto ha
surgido con la finalidad de alcanzar nuevas propuestas nutricionales que permitan el
uso de antioxidantes como aditivos alimentarios sin cambiar el sabor, aroma y color
de los productos originales, así como, el aprovechamiento de sus beneficios
protectores ante los efectos de los radicales libres y las enfermedades
degenerativas. Por otra parte, el reciente uso de los extractos naturales, se ha
debido a su gran carácter hidrofílico lo que, por tanto, ha facilitado su proceso de
extracción y potenciado las aplicaciones en medios acuosos. Sin embargo, cuando
el objetivo es retardar la liberación de sus compuestos activos en el medio acuoso,
diversos trabajos señalan que tal efecto puede ser contrarrestado empleando
tratamientos especiales a las microcápsulas durante su proceso de preparación. Así,
la hierba mate (Ilex paraguariensis) fue microencapsulada en alginato, recubierta en
quitosano y con posterior deshidratación de las microcápsulas utilizando diferentes
métodos de secado, demostrando que la matriz alginato-quitosano retarda los
tiempos de liberación del compuesto respecto a las microcápsulas sin recubrir
(Deladino et al., 2008). En otros trabajos, se han encapsulado soluciones acuosas
de extractos de la hierba Piper sarmentosum en esferas de alginato de calcio (Chan,
et al., 2010). También, se han encapsulado soluciones preparadas a partir de hojas
de frambuesa, espino, hiedra, milenrama, ortiga y extracto de hoja de olivo en
microesferas de alginato/quitosano preparadas por extrusión electrostática con
adición de ácido ascórbico para la disolución de quitosano (Belščak-Cvitanović et
al., 2011).

2.5 Diseño Experimental.

Este apartado pretende describir brevemente, las bases teóricas del diseño
experimental que ha sido utilizado en el estudio de preparación de microesferas de
alginato en emulsión para la encapsulación del principio activo. Específicamente se
hace referencia al diseño factorial a dos niveles, diseño central compuesto y factorial
fraccionado como estrategias experimentales para el estudio de un sistema o
proceso.

59
 INTRODUCCIÓN

2.5.1 Diseño factorial.

Los diseños factoriales se usan ampliamente en experimentos que incluyen

varios factores cuando es necesario estudiar el efecto conjunto de los factores sobre
la respuesta. Hay varios casos especiales del diseño factorial que son importantes
debido a su uso generalizado en el trabajo de investigación y porque constituyen las
bases de otros diseños de gran valor práctico. Entre ellos se encuentra, el de 𝑘
factores, cada uno estudiado sólo a dos niveles. Este diseño sirve como un estudio
preliminar de la influencia de diversos factores en una determinada variable
respuesta, ya que permite determinar si hay influencia o no, pero no permite
cuantificar influencias no lineales. Si todos los factores se estudian a dos niveles, se
dice que es un experimento factorial 2k, donde 𝑘 es el número total de variables que
se estudian. Los niveles de estos factores pueden ser cuantitativos o bien
cualitativos. Se denominan factores todas aquellas variables que puedan afectar al
sistema, y se considera respuesta de salida o variable respuesta a las diferentes
propiedades del producto obtenido. Existen diferentes técnicas de diseño factorial,
en función de los niveles estudiados por variable y del número de experimentos
programados (Prat et al., 1997).

- Diseño factorial a dos niveles: permite calcular de forma preliminar el efecto

de cada variable sobre una respuesta del sistema, así como las posibles
interacciones entre las diferentes variables. Para un diseño factorial a dos niveles, se
debe escoger un nivel inferior y superior de cada variable. A partir de las respuestas
determinadas para cada uno de los experimentos programados, se puede calcular el
efecto principal de una variable sobre la respuesta de salida. Éste se define como el
cambio que experimenta la respuesta cuando se produce la variación de una
variable desde su nivel inferior al superior, para todas las combinaciones posibles
del resto de variables. Se define interacción como la influencia que pueda tener el
cambio de nivel de una variable en el efecto de otra variable sobre la respuesta de
salida (Montgomery, 2002). Se puede analizar la interacción de dos variables
representando la respuesta en función de una variable, x1, para los dos niveles
estudiados de otra variable, x2. Cuando la diferencia de respuesta entre los dos
niveles estudiados de una variable, x1, no es la misma a todos los niveles de otra
variable, x2, se considera que existe interacción. Por el contrario, si la diferencia de
respuesta para cada nivel de x1 a diferentes niveles de x2, se considera que no
60
 INTRODUCCIÓN

existe interacción entre ellas. En este caso, cada variable podría ser estudiada de
manera independiente.

- Diseño Central Compuesto (CCD): estos diseños permiten describir

comportamientos no lineales, ya que cada variable se estudia a tres o más niveles.
Para un diseño central compuesto, el número total de experimentos a realizar es la
suma de un diseño factorial completo, 2k, un punto central que se replica un número
de veces determinado y un diseño axial o estrella que permite la estimación de la
curvatura. Si la distancia desde el punto central a un punto del diseño factorial
completo o fraccionado es  1 unidades para cada variable, la distancia desde el
punto central a un punto del diseño axial o estrella corresponde a   con 1. La
Figura 2.14, muestra el dominio experimental y los puntos experimentales
programados para un diseño central compuesto de dos y tres factores o variables,
los cuales se han usado en el presente trabajo.

Figura 2.14 Dominio experimental de un diseño central compuesto para dos factores, a
(Montgomery, 2002) y tres factores, b (Box et al., 1989).

El valor de  y el número de experimentos a realizar en el punto central, se

seleccionan según criterios de ortogonalidad y rotabilidad (Montgomery, 2002). El
diseño estrella implica la realización de un nuevo bloque de experimentos de nuevos
valores extremos (inferior y superior) para cada variable de diseño. Para evitar el
efecto de la experimentación en bloques, los dos diseños, estrella y factorial, deben
cumplir la condición de ortogonalidad. El diseño central compuesto, también debe
cumplir el principio de rotabilidad. Se considera que un diseño es rotable, si la
precisión en la estimación de la superficie es igual para todos los puntos y

61
 INTRODUCCIÓN

equidistante del centro del diseño, independientemente de la dirección en que se

encuentren. Es decir, que al girar la superficie sobre su centro, la precisión en la
estimación será la misma (Prat et al., 1997).
- Diseño factorial fraccionado: permite calcular el efecto de cada variable
sobre una respuesta del sistema, así como las posibles interacciones entre las
diferentes variables. Para un diseño factorial a dos niveles, se debe escoger un nivel
inferior y superior de cada variable. El número de experimentos a realizar sería 2 k-1
donde 𝑘 − 1 corresponde al número total de variables que se estudian. Por tanto,
representa a una fracción un medio del diseño 2 k completo, es decir, la mitad de las
combinaciones (Montgomery, 2002).

2.6 Modelos para ajustes cinéticos de liberación.

La encapsulación y por consiguiente la liberación controlada del principio

activo en alimentos se ha practicado en la industria alimentaria durante muchos
años. Sin embargo, la tecnología que se ha desarrollado es relativamente poco
sofisticada en comparación con otros campos de aplicación, tales como la
farmacología. Esto se debe en gran parte a las limitaciones impuestas a la industria
de alimentos para el uso de ingredientes comestibles de bajo coste, así como a su
procesado. Este apartado hace mención a los mecanismos de liberación más
empleados a nivel de fármacos que a su vez han sido aplicados recientemente para
el estudio de la liberación de diferentes principios activos en alimentos, como
vitaminas, proteínas, enzimas y compuestos polifenólicos.
Durante años, las aplicaciones farmacéuticas han hecho uso de sistemas
poliméricos de liberación controlada, que a su vez protegen al compuesto activo de
las degradaciones biológicas antes de su liberación. En este caso, el mecanismo de
liberación se basa en las características físico-químicas del polímero como matriz,
según tres categorías (Arifin et al., 2006):

- Difusión del fármaco desde el polímero no degradado (controlado por la difusión).

- Difusión del fármaco mejorada debido al hinchamiento del polímero (controlado por
el hichamiento).
- Difusión del fármaco debido a la degradación del polímero y su erosión (controlado
por la erosión).

62
 INTRODUCCIÓN

En este sentido, el fenómeno de liberación de un principio activo resulta difícil

de modelizar. Quizás por ello, son numerosas las ecuaciones planteadas que
intentan relacionar la cantidad del compuesto liberado (𝑀) en función del tiempo (𝑡).
Los correspondientes modelos cinéticos destinados a describir la liberación desde
formas de dosificación inmediata o modificada, se pueden agrupar en modelos
matemáticos mecanicistas o reales y modelos matemáticos empíricos o semi-
empíricos (Siepmann y Göpferich, 2001).

2.6.1 Modelos matemáticos mecanicistas o realistas.

Un modelo matemático mecanicista o realista, se fundamenta en parámetros

teóricos explicados con un sentido real que relacionan a 𝑀 = 𝑓(𝑡). Para ser capaz
de resolverlos, las condiciones iniciales y de contorno dadas deben ser conocidas,
por ejemplo, la distribución del compuesto dentro de la forma de dosificación antes
de la exposición al medio de liberación, el mantenimiento potencial de unas
perfectas condiciones de inmersión durante todo el experimento o la adecuación
constante de los límites específicos. Cabe resaltar que estos modelos, toman como
base teorías como la Ley de Fick o difusión, teorías que consideran el hinchamiento
del polímero, teorías que consideran tanto el hinchamiento del polímero como su
disolución y del compuesto activo, y teorías que toman en cuenta la erosión del
polímero y su degradación.
Las teorías basadas en la Ley de Fick han sido las más destacadas, debido a
su sencillez. Si la liberación del compuesto es una difusión controlada con
coeficientes de difusión constantes, el tratamiento matemático puede ser bastante
sencillo. Tal como se ilustra en la Figura 2.15, se tienen diferentes tipos de sistemas
o dispositivos. Los sistemas de reservorio que consisten en un depósito del
compuesto, que está rodeado por una membrana de control de velocidad de
liberación o barrera (generalmente polimérica). Por otro lado, se tienen los sistemas
tipo monolíticos, también llamados sistemas de "uno-bloque", debido a la formación
compuesto activo-matriz, es decir, un sistema donde no existe una separación
diferenciada entre el compuesto encapsulado y la membrana polimérica formada.
Por tanto, el principio activo se encuentra distribuido prácticamente de forma
homogénea en la matriz (Siepmann J. y Siepmann, F, 2008).

63
 INTRODUCCIÓN

Para ambos tipos de sistemas, se debe distinguir si la concentración inicial del

compuesto está por debajo o por encima de la solubilidad de éste en el dispositivo.
Para el caso de un dispositivo tipo reservorio con una concentración inicial del
compuesto por debajo de la solubilidad del mismo, las moléculas del compuesto
liberado no se reemplazan y la concentración del compuesto en la superficie de la
membrana interna disminuye continuamente con el tiempo (fuente de actividad no
constante). Si la membrana no se hincha o se disuelve, si se proporcionan
condiciones de inmersión perfectas durante todo el periodo de liberación y si la
permeabilidad del compuesto a través de la barrera permanece constante, resulta en
una cinética de liberación de primer orden e independiente de la geometría del
dispositivo.
En contraste, si la concentración inicial del compuesto supera su solubilidad
en un dispositivo tipo reservorio, las moléculas liberadas se van sustituyendo por la
disolución (parcial) del compuesto, lo que resulta en concentraciones constantes del
mismo (soluciones saturadas) en la superficie de la membrana interna (constante
fuente de actividad). Si las propiedades de la barrera de control de la velocidad de
liberación (incluyendo su grosor y la permeabilidad) permanecen constantes, y si se
proporcionan condiciones de inmersión perfectas durante todo el periodo de
liberación, la cinética de liberación resulta de orden cero (siempre que se
proporcione el exceso de fármaco) e independiente de la geometría del sistema
(Baker, 1987). Los diferentes sistemas descritos son mostrados en la Figura 2.15.

Figura 2.15 Sistema de clasificación de dosificación de fármacos por difusión controlada (Siepmann
J. y Siepmann, F, 2008).

64
 INTRODUCCIÓN

Los modelos matemáticos mecanicistas o realistas, se asientan en las teorías

básicas de la disolución planteadas hace más de un siglo por Noyes y Whitney en
1897. Esta teoría relaciona, la velocidad de disolución de los sólidos a las
propiedades del sólido y el medio de disolución. Afirmación que se expresa
matemáticamente como:

𝑑𝐶
= 𝑘(𝐶𝑠 − 𝐶) (19)
𝑑𝑡

Donde 𝑑𝐶 ⁄𝑑𝑡 es la variación de concentración de sólido en solución por unidad de

tiempo, 𝑘 es una constante de velocidad que depende de las condiciones
experimentales y tiene dimensiones de 𝑡 −1 , 𝐶 es la concentración de sólido en
solución libre a un tiempo 𝑡 y 𝐶𝑠 es la concentración de saturación del sólido en el
medio de disolución. Esta asume que la superficie del sólido permanece constante
durante la disolución, y que la disolución tiene lugar en dos pasos consecutivos:
disolución del sólido en la interfase sólido-líquido con la consiguiente formación de
una fina capa de difusión alrededor de la superficie del sólido (𝐶𝑠 ), seguida de la
difusión del soluto desde esa capa saturada hacia el medio de disolución (𝐶).
Estudios posteriores de Noyes y Whithey incorporaron el área de superficie
del sólido accesible al medio de disolución al considerar los efectos de este aspecto
sobre la velocidad de disolución. Estos fundamentos han sido usados para explicar y
desarrollar diversos modelos de liberación, en los que la etapa limitante en la
transferencia del soluto desde el sólido hacia el medio es siempre la difusión de las
moléculas a través de esa capa en torno a la partícula sólida (Viseras-Iborra, 2008).
Los modelos mecanicistas plantean la liberación del principio activo como un
proceso principalmente difusional, y han sido desarrollados para ajustar datos de
liberación desde sistemas reservorios o matriciales. En los sistemas reservorio, el
ajuste matemático de la liberación es sencillo si se supone que el sistema o
dispositivo es esférico (Crank, 1975). En los sistemas matriciales, asumen que el
compuesto se encuentra uniformemente distribuido en la matriz desde la que se
libera, partiendo de dos situaciones:

- Que la cantidad del principio activo sea menor que la solubilidad en la matriz (C 0 <
Cs), esto es, que el compuesto está disuelto.
- Que la cantidad del principio activo presente en la matriz sea mayor que su
solubilidad (C0 > Cs) y, por tanto el compuesto está disperso en la matriz.

65
 INTRODUCCIÓN

2.6.1.1 Modelo de orden cero.

La denominación de modelo de orden cero surge de la base teórica

desarrollada para el estudio cinético de las reacciones químicas, en las que el
término “orden” de reacción se refiere a la forma en que la concentración de una
sustancia influye en la velocidad de una reacción química, de manera que la
velocidad es independiente de la concentración. En el medio biológico, la disolución
de un sólido viene seguida de su absorción, por lo que la concentración del soluto se
mantiene en valores muy alejados de su solubilidad. Esto permite plantear una
solución parcial de la Ec. 19, para el caso en que 𝐶 << 𝐶𝑠 . Si 𝐶𝑠 es constante y se
considera el volumen de la disolución la ecuación queda:
𝑑𝑀
=𝑘 (20)
𝑑𝑡

Donde se expresa la cantidad de principio activo liberado en el tiempo y se describe

la velocidad de disolución como constante e independiente de la cantidad del
compuesto disuelto. Este modelo es válido si el área de la partícula permanece sin
variación. Al integrar entre tiempo 0 y 𝑡, se tiene:

𝑀𝑡 = 𝑀0 + 𝑘𝑡 (21)

Donde, 𝑀𝑡 es la cantidad de compuesto liberado en tiempo t y 𝑀0 es la cantidad del

compuesto inicial en solución. Usualmente el valor de 𝑀0 tiende a ser cero.

2.6.1.2 Modelo de primer orden.

Establece que la velocidad de disolución es proporcional a la primera potencia

de la concentración del principio activo disuelto. Partiendo de la Ec. 19, asumiendo
que 𝐶𝑠 es constante, que la forma del sólido no cambia y que su superficie será
proporcional a la cantidad del compuesto que quede por disolver, se tiene la
expresión matemática:
𝑑𝑀
− 𝑀−𝑀 = 𝑘𝐼 𝑑𝑡 (22)
𝑡

Donde, 𝑘𝐼 es una constante de proporcionalidad, el signo negativo indica la

disminución de la cantidad de sólido al disolverse. Integrando entre tiempo 0 y t,
linealizando y reordenando, se tiene:

66
 INTRODUCCIÓN

𝑀𝑡 = 𝑀∞ (1 − 𝑒 −𝑘𝐼(𝑡−𝑡0 ) ) (23)

Donde, 𝑀∞ es la cantidad de compuesto liberado en un tiempo infinito.

2.6.1.3 Modelo de Higuchi o de la Raíz Cuadrada.

El modelo surge de una propuesta hecha por Higuchi en 1961, para el ajuste
de una cinética de liberación de fármacos suspendidos en bases pomadas,
asumiendo: un diámetro de la partícula del principio activo mucho menor a la capa
de pomada aplicada, la concentración del compuesto en la base de la pomada (𝐶)
sea mucho mayor que su solubilidad en la base (𝐶𝑠 ) y la superficie de aplicación sea
inmiscible en la base de la pomada. En este sentido, el principio activo será
primeramente disuelto y posteriormente comenzará a difundirse.

𝐷𝑡𝐶
𝑀 = 2√2𝐶−𝐶𝑠 (𝐶 − 𝐶𝑠 ) = √𝐷𝑡(2𝐶 − 𝐶𝑠 )𝐶𝑠 (24)
𝑠

Donde, 𝐷 es el coeficiente de difusión del compuesto en el vehículo de la pomada y

𝑀 = 𝑀𝑡 ⁄𝑀∞ es la cantidad de compuesto liberado en un tiempo 𝑡. Esta ecuación es
válida para tiempos menores al agotamiento del compuesto, de manera que la
cantidad del principio activo liberado, resulta proporcional a la raíz cuadrada de la
concentración del compuesto, a la constante de difusión, solubilidad del compuesto y
al tiempo.
Posteriormente, Higuchi planteó el uso de la Ec. 24 para la liberación desde
matrices homogéneas y granulares. Cuando se trata de matrices no porosas
(homogéneas), no hinchables y en las que el compuesto se encuentra
uniformemente disperso, se asume que éste se disuelve en el seno de matriz y
posteriormente se difunde desde allí hasta la superficie. Conforme el compuesto se
va liberando, la distancia de difusión se hace mayor de manera que la variación de la
concentración progresa. En cambio si la matriz, presenta poros, primero debe entrar
el medio de disolución a través de éstos, por lo que resulta necesario introducir un
factor de tortuosidad en la ecuación. Presuponiendo, que la concentración del
compuesto en la matriz es menor que su solubilidad y que la liberación del mismo
ocurre lentamente y posterior a la difusión a través de los poros, la ecuación se
puede expresar como:

67
 INTRODUCCIÓN

𝐷𝜀
𝑀=√ (2𝐶 − 𝜀𝐶𝑠 )𝐶𝑠 𝑡 (25)
𝜏

Donde, 𝜀 es la porosidad de la matriz y 𝜏 es el factor de tortuosidad del sistema. Esta

ecuación asume, por otra parte que el sistema no se encuentra recubierto y que la
geometría de la matriz no cambia con la liberación.
De manera general, es posible agrupar las ecuaciones que describen el modelo de
Higuchi de forma simplificada:
𝑀𝑡
= 𝑘 ´ √𝑡 (26)
𝑀∞

Donde, 𝑘 ´ es una constante y su uso estará limitado al ajuste de la primera parte

(60%) de la cinética de liberación, es decir, 𝑀𝑡 ⁄𝑀∞ ≤ 0,6.

2.6.2 Modelos matemáticos empíricos.

La mayoría de los ajustes cinéticos realizados con las ecuaciones anteriores

no describen adecuadamente sistemas reales, debido principalmente a que un solo
mecanismo no es suficiente para explicar el proceso de liberación. En consecuencia,
surgen propuestas donde se plantea una contribución simultánea tanto de la difusión
como de la disolución, cuyo peso en la liberación dependerá del sistema objeto en
estudio (Wang et al., 1969). En estos casos, ni la cinética de primer orden ni la
ecuación de Higuchi serán capaces de ajustar el perfil de disolución. Estas ideas
condujeron al desarrollo de modelos empíricos (o semi-empíricos) en el que se
relaciona la cantidad de compuesto liberado desde sistemas poliméricos hidrofílicos
con el tiempo.

2.6.2.1 Modelos de Peppas.

Una ecuación muy simple y semi-empírica que se ha utilizado para describir la

liberación de fármacos a partir de sistemas poliméricos es la llamada “Ley de
Potencia”, que se expresa:

𝑀𝑡
= 𝑘𝑡 𝑛 (27)
𝑀∞

Donde, 𝑘 es la constante cinética que refleja las características estructurales y

geométricas del sistema polimérico/compuesto activo y 𝑛 es el exponente cinético

68
 INTRODUCCIÓN

que describe el mecanismo de liberación. El desarrollo de esta ecuación

generalizada, resulta de una modificación propuesta por Kosmeyer et al, (1986).
Puede observarse que la ecuación de Higuchi clásica (Ec. 24), así como la ecuación
general o simplificada (Ec. 26), representan el caso especial de la ley de potencia
cuando 𝑛 = 0,5.
Los trabajos iniciados por Nikolaos Peppas y en colaboración sucesiva con
otros autores plantearon limitaciones a la ley de la potencia, con la finalidad de
complementar dos mecanismos aparentemente independientes de transporte de
fármacos; la difusión Fickiana y un comportamiento anómalo denominado no-
Fickiano que describe en muchos casos la dinámica de hinchamiento y liberación del
compuesto activo. Por lo tanto, la Ec. 27 tiene dos significados físicos distintos y
realistas para los casos especiales extremos donde 𝑛 = 0,5 (liberación controlada
del compuesto por difusión) y 𝑛 = 1 (hinchamiento controlado y liberación del
compuesto). Los valores de 𝑛 entre 0,5 y 1 pueden ser considerados como un
indicador de superposición de los dos fenómenos (transporte anómalo) (Siepman y
Peppas, 2012). Sin embargo, se debe tener en cuenta que estos valores extremos
del exponente sólo son válidos para una geometría tipo película o laminar. Para
esferas y cilindros se han obtenido diferentes valores, tal como se indica en la Tabla
2.6 por modificaciones propuestas por Ritger y Peppas (1987).

Tabla 2.6 Valor del exponente cinético para la Ley de la Potencia y diferentes geometrías.

Valores del exponente cinético “𝒏”

Película fina Cilindro Esfera Mecanismo de Transporte
0,5 0,45 0,43 Difusión Fickiana
0,5 < 𝑛 < 1 0,45 < 𝑛 < 0,89 0,43 < 𝑛 < 0,85 Transporte anómalo (no fickiano)
1 0,89 0,85 Transporte Caso II

Por tanto, dependiendo de los valores de 𝑛 se puede interpretar la cinética de

liberación. Para el caso de esferas, si el mecanismo de difusión Fickiano es
predominante, entonces 𝑛 = 0,43 (Ec. 27), mientras 𝑛 = 0,85 se asocia a un
mecanismo anómalo o no-Fickiano, conocido como “transporte de Caso II” o
polímero hinchable. Si los valores de 𝑛 se encuentran entre 0,43 y 0,85 se explica
como un mecanismo de transporte intermedio/anómalo. Si 𝑛 < 0,43 se observa
como un comportamiento de difusión pseudo-Fickiano, es decir, las curvas de
liberación son parecidas a las obtenidas para una difusión Fickiana pero con un

69
 INTRODUCCIÓN

ritmo más lento hacia el equilibrio. Se asocia incluso a la presencia de poros en la

matriz polimérica, y la consiguiente difusión simultánea a través de la matriz
hinchada y a través de los poros llenos del medio de disolución. Para 𝑛 > 0,85 se
tiene un Super-caso II, que se caracteriza por una liberación muy rápida (Viseras-
Iborra, 2008; Siepmann J. y Siepmann F., 2008). La Ec. 27, presenta las
siguientes limitaciones:

- Los coeficientes de difusión deben ser independientes de la concentración.

- Solo es aplicable hasta el 60% de la cantidad de compuesto activo liberado.
- El transporte debe tener lugar en una sola dirección.

En relación a la última limitación, Peppas planteó que su uso sólo era

adecuado para películas finas, quedando para las formas esféricas y cilíndricas
limitado a ajustes aproximados. Por ello, posteriores estudios condujeron a
desarrollar modelos que tomaran en cuenta la dependencia del exponente cinético
respecto a la geometría del sistema.
A partir de la Ec. 27 se plantea otra ecuación semi-empírica modificada con la
incorporación del denominado tiempo de retraso introducido por Kim y Fassihi,
(1997), según la expresión:

𝑀𝑡
= 𝑘(𝑡 − 𝑡𝑟𝑒𝑡 )𝑛 + 𝑏 (28)
𝑀∞

Donde, 𝑘 es una constante, 𝑏 es la fracción total del compuesto liberado por el

“efecto estallido”, lo que hace referencia a la salida rápida desde el sistema, y 𝑡𝑟𝑒𝑡 es
el tiempo de retraso como período de tiempo en el que se percibe nuevamente una
cantidad significativa de compuesto liberado una vez ocurrido el efecto estallido.
Otro modelo semi-empírico fue desarrollado por Peppas y Sahlin. Este
modelo permite conseguir un poco más de información sobre la naturaleza de la
difusión del compuesto activo, ya que considera el componente difusional y la
contribución por transporte anómalo debido al hinchamiento del polímero o
componente de relajación por separado (Siepmann y Peppas, 2012). Este modelo
se puede expresar como:

𝑀𝑡
= 𝑘1 𝑡 𝑚 + 𝑘2 𝑡 2𝑚 (29)
𝑀∞

70
 INTRODUCCIÓN

Donde 𝑀𝑡 es la cantidad de compuesto liberado a tiempo t, 𝑀∞ la cantidad de

compuesto que se liberaría a tiempo infinito, y, por tanto, 𝑀𝑡 ⁄𝑀∞ es la fracción del
compuesto que se ha liberado a tiempo t, 𝑚 es el exponente de difusión fickiando
válido para cualquier geometría del sistema de liberación, 𝑘1 la constante
correspondiente a la difusión y 𝑘2 es la constante que refleja la relajación del
polímero.
El primer término, representa la contribución difusional de Fick (𝑘1 𝑡 𝑚 ) y el
segundo término se refiere al Caso II o contribución por relajación del polímero, dado
que se asume que son aditivos (Siepmann y Peppas, 2012). Entonces, la liberación
del soluto desde cualquier sistema polimérico, independientemente de su forma
geométrica, puede describirse como la suma de dos mecanismos: la difusión de
acuerdo a la Ley de Fick y la relajación con consiguiente hinchamiento de la
estructura polimérica. Si el polímero no se hincha, la Ec. 29 se transforma en la Ec.
27 siendo 𝑚 = 𝑛. La aplicación de la Ec. 29, a sistemas hinchables genera los
mismos exponentes difusionales recogidos en la Tabla 2.6.

2.6.2.2 Modelo de Gallagher-Corrigan.

Diferentes autores han propuesto la liberación del fármaco como un proceso

de difusión en una matriz simple, que presenta la degradación del polímero en una
etapa posterior a la liberación del fármaco. Por otra parte, se ha considerado la
liberación del fármaco como dependiente únicamente de la degradación del
polímero. Alternativamente, otros autores han combinado estos mecanismos
considerando la contribución del “efecto estallido” en la superficie y/o el
hinchamiento del polímero para explicar el perfil de liberación. Este concepto del
“efecto estallido”, en la etapa inicial del perfil de liberación del compuesto también
había sido propuesto por Kim y Fassihi (1997). Además, cabe destacar otros
aspectos como el tamaño y cantidad de macromoléculas del principio activo
disponibles. En este sentido, ha observado que con una baja cantidad de
macromoléculas es probable que el mecanismo dominante sea la degradación del
polímero. Mientras que para moléculas de principio activo pequeñas con una gran
cantidad disponible predomina el mecanismo difusional en la matriz. Por estas
razones, no se ha llegado a un consenso general que permita al formulador predecir
cuantitativamente el perfil de liberación probable para un sistema compuesto

71
 INTRODUCCIÓN

activo/polímero dado. Sin embargo, queda claro que el mecanismo de liberación a

partir de un polímero específico es conocido por ser altamente dependiente de la
característica fisicoquímica del compuesto activo, su cantidad disponible y las
variables de preparación implicadas en el proceso de elaboración de la cápsula o
dispositivo. De este modo, Gallagher-Corrigan (2000) proponen la siguiente
expresión matemática:

𝑒 𝑘2 𝑡−𝑘2 𝑡2𝑚𝑎𝑥
𝑓𝑡 = 𝑓𝑡𝑚𝑎𝑥 (1 − 𝑒 −𝑘1 𝑡 ) + (𝑓𝑡𝑚𝑎𝑥 − 𝑓𝐵 ) (1+𝑒 𝑘2𝑡−𝑘2 𝑡2𝑚𝑎𝑥 ) (30)

Donde, 𝑓𝑡 es la fracción del compuesto liberado en tiempo 𝑡, 𝑓𝑡𝑚𝑎𝑥 es la fracción

máxima liberada del compuesto durante el proceso, 𝑓𝐵 es la fracción del compuesto
liberado durante la primera etapa o “efecto estallido”, 𝑘1 es la constante cinética de
primer orden (1era etapa de liberación) en unidades t-1, 𝑘2 es la constante cinética de
la segunda etapa del proceso de liberación o degradación de la matriz y 𝑡2𝑚𝑎𝑥 es el
tiempo máximo del ratio de liberación del compuesto.
El modelo de Gallagher-Corrigan representa una expresión semi-empírica que
describe dos etapas en el proceso de liberación, y es desarrollada considerando que
la liberación del compuesto no está limitada químicamente por su interacción con la
matriz polimérica (Balcerzac y Mucha, 2009).

2.7 Alimentos funcionales.

Las nuevas tendencias tecnológicas se han enfocado en la producción de

alimentos funcionales mediante la incorporación de los mismos de compuestos
activos tales como vitaminas, aminoácidos, minerales, antioxidantes e incluso
células, enzimas y microorganismos probióticos beneficiosos para la salud, y por
tanto, de su conservación en los alimentos durante el procesamiento y almacenaje
(Parra-Huertas, 2010). Este apartado hace una breve reseña de las últimas
tendencias en el desarrollo de alimentos funcionales, así como del uso de
compuestos bioactivos tales como los polifenoles, debido a sus múltiples beneficios
y gran sensibilidad a ser degradados por lo que requieren protección para su
aprovechamiento. Finalmente, se destacan las características del extracto natural de
Cacao (Theobroma cacao L.) como fuente rica en polifenoles y que es empleada en
este estudio de encapsulación con alginato para aplicaciones alimentarias.

72
 INTRODUCCIÓN

2.7.1 Tendencias en el desarrollo de alimentos funcionales.

En las últimas décadas, las demandas del consumidor en el ámbito de la

producción de alimentos han cambiado considerablemente. La creencia de que los
alimentos contribuyen directamente a su salud, no sólo por proporcionar los
nutrientes necesarios sino incluso para prevenir enfermedades es cada vez más
frecuente. Según la Organización para la Agricultura y la Alimentación de las
Naciones Unidas (FAO), y la Organización Mundial de la Salud (OMS/WHO), varios
patrones de la dieta, junto con los hábitos de vida, constituyen los principales
factores de riesgo en relación con el desarrollo de enfermedades del corazón,
cáncer, diabetes, obesidad, osteoporosis y de tipo periodontal (WHO, 2003). En este
sentido, los alimentos funcionales juegan un papel importante siendo por ello de
gran interés (Figura 2.16). El éxito de los productos funcionales depende no sólo del
desarrollo del producto sino de la aceptación del consumidor, y por tanto se deben
tener en cuenta factores como: sabor, apariencia, propiedades químicas, estabilidad,
propiedad funcional saludable y precio. Por tanto, la industria de los alimentos debe
considerar diferentes variables para su desarrollo o rediseño (Betoret, et al., 2011).
Las tecnologías tradicionales más empleadas para el procesamiento de
alimentos funcionales, han sido: la formulación y mezcla, muy usadas debido a su
simplicidad y economía, con la incorporación de compuestos bioactivos para cubrir
deficiencias de vitaminas, minerales, entre otros. Por otra parte, la técnica de cultivo
y cría de animales, como principal fuente de nutrientes para la vida humana.
Seguidamente, se han desarrollado tecnologías específicas para el desarrollo de
alimentos funcionales que previenen el deterioro de compuestos fisiológicamente
activos, tales como:

- Microencapsulación: el desarrollo de una cápsula que permita controlar las

interacciones de los compuestos con el medio ambiente, ha facilitado la protección
de una amplia gama de materiales de interés biológico. Debido a su versatilidad,
esta tecnología está siendo estudiada por diferentes campos como la biomedicina,
biofarmacia y recientemente por la industria alimentaria para el suministro de
productos nutracéuticos.
- Películas y recubrimientos comestibles: se refiere a los revestimientos o
envolturas que poseen diferentes alimentos con la finalidad de alargar su vida útil.

73
 INTRODUCCIÓN

- Impregnación al vacío: se emplea para introducir solutos en la estructura

porosa de los alimentos, lo que modifica su composición sin alterar la integridad del
mismo (productos hortofrutícolas).
El desarrollo de los alimentos funcionales representa una oportunidad para
obtener nuevos productos, innovadores y versátiles que permitan satisfacer la
demanda actual de los consumidores. Aunque las tecnologías más usadas siguen
siendo las tradicionales (Figura 2.16). Del año 2000 al 2010 se ha observado una
creciente tendencia a las investigaciones y aplicación de tecnologías especiales
dirigidas a cubrir necesidades específicas de nutrición y para la prevención de
enfermedades que permitan mejorar la calidad de vida (Betoret et al., 2011).

Figura 2.16 Tendencia de los artículos relacionados con alimentos funcionales en el tiempo (Betoret
et al., 2011).

2.7.2 Compuestos bioactivos: Polifenoles.

Este apartado, describe de forma general las características fisicoquímicas y

estructurales, la biodisponibilidad y beneficios de los polifenoles para la salud
humana. Además, se analiza de forma específica el extracto de Cacao como fuente
de polifenoles, debido a su uso como compuesto activo a encapsular en alginato en
este trabajo.

74
 INTRODUCCIÓN

2.7.2.1 Características fisicoquímicas y estructurales de los polifenoles.

Los polifenoles son metabolitos secundarios de las plantas, y por lo general

desempeñan diversas funciones de protección frente al ataque de agentes
patógeno, así como para la defensa contra la radiación ultravioleta. En los alimentos,
los polifenoles pueden contribuir a la amargura, la astringencia, color, sabor, olor y
estabilidad oxidativa. Se han identificado más de 8.000 compuestos polifenólicos en
diferentes variedades de plantas. Todos los compuestos fenólicos vegetales surgen
a partir de un intermediario bioquímico común, la fenilalanina, u otro precursor como
el ácido siquímico. Poseen estructura de anillos aromáticos y enlaces conjugados a
partir de los cuales ejercen su acción antioxidante. Los polifenoles se pueden
clasificar en diferentes grupos en función del número de anillos de fenol que
contienen, y sobre la base de sus elementos estructurales. Las principales clases de
polifenoles son los ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos y lignanos (Bhooshan y
Rizvi, 2009).

- Ácido Fenólicos: se dividen en ácidos hidroxibenzoicos y ácidos

hidroxicinámicos. Éstos representan alrededor de un tercio de los compuestos
polifenólicos en nuestra dieta, y se encuentran en material vegetal, particularmente
en las frutas ácidas, entre los más comunes, el ácido cafeico, gálico y ferúlico.
- Flavonoides: son los polifenoles más abundantes en la dieta, se han
identificado más de 4000 variedades de estos, la mayoría responsables de los
colores atractivos de las flores, frutas y hojas. Su estructura base puede sufrir
muchas modificaciones y adiciones de grupos funcionales, por lo que son una gran
familia de diversos compuestos pero siempre manteniendo las características
polifenólicas y solubles en agua. Existen seis clases principales: las chalconas,
flavonas, flavanoles, flavandioles, antocianinas y taninos condensados. Otros
derivados son los isoflavonoides y neoflavonoides. Las diferencias individuales
dentro de cada grupo surgen del número y disposición de los grupos hidroxilos, así
como del grado de alquilación. Algunos de los más comunes son: la quercetina,
miricetina y catequina. La catequina debido a su estructura posee en su molécula
dos centros de quiralidad, por tanto tiene cuatro diasteroisómeros, dos son isómeros
de configuración trans y se denominan catequina, y los otros dos son de
configuración cis conocidos como epicatequina (Figura 2.17).

75
 INTRODUCCIÓN

Figura 2.17 Estructura química de la sub-clase de los flavonoides (Bhooshan y Rizvi, 2009).

- Estilbenos: son hidrocarburos aromáticos que contienen dos restos fenilos

conectados por un puente de carbono metileno, la mayoría de estos actúan en las
plantas como fitoalexinas, es decir, como compuestos antimicrobianos que se
acumulan y sintetizan sólo en respuesta a una infección o lesión (Ej: el resveratrol).
- Lignanos: son compuestos difenólicos que se forma por la dimerización de
dos residuos de ácido cinámico. Son uno de los dos grupos principales de
fitoestrógenos, que son antioxidantes. La otra clase de fitoestrógenos son las
isoflavonas.

2.7.2.1.a Extracto de Cacao rico en polifenoles.

La semilla del Cacao, Theobroma cacao L. (Sterculiaceae), almacena sus

polifenoles en las células pigmentarias en los cotiledones. Dependiendo de la
cantidad de antocianinas, son de color blanco o purpura. La composición de
polifenoles consta de tres grupos: los flavanoles o flavan-3-oles (37%), antocianinas
(4%) y proantocianidinas (58%). Respecto a la distribución específica de
compuestos en dichos grupos, se tiene: por encima del 35% (-) epicatequina y en
menores cantidades la (+) catequina con solo trazas de (+) galocatequina y (+)
epigalocatequina. La fracción de antocianinas está dominada por cianidina-3-α-L-
arabinósido y cianidina-3-β-D-galactósido. Y las proantocianidinas son en su

76
 INTRODUCCIÓN

mayoría flavan-3,4 dioles unidos formando dímeros, trímeros u oligómeros con la (-)
epicatequina (Wollgast y Anklan, 2000).
Las propiedades antioxidantes del cacao se han estudiado ampliamente en los
últimos años. Se ha reportado que el consumo de cacao, debido a su contenido de
flavanoles, mejora la función endotelial y reduce procesos inflamatorios, efectos que
han sido directamente vinculados a la presencia de metabolitos en plasma derivados
de las procianidinas. Además, diversos estudios han evidenciado que la
biodisponibilidad de los polifenoles del cacao está fuertemente relacionada con el
tamaño molecular, al encontrarse una mayor concentración de compuestos
polifenólicos de bajo peso molecular en sangre, que por tanto tienen una mejor
oportunidad de llegar a los órganos en el cuerpo (Schinella et al., 2010).
En general, existe un consenso de que la actividad antioxidante de los
flavonoides resulta de una combinación de sus propiedades quelantes de hierro y
secuestradoras de radicales libres. Otros autores se refieren a la inhibición de
oxidasas, como la lipoxigenasa, ciclooxigenasa, mieloperoxidasa, oxidasa y la
xantina oxidasa, evitando las reacciones de oxidación, así como de hidroperóxidos
orgánicos. Por otra parte, se ha podido conocer que también inhiben enzimas
involucradas indirectamente en los procesos oxidativos, como la fosfolipasa, al
mismo tiempo que estimulan otras con reconocidas propiedades antioxidantes, tales
como la catalasa y la superóxido dismutasa. De esta forma, los flavonoides
interfieren en las reacciones de propagación de los radicales libres y en la formación
de los radicales en sí. (Morales et al., 2012).

2.7.2.2 Biodisponibilidad y beneficios de los polifenoles para la salud

humana.

La biodisponibilidad es la proporción del alimento que se digiere, absorbe y

metaboliza a través de las vías digestivas. La biodisponibilidad de cada polifenol es
diferente, tampoco existe una relación entre la cantidad de polifenoles en los
alimentos y su biodisponibilidad en el cuerpo humano. Generalmente, las agliconas
pueden ser absorbidas por el intestino delgado, sin embargo la mayoría de los que
polifenoles están presentes en los alimentos, se encuentran en forma de ésteres,
glucósidos o polímeros que no pueden ser absorbidos en su forma nativa. Antes de
su absorción, estos compuestos deben ser hidrolizados por enzimas intestinales o la

77
 INTRODUCCIÓN

microflora del colon. Durante este proceso, los polifenoles son modificados, de
hecho se conjugan en las células intestinales y más tarde en el hígado. En los
alimentos, todos los flavonoides excepto los flavanoles se encuentran en la forma
glucosilada. El destino de los glucósidos en el estómago no está claro aún. La
mayoría de los glucósidos, probablemente resisten la hidrólisis ácida en el
estómago, y por tanto llegan intactos al intestino donde sólo las agliconas y algunos
glucósidos pueden ser absorbidos (Bhooshan y Rizvi, 2009).
En relación a los beneficios, numerosos estudios han demostrado que el
consumo de polifenoles ha limitado la incidencia de enfermedades coronarias del
corazón, como la arteriosclerosis. Entre los polifenoles más destacados por producir
dicha acción inhibidora se tienen la quercetina y catequinas. También, se han
observado efectos antitrombóticos por medio de la inhibición de la agregación
plaquetaria, asociada al consumo diario de té negro y vino tinto, por la presencia de
resveratrol que inhibe la enzima (ciclooxigenasa) causante de la síntesis del
tromboxano y responsable de las trombosis. Por otra parte, se ha encontrado que
muchos polifenoles como la quercetina, catequinas, isoflavonas, lignanos,
flavanonas, resveratrol y ácido elágico poseen propiedades anticancerígenas,
especialmente como protectores y reductores de tumores o de su crecimiento.
Asimismo, se ha demostrado un efecto antidiabético al inhibir la absorción de la
glucosa en el intestino, en estudios específicos con (+) catequina, (-) epicatequina,
(-) epicatequingalato e isoflavonas. Otros estudios presentan beneficios en
enfermedades neurológicas como el Alzheimer y el Parkinson, causadas por el
estrés oxidativo (Bhooshan y Rizvi, 2009).

2.7.2.3 Uso de antioxidantes naturales en alimentos.

Las oxidaciones lipídicas ocurren en presencia de oxígeno (aire), luz o

metales, por ello se añaden a los alimentos agentes inhibidores que retarden este
proceso o lo eviten completamente. Frecuentemente se emplean productos químicos
sintéticos debido a su fácil acceso, economía, gran calidad y capacidad antioxidante.
Aunque la legislación aprueba su uso como aditivos alimentarios para alargar la vida
útil de los productos se requieren pruebas más complejas que garanticen su
completa seguridad. En este sentido, la tendencia en las últimas décadas, ha sido
incorporar compuestos de origen natural con miras a sustituir los antioxidantes

78
 INTRODUCCIÓN

sintéticos por compuestos más seguros con la misma función protectora. Entre
algunas fuentes naturales de compuestos inhibidores de la oxidación, se tienen:
aceites y semillas oleaginosas (tocoferoles, fosfolípidos); el salvado de avena y arroz
(compuestos derivados de la lignina); especias, hierbas, té y cacao (compuestos
polifenólicos) y proteínas e hidrolizados (aminoácidos) (Pocorný, 1991).
En los últimos años, ha habido un interés creciente por el desarrollo de
envases activos que mejoren la seguridad alimentaria y su vida útil. Principalmente,
se han desarrollado embalajes con compuestos activos alimentarios que permitan la
eliminación del oxígeno, la humedad por absorción, el dióxido de carbono o la
generación de etanol, con la incorporación en algunos casos de un sistema de
protección microbiano (antioxidantes y agentes antimicrobianos), considerando
materiales biodegradables y compuestos naturales (Wang et al., 2013).
Por otra parte, se ha investigado ampliamente la actividad antimicrobiana de
los polifenoles, entre los que han recibido mayor atención, se tienen los flavan-3-
oles, flavonoles y taninos. Respecto a los flavan-3-oles, se conoce la actividad
antibacteriana de las catequinas, cuando se demostró que estos compuestos, en
gran parte presentes en el té oolong y verde (Camellia sinensis), fueron capaces de
inhibir el crecimiento in vitro de varias especies bacterianas, tales como Vibrio
cholerae, Streptococcus mutans, Campilobacter jejuni, Clostridium perfringes, y
Escherichia coli. En lo que se refiere a los flavonoles, se ha demostrado una notable
actividad contra varias bacterias Gram-positivas, tales como Staphylococcus aureus,
Lactobacillus acidophilus y Actinomyces naeslundii (Daglia, 2012).
En este sentido, los polifenoles obtenidos de fuentes naturales prometen ser
aditivos alimentarios altamente beneficiosos para la industria alimentaria que pueden
sustituir a los sintéticos existentes.

2.8 Análisis Sensorial.

Este apartado describe aspectos generales del análisis sensorial como

técnica de evaluación de la percepción de las características organolépticas de los
alimentos (color, sabor, olor, textura) cuando el analizador es el ser humano. Las
posibles pruebas empleadas de tipo analíticas o afectivas, que permiten evaluar
sensorialmente factores muy específicos de un alimento con la finalidad de conocer
su aceptación o rechazo, preferencia o nivel de agrado en caso de introducir un

79
 INTRODUCCIÓN

nuevo producto o que haya sido modificado respecto a su formulación original. Por
otra parte, se describe la técnica de análisis del perfil de textura con la finalidad de
obtener características mecánicas como: dureza, elasticidad, gomosidad,
cohesividad y masticabilidad, propias de la aplicación de un esfuerzo sobre el
alimento que simula el proceso de masticación. El presente estudio evalúa la
aplicación de los encapsulados con el extracto de cacao en un alimento. En este
sentido, es importante determinar la aceptación o rechazo del alimento funcional por
el consumidor, así como cuantificar las propiedades texturales del producto a objeto
de evaluar su variación en el tiempo durante el almacenamiento, lo que sería
indicativo de una cierta degradación.

2.8.1 Aspectos generales.

La calidad sensorial de un alimento, no es una característica propia de este,

sino el resultado de la interacción alimento-hombre, por tanto podría decirse que es
una sensación humana provocada por sus sentidos (gusto, olfato y vista)
produciendo diferentes sensaciones: color, forma, tamaño, aroma, textura y sabor.
Bajo estas consideraciones, es importante la planificación correcta del análisis
sensorial incluyendo aspectos de tipo: ambiental, práctico (relacionado con las
muestras), informativos y humanos. En tal sentido, los aspectos ambientales se
relacionan directamente con factores externos que pueden influir sobre el evaluador,
por tanto, se requiere un entorno cómodo y confortable tanto para la preparación de
las muestras como para su evaluación. Mientras que, los aspectos prácticos se
relacionan con la muestra que se evalúa, y se refieren a su uniformidad,
presentación, efecto contraste (posición en que se asigna cada muestra), efecto de
convergencia (cuando se evalúan más de dos al mismo tiempo), preparación de las
muestras, temperatura de las muestras, codificación, tamaño y cantidad suficiente
para que se pueda realizar la evaluación, y empleo de utensilios inertes que no
aporten ni sabor ni olor al producto. Los aspectos informativos consisten en
suministrar toda la información al evaluador sobre tiempo para el análisis, posibilidad
o no de probar la muestra varias veces, horario y fecha del análisis, uso de agente
enjuagante para eliminar sabor residual entre muestras (agua, galletas neutras,
pan), diluyente o vehículo en caso de alimentos que no se consumen solos (Ej.
mayonesa), resaltar el periodo de degustación entre una muestra y otra (15-30

80
 INTRODUCCIÓN

segundos) e informaciones adicionales necesarias para evitar interferencias. Y

finalmente, considerar que los participantes son seres humanos (aspectos humanos)
sensibles tanto desde el punto de vista psicológico como el fisiológico, por tanto
deben ser preparados a fin de que emitan juicios exactos y confiables. Se distinguen
dos tipos de jueces: los analíticos y los afectivos. Los tipo analíticos se caracterizan
por presentar una sensibilidad sensorial específica para uno o varios productos
tomando en cuenta aspectos como la edad, sexo, carácter y responsabilidad,
afinidad por la muestra y disponibilidad. Por el contrario, los tipo afectivo son
individuos escogidos al azar (no entrenados) y representativos de la población a la
cual se estima que está dirigido el producto. La finalidad de aplicar una prueba
sensorial con este tipo de evaluador es conocer la aceptación, preferencia o nivel de
agrado de un producto (Espinosa-Manfugás, 2007).

2.8.2 Métodos de Evaluación Sensorial.

Cualquiera que sea la prueba que se vaya a emplear, es necesario que los
participantes comprendan la necesidad de efectuar la misma de la manera lo más
objetiva posible, que demuestren su capacidad de seguir instrucciones y una
ejecución correcta. Las pruebas que pueden ser utilizadas, se dividen en: pruebas
afectivas, pruebas discriminativas y descriptivas (Lawless y Hildegarde, 2010).

2.8.2.1 Pruebas Afectivas.

Se realizan con individuos o jueces no entrenados, se requieren un mínimo de

100 jueces escogidos de manera aleatoria con la finalidad de simular consumidores
habituales o potenciales del producto que se evalúa. Los resultados permiten
evaluar la aceptación o rechazo, preferencia o nivel de agrado de uno o más
productos, por medio de un cuestionario simple, claro y conciso para evitar fatiga y
confusión en los jueces. Los tipos de pruebas se clasifican en pruebas de
preferencia, pruebas de aceptación y pruebas escalares.

2.8.2.2 Pruebas Discriminativas.

Se realizan en condiciones controladas con individuos o jueces entrenados.

Son las pruebas sensoriales más sencillas y utilizadas con gran utilidad práctica, se

81
 INTRODUCCIÓN

limitan simplemente a responder si existe alguna diferencia perceptible entre dos

productos. Su análisis se fundamenta en frecuencia y proporciones estadísticas
(respuestas correctas o incorrectas), por lo que sus resultados permiten inferir si un
grupo de personas ha sido capaz de identificar un producto correctamente de una
serie de similares o tipo control. Las pruebas más comunes son: comparación
apareada simple, dúo-trío, triangular, ordenamiento y comparación múltiple. A
continuación se describen los métodos más usados y se muestran ejemplos en la
Figura 2.18:

- Apareada simple: permite evaluar simultáneamente dos muestras con el

objeto de determinar si existe diferencia perceptible entre ellas. Es una prueba fácil
de realizar y el agotamiento del juez es relativamente bajo. Se requieren entre 100 a
200 jueces y se emplea la tabla de significancia para pruebas de dos muestras; de
acuerdo al nivel de significancia y número de jueces participantes se verifica el
número mínimo de respuestas correctas para que haya diferencia significativa entre
muestras.
- Dúo-Trío: se muestra al juez una muestra control o referencia y dos muestras
codificadas, de las cuales una es igual a la muestra control. El par debe estar
dispuesto aleatoriamente, de forma que el juez identifique cuál es igual a la
referencia. Aunque la prueba es sencilla, requiere un esfuerzo mayor por parte del
evaluador y mayor tiempo de preparación respecto a la tipo pareada. En esta
prueba, la posibilidad de responder correctamente por efectos del azar es del 50%,
por tanto si el valor de respuestas correctas excede este porcentaje, se puede
afirmar que se ha identificado la muestra control. Requiere de 30 a 100 jueces, se
debe fijar desde el inicio con qué nivel de confianza se desea trabajar para hacer
uso de las tablas estadísticas.
- Prueba Triangular: consiste en presentar tres muestras simultáneamente,
dos de ellas iguales y una diferente; el juez tiene que identificar la muestra diferente.
Al igual que las pruebas anteriores, se requiere aleatoriedad en la presentación de
las muestras debiéndose ofrecer si es necesario las seis combinaciones posibles, en
las cuales las posiciones de las muestras son diferentes. Requiere entre 15 a 30
jueces y tiene la ventaja de que la probabilidad de respuestas por efectos del azar se
reduce con respecto a los dos tipos anteriores, pasando a ser del 33%, por esto en

82
 INTRODUCCIÓN

la práctica es de mayor utilidad. Igualmente, se debe seleccionar un nivel de

significancia para determinar el número mínimo de respuestas correctas.

Figura 2.18 Ejemplo de pruebas discriminatorias (Lawless y Hildegarde, 2010).

2.8.2.3 Pruebas Descriptivas.

Las pruebas descriptivas en general son más complejas ya que son los jueces
quienes establecen los descriptores que definen las diferentes características o
atributos sensoriales de un producto, y a través de ellos cuantifican las diferencias
existentes entre varios productos. Requieren un menor número de jueces
entrenados, entre 5 y 10, y un procesamiento más laborioso de los resultados. Los
componentes del análisis descriptivo se basan en la intensidad de un estímulo,
orden de aparición, la identificación de la característica y la impresión general del
producto. Para llevar a cabo las pruebas se requieren escalas que permitan su
medición tales como: escalas de categoría, escalas de líneas y escalas de
estimación de magnitud. Entre los tipos de pruebas, se tienen: el perfil de sabor,
perfil de textura, cuantitativo, tiempo y libre (Espinosa-Manfugás, 2007).

2.8.3 Análisis de Perfil de Textura (TPA).

Considerando que la textura es principalmente un atributo sensorial, su

estudio tradicionalmente se ha fundamentado en la percepción general desde el

83
 INTRODUCCIÓN

punto de vista sensorial de un grupo de personas. Sin embargo, al referirse a un

análisis de perfil de textura se hace referencia un método de tipo instrumental para
su cuantificación. Según Bourne y Szczesniak (2003), el análisis de perfil de textura
(TPA) implica la compresión de un bocado de alimento dos o más veces mediante
un movimiento alternativo que simula la acción de la mandíbula. La curva de fuerza-
tiempo resultante se utiliza entonces para cuantificar un número de parámetros de
textura que se correlacionan bien con los resultados de la evaluación sensorial
(Otegbayo et al., 2007).

2.8.3.1 Aspectos generales del TPA.

La medición de la textura sensorial se percibe principalmente por el tacto (lo

táctil sentido), aunque los ojos y los oídos pueden proporcionar información sobre
algunos importantes componentes de perfil de textura total de un producto.
Tradicionalmente, se han empleado para la evaluación de la textura métodos
sensoriales que puede parecer que carecen de precisión en las investigaciones
científicas debido a la variabilidad en la percepción de persona a persona, gustos o
disgustos, efecto de la hora y día en que se realizan, entre otros. Sin embargo, su
gran importancia en la determinación de la calidad de alimentos existentes,
modificados o nuevos productos ha conducido al desarrollo de nuevos métodos de
análisis de tipo instrumental que se correlacionen con los tradicionales (Bourne,
2002).
En este sentido, los fundamentos del análisis moderno de la textura sensorial
se han construido gracias a las propuestas hechas por Szczesniak (1963) en la
“General Foods Corporation” actual Kraft Foods, a través del denominado método de
“Análisis de Perfil de Textura”, que mide el parámetro “textura” objetivamente a
través de la imitación del proceso de masticación. El TPA propuesto por Szczesniak,
viene descrito por una unidad compuesta de una placa de apoyo, un brazo flexible
unido a un calibrador de tensión y un émbolo que actúa sobre la muestra, por lo
general una pieza equivalente al tamaño de un trozo común para morder, el cual
comprime dos veces mediante un movimiento de vaivén que imita la acción de la
mandíbula. El medidor de tensión detecta la fuerza generada, que es grabada en un
registrador de banda. La curva obtenida se representa por un gráfico de fuerza como
función del tiempo. Su interpretación se basa en la clasificación de los parámetros

84
 INTRODUCCIÓN

mecánicos de la textura. La curva proporciona siete parámetros texturales, cinco

medidos y dos calculados a partir de los medidos. Estos parámetros corresponden a:
dureza, cohesividad, elasticidad, adherencia, fragilidad, masticabilidad, gomosidad y
la viscosidad (Pons y Fiszman, 1996). En la Figura 2.19, se tiene una curva típica
de perfil de textura, donde se señalan los factores de medición que permiten definir
los parámetros texturales.

Figura 2.19 Típica curva de un análisis de perfil de textura instrumental. Obtenida de

“www.texturetechnologies.com, http://128.121.92.221/texture_profile_analysis.html”.

Donde, Distancia 1 representa el tiempo de recorrido de la primera compresión,

Distancia 2 es el tiempo de recorrido de la segunda compresión, A 1 y A2 son las
áreas bajo las curvas para la primera y segunda compresión respectivamente.
Dureza, es la fuerza máxima de la primera compresión (N), Fracturabilidad, es el
punto de inflexión que se puede presentar en la primera compresión y A 3
corresponde a la adhesividad.
Las definiciones de los parámetros texturales, vienen dadas a continuación
(Pons y Fiszman, 1996):

- Dureza: es la fuerza máxima de la primera compresión (primer bocado),

representado por el pico del primer ciclo de compresión.
- Elasticidad: se calcula mediante la relación de la distancia dada por la
segunda compresión respecto a la distancia de la primera compresión (Distancia
2/Distancia 1). También conocido como índice de elasticidad, al representar la
recuperación de la muestra durante el tiempo que transcurre entre el final de la

85
 INTRODUCCIÓN

primera mordedura y el inicio de la segunda. Un alto índice de elasticidad representa

una textura gomosa mientras que un bajo índice hace referencia a un producto
quebradizo.
- Cohesividad: se calcula como un ratio entre el área de la segunda
compresión respecto al área de la primera compresión (Área 2/Área1). Se define
como una relación de trabajo dada por los dos ciclos de compresión, y sirve como
indicador de la viscoelasticidad de la muestra. Un valor próximo a 1 indica total
elasticidad, mientras un valor próximo a cero indica que la muestra no se recupera
en absoluto. Esto puede ser relacionado con la fuerza de los enlaces internos que
componen el cuerpo de la muestra.
- Gomosidad: es el producto de la dureza por la cohesividad expresada en
unidades de fuerza (N), y simula la energía requerida para desintegrar un alimento
semi-sólido con objeto de ser deglutido. En una evaluación sensorial tradicional, se
evalúa por la cantidad de movimiento necesario antes de que el alimento se
desintegre.
- Masticabilidad: es el producto de la gomosidad por la elasticidad expresada
en unidades de fuerza (N) y sólo es aplicable a productos sólidos. Se relaciona con
la energía requerida para masticar un producto hasta un estado adecuado para la
deglución, e íntimamente vinculado a los parámetros primarios de dureza,
cohesividad y elasticidad.
- Adhesividad: dada por el área de fuerza negativa al final del primer ciclo de
compresión, que representa el trabajo necesario para tirar del émbolo cierta
distancia de la muestra. Es decir, el trabajo necesario para superar las fuerzas de
atracción entre la superficie de la muestra y la superficie de otros materiales con los
que el alimento entra en contacto, por lo que la adherencia se relaciona con las
propiedades superficiales.
- Fracturabilidad: originalmente conocido con el término fragilidad, se define
como la fuerza dada por la primera ruptura significativa en la curva y del material. La
existencia de una ruptura es un fenómeno visible relacionado con la macroestructura
de la muestra y debe ser identificado como un cambio en la inflexión de la curva.

2.8.3.2 Consideraciones para realizar un TPA.

86
 INTRODUCCIÓN

Las condiciones de trabajo reportadas por diversas investigaciones son

diferentes, haciendo que los resultados sean imposibles de comparar. Estas
diferencias vienen dadas por las condiciones experimentales tales como: forma y
tamaño de la muestra, relación de compresión y tamaño de la sonda empleada
frente a la muestra, grado de deformación, velocidad, número de ciclos de
compresión y repeticiones por valores medios. Por ello es importante definir estos
aspectos a fin de tomar consideraciones al momento de diseñar un estudio mediante
el uso de TPA (Pons y Fiszman, 1996).
- Forma y tamaño de la muestra: en general es recomendable disponer la
muestra en moldes de diámetro y altura estándar, o la reducción de la muestra
mediante cortes específicos que proporcionen tamaños estándar como cubos o
cilindros.
- Tamaño de la sonda empleada frente a la muestra: la relación entre el
tamaño de la muestra y el tamaño de la unidad de compresión o sonda ciertamente
determina las magnitudes de los resultados. Así, cuando la sonda es más grande
que la muestra, las fuerzas registradas son en gran parte debido a la compresión
uniaxial. En caso contrario, las fuerzas se derivan en gran parte de la punción, una
combinación de compresión y cizalla.
- Grado de deformación: su elección dependerá de la finalidad de la prueba.
Si se trata de imitar el proceso de masticación altamente destructivo en la boca, los
valores de deformación para romper la muestra deben alcanzar entre 70-80%. Sin
embargo, en trabajos recientes se han aplicado niveles de deformación entre el 20-
30%, en cuyo caso las muestras no se rompen pero es posible obtener información
valiosa sobre los parámetros más importantes (dureza, elasticidad, cohesividad y
sus derivados).
- Velocidad: las velocidades de compresión más utilizadas están
comprendidas entre 10 y 250 mm/min, y dependen de los límites del instrumento
empleado. Sin embargo, muchos estudios han demostrado que el aumento de la
velocidad también incrementa la fuerza requerida para lograr una compresión. De
hecho, estos estudios han establecido que el aumento de la velocidad de
compresión conduce a un aumento en la dureza, al observar el comportamiento de
la dureza como función de la velocidad de compresión entre 0,02 mm/s hasta 100
mm/s, mostrando una relación logarítmica entre ellos (Rosentahl, 2010).

87
 INTRODUCCIÓN

- Número de ciclos de compresión: teniendo en cuenta las características de

los equipos utilizados, en algunos casos puede programarse un tiempo entre ciclos
de compresión. En caso de que un periodo de tiempo pueda ser seleccionado, debe
especificarse en las condiciones de prueba, ya que la cantidad de tiempo entre
ciclos se relaciona claramente con los parámetros dados por un TPA.
- Efecto de la lubricación: el efecto de fricción entre las placas y la superficie
de la muestra puede contribuir a un valor de dureza mucho mayor al esperado. Para
obtener información real sobre las propiedades mecánicas de los alimentos, los
resultados deben ser reproducibles, y los parámetros que describen los materiales
deben ser independientes de las condiciones de la prueba o dimensiones de la
muestra. Lo que significa que las curvas de fuerza-tiempo dependen tanto de la
geometría de la muestra, como del área de contacto entre la muestra y las placas.
Por tanto, es conveniente para evitar este tipo de efectos de fricción, la realización
de experimentos preliminares utilizando aceite mineral o vegetal entre la muestra y
las placas a objeto de detectar si los resultados obtenidos pueden ser influenciados
por este factor o no.

2.8.4 Ensayo de Resistencia.

Es un ensayo técnico para determinar la resistencia de un material o su

deformación ante un esfuerzo de compresión. En este sentido, todo material
sometido a un esfuerzo experimenta una deformación, el cual desaparece cuando
también lo hace la fuerza que lo originó. Este comportamiento se cumple mientras la
fuerza de compresión no supere un determinado valor denominado resistencia o
límite de cedencia, y se admite que, por debajo de este valor, el único mecanismo
por el que se produce la deformación es la variación en la distancia de enlace entre
átomos, iones o moléculas, conservando en todos los casos las mismas posiciones
de equilibrio, este comportamiento es definido como deformación elástica. Mientras
que, se define deformación plástica a la deformación permanente que existe
después de retirar la fuerza que lo originó (Núñez et al., 2012).
La textura puede considerarse como un manifiesto de las propiedades
mecánicas de un alimento y, por tanto, un atributo importante de calidad que influye
en la preferencia del consumidor, procesamiento y manipulación de alimentos, y que
por ello puede tomarse como un índice de deterioro. Es por todo esto que existe

88
 INTRODUCCIÓN

interés por tratar de medir la textura a través de métodos cuantitativos. El ensayo de

resistencia es una prueba fundamental que ha sido aplicada en la industria
alimentaria con la finalidad de medir la firmeza o consistencia de un producto a
través del comportamiento de éste cuando la muestra es comprimida por una sonda
u otro dispositivo hasta alcanzar el límite de cedencia o comúnmente conocida como
fuerza o límite de fluencia. En este sentido, constituye también un método de
medición de la textura, ya que puede relacionarse en la práctica con la percepción
de textura del alimento entre los dedos o con una cuchara, siendo ésta una prueba
de impresión no destructiva. Asimismo ocurre cuando un alimento es llevado a la
boca y se obtiene una sensación (impresión no destructiva), seguidamente es
separada por la lengua contra el paladar causando su rompimiento (impresión
destructiva) (Peng y Regenstein, 2007).
A partir del ensayo de resistencia, se pueden obtener cinco tipos de curvas
fuerza-distancia, tal como se muestra en la Figura 2.20.

Figura 2.20 Representación de cinco tipos de curvas de fuerza-distancia. LC: límite de cedencia.
Tipos básicos de tendencias con: aumento continuo de la fuerza, A; fuerza casi constante, B;
disminución de la fuerza, C; cambio gradual de la pendiente donde LC no está claramente definido e
inexistencia del LC, E (Peng y Regenstein, 2007).

En los tipos A, B, y C ocurre un rápido aumento inicial de la fuerza para una

corta distancia de movimiento. Durante esta etapa, se lleva a cabo una deformación
del material tipo plástica, es decir, donde no ocurre una deformación permanente de
la estructura, la cual no es de gran importancia en la prueba. Esta etapa termina
abruptamente, cuando la sonda causa un aplastamiento irreversible de la muestra,
89
 INTRODUCCIÓN

evento representado en la curva por el repentino cambio en la pendiente. Este

cambio representa la mencionada fuerza máxima o límite de cedencia, siendo el
punto de mayor interés en la prueba. Se puede observar que las curvas después del
límite de cedencia pueden presentar tres tipos básicos de tendencia: A, un aumento
continuo de la fuerza. B, una fuerza casi constante y C, una disminución de la
fuerza. En la curva D el LC no está claramente delineado, sino que ocurre un cambio
gradual en la pendiente (comportamiento asociado a algunas pastas de almidón,
coberturas y espumas). Por el contrario, la curva de tipo E, encontrada para algunas
pastas de almidón; no muestra la existencia de un límite de cedencia,
comportándose esencialmente como un líquido viscoso y, por tanto, siendo una
representación no adecuada para éste tipo de ensayo.

90
HOJA PRESENTACIÓN MATERIALES Y MÉTODOS

3. MATERIALES Y MÉTODOS

91
HOJA PRESENTACIÓN MATERIALES Y MÉTODOS

92
 MATERIALES Y MÉTODOS

En este apartado se describen los materiales, equipos, técnicas y

procedimientos experimentales utilizados para la preparación de los diferentes
encapsulados de alginato cálcico.

3.1 Materiales.

A continuación se detallan los materiales utilizados en este trabajo, tanto los

reactivos como equipos.

3.1.1 Reactivos para la caracterización del alginato de sodio.

- Alginato de sodio para la preparación de los geles (Panreac).

- Ácido algínico (Sigma Aldrich).
- Alginato de sodio como patrón de referencia (Solé Graells).
- Agua deuterada 99,9 %D (Euriso-top).
- Azúcar blanca de uso comercial (Azucarera).
- Dextranos (Leuconostoc mesenteroides) grado analítico con distribución
estrecha de peso molecular (Sigma Aldrich).
- Nitrato de sodio (NaNO3) ≥ 99 % (Sigma Aldrich).
- Agua milliQ.

3.1.2 Reactivos para la preparación de los geles de alginato.

- Alginato de sodio (Panreac).

- Sales de calcio, las cuales se muestran en la Tabla 3.1.

Tabla 3.1 Características de las sales de calcio.

Sal Fórmula Peso Molecular Distribuidor

(g/mol)

Carbonato de calcio 98,5-100% CaCO3 100,09 Panreac

Citrato de calcio 99% C12H10Ca3O14.4H2O 570,50 Sigma Aldrich

Hidróxido de calcio 90% Ca(OH)2 74,09 Sigma Aldrich

Cloruro de calcio ≥ 96% CaCl2 110,99 Sigma Aldrich

93
 MATERIALES Y MÉTODOS

- Aceite de girasol refinado (El Corte Inglés distribuido por Aceites del Sur
Coosur, S.A).
- Ácido acético glacial (CH3COOH) 99,5 % (Panreac).
- Hidróxido de sodio (NaOH) ≥ 98 % en forma de lentejas (Sigma Aldrich).
- Ácido clorhídrico concentrado (HCl) 37 % (Panreac).
- Agua milliQ.

3.1.3 Reactivos para las emulsiones.

Las emulsiones preparadas para la obtención de las microesferas de alginato

de calcio, se formaron a partir de una fase acuosa y una fase oleosa. La fase acuosa
constituida por solución de alginato sódico y una solución de carbonato o citrato de
calcio, una fase oleosa conformada por aceite vegetal y tensioactivo. Los
tensioactivos utilizados se muestran en la Tabla 3.2, todos suministrados por Sigma
Aldrich a excepción del Polirricinoleato de Poliglicerol (PGPR) gentilmente
suministrado por Lansenor Emul, S.L..

Tabla 3.2 Características de los tensioactivos.

Familia Nombre Nombre Fórmula HLB

común

Span 80 Monooleato de sorbitán C24H44O6 4,6

Ester de sorbitol Span 85 Trioleato de sorbitán C60H108O8 1,8

Tween 20 Monolaureato de polioxietileno

sorbitán
Ester de sorbitol C58H114O26 16,7
etoxilados
Tween 80 Monooleato de polioxietileno sorbitán C64H124O26 15,0

Esteres de Polirricinoleato de poliglicerol (1,2,3-

grasas de propanotriol, homopolémero-12-
glicerina PGPR hidroxi-9-octadecenoato) H(C18H32O2)nOH 1,5±0,5

3.1.4 Reactivos para la caracterización y cuantificación del principio activo utilizado

en los encapsulados.

- Extracto natural de Cacao (Theobroma cacao L.) en polvo suministrado

gentilmente por la facultad de Farmacia de la Universidad de Barcelona.
- Ácido gálico (3,4,5-Trihidroxibenzóico ácido) 97,5–102,5% (Sigma Aldrich).
94
 MATERIALES Y MÉTODOS

- (+) Catequina hidratada ≥ 96 % (Sigma Aldrich).

- (-) Epicatequina ≥ 90 % (Sigma Aldrich).
- Reactivo del fenol según Folin-Ciocalteu, 2 N (Sigma Aldrich).
- Carbonato de sodio (NaCO3) ≥ 99 % (Sigma Aldrich).
- Agua milliQ.

3.1.5 Reactivos para la preparación de las gelatinas.

- Gelatina neutra en polvo (Kraft Foods Portugal).

- Fructosa tipo Diet Rádisson (Pagesa).
- Colorantes vegetales (Vahiné Food McCormick España S.A.).
- Aroma natural de frambuesa (Scrap Cooking Carambelle).
- Frambuesa natural liofilizada en polvo (Sosa Ingredients, S.L.).
- Aceite de oliva formato spray (Carbonell).
- Tostadas ligeras, Santiveri.
- Agua mineral (Font Vella).

3.1.6 Otros reactivos.

- Triptona de soja agar, Oxoid.

- Sabouraud Dextrosa agar con Cloranfenicol, Oxoid.

3.2 Equipos.

Los equipos utilizados se detallan a continuación:

 Balanza COBOS modelo AX 200, capacidad de 200 g y precisión de 0,1 mg.

 Ultra-Turrax modelo T25 Básico IKA WERKE.
 Homogenizador de Ultrasonido modelo HD2070 Sonoplus Bendelin, con
sonda de titanio de 20 kHz de frecuencia y 21 W de poder.
 Minireactor compacto con agitación mecánica y calefacción modelo HME-
R/100 ml, rango temperaturas entre 30-300 ºC y velocidad de agitación entre
100-700 rpm, Trallero y Schlee.
 Varilla de agitación con palas en forma de áncora de vidrio con diámetro de 6
cm, Trallero y Schlee.
 Agitador modelo RCT Básico IKA de 0-2500 rpm.

95
 MATERIALES Y MÉTODOS

 Baño termostático modelo Tectron 200, Selecta.

 Placa calefactora modelo ETS-DS IKA, 0-310 ºC y 0-1500 rpm.
 Microscopio óptico modelo B600 OPTIKA, con Cámara digital adaptada
modelo Moticam 2300 de 3.0 Mpixel, Software Motic Images Plus 2.0 ML.
 Agitador tipo vórtex modelo REAX top, HEIDOLPH.
 Microscopio electrónico de barrido (SEM), Hitachi TM-1000.
 Microscopio electrónico de barrido (SEM) modelo Quanta 200, FEI Co.
 Mastersizer 2000 APA (Malvern Instruments, MA), analizador de partículas
entre 0,02-2000 µm, unidad de dispersión de líquidos HYDRO 2000SM.
 Medidor de pH/Ion meter-ISE, Prolab 3000, Schott Instruments. Electrodo
selectivo del ión Calcio modelo CA 60 ISE y electrodo de pH Blue line.
 Centrífuga con control electrónico modelo Mixtasel-BL, Selecta.
 Reómetro RS300, HAAKE dotado de un baño termostático modelo F6 y
recipiente HAAKE modelo C25. Sensores placa-placa rugosa de titanio
diámetros de 20 mm y 35 mm.
 Reómetro Modular MARS III, HAKKE. Baño termostático modelo F6 y
recipiente HAAKE modelo C25. Sensores placa-placa rugosa diámetros 20
mm y 35 mm, placa-placa lisa diámetros 35 mm y 60 mm.
 Estufa de vacío serie VD WTB modelo VD-23, Binder.
 Horno J.P. modelo Prebatem, Selecta.
 Refractómetro manual ABBE, Labolan con baño termostático modelo ECO ET
S/G series, Lauda.
 TurbiscanTM Clásico modelo MA2000 marca TURBISOFT.
 Espectrofotómetro modelo Perkin Elmer UV/VIS, Lambda 20.
 Liofilizador modelo LyoQuest-55, Telstar.
 Espectrómetro de resonancia magnética nuclear modelo DMX-500 (500
MHz), Brucker.
 Calibrador digital Pie de rey, Topcraft GT-DC-02.
 Cromatógrafo de ultra resolución (UPLC) Acquity, sistema cromatográfico
Waters Milford, MA. Columna C18 (50x1 mm diámetro interno) BEH y
software Empower Pro 2.
 Cromatógrafo con módulo de separación tipo Waters 2695, Alliance con un
detector de índice de refracción modelo Waters 2414. Columnas de hidrogel

96
 MATERIALES Y MÉTODOS

(7,8x300 mm) de 2000 y 1000 𝐴̇ conectadas en serie, para cromatografía de

exclusión por tamaño.
 Calorímetro diferencial de barrido modelo 822e, Mettler Toledo.
 Difractómetro X´pert PRO MPD, objetivo CuKα con radiación de rayos X de
1,54 𝐴̂, 45 kV y 40 mA.

3.3 Técnicas de análisis y caracterización.

Este apartado describe las técnicas de análisis y caracterización utilizadas a

través de los diferentes métodos de preparación empleados para la realización del
presente trabajo.

3.3.1 Resonancia Magnética Nuclear (RMN).

La resonancia magnética nuclear es un fenómeno físico basado en las

propiedades mecánico-cuánticas de los núcleos atómicos. Para el tratamiento del
espectro se empleó el programa MestreNova v.8.1.2 y, para la determinación de las
fracciones molares el protocolo de cálculo descrito en el método ASTM International
F 2259-03.

3.3.2 Cromatografía de exclusión por tamaño (CET).

La cromatografía de exclusión por tamaños, está basada en la utilización de

fases estacionarias constituidas por una material, principalmente orgánico, muy
poroso y teóricamente inerte que permite la discriminación de los solutos según su
tamaño molecular. En el caso de los polímeros, se utiliza ampliamente debido a su
capacidad para proporcionar buenos resultados respecto a la distribución de sus
masas molares. La técnica consta de una fase estacionaria con pequeñas partículas
poliméricas inertes, altamente entrecruzadas que contiene una red de poros de
diferentes tamaños en los que pueden difundir las moléculas de soluto y disolvente,
y una fase móvil conformada por un buen disolvente con el polímero a caracterizar.

3.3.3 Calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Es una técnica termoanalítica en el que la diferencia de calor entre una

muestra y una referencia es medida como una función de la temperatura. El principio
97
 MATERIALES Y MÉTODOS

básico subyacente a esta técnica es que, cuando la muestra experimenta una

transformación física, se necesitará que fluya más o menos calor a la muestra que a
la referencia para mantener ambas a la misma temperatura. El comportamiento
térmico (termograma) es de gran utilidad para predecir comportamientos esperados
de un material, identificar compuestos, medir la estabilidad, entre otros.

3.3.4 Difracción de rayos X (DRX).

Al radiar un haz de rayos X enfocado a la muestra y con un ángulo específico

de incidencia, estos difractan de diversas formas dependiendo de la estructura
cristalina de la muestra obteniéndose un patrón de difracción. La técnica permite
identificar una sustancia al comparar el patrón de difracción de la muestra con una
base de datos de patrones conocidos, ya que cada patrón de difracción es único.

3.3.5 Refractometría.

La técnica consiste en medir el índice de refracción (IR) de un líquido, con

objeto de determinar su composición si se trata de una disolución o de su pureza si
es un compuesto único. El principio de medición se fundamenta en el cambio de
dirección que sufre el haz de luz al pasar por un medio a otro de distinta densidad,
este cambio de dirección se denomina refracción.

3.3.6 Espectrofotometría UV-VIS.

La técnica se basa en la medición de la cantidad de energía radiante que

absorbe un sistema en función de la longitud de onda de la radiación. De manera
que, permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que
contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una cantidad
conocida de la misma sustancia. La espectrofotometría UV-VIS utiliza haces de
radiación del espectro electromagnético, en el rango UV de 80 a 400 nm y para la
luz visible de 400 a 700 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los
materiales en un amplio espectro.

98
 MATERIALES Y MÉTODOS

3.3.7 Cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC).

La técnica de cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC), es una

avanzada técnica de cromatografía de líquidos, en el cual hay una estrecha columna
con partículas muy pequeñas (1,7 µm) y fases móviles que operan a muy altas
presiones.

3.3.8 Microscopía óptica.

La microscopía es el conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer

visible los objetos de estudio que por su tamaño están fuera del rango de resolución
del ojo normal. La microscopía clásica, consiste en hacer pasar un haz de luz visible
de una fuente a través de los lentes ópticos simples o múltiples para lograr una vista
ampliada de la muestra. La imagen resultante puede ser detectada directamente por
el ojo humano, impresa en una placa fotográfica o mostrada digitalmente.

3.3.9 Microscopía electrónica de barrido (SEM).

La microscopía electrónica de barrido, conocida por sus siglas en inglés,

SEM, Scanning Electron Microscope. Se basa en el principio de la microscopía
óptica en el que un haz de luz se sustituye por un haz de electrones. El equipo
cuenta con un dispositivo que genera un haz de electrones para iluminar la muestra
y con diferentes detectores que recogen los electrones generados de la interacción
con la superficie para crear una imagen que refleja las características superficiales
de la misma. La técnica se caracteriza por tener una elevada resolución que permite
obtener imágenes con apariencia tridimensional. La muestra (salvo que ya sea
conductora) se recubre generalmente por una capa muy fina de oro o carbón, lo que
le otorga propiedades conductoras. La técnica de preparación de las muestras se
denomina “sputtering” o pulverización catódica.

3.3.10 Técnica de dispersión múltiple de luz.

La estabilidad de las emulsiones, se determinó con un equipo denominado

Turbiscan que combina técnicas de dispersión múltiple de luz y analizadores ópticos.
El equipo está constituido por una celda de medida destinada a contener un tubo
cilíndrico de vidrio borosilicado de fondo plano, una fuente luminosa (=850 nm) que

99
 MATERIALES Y MÉTODOS

se desplaza verticalmente realizando un barrido de aproximadamente 65 mm de

altura a lo largo del tubo con un sistema de detección óptica equipado con dos
detectores sincronizados: un detector de luz transmitida situado en el eje de la
fuente (0º) y un detector de retrodifusión (Back Scattering, BS) que mide la luz
dispersada a un ángulo de 135º. La adquisición de datos se realiza a través de un
barrido a una razón de 1 captación/40m que permite obtener valores de transmisión
y BS relativos. A partir de los datos de transmisión y BS en función del tiempo, se
pueden describir los mecanismos de desestabilización de sistemas dispersos.

3.3.11 Difracción de luz láser.

Los equipos de difracción de luz láser se basan en principios ópticos para la

medición del tamaño de partículas. Un haz de láseres (466 nm azul y 630 nm roja)
atraviesa la zona de la muestra, en donde se colocan las partículas en suspensión,
el haz es dispersado en un ángulo dependiente del tamaño de la partícula con la que
interacciona. Cuando una partícula difracta la luz, la misma produce una intensidad
característica a un ángulo de difracción que se relaciona con el diámetro de la
partícula. El espectro de difracción láser de las partículas es asociado a una dada
distribución de tamaños. El instrumento mide el diámetro equivalente de una
partícula con un dado volumen, la distribución que se obtiene, es la cantidad en
volumen de partículas de un dado tamaño, respecto al volumen total de partículas.
La unidad de dispersión de líquidos, consiste en un agitador de hélice con el que se
consigue un flujo constante de partículas a través de la celda por donde pasa el haz.
El control de la dilución se realiza mediante el ajuste de la obscuración y el ajuste de
nivel de turbidez. La turbidez se utiliza para controlar la concentración de partículas
que atraviesa la celda de medida evitando así fenómenos de dispersión múltiple.

3.3.12 Análisis del perfil de textura (TPA).

El análisis del perfil de textura permite evaluar de forma objetiva las

propiedades mecánicas de un producto, ofreciendo la obtención simultánea de
varios parámetros. El TPA se realiza mediante un ciclo de doble compresión con un
tiempo de espera entre el final de la primera compresión y el inicio de la segunda.
Para el ensayo se utiliza un sensor que permita detectar la fuerza normal aplicada
durante el recorrido de compresión, para ello el software es programado para mover

100
 MATERIALES Y MÉTODOS

el sensor a una velocidad específica hasta alcanzar un fuerza 0,01 N. En el software

de un Texturómetro se establece la altura de la muestra y la velocidad de
compresión requerida en función del porcentaje de deformación que se desea
aplicar. Una vez que el sensor alcanza la fuerza programada se da inicio al ensayo,
el registro proporcionado tras el ciclo de doble compresión se conoce como curva
TPA, donde se representa la fuerza en función del tiempo.

3.3.13 Ensayo de Resistencia (ER).

Es una prueba en donde la muestra es comprimida por una sonda u otro tipo
de dispositivo hasta alcanzar una fuerza máxima o límite de cedencia provocando
una deformación tipo plástica o permanente. Para ello el software es programado
para mover el sensor a una velocidad específica y constante hasta ocasionar el
aplastamiento irreversible de la muestra, de esta forma se obtienen datos de fuerza
en función de la distancia.

3.4 Métodos de preparación.

En este apartado se detallan los procedimientos experimentales utilizados

para la realización de este trabajo.

3.4.1 Caracterización del alginato de sodio.

3.4.1.1 Determinación de la estructura química y peso molecular.

Los valores de composición química dados por la razón de sus monómeros

constituyentes el ácido manurónico (𝑀) y el ácido gulurónico (𝐺), definida por la
razón 𝑀⁄𝐺 , y su secuencia monomérica han sido convenientemente determinados
por la técnica de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), para una muestra no
hidrolizada de alginato de sodio preparada a partir de 20 mg de la sal de alginato en
1 ml de agua deuterada. La muestra se homogenizó en un vial aplicando sonicación
y agitación vigorosa de manera alternada cada 30 min durante 4 horas, con la
finalidad de garantizar una completa disolución. La muestra se colocó en un tubo de
5 mm especial para RMN y se analizó en un espectrómetro siguiendo el protocolo
propuesto por Santi et al. (2008).

101
 MATERIALES Y MÉTODOS

Para la determinación del peso molecular promedio del alginato sódico, se

empleó la técnica de cromatografía de exclusión por tamaño (CET) mediante el
protocolo propuesto por Sen (2011) con algunas modificaciones. Para la
construcción del calibrado universal, se utilizaron patrones de Dextrano entre 80900
y 1360000 Da. Se pesaron 2 mg de cada patrón por mililitro de agua milliQ en viales
de 1,5 ml para HPLC, agitados vigorosamente en un Vortex hasta completa
disolución. La muestra del polímero de concentración 2 mg/ml se preparó siguiendo
el mismo procedimiento de homogenización (sonicación y agitación) utilizado para la
preparación de la muestra analizada por RMN, esta se eluyó con una solución
filtrada de NaNO3 a 0,1 M con un flujo de 0,6 ml/min y temperatura constantes de 30
ºC a través de las columnas de hidrogel de 2000 y 1000 𝐴̇ conectadas en serie. Los
patrones se analizaron uno a uno, iniciando con dextrano de menor a mayor peso
molecular, y finalizando con la muestra problema de alginato sódico. Los datos
obtenidos, se procesaron empleando el software Empower para determinar el peso
molecular promedio del polímero en estudio.

3.4.1.2 Determinación de otros compuestos.

Para la identificación de otros compuestos presentes en el alginato sódico, se

utilizaron las técnicas DSC, DRX y Refractometría.

3.4.1.2.a Análisis por DSC.

Se analizaron los diferentes lotes de alginato de sodio suministrados
(Panreac) destinados para la preparación de los geles. Se pesaron muestras de
entre 7,3 y 9,5 mg de alginato sódico y colocaron en crisoles de aluminio de 40 µl.
Una vez colocada la muestra en el equipo, se realizó un barrido de temperatura
desde 30º hasta 300 ºC a una velocidad de 10 ºC/min bajo un atmósfera inerte de N2
a 50 ml/min y utilizando como blanco una muestra de Indio. También, se analizaron
muestras de 3,6 mg de ácido algínico a objeto de identificar su posible presencia y
7,3 de alginato de sodio (Solé Graell) con el fin de comparar los termogramas
obtenidos entre alginatos y los existentes en literatura.

3.4.1.2.b Análisis por DRX.

102
 MATERIALES Y MÉTODOS

Se pesaron 0,1 mg de alginato de sodio (Panreac) y ácido algínico. Las

muestras se colocaron directamente en un difractómetro tipo XPERT-PRO con un
objetivo CuKα con radiación de rayos X de 1,54 Å, 45 kV y 40 mA. Los espectros
obtenidos se compararon con la finalidad de identificar la presencia del ácido
algínico en la muestra de alginato sódico. Asimismo, se comparó el espectro de la
muestra problema con una base de datos de patrones conocidos a fin de identificar
la presencia de otros compuestos.

3.4.2.1.c Análisis por Refractometría.

Se preparó una curva de calibrado a partir de una solución acuosa de alginato
sódico 2% p/p como patrón de referencia (Solé Graells) con un contenido de azúcar
comercial que varió desde 0% hasta 16% p/p. El alginato de sodio (muestra
problema/Panreac) empleado para la preparación de los geles, se analizó
preparando igualmente una solución acuosa con 2% p/p del polímero. Se consideró
el índice de refracción, IR, del alginato sódico (IR=1,3355) de Solé Graell como
patrón de referencia para la construcción del calibrado.

3.4.2 Preparación de los geles de alginato.

3.4.2.1 Geles preparados por el mecanismo de gelificación externa.

Para caracterizar los geles de alginato preparados a partir del mecanismo de

gelificación externa (GE), se realizaron una serie de experimentos para observar la
influencia de la concentración de calcio sobre las propiedades reológicas de los
geles. Inicialmente, se preparó una solución acuosa de alginato sódico 2% p/p
debidamente homogenizada con un Ultra-turrax, almacenada durante 24 horas para
eliminar las burbujas de aire y garantizar su completa hidratación. A continuación, se
prepararon geles a partir de 4 g de solución de alginato sódico 2% p/p y 1 g de
solución acuosa de CaCl2 con concentraciones de 0,05; 0,15; 0,25; 0,35; 0,5; 0,65;
0,75; 0,9; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 5; 10 y 15% p/p de calcio. Las muestras, se colocaron en
viales de boca ancha a 25 ºC y dejaron 24 horas en reacción para garantizar una
gelificación completa. Los geles formados, se cortaron a 2 mm de la superficie y
analizaron en el reómetro aplicando ensayos oscilatorios para todas las
concentraciones, el aspecto de los geles obtenidos se muestran en la Figura 3.1.

103
 MATERIALES Y MÉTODOS

Para realizar el análisis comparativo de la influencia de la concentración de

calcio sobre las propiedades reológicas de los geles preparados por el mecanismo
de GE y de los geles preparados por el mecanismo de gelificación interna (GI), se
expresa la concentración de calcio como una relación de los moles de Ca+2/g
alginato para efectos del análisis y comparación de sus características
viscoelásticas.

Figura 3.1 Aspecto de los geles de alginato cálcico preparados por GE con diferentes
concentraciones de calcio a partir de soluciones acuosas de CaCl2 a 25 ºC.

3.4.2.1.a Determinación mínima de calcio e influencia del pH.

Para determinar la cantidad mínima de calcio se prepararon geles por GE

para diferentes concentraciones de calcio a partir de 4 g de solución de alginato
sódico 2% p/p y 1 g de solución acuosa de CaCl2 con concentraciones de 0,05; 0,15;
0,25; 0,35; 0,5; 0,65; 0,75; 0,9; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 5; 10 y 15% p/p de calcio en un vial
de boca ancha a 25 ºC, tras 24 horas de reacción se realizaron los ensayos
oscilatorios a cada uno de los geles para todo el rango de concentración de calcio.
Estos geles se cortaron a 2 mm desde la superficie (espesor) para todos los
ensayos. Una vez conocida la cantidad mínima de calcio, se seleccionó un valor
superior a la cantidad mínima requerida a fin de asegurar la completa formación del
gel. A continuación, se realizaron una serie de experimentos para observar la
influencia del pH sobre las propiedades reológicas de los geles. Se partió de 4 g de
solución de alginato al 2% p/p y 1 g de solución acuosa de CaCl2, a estas soluciones
de CaCl2 se ajustó el pH entre valores de 0,5 y 13 por medio de la adición de HCl o
NaOH. Cada muestra con pH diferente adicionada a la solución de alginato, se

104
 MATERIALES Y MÉTODOS

homogenizó y dejó reaccionar durante 24 horas en viales de boca ancha en un baño

a 25 ºC.

3.4.2.2 Geles preparados por el mecanismo de gelificación interna.

Para caracterizar los geles de alginato preparados a partir del mecanismo de

gelificación interna (GI), se realizaron una serie de experimentos para observar la
influencia de la fuente de calcio y su concentración en las propiedades reológicas de
los geles. Se preparó una solución acuosa de alginato sódico 2% p/p siguiendo el
mismo procedimiento de homogenización, hidratación y eliminación del aire durante
24 horas. Por otra parte, se prepararon soluciones acuosas con las sales de
carbonato e hidróxido de calcio a concentraciones de 0,05; 0,15; 0,25 y 0,5 M, y con
citrato cálcico a concentraciones de 0,02; 0,05; 0,08 y 0,17 M. Para formar los geles,
se partió de una mezcla compuesta por 20 ml de solución acuosa de alginato 2% p/p
y 1 ml de solución de la sal cálcica (carbonato, hidróxido o citrato) para cada
muestra según el tipo de sal y concentración. La mezcla alginato/sal se colocó
cuidadosamente en el interior de una jeringa plástica con capacidad de 60 ml a fin
de moldear el gel a una forma cilíndrica. A continuación, se adicionó sobre la fase
acuosa 50 ml de aceite de girasol con 80 µl de ácido acético glacial previamente
disuelto. En la Figura 3.2 se observa el aspecto de las muestras en el interior de la
jeringa y de los geles una vez formados. Las muestras se taparon con film plástico y
dejaron en reacción durante 24 horas en un baño a 25 ºC. Los geles cilíndricos se
cortaron a 2 mm de distancia de la interfase (alginato/aceite) con un espesor de 2
mm para ser analizados en el reómetro.

Figura 3.2 Muestras preparadas por gelificación interna. Formación y moldeo del gel en jeringas
plásticas, a; Geles a partir de citrato cálcico 0,05 M y Geles a partir de carbonato cálcico 0,05 M, b.

105
 MATERIALES Y MÉTODOS

3.4.2.2.a Geles preparados con citrato de calcio.

Se prepararon geles con citrato cálcico utilizando el mecanismo de GI a partir

de 20 ml de solución de alginato sódico 2% p/p y 1 ml se solución de citrato cálcico
con diferentes concentraciones (0,02; 0,05; 0,08 y 0,17 M), la mezcla alginato/sal se
colocó en la jeringa y sobre ésta la fase oleosa compuesta por 50 ml de aceite
vegetal y 80 µl de acético, tal como explica el apartado anterior. Los geles enteros
de forma cilíndrica se cortaron a 2 mm de distancia desde la interfase
(alginato/aceite) y sucesivamente hasta los 20 mm manteniendo un espesor de 2
mm. Los geles se analizaron a fin de determinar la influencia de la concentración de
calcio con la distancia desde la interfase en las propiedades reológicas de los
mismos. En la Figura 3.3, se muestra el aspecto de los geles obtenidos.
Por otra parte, se realizaron experimentos para observar la influencia de la
concentración del ácido acético en las características reológicas de los geles
preparados con diferentes concentraciones de calcio. Para la preparación de las
muestras, se partió de 4 g de solución de alginato 2% p/p, 1 g de la solución acuosa
de citrato cálcico con diferentes concentraciones (0,02; 0,05; 0,08 y 0,17 M) y 1 g de
solución acuosa de ácido acético a 4,02·10-3 M; 9,42·10-5 M y 6,36·10-6 M en viales de
boca ancha a 25 ºC. Éstas se agitaron moderadamente hasta homogenizar y dejaron
24 horas en reposo para garantizar una completa reacción, los geles obtenidos se
cortaron a 2 mm de la superficie y analizaron utilizando el reómetro.

Figura 3.3 Geles de alginato cálcico preparados por GI en jeringas a partir de diferentes
concentraciones de citrato cálcico. Soluciones acuosas de citrato cálcico: 0,02 M, a; 0,05 M, b; 0,08
M, c; 0,17 M, d y e. Muestras cortadas a 2 mm desde la interfase (alginato/aceite).

3.4.2.2.b Liberación del calcio total.

106
 MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizaron experimentos para observar el tiempo de liberación de los iones

calcio a partir de una solución acuosa de citrato cálcico de 0,05 M. Todas las
muestras se prepararon con 10 ml de solución de citrato y 80 µl de ácido acético, se
agitaron vigorosamente y dejaron reaccionar con diferentes tiempos en un vial. Las
mediciones de la concentración del ion calcio, se realizaron cada 2 min hasta
completar 30 min, las muestras se filtraron y analizaron por medio de un electrodo
selectivo de calcio. Se consideró inicialmente, el calcio libre presente en la solución
de citrato, es decir, sin la adición del agente acidificante de liberación como
referencia a tiempo cero.

3.4.2.3 Caracterización de los geles de alginato por ensayos reológicos.

Los geles formados tanto por GI para las diferentes sales de calcio utilizadas
y concentraciones, como los geles obtenidos por GE, se caracterizaron aplicando
ensayos oscilatorios en un Reómetro RS300 HAAKE con un sensor de diámetro 20
mm y placa de diámetro 35 mm rugosos para evitar deslizamiento de la muestra, con
un espacio entre sensor-placa de 1 mm y una temperatura de 25 ºC controlado por
un baño termostático. En primer lugar, se determinó el esfuerzo al que se debe
trabajar dentro de un rango de viscoelasticidad lineal, en el cual no hay destrucción
de estructura y en donde la respuesta viscoelástica no depende del esfuerzo
aplicado porque el esfuerzo y la deformación obtenida son proporcionales. Para ello,
antes de cada experimento se realizaron ensayos preliminares de barridos
oscilatorios a una frecuencia intermedia de trabajo, 1 Hz, y esfuerzos crecientes para
determinar el rango donde la respuesta no dependa del esfuerzo. De este modo, se
pudo conocer el intervalo de esfuerzo correspondiente a la zona lineal para dicha
frecuencia, en el cual 𝐺 ∗ permanecía constante, como una línea horizontal,
independiente del esfuerzo aplicado. Seguidamente, se realizaron los ensayos de
barrido de frecuencia y, con un intervalo de frecuencia fijado entre 0,01 y 10 Hz, se
eligió un esfuerzo en este caso de 20 Pa, que a su vez aseguraba la permanencia
en el rango lineal para ambos extremos de frecuencia.

107
 MATERIALES Y MÉTODOS

3.4.3 Preparación de las microesferas de alginato en emulsión.

3.4.3.1 Formación de microesferas en emulsión con diferentes sales de
calcio.

Se prepararon microesferas de alginato utilizando el método en emulsión por

GI propuesto por Poncelet (2001), con algunas modificaciones. Se partió de 20 ml
de solución de alginato sódico 2% p/p homogenizada, hidratada y sin burbujas de
aire, a la cual adicionó 1 ml de una solución acuoso con sal cálcica de carbonato
(CaCO3) o citrato (Ca3(C6H5O7 )2.4H20) de concentraciones 0,05 M o 0,15 M. La
mezcla alginato/sal cálcica (fase dispersa) se dispersó en 40 ml de aceite vegetal
con disolución previa de 5% p/p de tensioactivo Span 80 (S80) respecto al aceite
directamente en un minireactor de 100 ml a 25 ºC y 250 rpm. Para favorecer la
formación de la emulsión agua en aceite (W/O), la fase dispersa se suministró gota a
gota de forma controlada con una jeringa bajo agitación constante, una vez
adicionada toda la fase acuosa se mantuvo la agitación durante 15 min. A
continuación, se indujo la gelificación de las gotas de alginato sódico en emulsión
con la adición controlada de una mezcla compuesta por 10 ml de aceite vegetal y 80
µl de ácido acético glacial previamente disuelto. Las microesferas formadas después
de 15 min de reacción, se separaron de la fase oleosa con la adición de 100 ml de
solución acuosa de CaCl2 de concentración 0,05 M con un contenido de 10% p/p de
Tween 20 (T20) bajo agitación moderada durante 15 minutos, con el fin de romper la
emulsión y favorecer la partición completa de las microesferas hacia la fase acuosa.
Finalmente, el aceite se descartó, las microesferas se filtraron por gravedad en un
tamiz de 0,45 micras y lavaron gentilmente con la solución CaCl2/T20. La Figura 3.4,
muestra el aspecto de las microesferas obtenidas con las sales de calcio empleadas
al ser observadas al microscopio óptico.

108
 MATERIALES Y MÉTODOS

Figura 3.4 Microesferas preparadas en emulsión por GI con distintas sales de calcio. Microesferas
preparadas con CaCO3 (10X), a; Microesferas preparadas con citrato cálcico (20X), b. Soluciones
cálcicas de concentración 0,05 M. Observaciones por microscopía óptica con objetivos 10X y 20X.

Para determinar la influencia de la concentración de calcio y las diferentes

sales de calcio utilizadas en la preparación de las microesferas de alginato sobre el
tamaño y morfología de éstas, una parte de las microesferas obtenidas se
dispersaron en agua para ser observas por microscopía óptica. Para cada muestra,
se realizaron suficientes fotografías a fin de estimar la distribución de tamaño
mediante la medición de 300 diámetros de microesferas por muestra. Otras
microesferas, se secaron en una estufa de vacío a 40 ºC, 300 mbar durante 40 min y
analizaron directamente por SEM en un Hitachi TM - 1000 con un voltaje de
aceleración de 15 kV para observar su morfología.

3.4.3.2 Estabilidad de las emulsiones.

3.4.3.2.a Determinación de la estabilidad de las emulsiones para diferentes
tensioactivos y concentraciones.

Las emulsiones W/O, se prepararon para 10 g de emulsión total constituida

por 1 ml de solución de la sal cálcica, seleccionada según los resultados obtenidos
en el estudio de preparación de las microesferas en emulsión por GI con las
diferentes sales de calcio, en 20% p/p de solución acuosa de alginato sódico 2% p/p.
En este sentido, se mantuvo una relación de fase dispersa y fase continua de 20:80
para todas las emulsiones estudiadas. Por pesada se colocó en un tubo el aceite

109
 MATERIALES Y MÉTODOS

vegetal y gota a gota la cantidad correspondiente del tensioactivo para cada

concentración estudiada (2, 5 y 10% p/p) aplicando agitación constante con un
Vórtex a 25 ºC. A continuación, una vez pesada la cantidad concreta de solución de
alginato y adicionada la solución de sal cálcica, la mezcla homogenizada se añadió
gota a gota en la fase oleosa agitando entre cada adición. Se emplearon para el
estudio de estabilidad, los tensioactivos S80, Span 85 (S85), Polirricinoleato de
poliglicerol (PGPR) y una mezcla de S80 y Tween 80 (S80=51 y T80=49). El Vórtex
se utilizó a una velocidad media para todas las emulsiones preparadas, a fin de
evitar la formación de espumas. Una vez formada la emulsión, se pasó
cuidadosamente a un tubo apto para el análisis de dispersión de luz y colocó en el
Turbiscan. Las mediciones se realizaron de forma continua durante 14 min a una
temperatura de 25 ºC, no se consideraron tiempos mayores ya que una vez formada
la emulsión esta es utilizada inmediatamente para la obtención de microesferas de
alginato por gelificación de las gotas a través de una reacción química en el proceso
de emulsificación por GI. A partir de los perfiles obtenidos, se consideró seleccionar
dos zonas diferentes a lo largo del tubo con el fin de comparar la estabilidad de las
emulsiones W/O mediante la adopción de los valores medios de Back Scattering
(BS) teniendo en cuenta puntos específicos del análisis a los 20-25 mm y 50-55 mm
de longitud del tubo siguiendo el protocolo propuesto por Márquez et al, 2010. Para
determinar la cinética de desestabilización de las emulsiones, se representó el
porcentaje de coalescencia (%C) usando la siguiente ecuación:

(𝐵𝑆𝑖𝑛 −𝐵𝑆𝑓 )
%𝐶 = [ ] 𝑥100 (31)
𝐵𝑆𝑖𝑛

Donde el BSin es el valor inicial a tiempo cero, y BSf es el valor final obtenido pasado
el tiempo de estudio. Las mediciones se realizaron por duplicado a fin de expresar
los valores medios ± la desviación estándar (DE).

3.4.3.2.b Distribución de tamaño de las microesferas y su correlación con el tamaño

de gota de las emulsiones.

Siguiendo el protocolo descrito en la preparación de las emulsiones para el

estudio de estabilidad (apartado 3.4.3.2.a), se realizaron otros experimentos
utilizando los mismos tensioactivos S80, S85, S80-T80 y PGPR para la preparación
de las emulsiones pero esta vez para la formación de las microesferas. Para ello, se

110
 MATERIALES Y MÉTODOS

utilizó solamente la concentración intermedia de tensioactivo (5% p/p) y la sal de

calcio seleccionada a fin de observar la influencia del tipo tensioactivo en la
distribución de tamaño de las microesferas. Para inducir la gelificación de las gotas
de la fase dispersa en la emulsión, se adicionó el ácido acético a la fase oleosa.
Por otra parte, una vez identificado y seleccionado el tensioactivo que
proporciona el tamaño de microesferas más adecuado según los objetivos
planteados en este estudio, se realizaron una serie de nuevos experimentos
aplicando el mismo protocolo de preparación de las microesferas pero utilizando
específicamente el tensioactivo y la fuente de calcio seleccionada con la finalidad de
determinar la existencia de alguna correlación entre la distribución del tamaño gota
de la emulsión y las microesferas obtenidas con el sistema seleccionado. Para ello,
primeramente, se realizó el procedimiento de preparación de la emulsión (sin la
adición del ácido acético en la fase oleosa) a fin de estudiar el tamaño de gota de la
fase dispersa en emulsión. A continuación, se realizó nuevamente el ensayo de
preparación de la emulsión pero adicionando el acético a la fase oleosa para así
inducir la gelificación de las gotas y poder analizar la distribución de tamaño de las
microesferas obtenidas por microscopía óptica. Para este estudio de correlación
entre el tamaño de gota y las microesferas se establecieron dos concentraciones
diferentes del tensioactivo seleccionado (2% y 5% p/p).

3.4.3.3 Preparación de microesferas en emulsión con el principio activo a

encapsular: diseño experimental completo.

Se realizó un diseño experimental compuesto 23 para observar la influencia de

las variables de composición y otro diseño experimental compuesto 2 2 para
determinar la influencia de las variables de preparación en el tamaño y
polidispersidad de las microesferas, así como el porcentaje de retención del
compuesto activo encapsulado en las microesferas luego de ser separadas de la
emulsión. Para ello, se establecieron como factores las siguientes variables:

- Variables de composición: concentración de tensioactivo (4-15% p/p)

respecto al aceite, cantidad de fase dispersa (15-40% p/p) utilizada en la emulsión y
concentración de CaCl2 (0,03-0,1M) en la solución acuosa con 10% p/p de T20 para
el lavado y separación de las microesferas obtenidas en emulsión (CaCl2/T20).

111
 MATERIALES Y MÉTODOS

- Variables de preparación: velocidad de agitación (250-600 rpm) y velocidad

de centrifugación (2000-3800 rpm) para la separación de las microesferas.

Se partió de una fase dispersa constituida por solución de alginato sódico al

2% p/p con 1% p/p de extracto de cacao, esta se preparó mediante homogenización
a 10000 rpm con posterior sonicación durante 20 min. La solución alginato/cacao se
almacenó durante 24 horas bajo refrigeración y protección de la luz para asegurar su
completa hidratación y desaireación. El procedimiento estándar para todas las
variables de composición se estableció a 25 ºC, velocidad de agitación de 250 rpm y
centrifugación 4000 rpm durante 10 min para la separación de las microesferas. A
partir de una fase dispersa constituida por solución alginato/cacao (27,5% p/p) se
adicionó la cantidad correspondiente de citrato cálcico a 0,05 M (6,2% p/p respecto a
la fase dispersa), una vez homogenizada durante 5 min se dispersó gota a gota con
una jeringa en 40 ml de aceite vegetal con 9,5% p/p del tensioactivo seleccionado
respecto al aceite previamente disuelto (fase oleosa). La emulsión W/O se preparó
bajo agitación constante durante 15 min en un minireactor. La gelificación de las
gotas se inició al adicionar los 10 ml restantes de aceite vegetal junto con 80 µl de
ácido acético disueltos en el mismo, agitando durante 15 min más. Las microesferas
pregelificadas se separaron de la fase oleosa adicionando 100 ml de solución
acuosa a 0,07 M CaCl2/T20 bajo agitación moderada durante 15 min con la finalidad
de continuar el proceso de gelificación, mejorar la retención del principio activo y
favorecer la separación de las fases. Las microesferas se separaron por
centrifugación, descartando la fase oleosa y reservando la fase acuosa para la
cuantificación de los polifenoles presentes en la solución de separación. Las
microesferas alginato/cacao se redispersaron en agua para su análisis de
distribución de tamaño por difracción laser. Del mismo modo, se aplicó el
procedimiento descrito anteriormente (condiciones del punto central del diseño) para
la preparación de las microesferas pero considerando las condiciones de
composición de cada uno de los ensayos que conforman el diseño experimental
compuesto 23.
Por otra parte, se realizó el estudio de la influencia de las variables de
preparación a través de un diseño experimental compuesto 2 2, para ello se tomaron
las condiciones de composición del punto central del diseño experimental 2 3 descrito
anteriormente. La preparación de la emulsión W/O se realizó siguiendo el protocolo

112
 MATERIALES Y MÉTODOS

anterior pero utilizando los parámetros planteados para las variables de preparación
(velocidad de agitación y centrifugación) en el diseño 22 para cada uno de sus
ensayos constituyentes. La Figura 3.5, muestra la separación de las fases y las
microesferas obtenidas con el cacao encapsulado luego del proceso de
centrifugación.

Figura 3.5. Separación de las microesferas de alginato/cacao de la emulsión por centrifugación. Fase
oleosa, a; Fase acuosa, b y Microesferas de alginato/cacao, c.

3.4.3.3.a Caracterización del extracto de cacao como principio activo a encapsular.

 Análisis de los polifenoles totales por el método de Folin-Ciocalteau.

Se utilizó como principio activo de encapsulación extracto natural de Cacao

(Theobroma cacao L.) suministrado gentilmente por la facultad de Farmacia de la
Universidad de Barcelona. Para la cuantificar los polifenoles totales se utilizó el
protocolo propuesto por Erkan et al., (2008) que emplea el método de Folin-
Ciocalteau utilizando ácido gálico como compuesto fenólico de referencia. En primer
lugar, se realizó una recta de calibrado a partir del patrón de referencia. A
continuación, se preparó una solución madre a partir de 250 mg del extracto en 50
ml de agua miliQ, la muestra se protegió de la luz y sonicó durante 4 horas.
Seguidamente, se realizó una dilución 1:5, de esta se tomó una alícuota de 250 µl y
adicionó un 12% v/v de solución de NaCO3 de concentración 20% p/p, luego agregó
un 4% v/v del indicador Folin a 2 N y completó con agua miliQ hasta 10 ml, se agitó
vigorosamente y dejó reaccionar durante 1 hora debidamente protegidas de la luz en
recipientes de vidrio de color ámbar. En análisis de absorbancia de las muestras se
realizó en un espectrofotómetro UV-VIS Perkin a una longitud de onda de 765 nm.

113
 MATERIALES Y MÉTODOS

 Cuantificación de los polifenoles por UPLC.

Se caracterizó el extracto de cacao con la cuantificación de algunos de sus

polifenoles principales, tales como la (+) catequina y (-) epicatequina mediante un
Cromatógrafo para líquidos de ultra resolución (UPLC) Acquity siguiendo el protocolo
descrito por Serra-Cayuela, et al. 2013. En primer lugar, se realizaron los calibrados
con patrones de (+) catequina y (-) epicatequina. A continuación, se preparó una
solución madre con 250 mg de extracto en 50 ml de una solución etanol-agua
(50:50), la cual se sonicó y seguidamente diluyó 1:5. Se empleó una fase móvil con
solución de acetonitrilo/agua/ácido fórmico (2:97:1) y otra con una solución
agua/ácido fórmico/acetonitrilo (80:19:1). Todas las muestras se filtraron antes de su
inyección utilizando un filtro de 0,22 µm, luego se inyectó 5 µl de la muestra. Los
datos fueron adquiridos con el software Empower Pro 2. Los cromatogramas se
monitorizaron a 284 nm.

3.4.3.3.b Análisis de tamaño de las microesferas por difracción laser.

Para la medición del tamaño y polidispersidad de las microesferas de alginato
con el principio activo se utilizó un Mastersizer 2000 equipado con una unidad de
dispersión Hydro 2000SM. Las muestras fueron colocadas en agua destilada y
dispersadas a una velocidad de 1500 rpm mediante la unidad de líquidos. Las
mediciones se realizaron considerando un IR para el alginato de 1,336 y para el
agua de 1,333. El software del equipo genera el diámetro medio del volumen
equivalente (D[4,3]) en µm, así como una representación de la distribución de
porcentajes volumen frente a los diámetros de las microesferas. Asimismo, el
software reporta otra variable respuesta denominada SPAN, factor de
polidispersidad o amplitud de la distribución de tamaño referido a la variabilidad del
tamaño de las partículas presentes en la muestra. Esta variable puede ser
expresada matemáticamente como la diferencia de los diámetros medio de
volúmenes acumulados para el 90% y 10% de las partículas en la muestra, en
relación al diámetro medio de volumen acumulado para el 50% de las partículas de
la muestra [(D90-D10) / D50]. Los cuales corresponde al diámetro medio de volúmenes
acumulados a un 10%, 50% y 90% respectivamente.

3.4.3.3.c Determinación del contenido de polifenoles totales en las microesferas.

114
 MATERIALES Y MÉTODOS

El contenido total de polifenoles retenidos en las microesferas de alginato fue

analizado por el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau explicado en el
apartado 3.4.3.3.a con algunas modificaciones. Para determinar la cantidad de
fenoles totales iniciales en la fase dispersa (alginato/cacao) se tomó 1 ml (diluido
1:1000), a éste se adicionó la cantidad correspondiente a un 12% v/v de solución
NaCO3 de concentración 20% p/p, un 4% v/v de Folin a 1 N (diluido 1:1 respecto a
su condición estándar) y el resto en agua miliQ hasta completar 10 ml, se agitó
vigorosamente y dejó en reposo durante 2 horas a temperatura ambiente. Siguiendo
el mismo procedimiento de preparación, se tomó una alícuota de 1 ml (diluido 1:100)
de la solución acuosa de separación (sobrenadante) reservada y analizó el
contenido de polifenoles presentes. Pasado el tiempo de reacción se midió la
absorbancia a 765 nm para cada muestra. Este protocolo se aplicó para cada uno de
los ensayos del diseño experimental completo referidos al diseño 23 (variables de
composición) y al diseño 22 (variables de preparación). A fin de determinar la
eficiencia de encapsulación de los polifenoles totales retenidos por las microesferas,
se expresó el porcentaje de retención de polifenoles como la diferencia de
concentración de los polifenoles iniciales presentes en la fase dispersa
(alginato/cacao) respecto a los polifenoles presentes en el sobrenadante, según la
siguiente expresión matemática:

(𝐶𝑖 −𝐶𝑓 )
%𝑅𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖ó𝑛 = [ ] 𝑥100 (32)
𝐶𝑖

Donde 𝐶𝑖 es la concentración inicial en mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/g

extracto seco de cacao presente en la fase dispersa y 𝐶𝑓 es la concentración final en
mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/g extracto seco de cacao presente en el
sobrenadante. Las mediciones se realizaron al menos por duplicado para expresarlo
como el valor medio ± DE.
Por otra parte, se prepararon blancos para cada ensayo con la finalidad de
eliminar cualquier interferencia durante las mediciones de absorbancia,
considerando tanto la presencia del T20 en la solución de separación utilizada como
de posibles restos de pequeñas gotas de emulsión. Para ello, cada ensayo se
realizó nuevamente sin la incorporación del extracto de cacao en la fase dispersa.
Todas las muestras fueron debidamente filtradas.

115
 MATERIALES Y MÉTODOS

3.4.3.3.d Análisis de la viscosidad de la fase dispersa.

Se preparó la fase dispersa a partir de la solución de alginato sódico al 2% p/p
con 1% p/p de extracto de cacao y adicionó la solución de citrato cálcico a 0,05 M
(6,2% p/p respecto a la fase dispersa), homogenizó y realizaron una serie de análisis
de viscosidad estacionaria en función del gradiente y a dos tiempos a partir de la
preparación de esta fase. Para ello, se utilizó un Reómetro Modular Mars III con
sensor y placa rugosa de diámetro 35 mm a temperatura controlada de 25 ºC. Se
preparó y observó el comportamiento de la fase dispersa utilizada en el diseño
experimental completo según las condiciones dadas para el punto central del diseño
23 (apartado 3.4.3.3). A continuación, se realizó nuevamente el mismo estudio para
la fase dispersa a pH neutro (fase dispersa neutralizada con NaOH 6 M entre 6,5 y
6,8 de pH).

3.4.3.4 Preparación de microesferas en emulsión con el principio activo y fase

dispersa a pH neutro: diseño fraccionado.

Se realizó un diseño fraccionado 23-1 factorial utilizando como fase dispersa la

solución de alginato 2%/cacao 1% p/p a pH neutro, la preparación de las
microesferas de alginato con el extracto de cacao a encapsular se realizó siguiendo
el mismo protocolo descrito para el diseño experimental completo (apartado 3.4.3.3)
referido al diseño 23 para las variables de composición: concentración de
tensioactivo (4-15% p/p), cantidad de fase dispersa (15-40% p/p) y concentración de
CaCl2 (0,03-0,1 M) en la solución acuosa de lavado con 10% p/p T20 para la
separación de las microesferas obtenidas. Para ello, se estableció una velocidad de
agitación de 250 rpm a 25 ºC y una velocidad de centrifugación 4000 rpm durante 10
min para la separación de las microesferas. A fin de observar el efecto de la fase
dispersa con extracto de cacao neutralizada sobre la distribución de tamaño y
polidispersidad de las microesferas, así como en el porcentaje de retención de los
polifenoles (%Ret).

3.4.3.5 Preparación de las microesferas con un principio activo puro a

encapsular: diseño fraccionado.

Se estableció un diseño fraccionado 23-1 factorial utilizando como compuesto

activo fenólico puro la (+) catequina. Para la preparación de las microesferas con

116
 MATERIALES Y MÉTODOS

catequina se partió de una fase dispersa compuesta por una solución de catequina
1000 ppm con 2% p/p de alginato sódico, ésta se homogenizó, sonicó durante 10
min y controló el pH, finalmente se dejó hidratar y desairear durante 24 horas. Se
plantearon como factores de entrada la cantidad de fase dispersa (15-40% p/p),
concentración del tensioactivo (4-15% p/p) respecto al aceite y velocidad de
agitación (250-600 rpm), y como variables de salida la distribución de tamaño o
diámetro medio del volumen (D[4,3]) de las microesferas, la polidispersidad o factor
SPAN y el %Ret del compuesto puro en las microesferas. El procedimiento estándar
de preparación de las microesferas (condiciones del punto central diseño 2 3-1) se
realizó a partir de la fase dispersa constituida por la solución alginato/catequina
(27,5% p/p) y citrato cálcico a 0,05 M (6,2% p/p respecto a la fase dispersa), una vez
homogenizada durante 5 min se dispersó gota a gota con una jeringa en 40 ml de
aceite vegetal con 9,5% p/p del tensioactivo seleccionado y utilizado en el diseño
experimental completo previamente disuelto (fase oleosa). La emulsión W/O se
preparó bajo agitación constante a 425 rpm durante 15 min en un minireactor a 25
ºC. La gelificación de las gotas se inició al adicionar los 10 ml restantes de aceite
vegetal junto con 80 µl de ácido acético disueltos en el mismo, agitando durante 15
min más. Las microesferas pregelificadas se separaron de la fase oleosa
adicionando 100 ml de solución acuosa a 0,07 M CaCl2 con 10% p/p de T20 bajo
agitación moderada durante 15 min para completar la formación del gel y favorecer
la partición de las fases, la mezcla microesferas/emulsión se centrifugó a 4000 rpm
durante 10 min, posteriormente la fase oleosa se descartó y la fase acuosa fue
reservada para la cuantificación de la catequina presente en la solución de
separación y, finalmente las microesferas se redispersaron en agua para la medición
de sus tamaños por difracción laser. Este protocolo se realizó para todos los
ensayos del diseño, utilizando siempre la misma concentración CaCl2/T20 para la
solución acuosa de lavado y las mismas condiciones de centrifugación para la
separación de las microesferas.
Los diferentes diseños experimentales estudiados y sus resultados se
procesaron con el Statgraphics Plus (versión 5.1 Estadísticos Gráficos Corporation,
Rockville, EE.UU., 2000). Todos los datos se analizaron empleando un ANOVA,
donde se consideraron significativas las respuestas con p < 0,05. Las medidas se
realizaron por duplicado y expresaron como valores medios ± DE.

117
 MATERIALES Y MÉTODOS

3.4.3.6 Análisis térmico de las microesferas de alginato con el principio activo

encapsulado.

A fin de estudiar el comportamiento térmico de las microesferas obtenidas en

emulsión por GI se realizó un análisis térmico mediante DSC. Para ello, se tomaron
muestras de microesferas de alginato con y sin el extracto de cacao preparadas en
emulsión siguiendo el protocolo descrito anteriormente y específicamente para las
condiciones del punto central en el diseño fraccionado a pH neutro con extracto de
cacao (apartado 3.4.3.4). Una vez preparadas las microesferas con y sin el extracto
de cacao, éstas se separaron y congelaron en un baño con nieve carbónica y
acetona para posteriormente ser liofilizadas. Se utilizó un liofilizador marca LyoQuest
a una temperatura de -51 ºC y 0,1 mbar durante 18 horas. Las microesferas
liofilizadas se analizaron por DSC, para ello se pesaron muestras entre 3,8 y 4,4 mg
las cuales se colocaron en crisoles de aluminio con una capacidad de 40 µl. Una vez
la muestra en el equipo, se realizó el análisis térmico aplicando un barrido de
calentamiento desde 30º hasta 300 ºC con una velocidad de 10 ºC/min bajo una
atmósfera inerte de N2 a 50 ml/min.

3.4.4 Preparación de las esferas por extrusión.

3.4.4.1 Esferas preparadas por el mecanismo de gelificación externa.

Se prepararon esferas de alginato de calcio por extrusión a través del

mecanismo de GE, a fin de observar su morfología, tamaño y textura. Se realizaron
una serie de experimentos utilizando soluciones de alginato 2%/cacao 1% o 3% p/p.
Las soluciones acuosas de alginato sódico al 2% p/p y extracto de cacao 1% p/p, y
las soluciones con alginato 2% p/p y extracto de cacao 3% p/p, se homogenizaron,
sonicaron, desairearon y almacenaron. A continuación, se ajustó el pH entre 6,7 y
6,9 adicionando unas gotas de solución 6 M de NaOH. Para ello, se partió de 20 ml
de solución de alginato 2%/cacao 1% p/p o 20 ml de solución de alginato 2%/cacao
3% p/p, la cual se goteó con una jeringa sin aguja (50 ml BD Plastipak-2 mm de tubo
de diámetro interno) durante 5 min por control manual en 80 ml de un baño
gelificante compuesto por solución acuosa de CaCl2 a diferentes concentraciones
(0,002 M o 0,005 M CaCl2 respectivamente). Las esferas formadas se mantuvieron
en el baño de calcio durante 15 min bajo agitación moderada para garantizar su
completa gelificación. A continuación, se filtraron a través de un colador tipo cuchara

118
 MATERIALES Y MÉTODOS

de acero inoxidable para esferificaciones y lavaron con agua. Algunas esferas se

reservaron a fin de analizar sus propiedades mecánicas, otras esferas para medir su
diámetro medio número-longitud y otras más para observar su morfología. En la
Figura 3.6, se muestra el aspecto de las esferas preparadas por GE.

Figura 3.6 Esferas de alginato/cacao preparadas por extrusión y gelificación externa.

3.4.4.2 Esferas preparadas por el mecanismo de gelificación interna.

Se partió de 20 ml de solución 2% alginato/cacao 1% p/p o 20 ml de solución

2% alginato/cacao 3% p/p neutralizada, la que se mezcló con 1000 µl de solución de
citrato cálcico (Ca3(C6H5O7)2.4H20) de concentración 0,05 M o 500 µl de solución de
citrato cálcico a 0,25 M. Las mezclas de alginato 2%/cacao 1%/citrato cálcico o
alginato 2%/cacao 3%/citrato cálcico a baja y alta concentración de calcio se
gotearon usando una jeringa sin aguja (50 ml BD Plastipak-2 mm de tubo de
diámetro interno) durante 5 min por control manual en 40 ml de aceite vegetal con 80
µl de ácido acético previamente disuelto para inducir la gelificación de las gotas. Las
esferas formadas por extrusión para cada muestra, se mantuvieron en el baño
oleoso acidificado durante 15 min bajo agitación moderada para asegurar su
completa gelificación. Luego, se filtraron a través de un colador tipo cuchara y
lavaron con agua. Algunas esferas se reservaron a fin de analizar sus propiedades
mecánicas, otras esferas para medir su diámetro medio número-longitud y otras más
para observar su estructura interna. En la Figura 3.7, se muestra el aspecto de las
esferas preparadas por GI.

119
 MATERIALES Y MÉTODOS

Figura 3.7 Esferas de alginato/cacao preparadas por extrusión y gelificación interna.

3.4.4.3 Caracterización de las esferas: morfología, tamaño y textura.

Las esferas obtenidas por extrusión a partir de las soluciones de alginato con
diferentes concentraciones de extracto de cacao y sal de calcio, se caracterizaron
según su morfología (estructura interna), tamaño (diámetro) y propiedades
mecánicas (textura) tanto para las esferas preparadas por GE como las esferas
preparadas por GI. En primer lugar, se tomaron 15 esferas de forma aleatoria para
cada muestra y midieron sus diámetros utilizando un calibrador digital (Topcraft GT-
CC-02). Los valores de los diámetros se expresaron en base a la longitud media ±
DE, éstos valores se analizaron empleando el software estadístico Statgraphics Plus
(versión 5.1 Estadísticos Gráficos Corporation, Rockville, EE.UU., 2000). Las
comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba t de Student con un
nivel de significación establecido para p < 0,05.
Por otra parte, se tomaron un par de esferas para ser analizadas por SEM con
un Quanta 200 microscopio, con el fin de determinar su morfología. Para ello, las
esferas fueron congeladas con nitrógeno líquido y liofilizadas utilizando un
LyoQuest-55 a -51 ºC, 0,1 mbar y -0,2 ºC en la placa de calentamiento durante 18
horas. Una vez secas, las esferas de alginato/cacao se pegaron a una cinta
adhesiva y recubrieron con 40 nm de oro utilizando la técnica de pulverización en un
Joel JFC-100. Finalmente, las esferas enteras y partidas a mitad se examinaron por
SEM con un voltaje de aceleración entre 7,0 y 20 kV y un detector de Everhard-
Thornley (ETD).
El análisis de la textura se llevó a cabo en un reómetro modular MARS III
HAAKE programado para realizar mediciones con la fuerza normal (F). La

120
 MATERIALES Y MÉTODOS

experimentación se realizó siguiendo el protocolo de Análisis de perfil de textura

(TPA) propuesto por Deladino et al., 2008 con algunas modificaciones referidas a la
velocidad de compresión y según los resultados dados de porcentaje de
deformación más adecuado en el trabajo realizado por Wang et al., 2005 que
garantiza una recuperación completa en las esferas de alginato después de un
proceso de compresión, así como las limitaciones de trabajo del instrumento. Todos
los TPA se realizaron en una cápsula Petri de vidrio (100 mm diámetro x 15 mm de
altura), la que se llenó completamente con las esferas de alginato/cacao obtenidas
por extrusión y las diferentes técnicas de gelificación según las formulaciones,
utilizando un sensor de diámetro 35 mm rugoso a una velocidad de compresión de
0,025 mm/s, un 17% de deformación y una temperatura controlada a 5 ± 0,5 ºC. A
partir de las curvas dadas por el análisis de textura representado por un perfil de
fuerza en función del tiempo, se midieron directamente algunas propiedades
mecánicas como dureza, elasticidad y cohesividad, mientras otras fueron calculadas
tales como gomosidad y masticabilidad. Con el fin de obtener resultados
representativos de la textura de las esferas, los experimentos se realizaron por
triplicado y expresaron como un valor medio ± desviación estándar. Se realizó el
análisis de varianza (ANOVA) empleando el software Statgraphics Plus (versión 5.1
Estadística Graphics Corporation, Rockville, EE.UU., 2000). Todos los análisis
estadísticos, se aplicaron considerando un nivel de significancia establecido para p
< 0,05.
En la Figura 3.8, se muestran las esferas de alginato/cacao colocadas en la
cápsula Petri para la realización del TPA mediante el uso del Reómetro.

Figura 3.8 Esferas preparadas por extrusión para el análisis de textura.

121
 MATERIALES Y MÉTODOS

3.4.5 Métodos de determinación de la liberación del principio activo.

Con el fin de estudiar el mecanismo de liberación de los polifenoles desde los

encapsulados, se prepararon microesferas de alginato/cacao en emulsión por GI y
esferas por extrusión con el extracto de cacao empleando ambos mecanismos de
gelificación, las cuales redispersaron en una solución acuosa para determinar el
proceso de liberación del principio activo en el tiempo. Por otra parte, a partir de las
esferas de alginato/cacao se estudió la influencia de la concentración de calcio en la
liberación de los polifenoles al analizar la difusión del principio activo desde geles de
alginato con el extracto de cacao hacia una base de gelatina neutra.

3.4.5.1 Liberación desde las microesferas.

Se prepararon microesferas de alginato/cacao en emulsión por GI tal como

indica el protocolo en el apartado 3.4.3.4 para las condiciones dadas por el punto
central del diseño fraccionado a pH neutro. Una vez separadas las microesferas por
centrifugación y descartada la fase oleosa, la fase acuosa se reservó para utilizar
esta como parte del medio de redispersión de las microesferas, a objeto de
considerar la concentración de polifenoles liberados durante el proceso de
separación. En este sentido, se prepararon microesferas para ser redispersadas en
50, 75, 100, 125, 150 y 200 ml de disolución acuosa constituida por el medio de
separación reservado y, en los casos necesarios, parte de solución acuosa
constituida por CaCl2 a 0,05 M y 10% p/p de T20 para completar el volumen del
medio. Cada una de las muestras se agitaron continuamente a 400 rpm (IKA Modelo
ECA básico), se tomaron alícuotas del medio pasados 10 min, luego cada 5 min
hasta completar 1 hora, después de 4 horas y finalmente a las 24 horas. Las
alícuotas se analizaron para determinar el contenido de polifenoles totales liberados
desde las microesferas con el tiempo, para ello se siguió el procedimiento de análisis
espectrofotométrico de los polifenoles totales por el método de Folin-Ciocalteau
(aparatado 3.4.3.3.a). Todas las muestras fueron protegidas de la luz hasta su
análisis. El medio acuoso CaCl2/T20 utilizado se consideró en la preparación de los
blancos para todas las mediciones a fin de eliminar cualquier interferencia. Los
resultados se expresaron como porcentaje de polifenoles totales liberados con el
tiempo, teniendo en cuenta la cantidad de fenoles totales presentes inicialmente en

122
 MATERIALES Y MÉTODOS

la fase dispersa (alginato/cacao) y la concentración en solución de los polifenoles

liberados desde las microesferas.

𝐶𝑠𝑜𝑙
%𝐶𝑇𝐹𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 = 𝑥100 (33)
𝐶𝑖

Donde %𝐶𝑇𝐹𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 es el porcentaje o contenido total fenólico liberado desde

las microesferas en el tiempo de estudio, 𝐶𝑠𝑜𝑙 es la concentración en solución de
polifenoles totales liberados expresado en mg EAG/g extracto cacao y 𝐶𝑖 es la
concentración inicial de polifenoles presentes en la solución de alginato/cacao (fase
dispersa) expresado en mg EAG/g extracto cacao. El estudio de todos los modelos
de ajuste se realizó a través del software Matlab v.7.9.0, The Mathworks, Inc. Natick,
MA. USA.

3.4.5.2 Liberación desde las esferas.

Se realizaron una serie de experimentos según el protocolo descrito en el

apartado 3.4.4.1 para la preparación de esferas por extrusión con el mecanismo de
GE. En este caso se partió de 20 ml de solución de alginato al 2%/cacao 1% p/p o
20 ml de solución de alginato al 2%/cacao 3% p/p, la cual se goteó directamente en
100, 150, 200, 250 y 300 ml de solución acuosa de CaCl2 a 0,002 M (bajo calcio) o
0,005 M (alto calcio) respectivamente, actuando como baño gelificante para el
estudio con diferentes concentraciones de calcio y a su vez como medio de
liberación del principio activo. Las esferas formadas se mantuvieron en el baño
gelificante durante 10 min bajo agitación moderada, y luego se tomaron las alícuotas
pasados los 10 min y sucesivamente cada 10 min hasta completar 1 hora, tras 4
horas y finalmente a las 24 horas. Todas las alícuotas fueron analizadas para
determinar el contenido de polifenoles totales liberados desde las esferas con el
tiempo, mediante el análisis espectrofotométrico del método de Folin-Ciocalteau y
utilizando para los cálculos la ecuación 33.
Por otra parte, se prepararon esferas por extrusión con el mecanismo de GI
(apartado 3.4.4.2) a fin de estudiar la liberación de los polifenoles desde las esferas
utilizando diferentes cantidades de extracto de cacao y concentraciones de calcio.
Se partió de 20 ml de alginato al 2%/cacao 1% p/p o 20 ml de alginato al 2%/cacao
3% p/p con la adición de 1000 µl de solución de citrato cálcico a 0,05 M (bajo calcio)
o 500 µl de solución de citrato cálcico a 0,25 M (alto calcio). Una vez extruida la

123
 MATERIALES Y MÉTODOS

mezcla alginato/cacao/citrato en el baño oleoso acidificado, se dejaron gelificar

durante 10 min, separaron con una cuchara coladora, lavaron y suspendieron en
100, 150, 200, 250 y 300 ml de solución de CaCl 2 a 0,001 M con agitación
moderada. Se tomaron alícuotas de la solución acuosa de acuerdo con el volumen
del medio, inicialmente pasados 10 min y sucesivamente cada 10 min hasta
completar 1 hora, después de 4 horas y finalmente a las 24 horas.
El estudio de todos los modelos de ajuste se realizó a través del software
Matlab v.7.9.0, The Mathworks, Inc. Natick, MA. USA.

3.4.5.3 Liberación de los polifenoles desde geles de alginato/cacao con

diferentes concentraciones de calcio en gelatina.
Con el fin de estudiar la influencia de la concentración de calcio en la
liberación de los polifenoles se prepararon geles de alginato/cacao por el mecanismo
de gelificación interna sobre una base de gelatina neutra que sirvió de referencia
para evaluar el contenido de polifenoles difundidos desde el gel alginato/cacao
formado hacia la gelatina con la evolución del tiempo. Se partió de 12 g de una
solución de alginato 2%/cacao 3% p/p a la que adicionó 600 μl de solución de citrato
cálcico a 0,05 M (baja concentración de calcio) o 600 μl de citrato cálcico a 0,25 M
(alta concentración de calcio). Cada muestra se preparó en un cilindro de plástico
colocando 30 ml de gelatina neutra en la parte inferior (preparada como indica las
instrucciones del producto), una vez gelificada por refrigeración, se colocó la mezcla
homogenizada de alginato/cacao/citrato cálcico sobre ésta y adicionó 80 µl de ácido
acético para inducir la formación del gel. Todas las muestras fueron protegidas de la
luz y reservadas en refrigeración hasta su análisis. Se realizaron varias muestras de
alginato/cacao utilizando bajas y altas concentraciones de calcio a fin de realizar
mediciones a las 5, 16, 21 y 38 horas de iniciado el proceso de gelificación. Los
geles formados (alginato/cacao y gelatina) se separaron y, se realizó un corte en la
superficie de la gelatina de 1 mm de espesor, el cual se eliminó para evitar las
posibles interferencias provocadas por el contacto directo de la gelatina con el gel
alginato/cacao. A continuación, se realizó un nuevo corte a la gelatina con un
espesor de 5 mm, ésta se fundió a 35 ºC y analizó por el método de Folin-Ciocalteu
a fin de determinar los polifenoles totales difundidos hacia la gelatina a las 5, 16, 21
y 38 horas. Se prepararon blancos a partir de gelatina neutra con la finalidad de
eliminar interferencias.
124
 MATERIALES Y MÉTODOS

Por otra parte, se prepararon geles siguiendo el mismo procedimiento descrito

en el párrafo anterior pero colocando la gelatina y la mezcla alginato/cacao/citrato
cálcico en un tubo para mediciones de dispersión de luz (Turbiscan). Se
consideraron las mismas concentraciones pero utilizó la mitad de las cantidades de
cada material debido a las limitaciones del volumen del tubo. El estudio de liberación
de polifenoles desde el gel de alginato/cacao con diferente concentración de calcio
hacia la gelatina neutra se analizó por mediciones de dispersión de luz utilizando el
Turbiscan MA2000. Las mediciones se realizaron a las 5, 16, 21 y 38 horas para
cada muestra mediante un escaneo a lo largo del tubo, dando valores de BS como
una función del tiempo y la longitud del tubo.

3.4.6 Preparación y análisis de gelatinas para la aplicación de un alimento funcional.

Con el fin de estudiar y evaluar la aplicación de un producto alimentario

funcional, se prepararon gelatinas enriquecidas con la incorporación de las esferas
de alginato/cacao o encapsulados. Para llevar a cabo el estudio se aplicaron
técnicas de análisis sensorial, en primer lugar, una prueba de tipo analítica
empleando como analizador al ser humano con miras a evaluar la aceptación o
rechazo del producto según las características organolépticas percibidas. A
continuación, un análisis instrumental de las propiedades mecánicas de diferentes
tipos de gelatinas con y sin la incorporación de los encapsulados y la influencia de
estos sobre la textura con la evolución del tiempo de almacenamiento.

3.4.6.1 Preparación de las gelatinas enriquecidas con los encapsulados.

Se preparó un postre de gelatina enriquecido con esferas de alginato/cacao o

encapsulados preparadas por extrusión. Se partió de 20 g de gelatina natural neutra
hidratada previamente en 1 L de agua durante 30 min, a continuación se añadió 1 L
de agua mineral a punto de ebullición generando un total de 2 litros de gelatina
líquida. Una vez disuelta, se agregaron 100 g de fructosa, 8 ml de aroma de
frambuesa y 2 ml de colorante amarillo. Esta preparación de gelatina se reservó a
temperatura ambiente hasta ser necesaria para la elaboración del postre, y se
mantuvo en estado líquido al encontrarse por encima de su temperatura de
gelificación. La preparación de los encapsulados se llevó a cabo según los
resultados obtenidos en la caracterización las esferas (morfología, tamaño y textura)

125
 MATERIALES Y MÉTODOS

preparadas por extrusión con ambos mecanismo de gelificación a objeto de

proporcionar los encapsulados o esferas de características más adecuados para su
incorporación en un alimento (apartado 3.4.4.3). En este sentido, se prepararon
esferas alginato/cacao o cápsulas bioactivas por extrusión con el mecanismo de GI a
partir de 20 ml de solución alginato 2%/cacao 3% p/p a pH neutro y 500 μl de
solución de citrato cálcico a 0,25 M (alta concentración de calcio), éstas se gotearon
en un baño oleoso acidificado bajo agitación moderada y se mantuvieron allí durante
15 min, se filtraron, lavaron con agua y reservaron bajo refrigeración hasta su uso.
Del mismo modo, se prepararon esferas de alginato con frambuesa a partir de 20 ml
de una solución acuosa de alginato sódico al 2% p/p y frambuesa entera liofilizada
en polvo utilizando la misma cantidad que con el extracto de cacao encapsulado.
Esta mezcla se homogenizó y dejó desairear durante 24 horas. A la solución de
alginato 2%/frambuesa 3% p/p se le controló el pH y a continuación se adicionaron
unas gotas de colorante para conseguir el color natural del extracto de cacao
(burdeos). La frambuesa entera liofilizada se utilizó con el fin de obtener esferas con
alto contenido de fibra que permitiera la retención de los colorantes. Algunas esferas
se colorearon con naranja, otras con verde y el resto con burdeos. Una vez
endurecidas las esferas en el baño gelificante durante 15 min, las esferas se colaron
con una cuchara de acero para esferificaciones, se lavaron ligeramente con agua y
se almacenaron bajo refrigeración hasta su uso. Cada postre de gelatina se preparó
con 30 ml de gelatina (endulzada, aromatizada y coloreada) y 30 esferas de alginato
conformadas por 10 esferas de cada color, y se introdujeron en un vaso de plástico.
En algunos postres de gelatina se incorporaron las esferas de color burdeos
(frambuesa), para simular las esferas de alginato/cacao, y en otras se utilizaron las
esferas con el extracto de cacao (cápsulas bioactivas) en su lugar. Finalmente, tras
1 día de refrigeración se realizó la evaluación sensorial a las muestras mediante la
aplicación de una prueba de tipo discriminatorio. La Figura 3.9 muestra el aspecto
final de las gelatinas utilizadas para la cata.

126
 MATERIALES Y MÉTODOS

Figura 3.9 Postres de gelatina enriquecidas con los encapsulados preparadas para la evaluación
sensorial. Proceso de incorporación de las diferentes esferas, a y Postres de gelatinas presentados
para su evaluación sensorial, b.

3.4.6.2 Evaluación sensorial tipo discriminatorio de postres de gelatina

enriquecida con encapsulados de alginato.
El método de análisis de tipo discriminatorio se implementó a través de una
prueba triangular para los postres de gelatina. Para ello, se estableció un grupo de
20 personas de diferentes edades, conformado aleatoriamente por estudiantes y
personal del Campus de la Alimentación de la Universidad de Barcelona. Para
realizar la prueba triangular se prepararon tres muestras codificadas para cada
panelista. Estas tres muestras se presentaron simultáneamente a cada panelista
indicando que la degustación debía comenzar de izquierda a derecha, pudiendo
probar cada una tantas veces fuese necesario siempre que se respetara el orden de
las muestras. Se sugirió beber un poco de agua o comer un trozo de galleta para
eliminar posibles interferencias. A los panelistas se les informó que dos muestras
eran idénticas y una diferente, por tanto, debían identificar la muestra diferente e
indicar su respuesta en el formulario. Las muestras se presentaron en forma
aleatoria a fin de no crear tendencias en la decisión con un número posible de
combinaciones igual a seis. Las pruebas se realizaron en el Laboratorio de
Evaluación Sensorial del Dpto. de Nutrición y Bromatología, iluminado con luces
rojas para enmascarar las diferencias de intensidad de color. Las respuestas se
procesaron de acuerdo a una tabla de probabilidad estadística con α=0,05 (Mason y
Nottingham, 2002), con la probabilidad de una respuesta correcta por casualidad de
un 1/3.

127
 MATERIALES Y MÉTODOS

3.4.6.3 Preparación de las gelatinas con y sin encapsulados.

Se prepararon diferentes muestras de gelatina en cilindros de plástico

previamente lubricados con aceite vegetal para ser analizados a través de un TPA.
Cinco tipos de gelatinas fueron preparadas: en tres tipos de gelatinas se
incorporaron esferas de alginato tal como se describe a continuación:

.- Gelatinas con esferas de alginato/cacao (GEC): incorporación de esferas alginato

2%/cacao o encapsulados (cantidad de extracto utilizado en la elaboración de los
postres enriquecidos) en gelatina natural neutra.
.- Gelatinas con esferas de alginato (GEA): incorporación de esferas de alginato 2%
p/p sin el extracto de cacao en gelatina natural neutra.
.- Gelatinas como postre enriquecido (GPE): gelatinas preparadas con la misma
formulación de las gelatinas enriquecidas e incorporación de las esferas de alginato
2%/cacao o encapsulados.

Otros dos tipos de gelatinas se prepararon sin encapsulados:

.- Gelatinas con extracto de cacao sin encapsular o libre (GCL): adición directa del
extracto de cacao a la gelatina natural neutra.
.- Gelatinas neutras (GN): gelatina natural neutra sin la adición de las esferas de
alginato ni el extracto de cacao.

Las esferas de alginato 2%/cacao se prepararon por extrusión aplicando las

condiciones de formulación y el mecanismo de gelificación utilizados para la
elaboración de los encapsulados incorporados en los postres enriquecidos para su
análisis sensorial (apartado 3.4.6.1). Del mismo modo, se prepararon esferas de
alginato 2% p/p sin extracto de cacao. Se utilizó gelatina neutra para la preparación
de las muestras de GEC y GEA, la cual se elaboró de acuerdo a las instrucciones de
preparación del producto, mientras que para las GPE, se incorporó a la preparación
de la gelatina natural neutra el endulzante (fructosa), colorante y aromatizante,
ingredientes utilizados para la elaboración de las gelatinas enriquecidas como
postre, para ello se mantuvieron las proporciones indicadas en el apartado 3.4.6.1.
Para cada muestra de gelatina se utilizaron 15 ml de gelatina y 15 esferas de
alginato 2% p/p sin cacao o esferas de alginato 2%/cacao (encapsulados) según el
tipo de gelatina (GEA, GEC o GPE).

128
 MATERIALES Y MÉTODOS

Para la preparación de las GCL se adicionó directamente extracto de cacao a

la gelatina neutra (sin encapsular), se consideró la concentración de cacao utilizada
para la preparación de las esferas alginato/cacao. Al no observarse gelificación y la
formación de un precipitado se duplicó la concentración de gelatina en la
preparación. En este sentido, la GN se realizó considerando el doble de
concentración de gelatina para ser comparada con la GCL. Se finalizó, colocando
una capa delgada de aceite vegetal sobre la superficie de todas las muestras en
cada cilindro para evitar la evaporación de agua durante su almacenamiento. Todas
las muestras fueron protegidas de la luz y se mantuvieron refrigeradas. Se
prepararon las muestras necesarias para un plan de análisis de 27 días de
almacenamiento.

3.4.6.4 Análisis instrumental de las propiedades texturales de las gelatinas

con y sin encapsulados.
Para llevar a cabo el análisis instrumental de textura a los diferentes tipos de
gelatinas con el tiempo de almacenamiento se utilizó un Reómetro modular MARS III
HAAKE programado para realizar mediciones con la fuerza normal. El TPA se
realizó con un sensor de 35 mm y una placa de 60 mm lisos, una velocidad de 0,025
mm/s y 17% de deformación durante los ciclos de compresión. A partir de las curvas
de TPA se midieron las propiedades mecánicas dureza, cohesión y elasticidad, y se
calcularon gomosidad y masticabilidad. Por otra parte, el ensayo de resistencia (ER)
se realizó con un sensor de 20 mm y una placa de 35 mm rugosos para evitar
deslizamientos de la muestra a una velocidad de compresión de 0,025 mm/s
constante y un 70% de deformación.
El ensayo de resistencia aplicado a las gelatinas se realizó de acuerdo al
protocolo propuesto por Zhou y Regestein (2007) con algunas modificaciones
dadas las limitaciones del equipo. Los ensayos de TPA y ER se realizaron
periódicamente según la planificación durante los 27 días de almacenamiento, éstos
se realizaron al menos por triplicado para la GEC. La superficie de la muestra se
lubricó con aceite vegetal en aerosol antes de cada ensayo. Durante el análisis
instrumental de las propiedades texturales la temperatura se mantuvo a 5 ± 0,5 ºC a
fin de simular las condiciones de refrigeración de las gelatinas. Las gelatinas en
forma cilíndrica se cortaron con un espesor de 10 mm desde su superficie.

129
 MATERIALES Y MÉTODOS

3.4.6.5 Análisis del principio activo en las gelatinas y su evolución con el

tiempo.

A fin de evaluar la presencia de los polifenoles en las gelatinas, se analizó la

concentración de los fenoles totales en las gelatinas con los encapsulados (GEC) y
en las gelatinas con extracto de cacao libre (GCL) y su evolución con el tiempo de
almacenamiento. Para ello, se prepararon las gelatinas necesarias para cada tipo de
muestra considerando los 27 días de almacenamiento. Éstas se fundieron a 35 ºC,
en el caso de las GEC se extrajeron los encapsulados o esferas, una vez líquidas se
tomaron alícuotas y analizaron por el método de Folin-Ciocalteau agregando un 12%
v/v de solución NaCO3 de concentración 20% p/p, un 4% v/v de reactivo de Folin 2 N
y agua MilliQ hasta completar 10 ml. Se agitaron vigorosamente y dejaron reaccionar
durante 1 hora, a continuación se filtraron y procedió a la medición de su
absorbancia a 765 nm. Para eliminar interferencias se consideró en el blanco la
presencia de gelatina natural neutra. El contenido de fenoles totales fue expresado
como mg EAG/ml de solución con extracto de cacao. Las mediciones se realizaron
al menos por triplicado para expresar el valor medio ± DE.

3.4.6.6 Análisis microbiológico.

Se realizó el ensayo por siembra directa con el fin de determinar la presencia

de microorganismo en las muestras de gelatinas. Para el crecimiento de una amplia
variedad de organismos se preparó un medio con 40 g de agar/soja/triptona en 1 litro
de agua milliQ a ebullición y agitó hasta su disolución completa. El medio se
esterilizó en un horno a 140 ºC durante 3 horas (Horno Selecta) y colocó en placas
de Petri estériles (100x15 mm), se tapó y se dejó enfriar hasta su completa
gelificación. Para el aislamiento de hongos y levaduras se preparó un medio de pH
ácido con 65 g de agar/dextrosa/Sabouraud en 1 litro de agua milliQ a ebullición, una
vez disuelto se esterilizó aplicando las condiciones mencionadas anteriormente. A
continuación, se adicionó una solución de antibiótico (100 mg de cloranfenicol) en el
agar esterilizado, se homogenizó y esterilizó de nuevo. La mezcla se colocó en
placas de Petri estériles, taparon y dejaron enfriar. Se analizaron las GN, GEC y
GCL almacenadas hasta el último día de experimentación (Día 27). En este sentido,
cada muestra se inoculó empleando un bastoncillo de algodón sobre la superficie de
cada medio haciendo movimientos en zig-zag. Todas las muestras se incubaron a

130
 MATERIALES Y MÉTODOS

37 °C durante 72 horas. Se empleó la observación directa para evaluar la presencia

de microorganismos en estas muestras.

131
 MATERIALES Y MÉTODOS

132
HOJA PRESENTACIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

133
HOJA PRESENTACIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN

134
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Caracterización del Alginato de sodio.

La caracterización del alginato de sodio se llevó a cabo para determinar su

composición química (estructura y peso molecular) y presencia de otros
compuestos, a fin de identificar las características específicas del polisacárido usado
como materia prima para la preparación de los encapsulados estudiados en este
trabajo. Considerando que el alginato comercial varía en composición y peso
molecular según su origen y formulación del proveedor, y debido a la importancia
que tiene ésta sobre las características del gel formado es imprescindible su
caracterización.

4.1.1 Determinación de la composición química.

El análisis de la estructura química del alginato de sodio utilizado para la

preparación de los diferentes encapsulados, se realizó por RMN para una muestra
no hidrolizada de alginato de sodio (Panreac) tal como se explica en el apartado
3.4.1.1. A partir de ésta técnica se determinó el ratio de sus monómeros (𝑀/𝐺) y la
frecuencia de los bloques constituyentes.

4.1.1.1 Estructura química: Resonancia magnética nuclear.

El espectro resultante se procesó con el programa MestreNova v. 8.1.2

(Apéndice 9.1-Figura 9.1). Los resultados de las fracciones molares dados por los
valores de las integraciones (decovolución de los picos) y los cálculos realizados a
partir del protocolo descrito en el método de l'ASTM International se muestran en la
Tabla 4.1.

135
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 4.1 Composición y frecuencia de bloques del alginato de sodio.

Frecuencias de bloques Fracciones Longitud media Valores de N

mónadas, díadas y tríadas (F) molares de F de los bloques (N)
FG 0,41 NG 2,55
FM 0,59 NM 3,64
FGG 0,25 NG˃1 3,04
FMM 0,43
FGM 0,16
FGGG 0,13
FMGM 0,04
FGGM 0,12
Ratio M/G 1,43 58,85% M y 41,15% G

Monómeros: ácido ∝-L-gulurónico, G y ácido 𝛽-D-manurónico, M; Frecuencia de bloques, F;

Frecuencia mónada de G, FG; Frecuencia mónada de M, FM; Frecuencia díada de GG, FGG;
Frecuencia díada de MM, FMM; Frecuencia díada bloques alternados de GM, FGM; Frecuencia tríada
de GGG, FGGG; Frecuencia tríada de bloques alternados de MGM o GGM, F MGM o FGGM; Longitud
media de los bloques, N; Longitud media de los bloques-G, NG; Longitud media de los bloques-M, NM;
Longitud media de los bloques-G mayores de 1, NG˃1.

Estos resultados indican que la estructura polimérica del alginato sódico se

encuentra conformada por diferentes bloques constituidos principalmente por un
58,85% de fracciones del ácido β-D-manurónico y un 41,15% por fracciones del
ácido α-L-gulurónico. La cadena polimérica posee una distribución de bloques
heterogénea conformada de manera aleatoria entre frecuencias mónadas (F M y FG),
díadas (FMM, FGG y FGM) y tríadas (FGGG, FMGM y FGGM) como ejemplo se tiene la
estructura mostrada en la Figura 2.1. Se ha demostrado que las propiedades de los
alginatos dependen de la proporción relativa de estos tres tipos de bloques: 𝑀, 𝐺 y
alternados 𝑀𝐺 (Smidsrod y Draget, 1996). Por otra parte, a partir de estos valores
se puede calcular la longitud media de los bloques, observándose que N G˃1 es
superior a la unidad lo que puede ser un indicativo de correlación con el poder
gelificante en caso que se estuviesen empleando diferentes fuentes de alginato
(Draget, 2000). En tal sentido, los valores de la longitud media de los bloques-G
(NG=2,55) y la longitud media de los bloques-M (NM=3,64), así como las fracciones
molares o proporciones de los bloques-G (FG=0,41) y bloques-M (FM=0,59) indican
las propiedades químicas y físicas de las moléculas de alginato, sugiriendo que
existe una contribución equilibrada por parte de los bloques-G quienes proveen la
capacidad de formación del gel, y los bloques-M así como de las unidades

136
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

alternadas (MG) quienes proporcionan flexibilidad a las cadenas de los ácidos

urónicos.
En este trabajo la preparación de los diferentes encapsulados se realizó a
partir de una misma fuente de alginato de sodio, es decir, empleando alginato de
sodio de iguales características y suministrado por un mismo proveedor.

4.1.1.2 Peso molecular: Cromatografía de exclusión por tamaños.

De acuerdo a la curva de calibrado realizado con Dextranos de pesos

moleculares desde 80900 hasta 1360000 Da y a partir de la ecuación de ajuste de
tercer orden (R2 = 0,99), mostrada en el Apéndice 9.1-Figura 9.3, y la información
dada por el cromatograma del alginato sódico (Panreac) se procesaron los datos
utilizando el software Empower para el cálculo del peso molecular promedio (𝑀𝑤 ) del
alginato de sodio en 1750 kDa y el peso molecular numérico promedio (𝑀𝑛 ) en 668
kDa (Figura 4.1). La literatura señala que un alto peso molecular hace al alginato
susceptible a degradación polimérica debido a cambios bruscos de pH. Por otra
parte, su poder espesante se hace mayor lo que podría dificultar su manipulación.

Figura 4.1 Cromatograma del alginato sódico obtenido por CET. Cromatogramas del calibrado con
Dextranos de pesos moleculares entre 80900 y 1360000 Da, a; Cromatograma del alginato sódico
(Panreac) en solución acuosa 2 mg/ml, b. Peso molecular promedio, M w; Peso molecular numérico
promedio, Mn. Siglas en inglés para la Cromatografía de Permeación de gel, GPC o Cromatografía de
Exclusión por Tamaño, CET.

137
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Según Draget (2000) la relación 𝑀𝑤 ⁄𝑀𝑛 conocida como Índice de

polidispersidad (IP) permite inferir si la muestra está conformada por una mezcla de
productos de diferentes pesos moleculares (amplia distribución) para obtener una
muestra de cierto peso molecular (IP ˃ 2) o se ha producido una degradación del
polímero durante su proceso de producción o incluso de la materia prima antes de
su extracción (IP ˂ 2). La muestra de alginato de sodio utilizada presenta un IP igual
a 2,62 lo que sugiere una amplia distribución de sus pesos moleculares, por tanto, la
muestra de alginato de sodio es producto de una mezcla de diferentes tipos durante
el proceso de manufacturación, el cual es un método muy común por parte de los
fabricantes a fin de suministrar un producto de viscosidad específica. En tal sentido,
dicho resultado representa una característica de composición significativa a tomar en
cuenta durante el estudio de caracterización de sus geles y preparación de los
encapsulados.

4.1.2 Determinación de otros compuestos.

Se realizó un estudio del comportamiento térmico por DSC de diferentes

muestras de lotes de alginato sódico (Panreac) y alginato sódico (Solé Graell), los
termogramas para cada muestra se obtuvieron a través de un barrido de
temperaturas entre 30º y 300 ºC a una velocidad de 10 ºC/min bajo un atmósfera
inerte de N2 (apartado 3.4.1.2.a). A fin de determinar similitudes o diferencias se
compararon los termogramas anteriores con los señalados por la literatura. Por otra
parte, la técnica de difracción de rayos X se empleó para identificar la presencia de
otro compuesto en la muestra y una vez conocido se cuantificó por Refractometría.

4.1.2.1 Comparación entre termogramas de alginatos.

Los termogramas obtenidos del análisis de los tres lotes de alginato de sodio
suministrados por Panreac presentaron curvas calorimétricas similares, por tanto, en
la Figura 4.2 se representa su valor medio de las muestras de alginato sódico
analizado de los diferentes lotes (Apéndice 9.1) el cual se compara con el
termograma resultante del análisis del alginato sódico suministrado por Solé Graell.

138
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.2 Termogramas de alginato de sodio. …… Panreac, - - - - - Solé Graell. Picos: Endo
(endotérmico) 108,34º y 102,29 ºC; Exo (exotérmico) 239,08º y 248,83 ºC de Panreac y Solé Graell
respectivamente. Pico desconocido: 191 ºC correspondiente a las muestras de Panreac.

Puede observarse en la Figura 4.2 un segundo pico endotérmico a los 191 ºC

correspondiente al alginato de sodio suministrado por Panreac, comportamiento
prácticamente imperceptible para el caso de la muestra de Solé Graell, que puede
ser apreciado con más detalle en el Apéndice 9.1-Figura 9.6. Según investigaciones
hechas por Soares et al., (2004) el alginato de sodio analizado en una atmósfera de
N2 a 10 ºC/min presenta un pico endotérmico ancho que sugiere un proceso de
deshidratación alrededor de los 92,6 ºC seguido de un pico exotérmico alrededor de
los 250,6 ºC lo cual se atribuye a un proceso de descomposición del polímero. Este
comportamiento térmico es bastante similar en ambas muestras de alginato, sin
embargo la literatura no destaca la presencia de un segundo pico endotérmico tal
como se aprecia para la muestra de Panreac. En tal sentido, podría tratarse de la
presencia de un compuesto diferente al observarse dos picos de fusión
(endotérmicos) distintos. No obstante, aunque tengan picos de fusión diferentes,
podrían ser poliformos de la misma sustancia y tener un comportamiento similar. Por
ello, es importante realizar una mejor caracterización que permita su identificación.

4.1.2.2 Identificación del compuesto: Difracción de rayos X.

139
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados del espectro obtenido por DRX del alginato de sodio muestran
la presencia de un compuesto cristalino representado por lo picos sobresalientes
(azul) en el espectro de color rojo. Se contrastó este espectro con la base de datos y
el resultante del análisis de una muestra de ácido algínico donde se pudo observar
una clara correspondencia de los picos sobresalientes con el patrón de difracción
identificado como Sacarosa (Figura 4.3).

Figura 4.3 Espectros de difracción con rayos X. Superposición de espectros del Alginato de sodio
(rojo), Ácido algínico (verde) y Sacarosa (azul), a; Comparación del patrón de difracción de los picos
sobresalientes (azul) con la base de datos, b.

4.1.2.3 Cuantificación del compuesto: Refractometría.

Considerando la similitud del espectro obtenido por DSC para el alginato
sódico suministrado por Solé Graell con los referenciados en la literatura (Soares et
al., 2004), se tomó este como patrón (índice de refracción, IR=1,3355) para la
elaboración de la curva de calibrado con sacarosa por análisis refractométrico. Las
mediciones del IR de varias disoluciones de alginato de sodio al 2% p/p (Solé Graell)
con diferentes concentraciones de sacarosa comercial (desde 0% a 16% p/p) se
realizaron en un refractómetro Abbe. A partir de la ecuación [IR =
(0,0014.%Sacarosa) + 1,3355] resultante de la recta de calibrado (Apéndice 9.1-

140
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 9.7), se cuantificó la cantidad de sacarosa presente en una muestra de

solución de alginato de sodio (Panreac/muestra problema) al 2% p/p, el IR de la
muestra de alginato sódico fue de 1,3368. Por tanto, se obtuvo como resultado un
0,93% p/p de sacarosa presente en el alginato de sodio suministrado por Panreac y
utilizado para la preparación de los geles de alginato cálcico en el presente trabajo.

4.2 Caracterización reológica de los geles de alginato obtenidos con diferentes

sales de calcio y mecanismos de gelificación.

La realización de experimentación previa fue necesaria a fin de determinar las

características viscoelásticas de los geles de alginato preparados con diferentes
fuentes de calcio, distintas concentraciones de la sal de calcio y mecanismos de
gelificación.

4.2.1 Influencia de la concentración de calcio en los geles preparados por

gelificación externa.
En la Figura 4.4 se muestran los valores promedios del módulo de
almacenamiento (G´) a frecuencia de 1 Hz para los geles preparados por gelificación
externa (GE) a partir de soluciones acuosas de CaCl2 para las relaciones 0,1·10-3;
0,4·10-3; 0,6·10-3 y 1,2·10-3 moles Ca+2/g alginato, los datos obtenidos de G´ para
todas las frecuencias, 0,01 a 10 Hz, se presentan en el Apéndice 9.2 (Tabla 9.1).

141
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.4 Propiedades reológicas de geles de alginato con diferentes concentraciones de calcio
preparados por gelificación externa. Solución de alginato sódico 2% p/p; Concentraciones de calcio, -
-3 -3 -3 -3 +2
0,1·10 ; 0,4·10 ; 0,6·10 y 1,2·10 moles Ca /g alginato; Valor medio del Módulo de
almacenamiento, G´ (± desviación estándar) a frecuencia de 1 Hz y 25 ºC.

Los geles preparados por gelificación externa a partir de una solución de

alginato sódico 2% p/p y diferentes concentraciones de calcio, se cortaron a 2 mm
desde su superficie (espesor) y analizaron por ensayos reológicos. Se puede
observar que los valores de G´ se incrementan progresivamente al aumentar la
concentración de calcio en estos geles. Para la mayor concentración de calcio
utilizada (1,2·10-3 moles Ca+2/g alginato) se tiene un valor de G´ considerablemente
superior a los obtenidos con las menores concentraciones de calcio (0,1-0,6·10-3
moles Ca+2/g alginato), esto se atribuye a la formación de un gel más reticulado
debido a la mayor cantidad de iones calcio disponibles en la solución de CaCl2 que
permiten la formación de mayores puntos de gelificación y, por tanto, confieren al gel
una estructura más compacto (Draget, 2000). Por otra parte, los geles se
observaron completamente transparentes y homogéneos para todas las
concentraciones de calcio estudiadas.

4.2.1.1 Concentración mínima de calcio requerida para la gelificación.

Se realizó la prueba de barrido de frecuencia en los geles preparados por

gelificación externa a partir de una solución de alginato de sodio al 2% p/p y
diferentes concentraciones de calcio, [Ca+2], a partir de una solución acuosa de
CaCl2 como se explica en el apartado 3.4.2.1.a, la cual permitió determinar la

142
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

cantidad mínima de calcio requerida para que se produjera una gelificación

adecuada. Tomando en consideración que en un gel adecuadamente formado las
moléculas de alginato se unen en una red tridimensional que se extiende a toda la
masa de gel formada, en un gel existen todos los tiempos de relajación, y por tanto,
como consecuencia la respuesta viscoelástica de un gel es independiente de la
frecuencia. En tal sentido, el punto de gelificación se puede determinar si una
variable viscoelástica, por ejemplo, el módulo complejo (G*) se representa
gráficamente frente a la [Ca+2] para cada frecuencia de prueba. En la Figura 4.5 se
observa que el punto en el que todas las curvas se unen en el mismo valor
representa el valor mínimo de [Ca+2] requerido para la gelificación.

Figura 4.5 Concentración mínima de calcio requerida para la gelificación. Módulo complejo, G* como
+2 -3
función de los moles Ca /g alginato total (·10 ) para frecuencias de ‫ ס‬0,1; ◊ 1,0; □ 1,5; Δ 2,0 y ᵡ 5,0
Hz. Geles preparados por gelificación externa con alginato de sodio al 2% p/p y 0,05; 0,15; 0,25; 0,35;
0,5; 0,65; 0,75; 0,9; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 5; 10 y 15% p/p de calcio a partir de soluciones acuosas de
CaCl2 a 25 ºC.

En concentraciones más altas, se observa que todas las curvas coinciden, y

el aumento posterior de G* con la concentración de calcio puede ser atribuido a un
fortalecimiento ulterior de los geles debido a la formación de más puntos de
conexión entre las moléculas de alginato ya interconectadas (formación de una red
más compacta o cerrada). De acuerdo con la Figura 4.5, la gelificación se produce a
un valor mínimo de 0,113·10-3 moles de Ca+2/g de alginato. Los valores de G* para
todas las concentraciones de calcio y frecuencias se presentan en el Apéndice 9.2
(Tabla 9.2).

143
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.2.1.2 Influencia del pH en las propiedades reológicas del gel.

Con el fin de evaluar la influencia del pH en la formación de geles de alginato
por GE, se prepararon los geles a partir de una solución de alginato sódico 2% p/p y
una solución acuosa de CaCl2 tomando en consideración el valor mínimo de calcio
requerido determinado en el apartado anterior para la formación adecuada del gel.
En tan sentido, se tomó un valor superior al mínimo requerido e igual 0,18·10-3 moles
de Ca+2/g de alginato con la finalidad de garantizar la completa formación del gel.
Para ello, se utilizaron varias soluciones de CaCl2 con diferentes pH, entre valores
de 0,5 y 13, por medio de la adición de HCl o NaOH, como se explica en el apartado
3.4.2.1.a. Los valores de G* obtenidos en el estudio de la influencia del pH en las
propiedades reológicas de los geles se presentan en el Apéndice 9.2 (Tabla 9.3) y
representaron frente a la frecuencia en la Figura 4.6. A pesar de que puede
observarse la independencia de los valores de G* con la frecuencia, lo que parece
indicar que existe un gel adecuadamente formado en el intervalo de estudio (pH 0,5
a 13), cabe resaltar que se obtuvo un gel blanco no homogéneo con partículas
sólidas en el interior al utilizar pH por debajo de 4 en la formación de estos geles
(Figura 4.7). Este fenómeno se puede atribuir a la precipitación de ácido algínico
(Cubero et al., 2002), que produce un aumento en la respuesta viscoelástica debido
a la presencia de un material de características diferentes al gel de alginato de
calcio. Por lo tanto, no es adecuado trabajar por debajo de este pH.

Figura 4.6 Influencia del pH sobre las propiedades reológicas para un barrido de frecuencias en geles
-3 +2
preparados por GE con 0,18·10 moles de Ca /g alginato. Modulo complejo, G*. Geles preparados
con alginato de sodio al 2% p/p, 25 ºC. ̶ pH 0,5; ◊ pH 3; - pH 4; □ pH 5; ‫ ס‬pH 6; ∆ pH 8; x pH 11 y +
pH 13.

144
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Por otro lado, para valores de pH iguales a 11 o superiores se observa un

descenso del módulo complejo (G*), probablemente debido a una despolimerización
parcial del alginato, de acuerdo a las observaciones hechas por Cubero y
colaboradores (2002) en estudios del gel de alginato con pH superiores a 10.

Figura 4.7 Aspecto de los geles por influencia del pH. Formación de un precipitado a pH inferior de 4
correspondiente a la presencia de ácido algínico (izquierda) y gel de alginato a pH superior a 4
(derecha).

4.2.2 Influencia de la fuente de calcio y la concentración en los geles preparados por

gelificación interna.

Los geles preparados a partir de una solución de alginato 2% p/p, diferentes

sales de calcio (Hidróxido, Carbonato y Citrato) y varias concentraciones (0,1·10-3;
0,4·10-3; 0,6·10-3 y 1,2·10-3 moles Ca+2/g alginato), se formaron en jeringas colocando
la solución alginato/sal de calcio y sobre ésta el aceite vegetal con ácido acético
disuelto para inducir la formación del gel a través de la liberación de los iones calcio
dispersos en la solución de alginato sódico. El estudio de la influencia de las
diferentes fuentes de calcio y concentraciones se realizó a través de las propiedades
reológicas de los geles formados tras 24 horas de reacción. Los geles cilíndricos se
cortaron a 2 mm de distancia de la interfase (alginato/aceite), como se explica en el
apartado 3.4.2.2. En la Figura 4.8 se muestran los valores del módulo de
almacenamiento (G´) para las distintas sales de calcio utilizadas en el proceso de
preparación de los geles. Para cada muestra el valor medio del G´ se representó en
función de la variación de la cantidad de calcio (moles de calcio por gramo de
alginato de sodio) a 1 Hz de frecuencia. Los datos de los ensayos reológicos

145
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

obtenidos por duplicado con su correspondiente desviación estándar (DE), se

presentan en el Apéndice 9.2 para cada una de las sales de calcio estudiadas
(Tablas 9.4 al 9.6).

Figura 4.8 Propiedades reológicas de geles de alginato con diferentes sales de calcio y
concentraciones preparados por gelificación interna. о Hidróxido, ▲ Citrato y □ Carbonato de calcio.
-3 -3 -3 -3 +2
0,1·10 ; 0,4·10 ; 0,6·10 y 1,2·10 moles Ca /g alginato. Valor medio del módulo de
almacenamiento, G´ para 1 Hz de frecuencia a 25 ºC.

Se observa, en general, cómo al aumentar la concentración del agente

entrecruzante (sal de calcio) el valor de G´ aumenta, indicando que se ha formado
un gel más compacto. Los valores de G´ más bajos se obtuvieron al usar el
carbonato de calcio y los valores más altos con el hidróxido de calcio. Sin embargo,
al utilizar la relación superior de 1,2·10-3 moles de Ca+2/g alginato los valores de G´
fueron muy similares para todas las sales de calcio, indicando que las características
viscoelásticas de los geles formados para esta concentración son independientes de
la fuente de calcio empleada. Por otra parte, cabe destacar que al emplear Ca(OH) 2
se apreció por observación directa que durante la preparación de la mezcla
conformada por solución de alginato/sal de calcio había que gelificaban
rápidamente. Una vez trascurridas las 24 horas de reacción, se obtuvo un gel
heterogéneo con partes formadas por hilos blancos, zonas de gel transparente y
otras aún líquidas. Este factor de heterogeneidad podría explicar la marcada
diferencia de los valores de sus módulos de almacenamiento (G´) entre las muestras
del mismo gel, y por tanto, la diferencia importante observada entre los valores de

146
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

las desviaciones estándar resultantes (Figura 4.9) para cada caso de concentración
de calcio utilizada en los geles de alginato formados a partir de Ca(OH)2 respecto al
resto de los geles preparados con las diferentes sales de calcio.

Figura 4.9 Desviaciones estándar de G´ en geles de alginato preparados por GI con diferentes sales
de calcio y concentraciones. Módulo de almacenamiento, G´; Desviación estándar, DE. Barras
contorno discontinuo, Ca(OH)2, barras relleno de tramas a rayas, (CaCO 3) y barras relleno de tramas
a puntos, Citrato de calcio.

La característica de formación del gel heterogéneo en los geles donde se

utilizó Ca(OH)2 puede atribuirse al producto de solubilidad (Kps) dado por la sal de
calcio utilizada, en cuyo caso se tiene que para el Ca(OH)2 su producto de
solubilidad (Kps) a 25 ºC es igual a 5,02·10-6 y, por tanto, mayor respecto al Kps dado
a la misma temperatura para el CaCO3 e igual a 6,0·10-9 (Generalic, 2013). En tal
sentido, los valores de Kps indican que habría una mayor cantidad de iones calcio
solubles disponibles al utilizar como fuente de calcio la sal de hidróxido de calcio, lo
que provocaría una reacción prematura y no controlada de gelificación, y con ello, la
formación de pequeños trozos de gel antes de iniciar el proceso de gelificación
interna para la liberación del calcio insoluble al acidificar el medio. Al no formar un
gel homogéneo, esta sal no resulta adecuada.
Respecto a los geles formados con carbonato de calcio se observaron muy
transparentes y con presencia de huecos o poros probablemente producto de la
liberación de CO2 durante la reacción de gelificación (Chan et al., 2002). Por otro
lado, los geles formados a partir de citrato de calcio mostraron la presencia de

147
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

puntos blancos al utilizar mayor cantidad de esta sal de calcio, indicando un exceso
de la misma, que quedaba precipitada en el seno del gel. Los geles preparados con
citrato de calcio parecen ser más compactos que los obtenidos con carbonato de
calcio dados los valores de G´ mayores para las concentraciones entre 0,1-0,6·10-3
moles Ca+2/g alginato (Figura 4.8), probablemente debido a la ausencia de poros ya
que en este caso no se desprende dióxido de carbono durante el proceso de
formación del gel. En todo caso ambos geles muestran una mejor reproducibilidad
de los resultados al observarse DE mucho menores y cercanas entre muestras,
mientras los valores obtenidos para los geles preparados con hidróxido de calcio
fueron muy variables, precisamente debido a que en este caso los geles formados
no son homogéneos. Considerando la reproducibilidad de los resultados, los valores
de G´ y la homogeneidad de los geles formados a partir de citrato de calcio, se
realizaron mayores estudios del proceso de formación de este gel por el mecanismo
de gelificación interna con citrato como fuente de calcio.

4.2.2.1 Influencia de la concentración de citrato cálcico y la distancia desde la

interfase alginato/aceite en el comportamiento reológico de los geles
preparados por gelificación interna.

Los geles de alginato formados por el mecanismo de gelificación interna en

jeringas se prepararon a partir de solución de alginato 2% p/p y diferentes
concentraciones de solución de citrato cálcico (0,02; 0,05; 0,08 y 0,17 M). Una vez
homogenizada la mezcla alginato/citrato se colocó en el cilindro y sobre ésta el
aceite con el acético disuelto. La muestra se dejó gelificar durante 24 horas a 25 ºC,
tal como se explica en el apartado 3.4.2.2.a. Los geles cilíndricos formados se
cortaron a 2 mm de distancia de la interfase (alginato/aceite), y sucesivamente hasta
alcanzar los 20 mm de distancia a la interfase, manteniendo un espesor para cada
muestra de 2 mm. El estudio de la influencia de la concentración de calcio en las
características del gel en función de la distancia a la interfase se realizó por medio
de ensayos reológicos a través de un barrido de frecuencias entre 0,01 y 10 Hz. A
continuación, se muestra en la Figura 4.10 el comportamiento del módulo de
almacenamiento (G´) a frecuencia de 1 Hz de los geles con la distancia a la interfase
(alginato/aceite) para diferentes concentraciones de calcio.

148
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.10 Influencia de la concentración de citrato de calcio con la distancia a la interfase

alginato/aceite en las propiedades reológicas de sus geles preparados por GI a 25 ºC. Geles
-3 -3 -3 -3 +2
preparados con □ 0,1·10 ; ● 0,4·10 ; ♦ 0,6·10 y ▲ 1,2·10 moles Ca /g alginato. Módulo de
almacenamiento, G´ a frecuencia de 1 Hz.

Puede observarse que los valores de G´ disminuyen a medida que nos

alejamos de la interfase del gel formado, es decir, de la superficie de contacto
solución alginato/sal de calcio con el aceite vegetal acidificado (aceite/acético) para
las relaciones de concentración entre 0,4·10-3 y 1,2·10-3 moles de Ca+2/g alginato,
mientras que para 0,1·10-3 moles de Ca+2/g alginato sólo fue posible analizar el trozo
de gel formado correspondiente a los 4 mm desde la interfase (Figura 4.10). Este
aspecto se atribuye a que la cantidad de calcio presente no fue suficiente para
garantizar un avance adecuado del proceso de gelificación y, por tanto, para la
formación completa del gel de alginato. Considerando que los valores de G´ se
presentaron muy similares a lo largo del gel para cada muestra estudiada entre las
relaciones de concentración utilizadas de 0,4·10-3 y 1,2·10-3 moles de Ca+2/g
alginato, se puede decir que a partir de 0,4·10-3 moles de Ca+2/g alginato se tiene
suficiente calcio para una gelificación completa, y probablemente con un mayor
tiempo de reacción los valores de G´ a lo largo del gel aumentarían hasta situarse en
valores muy parecidos a los obtenidos cerca de la interfase para cada
concentración.

4.2.2.1.a Influencia de la concentración de acético en las características reológicas

de los geles con diferentes concentraciones de calcio.

149
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Figura 4.11 se puede observar la representación del módulo complejo

(G*) a frecuencia de 1 Hz dentro de la zona de viscoelasticidad lineal para los geles
preparados por GI. Los geles se formaron a partir de una solución de alginato 2%
p/p con diferentes concentraciones de citrato cálcico (0,02; 0,05; 0,08 y 0,17 M) y a
la cual adicionó una solución acuosa de ácido acético a diferentes concentraciones
(4,02·10-3, 9,42·10-5 y 6,36·10-6 M) como agente de liberación de los iones calcio
presentes en la solución alginato/sal de calcio, tal como se describe en el apartado
3.4.2.2.a. Los valores de G* mostrados en la Figura 4.11 se presentaron
prácticamente independientes de la concentración de ácido, dependiendo
fundamentalmente de la cantidad de calcio. Esto pudiera atribuirse a la formación de
un complejo sistema acético-citrato que actúa como regulador del pH y, por tanto, el
calcio liberado no depende del acético incorporado, y sí de la cantidad de citrato,
que determinaría la concentración de calcio que puede ser liberada. A más citrato,
más calcio liberado y con esto la formación de un gel más fuerte.

Figura 4.11 Influencia de la concentración del acético en las propiedades reológicas de los geles
preparados por GI para diferentes concentraciones de calcio. Soluciones de citrato cálcico a 0,02;
-3 -5 -6
0,05; 0,08 y 0,17 M; Solución acuosa de ácido acético a ◊ 4,02·10 M, ∆ 9,42·10 M y ■ 6,36·10 M;
Módulo Complejo, G* a frecuencia de 1 Hz y 25 ºC.

4.2.2.1.b Tiempo de liberación total del calcio.

A fin de determinar el tiempo de liberación total de los iones calcio por el

mecanismo de gelificación interna, se prepararon varias soluciones acuosas de
citrato cálcico a 0,05 M, a éstas se adicionó la misma cantidad de acético glacial y

150
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

una vez homogenizadas se realizaron mediciones para determinar la cantidad de

iones calcio presentes en solución para diferentes tiempos cada 2 min hasta
completar 30 min. Se puede observar en la Figura 4.12 que al cuantificar la cantidad
del ion calcio mediante la utilización de un electrodo selectivo de iones, se
detectaron 0,035·10-7 moles de Ca+2 disponibles en la solución de citrato a tiempo
cero (antes de la adición del acético). A continuación, se pudo apreciar que una vez
añadido el agente de liberación de los iones calcio (ácido acético), la liberación de
éstos fue muy rápida, pasando con tan solo 2 min de reacción a 3,57·10-7 moles
Ca+2, aumentando progresivamente la disponibilidad de los iones calcio en solución
hasta los 10 min y, finalmente permaneciendo con un valor prácticamente constante
de 4,31·10-7 moles Ca+2 desde los 10 min hasta los 30 min de reacción. En tal
sentido, puede decirse que la cantidad de calcio disponible en una solución de
citrato cálcico de 0,05 M para las condiciones estudiadas y en referencia al valor de
los moles da calcio detectados hasta los 30 min, es de apenas un 0,8% de iones
calcio sin la adición del acético, la cual puede ser incrementada en un 99,5% con la
adición del acético glacial tras 10 min de reacción.
La sal de citrato cálcico no ha sido una fuente de calcio utilizada comúnmente
en los estudios de formación de geles de alginato, a diferencia del carbonato de
calcio (Chan et al., 2002, 2006; Choi et al., 2002; Silva et al., 2006; Zhao et al.,
2007; Chen y Subidare, 2006, 2007; Funami et al., 2009; Guan et al., 2011). En el
presente estudio, debido a los resultados de viscoelasticidad mostrados y al aspecto
visual más homogéneo de los geles observado al utilizar citrato, se puede inferir que
la utilización de esta sal de calcio para la formación de geles de alginato por
gelificación interna parece ser una fuente alternativa frente a otras empleadas
tradicionalmente.

151
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.12 Liberación del calcio total en el tiempo. Solución citrato de calcio 0,05 M, 25 ºC.

4.2.3 Comparación de las propiedades reológicas entre los geles de alginato

obtenidos por gelificación externa y gelificación interna.

Este apartado compara las propiedades viscoelásticas de los geles de

alginato cálcico obtenidos a partir de los diferentes mecanismos de gelificación
utilizados y la influencia de la concentración de calcio en las características de los
mismos. La Figura 4.13 recopila los resultados generados por los ensayos
reológicos a frecuencia de 1 Hz en los apartados anteriores para los geles
preparados por gelificación externa e interna con diferentes concentraciones de
calcio. Se puede observar que, independientemente del mecanismo de gelificación
empleado para la formación del gel, las propiedades viscoelásticas de los geles
muestran la misma tendencia de variación con la concentración de calcio, al
producirse un incremento progresivo de los valores del módulo de almacenamiento
(G´) con el aumento de la concentración de calcio para todos los casos, lo que indica
la formación de un gel cada vez más compacto.

152
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.13 Propiedades reológicas de los geles de alginato preparados con diferentes mecanismos
de gelificación y concentraciones de calcio a 25 ºC. о Hidróxido (GI), ▲ Citrato (GI), □ Carbonato (GI)
-3 -3 -3 -3 +2
y - Cloruro de calcio (GE). 0,1·10 ; 0,4·10 ; 0,6·10 y 1,2·10 moles Ca /g alginato. Módulo de
almacenamiento, G´ a frecuencia de 1 Hz y 25 ºC.

Por otra parte, se puede observar que al utilizar las concentraciones entre 0,1-
0,6·10 moles Ca+2/g alginato los valores de G´ para los geles formados por GE se
-3

presentan ligeramente superiores respecto a los geles obtenidos por GI con la sal de
CaCO3 pero con valores de elasticidad menores respecto al resto de los geles
preparados por GI a partir de las sales de hidróxido y citrato de calcio. Esta
diferencia entre los geles preparados por GE y los geles formados a partir de
carbonato cálcico por GI, podría atribuirse a un debilitamiento del gel preparado por
GI como consecuencia de la liberación del CO2 producido durante el proceso de
gelificación que provoca la presencia de cavidades en su estructura. Sin embargo,
este aspecto se presenta diferente al compararse los resultados de los geles
preparados por GE respecto a los geles preparados por GI con las sales de
hidróxido y citrato de calcio. En este sentido, los valores de G´ muestran que para el
rango de concentraciones estudiado entre 0,1·10-3 y 0,6·10-3 moles Ca+2/g alginato,
los geles preparados con citrato cálcico por GI se presentaron más compactos
respecto a los obtenidos por GE. Esto podría explicarse debido a la formación de un
gel más homogéneo al tenerse la fuente de calcio distribuida en la solución del
polímero. En otras palabras, la red del gel formado por GI es más abierta pero más
uniforme que la presentada por GE, que presenta una zona externa muy compacta
porque tiene mucho calcio y una zona interna mucho menos reticulada porque no
todo el calcio ha llegado hasta allí. En el caso de los geles preparados con Ca(OH)2,
153
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

los valores de G´ superiores respecto a los obtenidos para los geles por GE, para
este mismo rango de concentraciones, puede ser producto de las zonas irregulares
observadas en la estructura del gel preparado por GI durante su gelificación,
provocando la formación de un gel heterogéneo, probablemente causado por la
presencia de una cantidad importante de iones en calcio en la solución de hidróxido
cálcico que produjeron una pregelificación de algunas partes del gel, antes de la
adición del agente acidificante (acético) para la liberación del calcio insoluble, tal
como se explicó en el apartado 4.2.2.
Por otra parte, se puede observar en la Figura 4.13 que al utilizar la mayor
concentración de calcio (1,2·10-3 moles C+2/g alginato) para la preparación de los
geles, los valores de G´ obtenidos para los geles formados por GI, se presentaron
similares entre sí para las diferentes sales de calcio y, por tanto, estos valores de
elasticidad parecen indicar que la característica de los geles para esta concentración
y condiciones de estudio son independientes del tipo de sal empleada, mientras que
el valor de G´ para el gel preparado por GE a la misma concentración de calcio se
muestra superior (en un 56%) respecto a los valores de G´ obtenidos para los geles
preparados por GI. Este aspecto que se muestra contrario a los resultados
observados para el rango inferior de concentraciones de calcio, podría ser atribuido
al tipo de mecanismo de gelificación y método de preparación utilizado para la
formación del gel. En este sentido, el gel preparado por GE pudo mostrar un mayor
carácter sólido debido a su proceso de formación para esta concentración, en donde
inicialmente y debido a una mayor cantidad de iones calcio disponibles en la
solución acuosa de CaCl2, se pudo formar una superficie de gel en la interfase
(alginato/solución CaCl2) más cerrada que ralentizara la difusión de los iones calcio
al interior del polímero como consecuencia de la saturación de ésta con los iones
calcio, lo que podría inducir a un mayor entrecruzamiento del gel en la superficie que
en el interior del mismo (Chan et al., 2006) y, por tanto, provocaría una superficie
más compacta de gel y, con ello valores de G´ superiores. Mientras que, en los geles
preparados por GI la sal de calcio es distribuida en el seno de la solución polimérica,
y por tanto, los iones calcio aunque se encuentren también en mayor cantidad
dependen para su liberación de la penetración del acético que se difunde desde el
aceite hacia el interior de la solución alginato/sal de calcio en donde se produce la
formación del gel. Por ello, se forma un gel más homogéneo y compacto en el

154
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

interior de su estructura pero de superficie más abierta que proporciona unas

características reológicas diferentes.

4.3 Estudio del método de preparación de las microesferas de alginato en

emulsión por gelificación interna.

Los estudios previos de preparación de los geles de alginato por gelificación

interna a partir de las diferentes fuentes de calcio, permitieron establecer las
condiciones iniciales del método de preparación de las microesferas de alginato en
emulsión. En tal sentido, se tomaron en cuenta las características reológicas de los
geles obtenidos con las sales de carbonato y citrato de calcio ya que los valores de
G´ presentaron mejor reproducibilidad de los resultados y mostraron un aspecto más
homogéneo que los preparados con hidróxido de calcio. Por otra parte, se consideró
la utilización del ácido acético glacial sin diluciones debido a su efecto regulador del
pH, un tiempo de reacción superior a los 12 min y una concentración de calcio
superior al mínimo requerido para garantizar la formación del gel. Con el fin de
estudiar el método de preparación de las microesferas en emulsión, se realizaron
ensayos preliminares para observar el efecto del tipo de sal de calcio (citrato o
carbonato) y su concentración en la distribución de tamaño de partícula y morfología
de las microesferas. Una vez seleccionada la fuente de calcio (elegida la sal), se
estudia la estabilidad de las emulsiones empleando diferentes tipos de tensioactivos
y concentraciones, ya que unas emulsiones más estables facilitarían a priori una
formación de microesferas de tamaños más homogéneos. Una vez establecido el
mejor sistema se realiza un estudio sistemático del efecto de las variables de
composición y preparación en la obtención de microesferas de alginato con el
principio activo a encapsular.

4.3.1 Obtención de las microesferas de alginato con diferentes sales de calcio y

concentraciones en emulsión por gelificación interna.

Las microesferas de alginato se prepararon a partir de una mezcla de alginato

de sodio al 2% p/p y soluciones de carbonato o citrato de calcio a 0,05 M y 0,15 M,
como se explica en el apartado 3.4.3.1 según el protocolo propuesto por Poncelet
(2001) y utilizando un 5% p/p de tensioactivo span 80 respecto al aceite (fase

155
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

oleosa). La emulsión W/O se preparó en un minireactor de 100 ml a 250 rpm y 25 ºC

a través de la adición por goteo manual de la fase dispersa (alginato/sal de calcio)
en la fase oleosa (aceite/span 80), una vez formada la emulsión se indujo el proceso
de gelificación de las gotas con la adición de otra parte del aceite vegetal con ácido
acético disuelto. Se pudo observar que las microesferas obtenidas con la mayor
concentración de citrato de calcio (0,15 M) se presentaron amorfas y en su mayoría
con tamaños superiores a las 1000 µm (Figura 4.14), probablemente debido a la alta
viscosidad de la mezcla de sal/alginato que dificultó una adecuada dispersión en la
fase oleosa. Por lo tanto, las microesferas preparadas con 0,15 M de citrato de
calcio se descartaron del estudio.

Figura 4.14 Imágenes de las microesferas de alginato preparadas en emulsión por gelificación
interna. Solución de alginato al 2% p/p, solución de citrato de calcio a 0,15 M, 25 ºC.

La distribución de tamaño de partícula se calculó por frecuencia estadística a

partir de la medición de los diámetros de 300 microesferas (Apéndice 9.3)
empleando el tipo de frecuencia relativa. De acuerdo con la Figura 4.15, se puede
observar que las microesferas de menor tamaño se obtuvieron al utilizar citrato de
calcio (0,05 M). Mientras que, las microesferas preparadas con carbonato de calcio
se presentaron más grandes y con tamaños muy similares para ambas
concentraciones utilizadas. Por otro lado, se ha señalado que las microesferas de
hasta 100 micras pueden ser añadidas a una amplia variedad de alimentos sin

156
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

cambiar sus propiedades sensoriales (Augustin, 2003), y por tanto, sería adecuado
los tamaños presentados por las microesferas preparadas con citrato de calcio a
0,05 M para ser añadidas a los alimentos sin que se note su presencia en cuanto a
propiedades organolépticas.

Figura 4.15 Distribución de tamaños de las microesferas de alginato preparadas en emulsión por
gelificación interna. Solución de alginato al 2% p/p con diferentes sales de calcio: ∆ Citrato 0,05 M; о
Carbonato 0,05 M y □ Carbonato 0,15 M, 25 ºC y 5% p/p tensioactivo S80.

4.3.1.1 Influencia de las diferentes sales de calcio y concentraciones en la

distribución de tamaño de las microesferas.

La prueba t de Student se aplicó para determinar la existencia o no de

diferencias significativas entre dos poblaciones mediante el Statgraphics Plus
(Version 5.1 Statistical Graphics Corporation, Rockville, USA, 2000). El valor
estadístico de la prueba t de Student, | t0 |, se puede calcular a partir de la siguiente
ecuación:

1 1
|𝑡0 | = |𝑦
̅̅̅1 − ̅̅̅|)/(𝑆
𝑦2 𝑝 √ ⁄𝑛1 + ⁄𝑛2 ) (34)

Donde ̅̅̅
𝑦1 y ̅̅̅
𝑦2 son los valores medios de las poblaciones que deben compararse; 𝑆𝑝
es la desviación estándar ponderada de los dos grupos; 𝑛1 y 𝑛2 son los tamaños de
las muestras de los grupos.
Al seleccionar un nivel de significación de α = 0,05 para un tamaño de
muestra de 300 microesferas, se tiene un valor crítico tabulado de t α/2, n1 + n2 - 2 igual

157
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

a 1,960 (Harris, 2003) según la tabla estadística mostrada en el Apéndice 9.3. Los
valores estadísticos de | t0 | por debajo de este valor indican que las poblaciones no
son significativamente diferentes. Con el fin de poder discernir la existencia o no de
una diferencia significativa se analizaron las distribuciones de tamaño de las
microesferas para todos los casos por análisis estadístico a través del Statgraphics
Plus. En la Figura 4.16 se muestran los ajustes de las distribuciones de las
microesferas preparadas con las diferentes sales de calcio y concentraciones a
distribuciones de tipo Log-normal.

Figura 4.16 Distribución de tamaño de las microesferas preparadas con diferentes sales de calcio y
concentraciones. Citrato cálcico a 0,05 M, a; Carbonato cálcico 0,05 M, b y Carbonato cálcico 0,15 M,
c para distribuciones de ajuste de tipo Log-normal.

En la Tabla 4.2 se comparan los valores de |t0| de las poblaciones de [CaCO3]

= 0,05 y 0,15 M, y las poblaciones de [CaCO3] = 0,05 M y [citrato de calcio] = 0,05 M.
Se puede observar que las poblaciones de las microesferas preparadas con las dos
concentraciones de CaCO3 no tienen una diferencia significativa en sus tamaños, ya
que los valores de |t0| son menores al valor crítico tabulado. Lo cual indica que la
distribución del tamaño de las microesferas no se ve afectada por la concentración
de calcio dentro del rango de concentración de CaCO3 utilizado.

158
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 4.2 Distribución de tamaño de las microesferas para diferentes fuentes y concentraciones de
calcio dadas las distribuciones de ajuste de tipo Log-normal.

Comparación de la Media Comparación de la Media

para diferentes concentraciones para diferentes sales
Distribución Comparación Carbonato Carbonato Carbonato Citrato
Іt0І Іt0І
de ajuste Parámetros 0,05 M 0,15 M 0,05 M 0,05 M
Distribución Media (µm) 65,66 64,14 0,31 65,66 33,93 6,47
Log-normal DE 47,29 53,98 47,49 27,71
DE: desviación estándar.

Por otro lado, cuando la naturaleza de la sal se cambia de CaCO3 a citrato de

calcio, se observan diferencias estadísticamente significativas, obteniendo tamaños
medios sensiblemente menores al utilizar el citrato cálcico. Por ello, se deduce una
clara influencia del tipo de fuente calcio sobre la distribución de tamaño de las
microesferas.
En estadística descriptiva, un diagrama de caja (Figura 4.17) es una manera
conveniente de representar gráficamente los grupos de datos numéricos a través de
sus cinco resúmenes de números a fin de analizar su nivel de dispersión, donde: las
observaciones más pequeñas se denominan, menor cuartil; la mediana, cuartil
medio; y las observaciones más grandes, cuartil superior (Harris, 2003). Los puntos
externos se muestran por separado cuando se tienen valores de más de 1,5 veces el
rango intercuartil por encima o por debajo de la caja (pequeños cuadrados). Para los
puntos externos más distantes, los cuales se encuentran a más de 3,0 veces el
rango intercuartil por encima o por debajo de la caja, se utilizan pequeños cuadrados
con el signo (+) en su interior. La Figura 4.17 muestra que cuando se utiliza citrato,
la mayor parte de las microesferas tienen un diámetro inferior a 100 micras, es decir,
el límite para evitar cambios en las propiedades sensoriales de los alimentos a los
que se podrían añadir. Además, se tiene una representación más estrecha de la
caja, cuartil medio, que cuando se utiliza CaCO3 en su lugar.

159
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.17 Dispersión del tamaño de las microesferas preparadas en emulsión por gelificación
interna con diferentes sales de calcio y concentraciones. Solución de alginato 2% p/p, Soluciones de
citrato, 0,05 M; carbonato, 0,05 M y carbonato de calcio, 0,15 M, 25 ºC.

4.3.1.2 Influencia de las diferentes sales de calcio y concentraciones en la

morfología de las microesferas.

Tomando en cuenta que la concentración de CaCO 3 no influye sobre la

distribución de tamaño de las microesferas en el rango de concentraciones
estudiado, y que para el caso de la sal de citrato al utilizar una alta concentración de
calcio se producen partículas de gel irregulares y de gran tamaño debido a que la
alta viscosidad no permite una emulsificación adecuada, se decide observar la
morfología de las microesferas preparadas para una baja concentración de las dos
sales de calcio estudiadas, y compararlas entre sí. En la Figura 4.18 se muestran las
imágenes realizadas por microscopía óptica a las microesferas de alginato
preparadas en emulsión por gelificación interna a partir de soluciones de carbonato y
citrato de calcio a 0,05 M. En ambos casos el aspecto es esférico. Sin embargo, las
microesferas preparadas con citrato parecen tener una superficie uniforme mientras
que las microesferas obtenidas con carbonato tienen un aspecto rugoso.

160
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.18 Imágenes por microscopía óptica de las microesferas de alginato preparadas en
emulsión por gelificación interna. Soluciones de alginato 2% p/p con diferentes sales cálcicas en
soluciones acuosas a 0,05 M de Carbonato, a y Citrato de calcio, b.

Esta característica morfológica, se pudo apreciar con más detalle en las

imágenes obtenidas por SEM de las microesferas previamente deshidratadas
(Figura 4.19). En donde se observa (Figura 4.19a) la presencia de huecos o
agujeros en la superficie de las microesferas preparadas con CaCO 3, lo que podría
atribuirse a la liberación de dióxido de carbono durante el proceso de gelificación
(Chan et al., 2002; Choi et al., 2002; Zhao et al., 2007). Teniendo en cuenta la
morfología de la superficie de las microesferas obtenidas con CaCO3, se infiere que
este aspecto podría facilitar la liberación prematura del compuesto activo
encapsulado. Por otro lado, se tiene el hecho de que se obtienen esferas más
pequeñas cuando se utiliza citrato de calcio, por tanto, esta sal es seleccionada
como la fuente de calcio.

Figura 4.19 Imágenes obtenidas por SEM de microesferas de alginato deshidratadas. Microesferas
preparadas en emulsión por GI a partir de una solución de alginato 2% p/p y soluciones acuosas de
sales cálcicas a 0,05 M de Carbonato, a y Citrato de calcio, b.

161
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.3.2 Estudio de estabilidad de las emulsiones para la obtención de las microesferas

de alginato.

Con la intención de obtener una emulsión lo más estable posible para la

preparación de microesferas de alginato con una distribución de tamaños más
uniforme, se prepararon emulsiones W/O con varios tipos de tensioactivos (S80,
S85, S80T80 y PGPR) y concentraciones (2%, 5% y 10% p/p) para el estudio de su
estabilidad, partiendo de 10 g de emulsión total, con un 20% de fase acuosa o
dispersa constituida por solución de alginato 2% p/p y la sal de citrato cálcico a 0,05
M seleccionada como fuente de calcio en los estudios anteriores y, un 80% de fase
oleosa, conformada por el aceite vegetal y el tensioactivo, sin el acético para evitar
la formación de microesferas a fin de observar la estabilidad de la emulsión con el
tiempo (apartado 3.4.3.2).

4.3.2.1 Influencia de la concentración y tipo de tensioactivo en la estabilidad

de la emulsión.

La Figura 4.20 muestra la evolución de retrodifusión (Back Scattering, BS),

medido con el Turbiscan MA2000, para las emulsiones W/O con 20% p/p de fase
dispersa y diferentes concentraciones de varios tensioactivos (S80, S85, S80T80 y
PGPR). Se puede observar una disminución del %BS cuando se utilizan
tensioactivos de tipo spans o una mezcla de span-tween, lo que indica un fenómeno
de desestabilización rápida con el tiempo de estudio de 14 min. En tanto que, al
utilizar polirricinoleato de poliglicerol (PGPR), el %BS permanece prácticamente
constante para todas las concentraciones estudiadas.

162
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

a b
35 35

30 30
Back-Scattering (%)

Back-Scattering (%)
25 25

20 20

15 15

10 10

5 5

0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (min) Tiempo (min)

c d
35 35

30 Back-Scattering (%) 30
Back.Scattering (%)

25 25

20 20

15 15

10 10

5 5

0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (min) Tiempo (min)

Figura 4.20 Perfil de desestabilización cinética para las emulsiones W/O con 20% de fase acuosa y
varias concentraciones de tensioactivo. S80, a; S85, b; S80T80, c y PGPR, d al ◊ 2%, □ 5% y Δ 10%
p/p y 25 ºC. El %BS representa la media de los valores dados a los 20 - 25 mm y 50 - 55 mm de
longitud del tubo.

La disminución con el tiempo de los valores de %BS se podría explicar debido

a la coalescencia de las gotas de la fase dispersa (solución alginato/citrato). En tal
sentido, a fin de determinar la cinética de desestabilización de las emulsiones, se
calculó el porcentaje de coalescencia (%C) a partir de la ecuación (31) cuyos
resultados se muestran en la Tabla 4.3. Cabe destacar, que la mayoría de los
trabajos reportan la utilización de tensioactivos tipo spans como el S80 y S85 en la
preparación de microesferas de alginato por GI (Poncelet, 2001; Chan et al., 2002;
Zhang et al., 2006; Chen y Subirade, 2006; Zhao et al., 2007). Sin embargo, los
resultados en este estudio indican que las emulsiones formadas con ellos son las
más inestables, ya que poseen el mayor porcentaje de coalescencia.

163
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 4.3 Variación del back scattering y coalescencia de las emulsiones W/O con el tiempo.

Tensioactivo Tiempo=0 Tiempo=14 min

2% p/p %BS in %BSf %C
S80 27,80 17,59 36,73
S85 15,84 12,14 23,36
S80T80 13,12 10,90 16,92
PGPR 25,55 24,39 4,54
5% p/p %BS in %BSf %C
S80 18,73 13,86 26,00
S85 16,77 10,65 36,49
S80T80 19,16 13,47 29,69
PGPR 25,88 24,77 4,29
10% p/p %BS in %BSf %C
S80 30,58 17,77 41,89
S85 22,94 15,64 31,82
S80T80 28,56 24,01 15,93
PGPR 22,80 22,63 0,75
%BS in: back scattering inicial; %BS f: back scattering final; Porcentaje de
coalescencia, %C. Tensioactivos Span 80, S80; Span 85, S85; Span 80 y
Tween 80, S80:T80; Polirricinoleato de poliglicerol, PGPR.

Por otra parte, se manifiesta que a pesar del aumento de la cantidad de

tensioactivo al utilizar S80, S85 y S80/T80 no se produce una mejora de la
estabilidad de las emulsiones. Los valores más bajos de coalescencia, y con una
diferencia importante respecto al resto de los tensioactivos, se obtuvieron al utilizar
el PGPR para todas las concentraciones. Este aspecto indica que las emulsiones
preparadas con PGPR son más estables. Además, al incrementar el % de PGPR en
la fase oleosa se obtuvo un %C menor (4,54 a 0,75 %C), lo que determina la
formación de emulsiones más estables para el intervalo de concentraciones
estudiado. Este comportamiento también fue observado por Márquez y
colaboradores (2010) en emulsiones W/O con PGPR y un 10% p/p de fase dispersa
en aceite de girasol, donde incluso se señaló una mejora de la estabilidad de la
emulsión con la presencia de sales de calcio en el sistema. Se conjetura que con
emulsiones más inestables probablemente se formarán esferas con una distribución
de tamaños muchos más amplia y, por ello, serán menos adecuadas para la
preparación de dichas microesferas que las preparadas con PGPR, que son, como
se ha visto, mucho más estables, cosa que se comprueba a continuación.

164
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.3.2.2 Influencia de la estabilidad de las emulsiones en la distribución de

tamaño de las microesferas de alginato.

Con la finalidad de observar la influencia de los tensioactivos utilizados sobre

la distribución de tamaño de las microesferas, se prepararon esferas de alginato en
emulsión a partir de una fase dispersa de alginato al 2% p/p y 1 ml de solución de
citrato de calcio a 0,05 M en una fase oleosa con un 5% p/p de los tensioactivos
estudiados: S80, S85, S80-T80 y PGPR y con la adición de ácido acético glacial
previamente disuelto en una parte del aceite vegetal para inducir la gelificación de
las gotas (apartado 3.4.3.2.b). Se puede observar en la Figura 4.21 la distribución de
tamaño de las microesferas de alginato obtenidas para cada muestra a partir de los
diferentes tensioactivos, donde las microesferas de menor tamaño fueron producidas
al utilizar el PGPR, seguidas en orden creciente de las microesferas preparadas con
S85, S80 y finalizando con el S80-T80.

40
35
30
% Frecuencia relativa

25
20
15
10
5
0
1 10 100 1000
Diámetro (μm)

Figura 4.21 Distribución de tamaño de las microesferas preparadas con □ S80, ◊ S85, Δ S80T80 y ‫ס‬
PGPR al 5% p/p. Polirricinoleato de poliglicerol, PGPR. Solución alginato 2% p/p, Solución de citrato
de calcio 0,05 M, 25 ºC.

Al estudiar la dispersión del tamaño de las microesferas preparadas en

emulsión por GI con los diferentes tensioactivos al 5%p/p a través del diagrama de
caja (Figura 4.22), se aprecia la polidispersidad en los tamaños de las microesferas
de alginato obtenidas. La representación muestra el cuartil medio menos estrecho al
utilizar PGPR, seguido del S85, S80 y finalizando con S80-T80, lo que, coincide con

165
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

el orden de la distribución de tamaño de las esferas de menor a mayor tamaño

mostrado en la Figura 4.21 (PGPR<S85<S80<S80T80).

Figura 4.22 Dispersión del tamaño de las microesferas preparadas en emulsión por GI con varios
tensioactivos. S80, S85, S80T80 y PGPR a 5% p/p. Polirricinoleato de poliglicerol, PGPR. Solución
alginato 2% p/p, Citrato de calcio 0,05 M, 25 ºC.

La Figura 4.23 permite apreciar de forma más clara la polidispersidad en el

tamaño de las microesferas preparadas en emulsión por GI con diferentes
tensioactivos (S80, S85, S80-T80 y PGPR) a través de las imágenes tomadas por
microscopía óptica para cada caso estudiado.

Figura 4.23 Polidispersidad de las microesferas de alginato preparadas en emulsión por GI con
diferentes tensioactivos. Solución de alginato 2% p/p, Citrato de calcio a 0,05 M y diferentes
tensioactivos al 5% p/p. Imágenes obtenidas por microscopía óptica utilizando varios objetivos. S80, a
(10X); S85, b (10X); S80-T80, c (10X) y PGPR, d (40X).

166
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Por otra parte, se pudo observar que también existe una relación directa de
este comportamiento referido a la polidispersidad y distribución de tamaño de las
microesferas con el grado de coalescencia de las emulsiones previas solamente
para el PGPR (Tabla 4.3), siendo el %C menor para el PGPR el cual proporcionó
emulsiones más estables y, por tanto, microesferas de alginato con una distribución
de tamaño medio menor y menos polidispersas. Mientras que, en el caso de los
spans, el grado de coalescencia no mostró seguir un orden específico, tal como se
observó para el factor de polidispersidad y tamaño de las esferas, sino que varió
según la concentración de tensioactivo utilizado. Este aspecto observado en los
spans, probablemente pudiera atribuirse a la existencia de otros mecanismos de
desestabilización que afecten a las emulsiones, como la sedimentación, floculación o
la maduración de Ostwald. En tal sentido, este aspecto parece indicar que las
emulsiones más estables producen, en consecuencia, microesferas menos
polidispersas y de menor tamaño, y por tanto conviene usar PGPR para la
preparación de las emulsiones W/O previas a la formación de las microesferas. Por
ello, el tensioactivo PGPR es seleccionado para la preparación de las microesferas
de alginato en emulsión.

4.3.2.3 Determinación de la correlación entre la distribución del tamaño de

gota de las emulsiones y la distribución de tamaño de las microesferas de
alginato obtenidas.

Como se ha descrito en este apartado, se ha comprobado que el citrato como

fuente de calcio a concentraciones de 0,05 M y la utilización del tensioactivo PGPR
en las emulsiones para la preparación de las microesferas permiten la producción de
microesferas de alginato con superficies más uniformes y tamaños adecuados para
ser añadidos en alimentos sin ser percibidos sensorialmente. Parece interesante
encontrar por tanto una posible correlación entre la distribución del tamaño de gotas
y las microesferas de alginatos obtenidas, utilizando el citrato de calcio y el
tensioactivo PGPR, que son los que mejor resultado han dado. Para llevar a cabo el
estudio, se emplearon dos de las concentraciones de PGPR utilizadas en el
apartado de estabilidad. La Figura 4.24 muestra las distribuciones del tamaño de
gota de las emulsiones iniciales y del tamaño de las microesferas obtenidas a partir
de las mismas con un 2% y 5% p/p de PGPR. Se puede observar que las

167
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

distribuciones de tamaño de gota se desplazan hacia valores más bajos al ocurrir la

formación de las microesferas, es decir que hay una contracción de las gotas al
producirse la gelificación, manteniendo en todo momento su forma esférica. Este
aspecto indica que la contracción producida por el proceso de gelificación se
relaciona con el fenómeno de sinéresis, según han estudiado otros autores (Chan et
al., 2011).

Figura 4.24 Distribución del tamaño de gota de emulsiones iniciales y del tamaño de las microesferas
de alginato obtenidas a partir de las mismas con PGPR al 2% ― y 5% - - - (p/p) por GI. □ gotas y ‫ס‬
microesferas. Solución de alginato 2% p/p, Citrato de calcio a 0,05 M y Polirricinoleato de poliglicerol,
PGPR, 25 ºC.

La Tabla 4.4 muestra el valor medio del diámetro de las gotas y esferas (𝐷𝑔 y
𝐷𝑒 ), su desviación estándar (DE) y porcentaje de desviación estándar relativa
(%DER). Se puede apreciar que los valores del %DER son del mismo orden de
magnitud, por tanto, se infiere que no ocurren cambios significativos en la forma de
la distribución de tamaño una vez que se produce la gelificación. A fin de determinar
la correlación entre el tamaño de gota y la esfera de alginato formada, se calculó un
factor de contracción por gelificación (𝐾𝑐𝑔 ) expresado según la Ec. 35 (Chan et al.
2011), el cual se define para cada muestra a partir del valor medio del diámetro de
las gotas formadas en la emulsión y posterior a su gelificación a partir de las
diferentes concentraciones de PGPR utilizadas en estos experimentos como:

𝐷𝑔 −𝐷𝑒
𝐾𝑐𝑔 = (35)
𝐷𝑔

168
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se puede observar que los valores de 𝐾𝑐𝑔 señalan una contracción cerca al 80%,
como consecuencia del fenómeno de sinéresis característico de los geles, debido a
la pérdida de agua durante el proceso de gelificación. Por otra parte, cabe destacar
que los diámetros obtenidos muestran valores prácticamente independientes para el
rango de concentración de tensioactivo estudiado.

Tabla 4.4 Valores medios de diámetros de gotas y esferas de alginato.

2% PGPR 5% PGPR
Diámetro (µm) De Dg De Dg
Media (µm) 11,19 54,20 10,14 45,58
DE 8,93 51,97 8,92 35,86
%DER 79,83 95,89 87,89 78,67
K cg 0,79 0,78
Desviación estándar, DE; Porcentaje desviación estándar relativa, %DER; Factor
de contración por gelificación, K cg; Diámetro esfera, De y diámetro de gota, Dg.

4.3.3 Estudio de las variables de composición y preparación para la obtención de las

microesferas en emulsión por gelificación interna con el principio activo a
encapsular.

La serie de experimentos realizados anteriormente permitió establecer las

condiciones iniciales del estudio de optimización para la preparación de las
microesferas de alginato con el principio activo a encapsular en emulsión por
gelificación interna. Bajo estas consideraciones, se realizó un diseño experimental
completo de tipo factorial 2k, compuesto y rotable con tres réplicas en el punto
central, como se ha explicado en el apartado 2.5, para estudiar la influencia de las
variables de composición con tres factores a dos niveles, y otro diseño para estudiar
la influencia de las variables de preparación con dos factores a dos niveles. El
dominio experimental correspondiente para cada diseño central compuesto
empleado en el presente trabajo se muestra en la Figura 2.14 de ese apartado en el
capítulo de introducción.
Para las variables de composición se plantearon tres factores: concentración
de tensioactivo, concentración de CaCl2 con 10% p/p de Tween 20 (T20) en la
solución de lavado de las microesferas obtenidas, y % fase dispersa, donde los
niveles inferiores y superiores fueron 4-15% p/p de tensioactivo respecto al aceite,

169
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

concentración de CaCl2 de 0,03-0,1 M en 100 ml de solución de lavado añadida a las

microesferas para facilitar su separación y 15-40% p/p para la fase dispersa.
Para las variables de preparación se plantearon dos factores definidos como
velocidad de agitación durante el proceso de gelificación y velocidad de
centrifugación para la separación de las microesferas una vez formadas. Los
máximos y mínimos se plantearon entre 250-600 rpm y 2000-3800 rpm,
respectivamente. La influencia de las variables de composición y preparación se
analizaron sobre las variables de salida especificadas como: diámetro medio del
volumen equivalente, D(4,3), cuyo cálculo se describe en el apartado 3.4.3.3.b, así
como el factor de polidispersidad (SPAN) al utilizar el análisis del tamaño de las
partículas por difracción láser, y el porcentaje de retención (%Ret) del principio
activo referido al contenido de polifenoles totales encapsulados en las microesferas
y analizado por el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau. La cantidad de
ensayos y combinaciones de las variables para la preparación de las microesferas
para ambos diseños se determinó con el software Statgraphics Plus 5.1.
El protocolo de preparación se llevó a cabo siguiendo las condiciones
planteadas para cada ensayo y diseño. Como ejemplo se describe el procedimiento
estándar de preparación de las microesferas en emulsión por GI para las
condiciones del punto central (apartado 3.4.3.3) donde se partió de una fase
dispersa (27,5%) de solución de alginato 2%/cacao 1% p/p y un 6,2% p/p de citrato
cálcico a 0,05 M (respecto a la fase dispersa), una vez homogenizada se goteó
manualmente en la fase oleosa constituida por aceite y 9,5% p/p de PGPR. La
emulsión W/O se preparó bajo agitación constante a 250 rpm y 25 ºC durante 15 min
en un minireactor, para la gelificación de las gotas se incorporó el resto de aceite
con el acético disuelto. Las microesferas pregelificadas se separaron de la fase
oleosa adicionando 100 ml de solución acuosa a 0,07 M CaCl 2/T20 bajo agitación
moderada durante 15 min a fin de continuar el proceso de gelificación y favorecer la
partición de las fases y, finalmente, éstas se separaron por centrifugación a 4000
rpm durante 10 min, descartando la fase oleosa y reservando la fase acuosa para la
cuantificación de los polifenoles presentes en la solución de separación. Las
microesferas alginato/cacao se redispersaron en agua para su análisis de
distribución de tamaño por difracción laser.

170
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Por otra parte, el extracto de cacao utilizado como principio activo a

encapsular se caracterizó a fin de determinar la calidad de éste y como valor
referencial frente a otros compuestos polifenólicos posibles a encapsular.

4.3.3.1 Caracterización del extracto de cacao como principio activo a

encapsular.
En este apartado se caracteriza el extracto de cacao empleado como principio
activo a encapsular con la finalidad de determinar su composición a objeto de tener
un valor referencial que permita conocer la calidad del extracto.

4.3.3.1.a Cuantificación de los polifenoles totales mediante análisis

espectrofotométrico para el extracto de cacao utilizado como principio activo a
encapsular.

Para determinar el contenido total de fenoles en el extracto de cacao

empleado como principio activo, y sucesivamente en las diferentes muestras de los
encapsulados, se partió de la construcción de una recta de calibrado preparada a
partir de patrones de ácido gálico. Para ello, se utilizó el análisis espectrofotométrico
con el método de Folin-Ciocalteu, explicado en el apartado 3.4.3.3.a, que permite
cuantificar los fenoles totales en equivalentes de ácido gálico (EAG) con la medición
de la absorbancia de una solución de concentración desconocida a través de una
recta de calibrado con un patrón fenólico de referencia (Apéndice 9.4-Figura 9.8). La
ecuación de ajuste del calibrado se utilizó tanto para la caracterización del extracto
de cacao como para el cálculo de los fenoles totales encapsulados (extracto de
cacao) a partir de las diferentes técnicas de gelificación y métodos de encapsulación
utilizados en este estudio. En tal sentido, al analizar el extracto se obtuvo como
resultado por triplicado de una solución preparada con 250 mg de extracto de cacao
seco en 50 ml de agua miliQ, una concentración de fenoles totales igual a 370,79 ±
2,16 mg EAG/g extracto cacao seco. Se puede inferir que dada la concentración
calculada de fenoles para el extracto, éste posee un alto contenido de polifenoles
totales, ya que al compararse con otros extractos y polvos de cacao estudiados en
diferentes trabajos su valor se encuentra por encima de los reportados (Hii et al.,
2009; Ortega et al., 2010; Schinella et al, 2010; Calatayud et al., 2013).

171
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.3.3.1.b Cuantificación de los compuestos fenólicos principales en el extracto de

cacao mediante técnica cromatográfica.

En la Tabla 4.5 se muestran los resultados obtenidos al analizar por UPLC

una solución madre de 250 mg de extracto de cacao en 50 ml de una solución
etanol-agua debidamente sonicada y diluida 1:5 (apartado 3.4.3.3.a), tomando como
patrones de referencia la (+)-Catequina y (-)-Epicatequina y, de acuerdo a los
cálculos necesarios a partir de los espectros obtenidos (Apéndice 9.4-Figuras 9.9 y
9.10). Estos compuestos fenólicos utilizados como patrones, se encuentran entre los
mayoritarios constituyentes del extracto de cacao. Los valores de concentración
(Tabla 4.5), indican que el extracto de cacao contiene éstos compuestos
polifenólicos en mayores proporciones frente a otros datos de composición
reportados por diferentes autores (Hii et al., 2009; Ortega et al., 2010; Schinella et
al, 2010; Calatayud et al., 2013). Sin embargo, cabe resaltar que su cuantificación
tiene como finalidad la obtención de un valor referencial que permita conocer la
calidad del extracto utilizado como principio activo a encapsular, teniendo en
consideración según señala Schinella y colaboradores (2010) que estas
características de composición pueden variar con las condiciones del análisis
aplicado.

Tabla 4.5 Composición fenólica del extracto de cacao utilizado como principio activo.

Muestra Extracto de Cacao

a
Fenoles Totales (EAG) 370,79 ± 2,16
b
(+)-Catequina 13,73 ± 0,02
b
(-)-Epicatequina 77,06 ± 0,20
a. Datos expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG)
b. Datos obtenidos mediante UPLC (mg fenol/g extracto seco)

4.3.3.2 Influencia de las variables de composición diseño 23 factorial

compuesto.

La Tabla 4.6 muestra los experimentos que se llevaron a cabo con el fin de
estudiar la influencia de las variables de composición (concentración de PGPR,
concentración de CaCl2 en la solución de lavado y % fase dispersa) en las
propiedades de las microesferas obtenidas con el extracto de cacao.

172
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3
Tabla 4.6 Diseño experimental 2 factorial compuesto.

Tensioactivo Fase Dispersa %Ret

CaCl 2 (M) D(4,3) (µm) SPAN
(%) (%)

9,5* 27,5 0,07 273,95±9,36 5,59±0,92 59,51±4,19

9,5 6,48 0,07 448,87±67,57 7,86±1,08 31,26±0,68
0,25 27,5 0,07 486,86±16,28 1,89±0,04 62,51±0,84
9,5 48,5 0,07 101,93±85,17 3,35±5,42 85,24±0,40
9,5 27,5 0,12 827,11±152,65 1,69±0,18 81,05±0,06
9,5* 27,5 0,07 157,06±30,84 2,42±0,74 61,97±3,15
15,0 40,0 0,03 59,20±13,62 6,29±7,52 89,61±0,25
4,0 15,0 0,10 301,71±56,56 3,55±0,49 48,51±2,39
15,0 15,0 0,10 241,13±108,15 4,21±0,94 30,25±4,78
9,5 27,5 0,01 171,87±13,76 1,42±0,16 62,32±0,60
4,0 40,0 0,10 152,62±32,76 2,51±0,47 82,05±0,22
4,0 15,0 0,03 332,38±43,71 3,76±1,02 46,37±1,15
9,5* 27,5 0,07 236,81±31,78 2,26±0,64 75,13±0,19
18,7 27,5 0,07 113,23±44,89 3,33±2,75 75,86±2,72
15,0 15,0 0,03 187,94±62,36 4,07±1,06 39,51±1,03
4,0 40,0 0,03 171,74±25,73 4,80±1,02 80,80±0,67
15,0 40,0 0,10 101,72±67,47 5,02±5,77 76,53±3,87
*Réplica: Puntos centrales. %Ret.: porcentaje retención fenoles totales (cacao) en microesferas

El análisis estadístico mediante ANOVA indica que las variables de

composición no tienen influencia significativa sobre el diámetro medio equivalente
D(4,3) de las microesferas ni el factor de polidispersidad o SPAN de la muestra de
microesferas, dentro del rango experimental estudiado. Sin embargo, se observa un
valor de p < 0,05 como efecto de la cantidad de la fase dispersa sobre el porcentaje
de retención de los polifenoles (%Ret) del extracto de cacao en las microesferas de
alginato obtenidas (Figura 4.25c), indicando una influencia significativa del % fase
dispersa en el %Ret. Cabe resaltar que los valores dados por el punto central y sus
réplicas en las variables de salida y que describen las propiedades de las
microesferas, evidencian diferencias importantes entre ellos, lo que indica la poca
reproducibilidad de los resultados, y por tanto, sugiere la existencia de variables no
controladas en el proceso.

173
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.25 Gráficos de Pareto para el diseño experimental de las microesferas preparadas en
emulsión por GI con extracto de cacao para las variables de composición. Variables de salida:
Diámetro medio equivalente, a; Factor de polidispersidad o Span, b y Porcentaje de retención de
fenoles totales o %Ret, c.

4.3.3.3 Influencia de las variables de preparación diseño 22 factorial

compuesto.

El diseño obtenido para las variables de preparación se realizó para estudiar

la influencia de las variables velocidad de agitación (250-600 rpm) en la emulsión
durante la gelificación y velocidad de centrifugación (2000-3800 rpm) para la
separación de las microesferas obtenidas en emulsión, a fin de determinar su efecto
en las propiedades de éstas, definiendo las variables de salida como tamaño y
polidispersidad de las microesferas, así como el %Ret del extracto de cacao como
principio activo a encapsular. Para llevar a cabo el estudio de la influencia de las
variables de preparación, se tomaron las condiciones de composición del punto
central indicadas en el diseño 23, 27,5% p/p fase dispersa, 9,5% p/p PGPR respecto
al aceite y solución acuosa de CaCl2 a 0,07 M con 10% p/p T20 para la separación
de las microesferas obtenidas en emulsión. En este sentido, se prepararon las
microesferas en emulsión por GI con el mismo protocolo descrito anteriormente
(apartado 4.3.3) como estándar para el punto central pero utilizando las velocidades
de agitación para el proceso de gelificación y velocidades de centrifugación para la

174
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

separación de las microesferas planteadas para cada ensayo del diseño 2 2. Los
resultados se muestran en la Tabla 4.7.

2
Tabla 4.7 Diseño experimental 2 factorial compuesto.

V.A (rpm) Cent. (rpm) D (4,3) µm SPAN %Ret

425* 2900 90,02±17,63 1,81±0,098 60,02±0,76

600 3800 73,02±0,96 1,59±0,007 22,96±0,35
675 2900 59,66±9,24 1,65±0,059 72,84±0,09
425* 2900 75,27±4,74 1,63±0,031 73,71±1,37
250 2000 157,23±11,67 2,05±0,113 74,53±0,63
425* 2900 80,98±20,51 1,65±0,106 82,78±0,16
425 1630 79,16±8,81 1,63±0,067 68,66±0,56
250 3800 127,13±7,23 1,89±0,04 75,58±0,07
175 2900 148,06±5,89 2,28±0,038 76,82±0,01
600 2000 84,01±12,26 1,53±0,074 26,07±0,73
425 4170 61,3±0,23 1,75±0,009 69,56±2,02
*Réplica: Puntos centrales. %Ret.: porcentaje retención fenoles totales (cacao)
en microesferas. Cent.: centrifugación. V.A.: velocidad de agitación

Al aplicar el ANOVA, se obtuvieron valores de p < 0,05 para el factor

velocidad de agitación sobre las variables respuestas concernientes al diámetro
medio de las microesferas y su factor de polidispersidad (SPAN), indicando con ello
la existencia de una influencia estadísticamente significativa de la velocidad de
agitación sobre el D(4,3) y el SPAN de las microesferas con extracto de cacao. Por
el contrario, el factor velocidad de centrifugación no mostró influencia significativa en
ninguna de las variables de salidas para las condiciones planteadas en este estudio
(Figura 4.26).

175
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.26 Gráficos de Pareto para el diseño experimental de las microesferas preparadas en
emulsión con extracto de cacao para las variables de preparación. Variables de salida: Diámetro
medio equivalente, a; Factor de polidispersidad o Span, b y Porcentaje de retención de fenoles totales
o %Ret, c.

Particularmente, el efecto del factor velocidad de agitación sobre el diámetro

medio se puede interpretar como un resultado esperado, ya que un incremento de la
velocidad tiende a inducir el rompimiento de las gotas de la fase dispersa en la fase
oleosa en gotas más pequeñas, lo que provocaría la formación de microesferas
menores. En la Figura 4.27 se muestra cómo la distribución de tamaños de las
esferas se desplaza a valores de diámetros menores a medida que aumenta la
velocidad de agitación utilizada durante el proceso de preparación de las
microesferas con extracto de cacao en emulsión por gelificación interna.

176
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.27 Efecto de la velocidad de agitación sobre el diámetro medio de las microesferas con
extracto de cacao preparadas en emulsión por GI. □ 175 rpm; ♦ 250 rpm; ∆ 600 rpm y ● 675 rpm.

Considerando los valores de las variables de salida dados por los puntos
centrales en el diseño 22 (Tabla 4.7), se pudo observar que los resultados en este
caso también son poco reproducibles. Este aspecto manifiesta la existencia de
variables no controladas en el sistema de preparación de las microesferas. Como
consecuencia, se decide profundizar en el estudio de la factor fase dispersa del
sistema (solución de alginato al 2% p/p con extracto de cacao 1% p/p) tomando en
cuenta que en los apartados anteriores se estudió la fuente de calcio y su
concentración, así como el tipo y concentración de tensioactivo, y se intentó detectar
alguna variable no controlada en la misma. Para ello se llevó a cabo el estudio de
viscosidad que se muestra en el apartado siguiente.

4.3.3.4 Influencia del pH en la viscosidad de la fase dispersa.

Se estudió la influencia del pH en la fase dispersa utilizada para la

preparación de las microesferas en emulsión bajo las condiciones de composición
planteadas para el punto central del diseño 23 compuesto. En este sentido, se realizó
un análisis de viscosidad estacionaria en función del gradiente de velocidad a
temperatura controlada de 25 ºC a la fase dispersa (27,5% p/p) preparada a partir de
una solución de alginato sódico 2% p/p con 1% p/p de extracto de cacao y 6,2% p/p
de suspensión de citrato de calcio a 0,05 M respecto a la fase dispersa, a dos pH
distintos, ácido y neutro, y dos tiempos. Se puede observar en la Figura 4.28 que la

177
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

viscosidad de la fase dispersa utilizada para el diseño experimental propuesto

aumenta con el tiempo, por ejemplo en un 63% desde los 6 a los 32 min para un
gradiente de velocidad de 1 (s-1), cuando el pH no se controla y por tanto permanece
ácido por efecto de la acidez del cacao, este efecto podría atribuirse a las
interacciones del sistema alginato/cacao/citrato que producen una pregelificación del
alginato como consecuencia de un ligero aporte de acidez por parte del extracto de
cacao que provoca la liberación de iones calcio, efecto no deseado ya que no está
controlado, lo que produce una pregelificación antes de la emulsificación (Apéndice
9.5). Ésta podría ser una de las variables no controladas del diseño experimental,
que hacían que los resultados fueran poco reproducibles. De la misma forma, se
realizó el estudio de viscosidad para la fase dispersa neutralizada (pH entre 6,5 y 6,8
al ser neutralizado con unas gotas de NaOH 6 M). En este caso los valores de
viscosidad mostraron poca variación con el tiempo (Figura 4.28), indicando que al
controlar el pH se ha podido evitar la pregelificación indeseada.

Figura 4.28 Comportamiento de la viscosidad estacionaria de la fase dispersa frente al gradiente de

velocidad con el tiempo. FD: fase dispersa; pH ácido, 5,0; pH neutro, 6,5-6,8; t1, tiempo 6 min; t2,
tiempo 32 min; gradiente de velocidad, γ; viscosidad estacionaria, η; о FD neutra a t1; □ FD neutra a
t2; ● FD ácida a t1 y ■ FD ácida a t2 a 25 ºC.

Por tanto, se decidió realizar un nuevo diseño experimental, en este caso de

tipo fraccionado para limitar el número de experimentos, pero neutralizando la fase
dispersa para evitar la pregelificación, y comprobar así si se obtenían resultados
más reproducibles.

178
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.3.3.5 Diseño experimental fraccionado a pH neutro.

4.3.3.5.a Diseño fraccionado con extracto de cacao.

Las microesferas de alginato con extracto de cacao encapsulado se

prepararon según el protocolo explicado en el apartado 3.4.3.3 para el estudio de las
variables de composición del diseño experimental completo pero con la fase
dispersa a pH neutro y un menor número de experimentos. En este sentido, se
realizó un diseño experimental fraccionado 23-1 para estudiar el efecto de los factores
a dos niveles de la cantidad de PGPR (4-15% p/p), % fase dispersa a pH neutro (15-
40% p/p) y la concentración de CaCl2 (0,03-0,1 M) en la solución con 10% p/p de
T20 para el lavado y separación de las microesferas sobre las variables respuesta o
de salida, especificadas como: diámetro medio de las microesferas, D(4,3), factor de
polidispersidad (SPAN) y el porcentaje de retención de los polifenoles en las
microesferas (%Ret). Las microesferas con el extracto de cacao a encapsular se
prepararon en emulsión por GI un minireactor a 250rpm y 25 ºC. Una vez formadas
las microesferas y particionadas a la fase acuosa con la adición de 100 ml solución
CaCl2/T20 bajo agitación moderada durante 15 min se separaron por centrifugación
a 4000 rpm durante 10 min, descartando la fase oleosa y reservando la fase acuosa
para la cuantificación de los polifenoles presentes en la solución de separación. Las
microesferas alginato/cacao se redispersaron en agua para su análisis de
distribución de tamaño y polidispersidad por difracción laser. Los resultados se
presentan a continuación en la Tabla 4.8.

179
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3-1
Tabla 4.8 Diseño fraccionado 2 factorial para la fase dispersa con extracto de cacao a pH neutro.

Tensioactivo (%) Fase dispersa (%) CaCl 2 (M) D (4,3) µm Span %Ret
9,5* 27,5 0,07 85,48±0,41 1,81±0,01 58,97±0,05
9,5* 27,5 0,07 87,35±1,86 1,86±0,03 59,93±0,07
4,0 40,0 0,03 136,34±10,0 1,77±0,04 78,45±0,01
15,0 40,0 0,10 39,60±2,43 1,88±0,02 80,92±0,30
15,0 15,0 0,03 143,93±9,19 2,37±0,10 47,76±0,02
4,0 15,0 0,10 321,14±23,4 3,90±0,19 53,61±0,03
*Réplica: Puntos centrales. %Ret.: porcentaje retención fenoles totales (cacao) en microesferas

Al utilizar la fase dispersa a pH neutro controlado se pudo observar

reproducibilidad de los resultados dado la cercanía entre los valores de las variables
de salida obtenidos en el diseño para el punto central y su réplica (Tabla 4.8), por lo
que pueden considerarse éstos más fiables. Por otra parte, el ANOVA mostró una
influencia estadísticamente significativa (p < 0,05) sólo para el factor % fase dispersa
sobre el porcentaje de retención de los polifenoles en las microesferas obtenidas, tal
como muestra la Figura 4.29c a través del gráfico de Pareto.

Figura 4.29 Gráficos de Pareto para el diseño fraccionado con la fase dispersa a pH neutro de las
microesferas preparadas en emulsión por GI para estudiar la influencia de las variables de
composición en las variables de salida: Diámetro medio equivalente, a; Factor de polidispersidad o
SPAN, b y Porcentaje de retención de fenoles totales o %Ret, c.

Los gráficos de Pareto permiten interpretar las posibles combinaciones e

interacciones entre las variables de entrada en un sistema y su efecto sobre las

180
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

variables de salida. Las franjas de tramas a rayas indican una dependencia positiva
(+) de la variable de entrada frente a la variable de salida, de manera que al
aumentar ésta aumenta la variable de estudio. Las franjas en blanco (-) significan
que una disminución de esa variable provoca un aumento de la variable de salida. Si
alguna franja supera la línea discontinua significa que este valor supera el error
experimental y, por tanto, que esa variable tiene una influencia estadísticamente
significativa sobre el parámetro estudiado. En este sentido, es evidente que un
incremento de la cantidad de fase dispersa provoca un aumento en el %Ret de los
polifenoles en las microesferas.
Por otro lado, se podría realizar de manera muy reservada dado los
resultados estadísticos, un análisis de las posibles tendencias producto de las
observaciones que puedan resultar de acuerdo a los valores mostrados en la Tabla
4.8, resaltado que otras posibles influencias podrían no ser observadas debido a un
enmascaramiento producto de las interacciones entre las variables de entrada. Por
ejemplo, se podría decir, en general, que un incremento de la concentración del
tensioactivo de 4% a 15% p/p provoca una disminución en los diámetros de las
microesferas desde 321 µm para las preparadas con menor concentración de PGPR
hasta diámetros de microesferas de 39 µm para las obtenidas con mayor
concentración del tensioactivo. Este comportamiento sería esperado ya que a mayor
cantidad de tensioactivo se puede estabilizar más interfase y, por tanto, producir
gotas de la emulsión de menor tamaño y, en consecuencia, microesferas más
pequeñas. De hecho, estas mismas observaciones han sido señaladas por otros
trabajos similares (Silva et al., 2006). Probablemente, este efecto se vea
contrarrestado por las interacciones entre la concentración de tensioactivo y la
cantidad de fase dispersa (Figura 4.26a) donde una disminución de la concentración
de PGPR provoca un aumento del diámetro de las microesferas, y a su vez, una
disminución del % fase dispersa provoca un aumento del diámetro de las
microesferas. Esto podría explicar el resultado mostrado en el quinto ensayo (Tabla
4.8) donde a pesar del incremento de PGPR al 15% p/p, la utilización de un 15% p/p
de fase dispersa en el proceso de preparación de la emulsión W/O provoca
microesferas de mayor tamaño a lo esperado para el rango de estudio. Estas
consideraciones podrían llevar a pensar que a pesar de las variables ya controladas,
existan en el sistema otros factores no controlados en el proceso de encapsulación.
Se tendría como ejemplo, el aspecto del protocolo de lavado y separación de las

181
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

microesferas con la solución de CaCl2, el cual se realiza manualmente. A pesar de

que este paso del procedimiento de preparación se intenta realizar exactamente
igual para cada muestra, una pequeña diferencia podría influir en las propiedades
finales de las microesferas obtenidas. En este sentido, por ejemplo, otros trabajos
han señalado que durante el proceso de partición y lavado de las microesferas de
alginato ocurre una pérdida importante del principio activo (Guan et al., 2011). Sin
embargo, a pesar de las limitaciones mencionadas, el protocolo aplicado en este
trabajo muestra que para el caso de la variable de salida especificada como %Ret,
se tienen retenciones del principio activo (polifenoles) de hasta un 60%. Por lo tanto,
la encapsulación de extracto de cacao en microesferas de alginato preparadas en
emulsión por gelificación interna con citrato de calcio y PGPR como estabilizante de
la emulsión parece ser un método prometedor. Hasta el momento, principalmente se
han logrado encapsular eficientemente polifenoles de plantas mediante el secado
por atomización y la técnica por extrusión (Deladino et al., 2008; Chan et al., 2010;
Fang y Bhandari, 2010; Nazzaro et al., 2009) y con nuevas tendencias
tecnológicas como la extrusión electrostática (Belščak-Cvitanović et al., 2011). Los
estudios más comúnmente reportados de encapsulación por
emulsificación/gelificación interna, se han centrado en la administración de
fármacos, atrapamiento de enzimas y células, pero no en la encapsulación de
polifenoles (Shah y Ravula, 2000; Talwalkar y Kailasaphaty, 2003; Kailasaphaty y
Masondole, 2005; Muthukumarasamy y Holley, 2006; Özer et al., 2008; Özer et
al., 2009; Brinques y Záchia-Ayub, 2011; Betoret E. et al., 2011).

4.3.3.5.b Diseño fraccionado con Catequina.

Tomando en consideración que la mayoría de los trabajos revisados en la

bibliografía utilizaron compuestos puros como los fármacos para estudiar su
encapsulación por el método de emulsificación/gelificación interna, se decide utilizar
como principio activo a encapsular un compuesto fenólico puro, seleccionando para
ello, la Catequina ya que constituye uno de los principales componentes del extracto
de cacao. En tal sentido, se realizó un diseño fraccionado 2 3-1 a dos niveles que
limite el número de experimentos y permita observar una posible influencia de las
variables de entrada en las propiedades de las microesferas preparadas en emulsión
por GI con un único compuesto activo a encapsular. Para ello, se plantearon como

182
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

variables de entrada la concentración de tensioactivo (4-15% p/p PGPR), % fase

dispersa (15-40% p/p) y la velocidad de agitación (250-600 rpm), las cuales se
tomaron en cuenta debido a los resultados obtenidos en los diseños anteriores, y
como variables de salida el diámetro medio del volumen de las microesferas, D(4,3),
la polidispersidad o factor SPAN y el %Ret del compuesto puro en las microesferas.
Las microesferas de alginato con (+) Catequina encapsulada se prepararon
siguiendo el protocolo indicado en el apartado 3.4.3.5 para el procedimiento
estándar de preparación explicado para el punto central del diseño 2 3-1. Se partió de
27,5% p/p de fase dispersa constituida por solución de alginato 2%/catequina 1000
ppm y 6,2% p/p citrato cálcico a 0,05 M respecto a la fase dispersa, la mezcla
homogeneizada se goteó en la fase oleosa conformada por 9,5% p/p PGPR en
aceite vegetal bajo agitación constante a 425 rpm y a temperatura controlada de 25
ºC en un minireactor, tras 15 min de agitación y formada la emulsión W/O se
adicionó el resto del aceite con acético disuelto para inducir la gelificación de las
gotas. Las microesferas pregelificadas se separaron de la fase oleosa adicionando
100 ml de solución acuosa a 0,07 M CaCl2 con 10% p/p de T20 bajo agitación
moderada durante 15 min, la mezcla microesferas/emulsión se centrifugó a 4000
rpm durante 10 min, la fase oleosa se descartó y la fase acuosa reservó para la
cuantificación de la catequina presente en la solución de separación y, finalmente las
microesferas se redispersaron en agua para la medición de sus tamaños y
polidispersidad por difracción laser. Los resultados se presentan a continuación en la
Tabla 4.9.

3-1
Tabla 4.9 Diseño fraccionado 2 factorial compuesto para la catequina.

Tensioactivo (%) Fase dispersa (%) V.A (rpm) D (4,3) µm SPAN %Ret
9,5* 27,5 425 74,44±4,03 1,75±0,03 42,43±0,01
9,5* 27,5 425 73,12±2,31 2,02±0,05 41,66±0,25
4 15 600 88,27±2,57 1,74±0,02 72,47±0,57
15 15 250 163,21±7,05 2,27±0,05 69,91±0,66
4 40 250 153,32±4,58 1,76±0,03 91,16±0,11
15 40 600 27,72±1,75 2,69±0,09 93,28±0,22
*Réplica: Puntos centrales. %Ret.: porcentaje retención fenoles totales (catequina) en microesferas
V.A: velocidad de agitación; diámetro medio equivalente, D (4,3); factor de polidispersidad, SPAN.

Los valores obtenidos para las variables de salida (D[4,3], SPAN y %Ret)
referidos al punto central y sus réplicas, presentan una buena reproducibilidad. Por

183
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

otra parte, el ANOVA muestra que no existe una influencia estadísticamente

significativa (p > 0,05) de los factores sobre las variables de salida para el rango
estudiado como puede apreciarse en la Figura 4.30.

Figura 4.30 Gráficos de Pareto para el diseño fraccionado con Catequina de las microesferas
preparadas en emulsión por GI para estudiar la influencia de las variables concentración de
tensioactivo, % fase dispersa y velocidad de agitación en las variables de salida: Diámetro medio
equivalente, a; Factor de polidispersidad o SPAN, b y Porcentaje de retención de Catequina o %Ret,
c; Tensioactivo (PGPR), A:T; Fase Dispersa, B:FD; Velocidad de Agitación, C:VA; Interacciones entre
variables, AC, AB y BC.

Estos resultados no esperados, podrían ser producto de las interacciones

dadas por la combinación de los factores estudiados, en donde algunos factores
actúan positivamente y otros negativamente sobre las variables de salida, lo que
puede enmascarar los efectos individuales en estas variables, y por ello se observa
como si nada influyera, cuando en realidad no es así. A saber, se podría hacer un
análisis reservado de la posible influencia de estas variables de entrada sobre las
variables de salida considerando los valores mostrados en la Tabla 4.9 y las
tendencias de las variables que se observan en los gráficos de Pareto (Figura 4.30a
y 4.30b). En este sentido, la velocidad de agitación parece influir en el diámetro de
las microesferas, tendencia general observada a excepción del ensayo para 4%T-
15%FD-600rpm, un aumento de la velocidad de agitación provocaría una
disminución del diámetro medio de las microesferas (Figura 4.31). Incluso podría
decirse que dada la interacción entre las variables y su combinación, se puede
observar que el factor velocidad de agitación podría favorecer aún más la
disminución de los D(4,3) al utilizar una mayor cantidad de tensioactivo, como

184
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

ejemplo se tendría los resultados mostrados por los ensayos donde se utiliza una
velocidad de 600 rpm con 4% y otro con 15% p/p de tensioactivo, respectivamente.
Lo que, por otra parte, se ve contrarrestado con la disminución del % fase dispersa
ya que este factor influiría negativamente provocando con su disminución un
aumento en el diámetro de las microesferas (Figura 4.30a).

10
9
8
7
% Volumen

6
5
4
3
2
1
0
1 10 100 1000 10000
Diámetro (µm)
Figura 4.31 Efecto de la velocidad de agitación sobre el diámetro medio de las microesferas con
catequina. ▲ 15%T-40%FD-600rpm; ● 9,5%T-27,5%FD-425rpm; о 9,5%T-27,5%FD-425rpm réplica;
∆ 4%T-15%FD-600rpm; ■ 4%T-40%FD-250rpm y □ 15%T-15%FD-250rpm. Tensioactivo, T; Fase
dispersa, FD; revoluciones por minuto, rpm.

Cabe resaltar que el manifiesto observado en los diseños estudiados

anteriormente con el extracto de cacao en referencia a una influencia
estadísticamente significativa del % fase dispersa en el %Ret del compuesto activo
en las microesferas, no fue observado en este estudio con la Catequina. Este
aspecto pudiera atribuirse a diferencias de composición dadas por el compuesto
activo encapsulado que provoquen interacciones con los factores en el diseño. En
otras palabras, el hecho de que el extracto de cacao esté constituido por múltiples
compuestos fenólicos con estructuras moleculares y tamaños diversos, podría
aportar interacciones positivas o negativas con las variables de entrada durante el
proceso de preparación de las microesferas. Mientras que, al utilizar la Catequina
como compuesto activo único a encapsular estos efectos se vean atenuados y, por
tanto, se obtengan resultados diferentes. Por otra parte, los valores de retención
mostrados por el punto central y su réplica en el diseño 2 3-1 con Catequina, %Ret
~42, y los valores obtenidos en el diseño fraccionado con el extracto de cacao,

185
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

%Ret~59, permiten inferir que una cantidad importante entre los compuestos activos
encapsulados en las microesferas preparadas con extracto de cacao está formada
por Catequina. y el resto por otros múltiples compuestos fenólicos tales como (-
)epicatequina, galocatequina, (+)epigalocatequina, antocianinas y proantocianidinas.
En este sentido, cabe recordar el apartado 2.7.2.2 en el capítulo de introducción
donde se menciona el aspecto de la biodisponibilidad y beneficios de los polifenoles
para la salud humana, en donde la catequina se encuentra entre los polifenoles más
destacados por ejercer una acción inhibidora sobre ciertas enfermedades
(Bhooshan y Rizvi, 2009). Por tanto, retenciones superiores al 50% en las
microesferas de alginato refuerzan la viabilidad de la encapsulación con estos
extractos naturales ricos en polifenoles a través de la técnica de gelificación interna
en emulsión para su aplicación en alimentos a fin de convertirlos en productos
funcionales.

4.3.3.6 Análisis térmico de las microesferas de alginato con extracto de cacao.

El efecto del extracto de cacao como principio activo encapsulado se estudió

a través del comportamiento térmico de las microesferas de alginato mediante la
aplicación de un análisis térmico (DSC) con la finalidad de observar la evolución del
gel de alginato cálcico de acuerdo a la temperatura con y sin extracto de cacao. Las
microesferas estudiadas se prepararon en emulsión por GI a partir de las
condiciones ya indicadas para el punto central del diseño fraccionado a pH neutro
controlado con el extracto de cacao. En la Figura 4.32 se muestra el termograma
para las microesferas de alginato con el extracto de cacao encapsulado y en la
Figura 4.33 para las microesferas de alginato sin el extracto de cacao. Puede
observarse que la temperatura de inicio del evento endotérmico (onset), también
denominada temperatura de transición sol-gel, para las microesferas con extracto de
cacao (Figura 4.32) fue de 50,12 ºC, mientras que para las microesferas sin el
compuesto activo fue de 44,37 ºC (Figura 4.33).

186
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.32 Análisis térmico (DSC) para las microesferas de alginato cálcico con extracto de cacao.
Microesferas preparadas en emulsión por GI para las condiciones dadas por el punto central en el
diseño fraccionado a pH neutro con extracto de cacao. Solución alginato sódico 2%/cacao 1% p/p y
citrato cálcico a 0,05 M.

Este aspecto parece indicar que la incorporación del extracto de cacao altera
la estructura del gel de alginato cálcico al modificar la supuesta temperatura de
transición sol-gel, lo que puede probablemente atribuirse a una interacción entre los
grupos fenólicos y la molécula de alginato. En tal sentido, la energía requerida por
las microesferas con cacao fue de -336,05 J/g lo que muestra una diferencia
importante respecto a la obtenida con las microesferas sin cacao de -182 J/g, es
decir, un 54% más de energía, lo que confirmaría la existencia de una fuerte
interacción entre todos los compuestos existentes dentro de la matriz polimérica de
las microesferas. Por otra parte, se observa que las temperaturas obtenidas en los
picos endotérmicos para cada caso, se presentan muy cercanas (107,38 y 102,41
ºC) lo que puede indicar que las fuertes interacciones entre los compuestos fenólicos
y el alginato parecen promover su estabilidad ya que prácticamente no ocurren
cambios importantes en la temperatura de los picos (Hamblenton et al., 2009). Por

187
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

tanto, podría pensarse que este efecto de estabilidad manifiesta una acción
protectora de la matriz del gel formado para el extracto de cacao encapsulado.

Figura 4.33 Análisis térmico (DSC) para las microesferas de alginato cálcico sin extracto de cacao.
Microesferas preparadas en emulsión por GI para las condiciones dadas por las condiciones del
punto central para el diseño fraccionado a pH neutro. Solución alginato sódico 2% p/p, solución citrato
cálcico a 0,05 M.

4.3.4 Estudio del mecanismo de liberación del principio activo desde las
microesferas.

Se estudió el mecanismo de liberación del principio activo desde las

microesferas preparadas con extracto de cacao encapsulado en emulsión por GI de
acuerdo a las condiciones dadas por el punto central del diseño fraccionado a pH
neutro. Se partió de una fase dispersa (27,5% p/p) constituida por una solución
alginato 2%/cacao 1% p/p y 6,2% p/p de solución de citrato cálcico a 0,05 M, la
mezcla homogenizada se incorporó por goteo a la fase oleosa (aceite/PGPR 9,5%
p/p) y finalmente se indujo la gelificación de las gotas al adicionar el agente
acidificante. Una vez pregelificadas las microesferas se adicionó una solución
acuosa de lavado (CaCl2/T20) para ser particionadas a la fase acuosa y facilitar su

188
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

separación, luego se centrifugaron a 4000 rpm por 10 min, la fase oleosa se

descartó y la fase acuosa compuesta por la solución de lavado y polifenoles
liberados se reservó para ser utilizada como medio de redispersión de las
microesferas en el estudio de liberación. La Figura 4.34 muestra la evolución del
porcentaje de polifenoles totales liberados con el tiempo, para las diferentes
diluciones de las microesferas estudiadas en 50, 75, 100, 125, 150 y 200 ml de
disolución acuosa constituida por el medio de separación reservado y, en los casos
necesarios, parte de solución acuosa con CaCl2 a 0,05 M y T20 al 10% p/p para
completar el volumen. El análisis de los fenoles totales liberados se determinó por
análisis espectrofotométrico con el método de Folin-Ciocalteau. Los resultados se
expresaron como porcentaje de polifenoles totales liberados con el tiempo, teniendo
en cuenta la cantidad de fenoles totales presentes inicialmente en la fase dispersa
(alginato 2%/cacao 1% p/p) y la concentración en solución de los polifenoles
liberados desde las microesferas (Ec. 33).
En la Figura 4.34 se puede observar, cualitativamente, que las curvas
presentan una tendencia similar de liberación del compuesto activo para todas las
diluciones estudiadas.

Figura 4.34 Contenido total fenólico liberado (%CTF) desde las microesferas preparadas en emulsión
por GI con el tiempo. Redispersión de las microesferas alginato 2%/cacao 1% p/p en ◊ 50, ᵡ 75, Δ
100, □ 125, ● 150 y ‫ ס‬200 ml de disolución acuosa con CaCl2 a 0,05 M y T20 al 10% p/p. Curvas
experimentales en línea continua y curvas de ajuste a la ecuación empírica del modelo de Peppas-
Sahlin en línea segmentada.

189
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con el fin de cuantificar estos resultados de liberación, los datos se analizaron

utilizando las ecuaciones descritas en el apartado 2.6.2.1, Ec. 27 y Ec. 29, referidas
a los modelos empíricos de Peppas o Ley de la Potencia y el modelo de Peppas-
Sahlin. Los parámetros cinéticos de ajuste obtenidos para éstos modelos mediante
el software Matlab v.7.9.0 se muestran en la Tabla 4.10.

Tabla 4.10 Parámetros cinéticos de los modelos de ajuste.

Modelo k or k1 k2
V (ml) n R2
Mt / M∞= (min-n) (min-2n )
50 0,0756 - 0,169 0,862
75 0,0653 - 0,224 0,929
n
kt 100 0,1540 - 0,159 0,859
125 0,2545 - 0,101 0,977
150 0,2767 - 0,114 0,892
200 0,3169 - 0,102 0,970
50 0,0592 (-)0,0036 0,295 0,924
75 0,0486 (-)0,0016 0,365 0,968
n 2n
k 1t + k 2t 100 0,1309 (-)0,0092 0,265 0,925
125 0,2688 (-)0,0265 0,135 0,975
150 0,2508 (-)0,0258 0,215 0,954
200 0,3318 (-)0,0371 0,150 0,981
𝑀𝑡 y 𝑀∞ son valores absolutos acumulados del principio activo en el tiempo t e infinito;
Volumen del medio o solución de liberación, V; Constante cinética característica del sistema,
k; Constante cinética Fickiana, k1; Constante cinética relajación/disolución, k2; Exponente
2
cinético de liberación, n y Coeficiente de correlación, R .

Aunque los resultados mostraron coeficientes de correlación satisfactorios

para la Ley de la Potencia, los valores dados para los exponentes de liberación (𝑛)
se presentaron menores a 0,43. En tal sentido, estos valores de 𝑛 difieren con los
datos tabulados de liberación controlada para fármacos (Tabla 2.6) a partir de
matrices poliméricas con diferentes geometrías específicamente para las esferas
tratadas en este estudio (Siepmann y Peppas, 2012). Por otra parte, se obtuvieron
buenos ajustes (R2 > 0,92) al utilizar el modelo Peppas-Sahlin, lo que sugiere la
existencia de un mecanismo de relajación/disolución que, por tanto, influye sobre los
parámetros cinéticos de liberación. Este modelo proporciona mayor información
sobre la naturaleza de la difusión del compuesto activo, ya que considera en la
ecuación la influencia del componente difusional, descrito por el primer término de la
ecuación (𝑘1 𝑡 𝑛 ), y el aporte del transporte anómalo debido al hinchamiento del

190
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

polímero o componente de relajación, descrito por el segundo término de la ecuación

(𝑘2 𝑡 2𝑛 ), por separado. En este sentido, los valores de una constante de velocidad
negativa (𝑘2 ) sugieren alguna influencia de la relajación de la matriz que se produce
por la interacción del polímero con el medio acuoso circundante a través de los
poros durante el proceso de liberación de los polifenoles desde las microesferas y
que conlleva el hinchamiento de éstas. Además, se puede observar en la Tabla 4.10
que los valores de 𝑘1 son mayores respecto a los 𝑘2 , lo que podría atribuirse a una
contribución predominante de difusión Fickiana en el mecanismo de liberación del
principio activo. Se observa que, salvo para algunas excepciones, la constante 𝑘1
aumenta al aumentar la dilución, lo cual tiene sentido ya que a mayor dilución la
concentración de polifenoles en el medio es menor al producirse la liberación,
aumentando la fuerza impulsora o diferencia de concentraciones de polifenoles entre
las microesferas de alginato y la solución externa. De manera que, el proceso de
liberación de los polifenoles desde las microesferas de alginato puede describirse
como la suma de dos mecanismos: la difusión de acuerdo a la Ley de Fick y la
relajación con consiguiente hinchamiento de la estructura polimérica descrito por el
modelo de Peppas-Sahlin.

4.4 Estudio de las esferas de alginato con principio activo preparadas por
extrusión con diferentes mecanismos de gelificación.

La obtención de esferas de alginato por extrusión con el mecanismo de

gelificación externa ha sido ampliamente estudiada a través de diferentes técnicas
de preparación, desde el goteo manual de la solución de alginato con el principio
activo sobre una solución de CaCl2 hasta técnicas más avanzadas que han logrado
la incorporación de dispositivos extrusores con boquillas múltiples y discos
aspersores, inyectores con impulsos vibratorios e incluso con la integración de un
flujo de aire (Champagne et al., 2000; Mark et al., 2009; Dohnal y Štěpánek,
2010). Entre las características principales de la técnica de preparación por extrusión
destaca la producción de esferas uniformes y de gran tamaño, comparada con las
obtenidas por la gelificación en emulsión. Por otra parte, diversos trabajos de
investigación han utilizado el mecanismo de gelificación interna a través de la
técnica de emulsificación con miras a producir esferas de menor tamaño a fin de ser
introducidas en los alimentos sin lograr su percepción por parte de los consumidores
191
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

(Poncelet, 2001; Gouin, 2004; Chan et al., 2006; Champagne y Fustier, 2007; de
Vos et al., 2010). En este orden de ideas, diversos diseños han surgido con la
finalidad de mejorar el proceso de producción de esferas mediante la optimización
de los dispositivos mecánicos (Zuidam y Shimoni, 2010) e incluso para la
producción de microesferas al combinar la técnica de emulsión con el mecanismo de
gelificación externa (Chuah et al., 2009). En este apartado, se pretende estudiar la
obtención de esferas de alginato con extracto de cacao preparadas por extrusión en
forma manual tanto con el mecanismo de gelificación interna como por el
mecanismo tradicional referido a la gelificación externa a fin de comparar su tamaño,
morfología y textura. Por otra parte, se pretende determinar la influencia de otras
variables como la concentración de calcio y cantidad del compuesto activo, así como
estudiar el mecanismo de liberación del principio activo según el tipo de gelificación
utilizada, a objeto de seleccionar la mejor formulación para la preparación de esferas
de alginato/cacao como cápsulas bioactivas que puedan ser incorporadas en
productos alimentarios para hacerlos funcionales.

4.4.1 Influencia del mecanismo de gelificación, concentración del extracto de cacao y

sal de calcio en el tamaño, morfología y textura de las esferas obtenidas por
extrusión.

Se prepararon y caracterizaron las esferas de alginato con extracto de cacao

utilizando la técnica por extrusión. Algunas esferas se obtuvieron a partir de
soluciones de alginato 2%/cacao 1% p/p o alginato 2%/cacao 3% p/p utilizando una
baja concentración de calcio (0,4·10-3 moles de Ca+2/g de alginato) o una alta
concentración del mismo (1·10-3 moles de Ca+2/g de alginato) mediante el
mecanismo de gelificación externa (GE) y otras esferas mediante el mecanismo de
gelificación interna (GI), tal como se explica en los apartados 3.4.4.1 y 3.4.4.2
respectivamente. Para la preparación de las esferas por GE con diferentes
concentraciones del extracto de cacao y calcio, se partió de una solución alginato
2%/cacao 1% o 3% p/p la cual se goteó sobre un baño acuoso de CaCl 2 a diferentes
concentraciones. Las esferas formadas se mantuvieron en el baño de calcio durante
15 min, se filtraron y lavaron con agua. Algunas esferas se reservaron a fin de
analizar sus propiedades mecánicas, otras para medir su diámetro medio número-
longitud y otras más para observar su morfología. Por otra parte, se prepararon

192
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

esferas por GI con diferentes concentraciones del extracto de cacao y calcio a partir
de soluciones de alginato 2%/cacao 1% o 3% p/p con la adición de diferentes
concentraciones de solución de citrato cálcico, la mezcla homogeneizada se goteó
sobre un baño gelificante de aceite vegetal y ácido acético disuelto a fin de inducir la
liberación de los iones calcio distribuidos en la solución polimérica. Las esferas
formadas se mantuvieron en el baño durante 15 min, luego se filtraron, lavaron y
reservaron a fin de analizar su textura, otras para medir su diámetro medio número-
longitud y otras más para observar su morfología. La composición de las diferentes
formulaciones utilizadas para la preparación de esferas de alginato/cacao por
extrusión se muestra en la Tabla 4.11.

Tabla 4.11 Formulación de las esferas alginato/cacao preparadas por extrusión.

%Cocoa CaCl2 Citrato cálcico moles Ca +2/

Fn
(p/p) (M) (M) g alginato (·10-3)

E1 1 0,002 - 0,4

E2 1 0,005 - 1,0

E3 3 0,002 - 0,4

E4 3 0,005 - 1,0

I1 1 - 0,05 0,4
I2 1 - 0,25 1,0
I3 3 - 0,05 0,4
I4 3 - 0,25 1,0
Formulación, Fn; Gelificación externa, E; Gelificación interna, I; Subíndices 1
y 2 para 1% p/p y subíndices 3 y 4 para 3% p/p extracto de cacao
-3
encapsulado; Además, subíndices 1 y 3 esferas preparadas con 0,4·10
+2 -3
moles Ca /g alginato y subíndices 2 y 4 esferas preparadas con 1·10
+2
moles Ca /g alginato.

4.4.1.1 Influencia de las diferentes formulaciones en el tamaño de las esferas.

Todas las esferas preparadas a partir de solución de alginato sódico 2% p/p y

el extracto de cacao para las diferentes formulaciones presentaron forma esférica
(Tabla 4.11). En la Tabla 4.12 se muestra el diámetro medio número-longitud (dl) de
las esferas para cada formulación y mecanismo de gelificación utilizado, calculados
a partir de los datos presentados en el Apéndice 9.6.

193
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 4.12 Diámetro medio número-longitud de las esferas alginato/cacao.

dl moles Ca +2/
Fn

(mm) g alginato (·10-3)

E1 3,65±0,36a 0,4

E2 3,46±0,31a 1,0

E3 4,03±0,48 0,4

E4 3,67±0,31 1,0

I1 4,42±0,30 0,4

I2 4,17±0,35 1,0

I3 4,37±0,36b 0,4

I4 4,33±0,35b 1,0

Formulación, Fn; Gelificación externa, E; Gelificación interna, I; Subíndices 1 y

2 para 1% p/p y subíndices 3 y 4 para 3% p/p extracto de cacao encapsulado;
-3 +2
Además, subíndices 1 y 3 esferas preparadas con 0,4·10 moles Ca /g
-3 +2
alginato y subíndices 2 y 4 esferas preparadas con 1·10 moles Ca /g
alginato; Diámetro medio número-longitud de las esferas alginato/cacao, dl
(±desviación estándar). Letras iguales (a y b) en la misma columna indican
que no hay diferencia estadísticamente significativa (p > 0,05) en los tamaños
de las esferas para las condiciones estudiadas entre grupos.

Primeramente, las poblaciones de las esferas preparadas con alginato

2%/cacao 1% p/p, se compararon con el fin de determinar la influencia de la
concentración de calcio para un tipo de gelificación en los tamaños de las esferas
obtenidas. Al comparar las esferas formadas por GE según las formulaciones E1 y
E2, se pudo observar que al utilizar diferente concentración de calcio, dentro del
rango experimental, no se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa (p >
0,05) en los tamaños de las mismas (Tabla 4.12). Por otra parte, la comparación
entre las esferas formadas por GI para las formulaciones I 1 e I2, mostró una
diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) al utilizar diferentes
concentraciones de calcio. Este aspecto sugiere que, dependiendo del mecanismo
de gelificación utilizado para la preparación de esferas, la concentración de calcio
puede afectar más o menos al tamaño de las mismas. En otras palabras, se puede
apreciar que el aumento de la concentración de calcio produce una disminución en
el tamaño de las esferas para ambos mecanismos de gelificación (Tabla 4.12) pero

194
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

que desde el punto de vista estadístico la concentración de calcio sólo influye de

manera significativa en los tamaños de las esferas cuando se utiliza la GI para el
rango estudiado. A continuación, se compararon las poblaciones de las esferas
preparadas con alginato 2%/cacao 1% p/p con una misma concentración de calcio
pero preparadas a partir de diferentes tipos de gelificación con el fin de determinar la
influencia del mecanismo de gelificación en los tamaños de las esferas obtenidas.
En este caso se puedo observar que los diámetros medios número-longitud entre las
poblaciones E1 e I1 y las poblaciones de esferas E2 e I2, mostraron una diferencia
estadísticamente significativa (p < 0,05), lo que indica una clara influencia del tipo de
mecanismo de gelificación en el tamaño de las esferas obtenidas. De hecho, se
puede apreciar que los diámetros medios de las esferas formadas por GE para
ambas concentraciones de calcio (E1 y E2) se presentaron menores respecto a los
diámetros medios de las esferas formadas por GI (I1 e I2). Este aspecto, como ya se
ha comentado, podría atribuirse a la formación de una capa externa más rígida del
gel formado por GE, debido a una mayor concentración de iones calcio ubicados en
esta capa externa, ya que éste se difunde desde afuera hacia adentro, lo cual
comprime la matriz de las esferas y, por lo tanto, produce una mayor expulsión de
agua. Esta sinéresis es una característica general de los geles. Los resultados
muestran que dicho fenómeno se produce en menor medida cuando se utiliza el
mecanismo de GI, ya que en este caso, aunque el gel es más homogéneo en toda la
esfera, es probablemente más abierto, debido a que el calcio está más
uniformemente distribuido, y, por tanto, también lo están los puntos de gelificación o
de interconexión entre las moléculas de alginato. Al ser un gel menos rígido expulsa
menos agua respecto a los formados por GE, y por ello se observa la diferencia de
tamaño de las esferas preparadas por los diferentes mecanismos de gelificación. Sin
embargo, cabe resaltar que mientras un aumento de la concentración de calcio en
las esferas obtenidas por GI influye significativamente en los tamaños, el efecto de
ésta variable no influye mucho en las esferas por GE porque al formarse una capa
rígida que debe estar casi saturada de calcio, el gel se habrá unido en casi todos los
puntos de unión posibles en la capa externa, éste, en el tiempo de gelificación
usado, no penetra mucho más al haber más calcio y, por tanto, la sinéresis que se
produce es muy parecida para ambas concentraciones de calcio. Mientras que para
la GI se produce un gel más abierto que para la GE pero, comparando la GI con
distintas concentraciones de calcio, más compacto cuando se usa más calcio, que

195
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

ya está incorporado en el interior de las esferas, produciéndose por tanto más

sinéresis cuanto más calcio hay, aunque siempre en menor proporción respecto a
las esferas preparadas por GE.
Las poblaciones de las esferas de alginato 2%/cacao 3% p/p, también se
compararon con el fin de determinar la influencia de la concentración de calcio y el
tipo de gelificación en el tamaño de las esferas obtenidas al encapsular mayor
cantidad de extracto de cacao. Los resultados mostraron una influencia
estadísticamente significativa (p < 0,05) de la concentración de calcio en los
diámetros medios número-longitud de las esferas preparadas por GE (E3 y E4);
mientras que para las esferas preparadas por GI (I3 e I4) no se observó (p > 0,05).
Este resultado, referido a la influencia de la concentración de calcio se presenta
contrario respecto a los obtenidos al utilizar una menor cantidad de extracto de
cacao (1% p/p, explicado anteriormente), efecto que puede ser atribuido al
incremento de la cantidad de extracto de cacao encapsulado (3% p/p) ya que al
encontrarse una mayor cantidad de compuestos polifenólicos en la matriz polimérica
se produce una mayor interacción de éstos con los iones calcio que por tanto
impiden la formación de puntos de gelificación, obteniéndose así un gel menos rígido
y, por tanto, que expulsa menos agua. La formación de puentes entre los polifenoles
y el calcio ha sido estudiada por Yamada y colaboradores (2007). En cuyo caso la
influencia de la concentración de calcio puede ser más o menos significativa según
el tipo de gelificación utilizado, tal como indican los resultados para la GE, donde se
puede observar una influencia importante del incremente de calcio en el tamaño de
las esferas ya que los iones calcios al difundirse desde el exterior a la superficie del
alginato, algunos forman puentes con los compuestos fenólicos y otros se unen al
alginato formando el gel, la formación de puentes entre los polifenoles y el calcio
disminuye la disponibilidad de los iones calcio para el proceso de gelificación, lo que
únicamente se puede ver contrarrestado con un incremento de la concentración de
calcio, promoviendo así la formación de una capa o superficie más rígida de gel que
por tanto provoca más sinéresis. Por el contrario, en las esferas preparadas por GI
los iones calcio distribuidos en la matriz polimérica tienen un contacto más directo
con los compuestos polifenólicos y, por tanto, se crea una relación de competencia
entre ellos que parece ser independiente de la concentración de calcio utilizada en
este estudio ya que se pueden observar diámetros medios de las esferas
prácticamente similares. En general, se puede observar en la Tabla 4.12 que los

196
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

tamaños de las esferas con una mayor cantidad de extracto (3% p/p), a excepción
de un caso, se mostraron superiores a los obtenidos en las esferas preparadas con
una cantidad menor de extracto de cacao (1% p/p) debido a la formación de un gel
menos rígido que por tanto expulsa menos agua. En referencia a la influencia del
tipo de mecanismo de gelificación, al comparar los diámetros medios entre las
poblaciones de las esferas formadas por los diferentes mecanismos de gelificación
con 3% p/p de extracto de cacao (E3 e I3; E4 e I4) se obtuvo una influencia
estadísticamente significativa (p < 0,05) del tipo de gelificación utilizado sobre los
tamaños de las esferas preparadas para una misma concentración de calcio. Este
resultado concuerda con los mostrados al utilizar una menor cantidad de extracto de
cacao (1% p/p), de manera que se evidencia la importancia del efecto que tiene el
mecanismo de gelificación utilizado para la preparación de las esferas por extrusión
sobre su tamaño para este rango de concentraciones estudiado.
En general, se puede observar que la concentración de calcio tiene influencia
sobre el tamaño de las esferas, ya que se aprecia una disminución en el diámetro
medio de estas al utilizar la concentración más alta de calcio, efecto también
observado y reportado por otros autores (Chan y Dobashi, 2003). Este aspecto se
puede explicar debido a la formación de un gel más reticulado y compacto, que por
lo tanto, produce más sinéresis. Sin embargo, es apropiado considerar la proporción
del compuesto activo utilizado para la preparación de las esferas, ya que este efecto
de la concentración del calcio se puede ver alterado según el tipo de mecanismo de
gelificación utilizado. Aspecto que, por tanto, requeriría de mayores estudios.

4.4.1.2 Influencia de las diferentes formulaciones en la estructura interna de

las esferas.

La estructura interna de las esferas obtenidas con alta concentración de calcio

(1·10-3 moles Ca+2/g de alginato) para ambos mecanismos de gelificación y
posteriormente liofilizadas se muestra en la Figura 4.35. Las microfotografías
obtenidas por SEM, evidencian claramente grandes agujeros para las esferas
preparadas por GE, Figura 4.35a y 4.35c. Mientras que, en las Figuras 4.35b y
4.35d, se puede observar una estructura interna más compacta y homogénea que
corresponde a las esferas obtenidas por el mecanismo de GI.

197
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

(a) (c)

(b) (d)

(e) (f)

Figure 4.35 Microfotografías por SEM de las esferas preparadas por extrusión. Esferas liofilizadas y
-3 +2
preparadas a partir de solución alginato 2%/cacao y 1·10 moles Ca /g alginato (alta concentración
de calcio). Alginato/cacao 1% p/p por GE, (a); Alginato/cacao 1% p/p por GI, (b); Alginato/cacao 3%
p/p por GE, (c); Alginato/cacao 3% p/p por GI, (d); Esferas de alginato 2% p/p control por GE, (e) y
Esferas de alginato 2% p/p control por GI, (f).

La característica estructural que muestran las esferas obtenidas por GE,

puede ser atribuida a la formación inicial de una capa de gel en la superficie de la

198
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

gota, lo que ralentizaría la difusión de los iones calcio hacia el interior, y por tanto, a
través de la matriz polimérica. Por esta razón, el resultado corresponde a una matriz
menos homogénea debido a la formación de un núcleo relativamente poco
reticulado, deficitario en calcio, y con una superficie tipo cáscara altamente
reticulada producto del mecanismo de gelificación cuya fuente de calcio es externa
(Zhao et al., 2007; Chan et al., 2006). En contraste, el mecanismo de GI utiliza una
fuente de calcio interna, en donde ocurre la difusión del H+ de forma más sencilla
respecto al Ca+2 desde la superficie hasta el núcleo de la gota a través del gel
formado, produciendo una matriz más homogénea. Cuando se emplea una mayor
concentración de extracto de cacao, la estructura interna de la esfera tiene una
apariencia menos porosa (Figura 4.35d), este aspecto puede atribuirse a la
ocupación de los espacios intersticiales debido a una mayor cantidad del principio
activo (Chan et al., 2011). Las mismas características morfológicas se apreciaron al
analizar la estructura interna de esferas de alginato preparadas para ambos
mecanismos de gelificación sin la utilización del extracto de cacao (Figura 4.35e y
4.35f). Lo que confirma la influencia del tipo de mecanismo de gelificación utilizado
en la estructura interna de las esferas. Por otra parte, se pudo observar que a pesar
de las diferentes concentraciones de calcio utilizadas, la estructura interna de las
esferas conserva la misma tendencia morfológica para cada mecanismo de
gelificación, las imágenes obtenidas por SEM para las esferas preparadas por
extrusión a partir de una menor concentración de calcio (0,4·10-3 moles Ca+2/g
alginato) se muestran en el apéndice 9.6.

4.4.1.3 Influencia de las diferentes formulaciones en las propiedades

texturales de las esferas.

Las curvas de esfuerzo-deformación obtenidas por medio del análisis de perfil

de textura (TPA), permitieron cuantificar las propiedades mecánicas de las diferentes
esferas de alginato/cacao húmedas, las cuales se correlacionaron con sus
características de textura. Las esferas alginato/cacao se prepararon por extrusión
para las diferentes formulaciones tal como se explicó anteriormente (Tabla 4.11), las
esferas se colocaron en una placa Petri, la que se llenó completamente según cada
caso, el TPA se realizó en un reómetro modular programado para realizar
mediciones con la fuerza normal a una velocidad de compresión de 0,025 mm/s, un

199
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

17% de deformación y una temperatura controlada a 5 ± 0,5 ºC. A partir de las

curvas dadas por el análisis de textura representado por un perfil de fuerza en
función del tiempo, se midieron directamente algunas propiedades mecánicas como
dureza, elasticidad y cohesividad, mientras otras fueron calculadas tales como
gomosidad y masticabilidad. En la Tabla 4.13, se presentan los valores medios de
los parámetros texturales correspondientes de las esferas o cápsulas obtenidas por
extrusión a través de los diferentes mecanismos de gelificación y formulaciones.
Todos los valores de los parámetros texturales obtenidos por triplicado se presentan
en el Apéndice 9.6 (Tabla 9.18) para las diferentes formulaciones (Esferas con
extracto de cacao 1% y 3% p/p preparadas a partir de bajas y altas concentraciones
de calcio).

Tabla 4.13 Parámetros mecánicos texturales de las esferas de alginato/cacao para las diferentes
formulaciones.

Fn Dureza (N) Cohesividad Elasticidad Gomosidad (N)

ac ad e ac
E1 2,714±0,383 0,507±0,026 0,799±0,001 1,842±0,693
ad ae f ad
E2 3,169±0,569 0,475±0,013 0,792±0,000 1,501±0,243
bc bd ace bc
E3 2,837±0,475 0,480±0,015 0,797±0,009 1,495±0,375

E4 2,281±0,244bd 0,446±0,014be 0,800±0,008adf 1,249±0,573bd

e cf g e
I1 0,224±0,029 0,654±0,064 0,792±0,000 0,207±0,105
f cg h f
I2 0,956±0,040 0,662±0,054 0,828±0,018 0,634±0,068

I3 0,467±0,167e 0,584±0,031df 0,820±0,018bcg 0,329±0,144e

f dg bdh f
I4 0,950±0,140 0,619±0,078 0,818±0,020 0,347±0,170

Formulación, Fn; Gelificación externa, E; Gelificación interna, I; Subíndices 1 y 2 para 1% p/p y

subíndices 3 y 4 para 3% p/p extracto de cacao encapsulado; Además, subíndices 1 y 3 esferas
-3 +2 -3
preparadas con 0,4·10 moles Ca /g alginato y subíndices 2 y 4 esferas preparadas con 1·10 moles
+2
Ca /g alginato; Las letras iguales (a hasta h) en la misma columna indica que no hay diferencia
estadísticamente significativa (p > 0,05) entre los valores medios de las poblaciones analizadas según
las formulaciones para un mismo atributo.

En ANOVA realizado entre los valores medios de un mismo atributo de textura

para las poblaciones de esferas, permitió analizar la influencia de la concentración

200
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

de calcio, la cantidad de extracto y tipo de gelificación sobre estos parámetros

mecánicos texturales obtenidos a través del TPA. En este sentido, se puede
observar que la dureza de las esferas alginato 2%/cacao preparadas por GI para las
diferentes cantidades de extracto de cacao, mostró una diferencia estadísticamente
significativa (p < 0,05) al utilizar varias concentraciones de calcio. De hecho, los
valores de dureza de las esferas obtenidas por GI se incrementaron desde 0,224
hasta 0,956 N al utilizar una mayor concentración de calcio (I1 e I2; I3 e I4). Este
aspecto indica que al utilizar una mayor concentración de calcio, se forma un gel
más reticulado y, por tanto, más compacto. Por el contrario, esta influencia de la
concentración de calcio no se observó (p > 0,05) para las esferas alginato 2%/cacao
preparadas por GE (E1 y E2; E3 y E4). Este hecho, podría ser atribuido a que la
corteza o superficie de las esferas preparadas por GE se satura rápidamente de
calcio incluso con la menor concentración de calcio utilizada, formándose un gel
rígido, y esta capa externa es la principal determinante de la dureza, resultando en
valores de dureza similares para las concentraciones de calcio utilizadas (valores
desde 2,281 hasta 3,169 N). El proceso de difusión de los iones calcio desde la
superficie hacia el núcleo de la gota del polímero se ve ralentizado debido a la
presencia de esta capa superficial de gel saturado y rígido que deben atravesar los
iones para llegar al núcleo de las esferas. Todo ello parece proporcionar valores de
dureza muy similares para el rango de concentración de calcio estudiado al utilizar el
mecanismo de GE. En cuanto a la influencia de la cantidad del extracto de cacao, no
se encontró diferencia estadísticamente significativa (p > 0,05) entre las poblaciones
de esferas preparadas con la misma concentración de calcio y tipo de gelificación
(E1 y E3; E2 y E4; I1 e I3; I2 e I4).
Por otro lado, al comparar la dureza de las esferas alginato/cacao preparadas
para una misma concentración de calcio y cantidad de extracto de cacao a través de
diferentes tipo de gelificación, se observaron diferencias estadísticamente
significativas (p < 0,05) entre los valores medios de dureza de las poblaciones (I1 y
E1; I2 y E2; I3 y E3; I4 y E4), lo que representa una clara evidencia del efecto del tipo
de mecanismo de gelificación sobre la dureza de las esferas a pesar de las
diferentes concentraciones de calcio y cantidad de extracto de cacao utilizado. En tal
sentido, los valores de dureza para las esferas preparadas por GE fueron muy
superiores (2,281 a 3,169 N) respecto a los obtenidos con las esferas preparadas
por GI (0,224 a 0,956 N), lo que confirma la formación de una capa mucho más

201
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

rígida en la superficie de esferas cuando se utiliza la GE, proporcionando así una

dureza externa superior, a pesar, de las características morfológicas observadas
(SEM) correspondientes a un núcleo menos reticulado (Figura 4.35a y 4.35c). De
acuerdo con estos resultados, la dureza de las esferas alginato/cacao se ve afectada
principalmente por el mecanismo de gelificación, y en segundo lugar, por la
concentración de calcio utilizada, especialmente cuando se utiliza la GI. Por el
contrario, la cantidad del extracto de cacao no parece afectar a la dureza de las
mismas.
Se estudió la cohesión como otro parámetro de textura medido a partir del
Análisis de perfil de textura (TPA), y correlacionado con la fuerza de los enlaces
internos que constituyen el cuerpo de un producto (Friedman et al., 1963). Se pudo
observar en la Tabla 4.13 a través del análisis estadístico que al preparar esferas de
alginato 2%/cacao con diferentes concentraciones de calcio, iguales cantidades de
extracto de cacao y utilizando el mismo tipo de gelificación, tanto para las esferas
preparadas por GE (E1 y E2; E3 y E4) como las preparadas por GI (I1 e I2; I3 e I4), sus
valores medios de cohesividad no mostraron diferencia estadísticamente significativa
(p > 0,05). Este aspecto parece indicar que la estructura interna formada entre la
matriz polimérica y el compuesto activo (fuerza de los enlaces) tanto de las esferas
preparadas por GE como las obtenidas por GI, mantienen una cohesión similar entre
esferas preparadas con el mismo tipo de gelificación, independientemente de la
concentración de calcio y la cantidad de extracto de cacao utilizado en los rangos de
estudio establecidos. Por otro lado, al comparar los valores medios de cohesividad
entre las diferentes poblaciones de esferas preparadas por diferentes mecanismos
de gelificación (E1 e I1; E2 e I2; E3 e I3; E4 e I4), se observó una diferencia
estadísticamente significativa (p < 0,05) entre ellos, resultado esperable, debido a la
diferencia morfológica observada previamente en las esferas alginato 2%/cacao
preparadas con distintos mecanismos de gelificación (Figura 4.35). Esto, a su vez
permite explicar los valores de cohesividad superiores obtenidos para las esferas
preparadas por GI respecto a los obtenidos por GE, debido a la formación de una
estructura interna más compacta y homogénea en las esferas formadas por GI.
Al observar los valores medios obtenidos para el atributo de elasticidad de las
diferentes poblaciones de esferas, éstos mostraron, en general, valores de
elasticidad ligeramente menores (0,792 - 0,800) para las esferas de alginato
2%/cacao preparadas por GE respecto a los obtenidos por GI (0,792 - 0,828).

202
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Considerando que la elasticidad se puede interpretar como el grado de recuperación

de la muestra cuando se aplica una fuerza externa, los valores mencionados
anteriormente parecen indicar que las esferas preparadas por GE se presentan
ligeramente más deformables, probablemente debido a la formación de una
estructura menos homogénea. Esta propiedad de textura, también conocida como
índice de elasticidad, se relaciona frecuentemente con el grado de relajación de la
muestra, el cual se presenta con valores entre 0 y 1. En tal sentido, cuando un
producto alimenticio posee una alta elasticidad, con valores próximos a la unidad, se
dice que éste tiene una textura gomosa, mientras que cuando los valores de
elasticidad son bajos corresponde a una textura de tipo quebradiza. En general, los
valores observados de elasticidad parecen describir una textura gomosa para todas
las esferas de alginato/cacao. Sin embargo, al realizar la comparación estadística
entre poblaciones de esferas, se pudo apreciar alguna diferencia estadísticamente
significativa entre valores medios de elasticidad, tal como para las esferas alginato
2%/cacao 1% p/p preparadas con diferentes concentraciones de calcio y tipo de
gelificación (p < 0,05). En este sentido, se pudo observar que al aumentar la
concentración de calcio las esferas preparadas por GI se presentaron más elásticas
(I1 e I2) respecto a las preparadas por GE (E1 y E2), lo que se atribuye a la formación
de una estructura interna más homogénea. Por el contrario, la influencia de la
concentración de calcio no se apreció estadísticamente significativa (p > 0,05) en las
esferas alginato 2%/cacao 3% p/p preparadas con diferentes concentraciones de
calcio y tipo de gelificación (E3 y E4; I3 e I4). Esto podría explicarse debido a la
cantidad de compuesto activo utilizado en la encapsulación, el cual al llenar los
espacios intersticiales en la matriz polimérica y dada la formación de puentes entre
los iones calcio y los polifenoles que provocan una disminución de los iones calcio
disponibles para la formación de puntos de gelificación, podría inducir la formación
de una estructura del gel con valores de elasticidad muy similares a pesar del
incremento en la concentración de calcio cuando se utiliza el mismo mecanismo de
gelificación. Al comparar los valores medios de elasticidad entre las esferas alginato
2%/cacao preparadas con diferentes mecanismos de gelificación, se pudo observar
que la cantidad de extracto utilizada en su preparación influye en el índice de
elasticidad obtenido ya que las esferas alginato 2%/cacao 1% (E 1 e I1; E2 e I2)
mostraron una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05). Este aspecto es
atribuido, como se ha dicho, a la diferencia en la estructura interna de las esferas.

203
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Por el contrario, se presentaron p > 0,05 para las esferas preparadas con 3% p/p de
extracto de cacao (E3 e I3; E4 e I4), lo que podría explicarse debido al llenado
intersticial de la matriz con el principio activo y dada la formación de menos puntos
de gelificación como consecuencia de la mayor cantidad de puentes calcio-
polifenoles formados, lo que provoca valores de elasticidad similares e
independientes de la concentración de calcio y tipo de gelificación utilizado para el
rango estudiado. En general, las esferas preparadas por GI se presentaron más
elásticas que las preparadas por GE.
Los resultados de gomosidad muestran diferencias significativas (p < 0,05), al
comparar sus valores medios entre poblaciones de esferas preparadas con una
misma concentración de calcio y cantidad de extracto de cacao pero utilizando
diferentes mecanismos de gelificación (E1 e I1; E2 e I2; E3 e I3; E4 e I4). Estos valores
de gomosidad, resultaron mayores para las esferas preparadas por GE respecto a
los obtenidos por GI, resultado esperable, debido a la gran contribución del atributo
dureza en el parámetro de gomosidad (producto de la dureza por la cohesividad). En
este sentido, los resultados estadísticos se mostraron iguales a los obtenidos con el
atributo dureza. Este parámetro textural, se relacionan con la energía requerida para
desintegrar un alimento (esferas o cápsulas) con objeto de ser deglutido (Pons y
Fiszman 1996; Szczesniak, 2002). Las esferas alginato 2%/cacao obtenidas por
GE, por tanto, requieren mucha más energía (1,249 a 1,842 N) que las preparadas
por GI (0,207 a 0,634 N). Y por tanto, puede decirse que las esferas preparadas por
GE al ser más gomosas requerirán mayor energía para su ruptura en boca respecto
a las esferas obtenidas por GI.
Por tanto, considerando que a través del análisis instrumental de las
propiedades mecánicas de un producto se puede conocer la tendencia de las
características percibidas desde el punto de vista sensorial, es importante tener en
cuenta especialmente las características de dureza y gomosidad, con la finalidad de
que su incorporación en los alimentos sea adecuada al seleccionar las cápsulas o
esferas de alginato/cacao que posean una textura más suave o dura según el efecto
que se desee perciba el consumidor en el producto.
La característica referida a masticabilidad calculada para las esferas
preparadas según cada caso del estudio, se muestran en el Apéndice 9.6. Este
atributo está íntimamente vinculado con las características de dureza, cohesividad y
elasticidad, ya discutidos en este apartado, el cual es interpretado como la energía

204
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

requerida para masticar el producto hasta un estado adecuado de deglución. Por

tanto, estos resultados permiten inferir claramente que las esferas de alginato/cacao
preparadas por GI requieren menor cantidad de energía para su desintegración en
boca, lo que está relacionado con la explicación dada anteriormente en referencia al
atributo gomosidad.

4.4.2 Estudio del mecanismo de liberación del principio activo desde las esferas
preparadas por gelificación externa y gelificación interna.

El desarrollo y aplicación de sistemas de vehiculización y liberación

controlada de compuestos activos se ha practicado en la industria alimentaria desde
hace años. Sin embargo, como se ha hecho mención en el apartado 2.6, los
modelos cinéticos estudiados y aplicados han sido pocos en comparación con otros
campos de estudios como la industria farmacológica en el desarrollo de nuevas
formas de medicación. La liberación controlada de compuestos activos es una
estrategia de uso frecuente en la formulación de alimentos con propiedades
funcionales. Ésta se define como el mecanismo mediante el cual uno o más
compuestos activos se difunden desde el interior de un soporte, cápsula, etc, hasta
el seno de un medio específico a lo largo del tiempo y con una cinética determinada
(Mastromatto et al., 2010). En los sistemas de liberación controlada, el agente
bioactivo es incorporado a una matriz o soporte que generalmente es de tipo
polimérico. Su velocidad de liberación depende de varios factores internos y
externos del sistema; principalmente viene determinada por las propiedades del
polímero como el tipo de matriz encapsulante, geometría del sistema, y naturaleza
del principio activo, y en menor medida, por factores externos como el pH, la
temperatura, solvente de liberación entre otros. Los mecanismos más importantes
que regulan la velocidad de liberación de un compuesto activo, son la difusión, el
hinchamiento y/o la degradación/erosión de la matriz. La importancia de cada uno
dependerá en gran parte de la composición de la matriz polimérica y del medio
circundante, por lo que el agente activo podrá ser liberado al medio por uno o más
mecanismos (Barba et al., 2009).
En este apartado se estudian algunos de los diferentes modelos cinéticos
previamente descritos en el apartado 2.6, a fin de determinar el mecanismo de
liberación de los polifenoles como principio activo encapsulado en las esferas de

205
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

alginato por extrusión a través de los mecanismos de gelificación externa o

gelificación interna. Entre los numerosos modelos cinéticos que han sido propuestos
para predecir el comportamiento de los fármacos al ser liberados desde una matriz
polimérica hacia el medio, se tienen la ley de la potencia o modelo de Kosmeyer-
Peppas generalizado, o el modelo de Higuchi que representa una versión
simplificada del anterior al especificar el valor del exponente cinético (𝑛).
Posteriormente se desarrollaron otros modelos, que surgieron con miras a
proporcionar mayor información de la naturaleza de la difusión del principio activo
debido a las desviaciones de la Ley de Fick observadas, como el modelo de Peppas-
Sahlin generalizado que introduce un segundo término a la ecuación cinética
establecida en la ley de la potencia, y a partir del cual se obtiene el modelo
simplificado conocido como modelo de Ritger-Peppas para un valor de exponente
cinético definido. En tal sentido, este trabajo estudia los modelos generalizados de la
Ley de la Potencia y el modelo de Peppas-Sahlin e incorpora otro modelo propuesto
por Gallagher-Corrigan, debido al planteamiento de dos términos matemáticos en la
ecuación cinética, el cual pretende explicar el fenómeno de difusión del soluto o
fármaco en dos etapas, una inicial llamada efecto estallido o en inglés “burst effect”
en donde ocurre una primera disolución rápida del soluto atrapado en el material de
forma más superficial, y una segunda etapa del proceso de liberación, más lenta, en
donde continúa la liberación del soluto e incluso podría ocurrir la degradación del
material polimérico.
El estudio de liberación de los polifenoles totales, se llevó a cabo desde las
esferas alginato/cacao preparadas según cada una de las formulaciones (Tabla
4.11) ya caracterizadas en el apartado anterior, a partir del método de extrusión tal
como se explica el apartado 3.4.5.2 para varias diluciones desde 50 ml hasta 300 ml
en un medio acuoso con CaCl2 como medio circundante de liberación. Para el
estudio se prepararon esferas alginato 2%/cacao 1% p/p y esferas alginato
2%/cacao 3% p/p y diferentes concentraciones de calcio en un baño acuoso
gelificante de CaCl2 para varias diluciones desde 50-300 ml a través del mecanismo
de GE, las esferas formadas se mantuvieron en el baño gelificante durante 10 min
para completar su gelificación. Por otra parte, se prepararon esferas alginato
2%/cacao 1% p/p y esferas alginato 2%/cacao 3% p/p por GI y diferentes
concentraciones de citrato cálcico, las esferas formadas se mantuvieron en el baño
oleoso acidificado durante 10 min para su gelificación completa, se separaron,

206
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

lavaron y suspendieron en 100, 150, 200, 250 y 300 ml de solución acuosa de CaCl2
a 0,001 M con agitación moderada. En todos los estudios realizados se tomaron
alícuotas de la solución acuosa de CaCl2, inicialmente pasados 10 min y
sucesivamente cada 10 min hasta completar 1 hora, después de 4 horas y
finalmente a las 24 horas. El análisis del contenido de polifenoles totales liberados
desde las esferas con el tiempo se realizó mediante el método de Folin-Ciocalteau.
En la Figura 4.36 se muestran los perfiles de liberación de los polifenoles
obtenidos desde las esferas preparadas con diferentes mecanismos de gelificación y
cantidad de extracto de cacao utilizando una baja concentración de calcio (0,4·10-3
moles Ca+2/g alginato) en una disolución de 150 ml de los distintos modelos de
ajuste cinéticos estudiados.

Figura 4.36 Perfiles de liberación de los polifenoles desde esferas preparadas por extrusión. Medio
de liberación: 150 ml disolución acuosa de CaCl2. Datos experimentales en puntos geométricos para
las esferas alginato 2%/cacao 1% p/p, a y alginato 2%/cacao 3% p/p, b preparadas por GE. Para las
esferas alginato 2%/cacao 1% p/p, c y alginato 2%/cacao 3% p/p, d preparadas por GI con una baja
-3 +2
concentración de calcio, 0,4·10 moles Ca /g alginato. Ajustes a los modelos: Power Law en línea
continua; Peppas-Sahlin en línea discontinua y Gallagher-Corrigan en línea punto-raya.

Se puede observar que los mejores ajustes a los datos experimentales

parecen obtenerse con los modelos de Peppas-Sahlin y Gallagher-Corrigan. Por el
contrario, los ajustes al modelo de Power Law se mostraron, en general, más

207
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

alejados de los datos experimentales. Estas tendencias similares se observaron en

los perfiles de liberación obtenidos desde esferas preparadas con diferentes
mecanismos de gelificación y cantidad de extracto de cacao utilizando una alta
concentración de calcio (1·10-3 moles Ca+2/g alginato) en una disolución de 150 ml
(Figura 4.37). El resto de perfiles obtenidos para todos los volúmenes de disolución
utilizados se presentaron muy similares.

Figura 4.37 Perfiles de liberación de los polifenoles desde esferas preparadas por extrusión.
Resultados obtenidos para una disolución acuosa de CaCl2 de 150 ml datos experimentales en
puntos geométricos para las esferas alginato 2%/cacao 1% p/p (a) y alginato 2%/cacao 3% p/p (b)
preparadas por GE y para las esferas alginato 2%/cacao 1% p/p (c) y alginato 2%/cacao 3% p/p (d)
-3 +2
preparadas por GI con una alta concentración de calcio, 1·10 moles Ca /g alginato. Ajustes a los
modelos: Power Law en línea continua; Peppas-Sahlin en línea discontinua y Gallagher-Corrigan en
línea punto-raya.

Con la finalidad de analizar más a fondo los ajustes obtenidos, en la Tabla

4.14 se muestran los parámetros cinéticos y coeficientes de correlación para cada
uno de los modelos estudiados.

208
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 4.14 Parámetros y coeficientes de correlación obtenidos a partir del ajuste a los modelos de
Power Law, Peppas-Sahlin y Gallagher-Corrigan.

Formulación, F n/ Modelo k or k1 k2 tmax

Diluciones, V (ml) Mt / M∞ = fb (min-n) ftmax (min-2n) (min) n R2 SSE
E1/100-300 - 0,324±0,045 - - - 0,132±0,125 ˃ 0,79 ˂ 0,032
E2/100-300 ktn - 0,360±0,049 - - - 0,158±0,019 ˃ 0,84 ˂ 0,014
E3/100-300 - 0,249±0,049 - - - 0,215±0,038 ˃ 0,88 ˂ 0,014
E4/100-300 - 0,279±0,031 - - - 0,097±0,017 ˃ 0,83 ˂ 0,008
E1/100-300 - 0,275±0,042 - (-)0,023±0,005 - 0,246±0,009 ˃ 0,91 ˂ 0,015
E2/100-300 k 1 t n + k 2 t 2n - 0,330±0,047 - (-)0,034±0,006 - 0,214±0,011 ˃ 0,91 ˂ 0,008
E3/100-300 - 0,247±0,039 - (-)0,017±0,003 - 0,272±0,003 ˃ 0,94 ˂ 0,015
E4/100-300 - 0,233±0,019 - (-)0,024±0,002 - 0,215±0,006 ˃ 0,90 ˂ 0,005
E1/100-300 0,350 0,068±0,006 0,498 - 0,661 0,016±0,010 240 - ˃ 0,97 ˂ 0,004
E2/100-300 0,360 0,087±0,016 0,478 - 0,642 0,014±0,012 245 - ˃ 0,91 ˂ 0,010
E3/100-300 0,390 0,060±0,013 0,515 - 0,696 0,019±0,005 210 - ˃ 0,94 ˂ 0,021
E4/100-300 0,250 0,089±0,006 0,348 - 0,467 0,013±0,007 235 - ˃ 0,95 ˂ 0,003
I 1/100-300 - 0,418±0,072 - - - 0,117±0,028 > 0,82 ˂ 0,021
I 2/100-300 ktn - 0,337±0,077 - - - 0,141±0,035 ˃ 0,84 ˂ 0,028
I 3/100-300 - 0,336±0,081 - - - 0,100±0,025 > 0,87 ˂ 0,005
I 4/100-300 - 0,269±0,014 - - - 0,127±0,007 > 0,81 ˂ 0,013
I 1/100-300 - 0,338±0,065 - (-)0,031±0,012 - 0,238±0,018 ˃ 0,93 ˂ 0,008
I 2/100-300 k 1 t n + k 2 t 2n - 0,297±0,094 - (-)0,031±0,031 - 0,253±0,041 > 0,93 ˂ 0,011
I 3/100-300 - 0,337±0,082 - (-)0,042±0,020 - 0,190±0,012 > 0,95 ˂ 0,002
I 4/100-300 - 0,233±0,014 - (-)0,021±0,003 - 0,239±0,011 > 0,91 ˂ 0,006
I 1/100-300 0,420 0,098±0,037 0,605 - 0,727 0,018±0,015 170 - ˃ 0,90 ˂ 0,026
I 2/100-300 0,300 0,078±0,049 0,551 - 0,628 0,006±0,005 200 - ˃ 0,91 ˂ 0,013
I 3/100-300 0,280 0,125±0,017 0,437 - 0,615 0,022±0,019 245 - ˃ 0,90 ˂ 0,006
I 4/100-300 0,300 0,084±0,011 0,440 - 0,502 0,015±0,003 265 - ˃ 0,93 ˂ 0,006

Formulación, Fn; Gelificación externa, E; Gelificación interna, I; Subíndices 1 y 2 para las esferas alginato/cacao 1% p/p y
subíndices 3 y 4 para las esferas alginato/cacao 3% p/p extracto de cacao encapsulado; Además, subíndices 1 y 3 para
esferas preparadas con 0,4·10-3 moles Ca+2/g alginato, y subíndices 2 y 4 para las esferas preparadas con 1·10-3 moles Ca+2/g
alginato, respectivamente; Fracción absoluta del compuesto activo liberado en el tiempo t e infinito, Mt / M∞; Volumen del medio
de liberación desde 100 ml hasta 300 ml, V; Constante cinética que refleja las características estructurales del sistema o la
contribución Fickiana, k o k1; Constante cinética de disolución/relajación del polímero, k2; Exponente cinético, n; Fracción
liberada durante la primera etapa del proceso, fb; Frácción máxima del compuesto liberado a lo largo del proceso, fmax;
constante de primer orden (min-1) durante la primera etapa, k1; constante para la segunda fase de liberación (min-1), k2; tiempo
durante el que se produce el máximo ratio de liberación a lo largo del proceso, tmax; Coeficiente de correlación, R2; Suma de
cuadrados debido al error, SSE; Valores medios (±desviación estándar).

Se puede observar que los coeficientes de regresión obtenidos para el

modelo de Peppas o Power Law se presentaron inferiores a R2 < 0,88, este
parámetro de ajuste puede explicar los valores del exponente cinético (𝑛), los cuales
se presentaron alejados respecto a los valores tabulados en literatura para
geometrías esféricas, figura geométrica característica de los encapsulados utilizados
en este estudio (Tabla 2.6). Considerando que 𝑛 permite interpretar el mecanismo de
liberación del compuesto activo, y dado los valores (𝑛 < 0,43), se puede inferir sobre
la existencia de un comportamiento de difusión pseudo-Fickiano, por ello, el modelo
de Peppas o Power Law es descartado del estudio para considerar otros modelos
más complejos que puedan proporcionar mayor información sobre la naturaleza de

209
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

la difusión de los polifenoles desde las esferas, tales como el modelo de Peppas-
Sahlin y Gallagher-Corrigan.
El ajuste al modelo de Peppas-Sahlin, presenta mejores coeficientes de
correlación respecto a los obtenidos con el modelo de Peppas (R2 > 0,90), así como
SSE menores. En tal sentido, el modelo permite interpretar el comportamiento de
liberación de los polifenoles desde las esferas de alginato/cacao, en donde se puede
apreciar que los valores dados para la constante cinética k1 son mayores respecto a
los obtenidos para k2. Este aspecto indica que el primer término de la ecuación tiene
una mayor contribución. Este término describe un comportamiento de tipo difusional.
Por tanto, se puede decir que el mecanismo de liberación de los polifenoles se ve
principalmente dominado por una contribución difusional Fickiana (Spizzirri et al.,
2013). Por otro lado, los valores obtenidos de los exponentes cinéticos (n < 0,43),
manifiestan al mismo tiempo, la existencia de un comportamiento difusional tipo
pseudo-Fickiano que es asociado a la presencia de poros en la matriz del polímero
encapsulante, y por tanto, se relaciona con la difusión simultánea del compuesto
activo a través de la matriz hinchada y de los poros llenos con el medio de
disolución. Dicho comportamiento, se denomina mecanismo de disolución/relajación.
Por otra parte, este comportamiento es a su vez reflejado en la tasa negativa que
aporta la constante cinética (k2), como consecuencia de una anomalía producto de la
relajación y posterior hinchamiento de la matriz polimérica que produce un
ralentizamiento del proceso de liberación del principio activo, tal y como han descrito
otros autores (Siepmann y Peppas, 2012).
En lo que respecta a los parámetros dados por el ajuste al modelo de
Gallagher-Corrigan, se pueden observar valores de R2 > 0,90. Esto parece indicar
que el modelo podría explicar el mecanismo de liberación de los polifenoles desde
las esferas. Sin embargo, los valores del estadístico de ajuste, SSE, se acercan más
a cero al utilizar el modelo de Peppas-Sahlin (0,002-0,015) respecto a los obtenidos
con el modelo de Gallagher (0,003-0,026), lo que indica que se tiene un mejor ajuste
de los datos experimentales con el modelo de Peppas-Sahlin. Por otra parte, al
observar los valores dados por las constantes cinéticas, 𝑘1 y 𝑘2 , éstas se presentan
muy similares. Por ello, podría inferirse que el proceso de liberación, descrito por
este modelo en dos etapas, ocurre prácticamente en iguales proporciones referidas
a la velocidad de liberación de los polifenoles. En otras palabras, una fase inicial
debida a la difusión del compuesto activo que se encuentra en la superficie de la

210
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

matriz polimérica, y que ocurre a una velocidad ligeramente mayor (𝑘1 > 𝑘2 )
influenciado por el “efecto estallido”, respecto a una segunda etapa o fase que
ocurre más lentamente y donde continúa la liberación de los polifenoles desde el
interior de la matriz hacia el exterior producto del hinchamiento o degradación del
polímero. En este sentido, es importante destacar que el modelo plantea la
posibilidad de explicar el proceso de liberación debido a la degradación del polímero.
Sin embargo, no se observó durante el estudio ningún tipo de degeneración de las
esferas, ya que éstas se conservaron enteras y esféricas en todo momento durante
la experimentación. Por tanto, la segunda etapa correspondería a un proceso de
hinchamiento del polímero producto del llenado intersticial de los poros de la matriz
con la disolución o medio de liberación. Tomando en cuenta estas consideraciones,
las cuales resultan muy semejantes a las dadas por el modelo de Peppas-Sahlin, y
sumando que éste proporciona otros parámetros como el exponente cinético que
permiten obtener mayor información sobre el mecanismo de liberación del
compuesto activo, se selecciona como modelo cinético más adecuado para explicar
el mecanismo de liberación de los polifenoles desde las esferas alginato/cacao para
ambos mecanismos de gelificación, el modelo de Peppas-Sahlin. En este sentido, se
puede observar en las Figuras 4.36 y 4.37 que las curvas cinéticas de ajuste al
modelo de Gallagher-Corrigan presentaron un comportamiento muy semejante al
obtenido con el modelo de Peppas-Sahlin, lo que se encuentra en consonancia con
las explicaciones dadas anteriormente, y por tanto, permite concluir que el proceso
de liberación del compuesto activo ocurre a través de un proceso complejo y
simultáneo producto de entredós mecanismos: la difusión fickiana de los polifenoles
y la relajación e hinchamiento de la matriz polimérica encapsulante, modelo descrito
por la ecuación cinética propuesta por Peppas-Sahlin. En la Figura 4.38 se muestran
los perfiles de liberación de los datos experimentales y sus ajustes al modelo de
Peppas-Sahlin obtenidos desde las esferas preparadas para las diferentes
formulaciones para el resto de las diluciones utilizadas.

211
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.38 Perfiles de liberación de los polifenoles desde esferas preparadas por extrusión. Datos
experimentales en puntos geométricos en diluciones acuosas de CaCl2 ●, о 100, ■, □ 200, ♦, ◊ 250 y
+, x 300 ml. Esferas alginato 2%/cacao 1% p/p (a, e) y alginato 2%/cacao 3% p/p (b, f) preparadas por
GE y esferas alginato 2%/cacao 1% p/p (c, g) y alginato 2%/cacao 3% p/p (d, h) preparadas por GI.
-3 +2
Esferas preparadas con 0,4·10 moles Ca /g alginato puntos geométricos rellenos y esferas
-3 +2
preparadas con 1·10 moles Ca /g alginato puntos geométricos sin relleno. Ajustes al modelo de
Peppas-Sahlin en línea discontinua.

212
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.4.2.1 Influencia de la concentración de calcio en la liberación del principio

activo desde las esferas.

A fin de analizar la influencia de la concentración de calcio sobre el proceso

de liberación de los polifenoles, se observaron los perfiles de liberación
gráficamente. La Figura 4.39 muestra los perfiles de liberación de los polifenoles
durante 24 horas para las diluciones de 150 ml y 300 ml en solución acuosa con
CaCl2 para las diferentes formulaciones de esferas alginato 2%/cacao 1% o 3% p/p
preparadas con varias concentraciones de calcio para ambos tipos de gelificación.
Se puede observar que los perfiles de liberación (Figura 4.39a y 4.39b) para las
esferas de alginato 2%/cacao 1% p/p presentan un comportamiento cinético muy
parecido. Las pequeñas diferencias que puedan apreciarse referidas al porcentaje
de liberación, son esperadas, al considerar que se utiliza un mayor volumen de
dilución (300 ml) que, por tanto, aumenta el gradiente de concentración de
polifenoles entre las esferas y el medio acuoso. En la Figura 4.39b, se muestra una
liberación aparentemente más rápida de los polifenoles desde las esferas
preparadas por GI respecto a las esferas obtenidas por GE, en donde se observa
una clara diferencia en los porcentajes liberados al utilizar una mayor concentración
de calcio que ralentiza la difusión del compuesto activo desde las esferas obtenidas
por GI.

213
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.39 Perfil de liberación de los polifenoles desde las esferas de alginato/cacao preparadas por
extrusión. Resultados experimentales en puntos geométricos y ajustes al modelo Peppas-Sahlin en
línea discontinua. Diluciones del medio para 150 ml, (a) y 300 ml, (b) para las esferas alginato
2%/cacao 1% p/p; Diluciones del medio para 150 ml, (c) y 300 ml, (d) para las esferas alginato
-3 +2 -3 +2
2%/cacao 3% p/p; ● 0,4·10 moles Ca /g alginato y + 1·10 moles Ca /g alginato concentración de
-4 +2 -3 +2
calcio para las esferas preparadas por GE; ▲ 0,4·10 moles Ca /g alginato y ■ 1·10 moles Ca /g
alginato concentración de calcio para las esferas preparadas por GI.

Por otra parte, en los gráficos Figura 4.39c y 4.39d, para las esferas de
alginato 2%/cacao 3% p/p, se puede observar que los perfiles de liberación se
encuentran más diferenciados y como se mencionó anteriormente se aprecia mejor
el comportamiento al utilizar un mayor volumen del medio de liberación. La Figura
4.39d muestra una influencia de la concentración de calcio al observarse un retraso
en la liberación de los polifenoles cuando se utiliza una mayor concentración (1·10-3
moles Ca+2/g alginato) para ambos mecanismos de gelificación, debido a que el gel
formado es más compacto y por tanto retrasa la liberación del principio activo. En tal
sentido, se puede observar que los % de liberación obtenidos, en general, al utilizar
una baja concentración de calcio (0,4·10-3 moles Ca+2/g alginato) van del 80% al
95%, mientras que en las esferas preparadas con una mayor concentración de
calcio se ven disminuidos hasta aproximadamente el 60%. Este aspecto puede
atribuirse a la formación de un gel de alginato más reticulado que, por tanto, dificulta
la difusión de las moléculas del principio activo al exterior. En la Figura 4.39c este

214
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

efecto es probablemente enmascarado por la poca cantidad de disolución utilizada,

por tanto los polifenoles liberados que se encuentran presentes en la solución en
una concentración mayor impiden la salida de las moléculas fenólicas, debido a una
baja fuerza impulsora. La complejidad del sistema alginato/cacao y su interacción
con el disolvente podría explicar las diferencias observadas en los perfiles de
liberación al emplear cantidades varias del compuesto activo, y por ello, sugerir que
al utilizar una menor concentración de extracto de cacao se facilita el acceso del
medio circundante a través de los poros e intersticios no ocupados en el interior de
las esferas, lo que produciría un enmascaramiento de la influencia de la
concentración de calcio sobre el proceso de liberación de los polifenoles. Por tanto,
mayores estudios serían necesarios para determinar la influencia de la
concentración de calcio en la liberación de los polifenoles de las esferas.

4.4.2.2 Influencia de la concentración de calcio en la liberación del principio

activo desde geles obtenidos por gelificación interna.

En virtud de los resultados obtenidos en el apartado 4.4.1 referente a la

caracterización de las esferas, se observó que las esferas alginato/cacao
preparadas por el mecanismo de GI presentaron atributos de textura referidos a una
mayor suavidad y menor gomosidad, los cuales son considerados en este estudio
desde el punto de vista sensorial, más apropiados para ser incorporados como
cápsulas bioactivas en alimentos. Por tanto, estas características de mayor suavidad
y menor gomosidad requerirán de menor energía para su ruptura en boca. Estos
resultados están en consonancia con la observación de una estructura más
compacta y homogénea. Por otra parte, los perfiles de liberación del principio activo
encapsulado, en general, mostraron que al utilizar una mayor concentración de
calcio el proceso de difusión de los polifenoles se ve retrasado. En lo que respecta a
la cantidad de extracto a utilizar, es importante resaltar que una mayor cantidad de
compuesto activo encapsulado, proporcionará mayor cantidad de polifenoles totales
disponibles. Se llevaron a cabo estudios adicionales para evaluar la influencia de la
concentración de calcio en la liberación del compuesto activo, tal como se explica en
el apartado 3.4.5.3, no a partir de esferas, sino a partir de geles preparados con
alginato 2%/cacao 3% p/p y varias concentraciones de calcio colocados sobre una
base de gelatina neutra, hacia la cual se iría difundiendo el principio activo, a fin de

215
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

determinar la influencia de la concentración de calcio sobre la liberación de los

polifenoles desde el gel hacia la gelatina con el tiempo. Para ello, se analizaron
varios geles de alginato 2%/cacao 3% p/p preparados a partir de 0,4·10-3 moles
Ca+2/g alginato y otros a partir de 1·10-3 moles Ca+2/g alginato formados por GI tras
5, 16, 21 y 38 horas. Los geles y la gelatina base se separaron, se realizó un corte
en la superficie de la gelatina de 1 mm, éste se eliminó para evitar posibles
interferencias provocadas por el contacto directo de la gelatina con el gel
alginato/cacao. Luego, se realizó un nuevo corte a la gelatina con un espesor de 5
mm, la cual se fundió a 35 ºC para ser analizada por el método de Folin-Ciocalteu.

20
Polifenoles totales, EAG (ppm)

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
Figura 4.40 Efecto de la concentración de calcio en la liberación de los polifenoles desde geles
alginato/cacao hacia gelatina neutra con el tiempo. Geles de alginato 2%/cacao 3% p/p preparados
-3 -3 +2
por GI con □ 0,4·10 y Δ 1·10 moles Ca /g alginato para las 5, 16, 21 y 38 horas; Polifenoles totales
en gelatina neutra expresados en equivalentes de ácido gálico, EAG.

En la Figura 4.40, se puede observar la evolución con el tiempo de la

concentración de polifenoles en gelatina. Los resultados muestran, en general,
menores cantidades de polifenoles difundidos en gelatina para el gel de alginato
2%/cacao 3% p/p preparado con la mayor concentración de calcio (1·10-3 moles
Ca+2/g de alginato). Este estudio confirma que un aumento de la concentración de
calcio induce un retraso en la liberación de polifenoles, tal como se había observado
en el estudio cinético con las esferas.
Por otra parte, se puede observar en la Figura 4.41 los resultados obtenidos
del análisis por retrodifusión o Back Scattering (BS) a partir de los geles de alginato

216
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2%/cacao 3% p/p preparados con diferentes concentraciones de calcio y colocados

sobre una base de gelatina natural neutra en un tubo especial para mediciones de
dispersión de luz (apartado 3.4.5.3). Las mediciones de BS se realizaron a 5 mm de
profundidad dentro de la gelatina, a fin de determinar los polifenoles difundido desde
el gel alginato/cacao a ésta con el tiempo (5, 16 21 y 38 horas). Estos resultados
parecen indicar que transcurridas 5 horas los polifenoles aún no han llegado a la
sección de la gelatina analizada o que la cantidad presente es pequeña para ser
observada a través de los valores de retrodifusión y, por ello el %BS se muestra
similar al correspondiente para la gelatina natural neutra (línea horizontal continua).
Transcurridas 16 horas, se pudo observar una marcada disminución del %BS con el
tiempo, lo que se atribuye a la presencia de moléculas fenólicas en la estructura de
la gelatina debido a la proximidad de los resultados y valor del BS dado para el gel
de alginato 2%/cacao 3% p/p (línea horizontal segmentada). En este sentido, los
resultados muestran que los valores de BS decrecen continuamente al utilizar una
baja concentración de calcio (0,4·10-3 moles Ca+2/g alginato) con el tiempo.

Figura 4.41 Efecto de la concentración de calcio en la liberación de los polifenoles desde geles con el
-3 -3 +2
tiempo. Geles de alginato 2%/cacao 3% p/p preparados por GI con ● 0,4·10 y о 1·10 moles Ca /g
alginato y analizados para las 5, 16, 21 y 38 horas. Porcentaje de Retrodifusión o Back Scattering,
%BS gel alginato 2%/cacao 3% p/p en línea segmentada y %BS gelatina natural neutra en línea
continua.

Por otro lado, al utilizar una concentración superior de calcio (1.10 -3 moles
Ca+2/g alginato) en el gel alginato/cacao, se obtuvieron valores de BS prácticamente
constantes a partir de las 16 horas de análisis. Este aspecto pudo indicar que no

217
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

ocurrieron cambios importantes en la zona de la gelatina natural neutra analizada, y

por tanto, que la cantidad de polifenoles totales presentes entre las 16 y 38 horas se
mantuvo prácticamente igual. Lo que permite confirmar las observaciones anteriores
referentes a la influencia de la concentración de calcio en la liberación de los
compuestos activos presentes en el gel alginato/cacao, de manera que, al utilizar
una mayor concentración de calcio (1·10-3 moles Ca+2/g alginato) se produce un
retraso en la difusión de los polifenoles desde los geles de alginato 2%/cacao 3%
p/p.

4.5 Estudio de un producto alimentario de aplicación funcional con la

incorporación de los encapsulados.

Se decide estudiar un producto alimentario de aplicación funcional con la

incorporación de esferas alginato/cacao o cápsulas obtenidas por el método de
extrusión y preparadas a través del mecanismo de gelificación interna. Se pretende
que el alimento funcional a evaluar sea un producto de aspecto atractivo e innovador
al incorporar cápsulas bioactivas de tamaño, textura y color llamativo para el
consumidor. En este sentido, con la finalidad de aprovechar los beneficios
nutricionales proporcionados por el extracto de cacao (propiedades antioxidantes),
se decide utilizar la mayor cantidad de extracto de cacao (3% p/p) empleada en este
estudio, una alta concentración de calcio (1·10-3 moles Ca+2/g alginato) que permita
inducir el retraso en la liberación de los polifenoles una vez integrados al producto
alimentario, y para la preparación de las esferas alginato/cacao se utiliza el
mecanismo de gelificación interna, principalmente debido a la aportación de sus
propiedades texturales referidas a suavidad y menor gomosidad de las esferas.
Además, esta técnica de gelificación utiliza un baño gelificante oleoso en donde los
compuestos activos (polifenoles) no son solubles, y con ello se podría garantizar el
máximo aprovechamiento de la cantidad de extracto de cacao encapsulado.
Este apartado estudia a través de una evaluación sensorial el grado de
aceptación o rechazo del producto alimentario funcional elaborado. Por otra parte,
estudia la influencia de las cápsulas en el producto, y la diferencia de adicionar el
principio activo encapsulándolo o sin encapsular, a través de un análisis instrumental
del perfil de textura y el ensayo de resistencia así como su evolución con el tiempo
de almacenamiento. Finalmente, se realiza un análisis cualitativo de tipo
218
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

microbiológico a las muestras del producto alimentario, una vez alcanzado el tiempo
final de almacenamiento establecido en el estudio.

4.5.1 Evaluación sensorial de las gelatinas enriquecidas con los encapsulados.

Las gelatinas enriquecidas con los encapsulados de alginato/cacao para un

producto tipo postre fueron analizadas empleando el método de análisis de tipo
discriminatorio a través de una prueba triangular. El postre de gelatina se preparó tal
como se describe en el apartado 3.4.6.1 a partir de gelatina natural neutra, la cual
fue aromatizada, coloreada, endulzada y a la que finalmente se incorporaron las
cápsulas o esferas de alginato 2%/cacao 3% p/p preparadas previamente por
extrusión con una alta concentración de calcio (1.10-3 moles Ca+2/g alginato) a través
del mecanismo de GI. Asimismo, se elaboraron esferas de alginato 2%/frambuesa
3% p/p liofilizada en polvo (sin extracto de cacao), las cuales se colorearon para
simular el color natural (burdeos) de las cápsulas bioactivas con extracto de cacao
(cápsulas control) a fin de ser incorporadas en la gelatina aromatizada, coloreada y
endulzada para su utilización como muestras control. Por otra parte, se prepararon
esferas de alginato 2%/frambuesa 3% p/p con diferentes colores (naranja y verde)
para ser incorporadas en las gelatinas enriquecidas (cápsulas bioactivas con
extracto de cacao) y también en las gelatinas utilizadas como muestras control
(cápsulas control sin extracto de cacao) para así elaborar un producto alimentario de
aspecto atractivo e innovador. La frambuesa entera liofilizada se utilizó con el fin de
obtener esferas con alto contenido de fibra que permitiera la retención de los
colorantes.
La prueba triangular se llevó a cabo en el Laboratorio de Evaluación Sensorial
en el Campus de Alimentación de Torribera de la Universidad de Barcelona con un
grupo de 20 personas seleccionadas aleatoriamente. Los panelistas recibieron tres
muestras codificadas, las cuales se presentaron aleatoriamente. A cada uno de los
panelistas se le informó de que debía comenzar la degustación de izquierda a
derecha, pudiendo probar cada una tantas veces fuese necesario siempre que se
respetara el orden de las muestras. Se sugirió beber un poco de agua o comer un
trozo de galleta para eliminar posibles interferencias. A los panelistas se les informó
de que dos muestras eran idénticas y una diferente y, por tanto, debían identificar la
muestra diferente e indicar su respuesta en el formulario.

219
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados mostraron que sólo 7 panelistas de los 20 identificaron la

muestra que era diferente. Esto significa que las muestras que sólo contenían las
esferas de alginato control (sin extracto de cacao) y aquellas con las esferas de
alginato/cacao, parecieron ser la misma al no mostrar ninguna diferencia
estadísticamente significativa desde el punto de vista organoléptico para un nivel de
confianza del 95%, según tabla estadística en el Apéndice 9.6 (Mason y
Nottingham, 2002). Este resultado, indica que se tiene una probabilidad de error
superior al 40%, por tanto, los panelistas sólo pueden acertar la respuesta por
estimación aleatoria. En este sentido, los panelistas no pudieron identificar la
diferencia entre las muestras, por ello, se tiene como resultado que el sabor del
extracto de cacao (astringente y amargo) encapsulado en las esferas de alginato, no
fue percibido por la mayoría de ellos, así como otras propiedades tales como la
textura y el olor. Por tanto, el sabor del compuesto activo rico en polifenoles fue
satisfactoriamente enmascarado a través de su encapsulación. La Figura 4.42
muestra los postres de gelatina probados por los panelistas en la prueba triangular.

Figura 4.42 Fotografías de los postres de gelatina enriquecida con los encapsulados. Iluminación con
luz natural, a; Iluminación con luces rojas, b.

4.5.2 Estudio comparativo de la texturas de las gelatinas con y sin la incorporación

de encapsulados y su evolución con el tiempo de almacenamiento.

Se estudiaron distintos tipos de gelatinas preparadas sin y con la

incorporación de esferas alginato/cacao como cápsulas bioactivas a fin de observar
la influencia de éstas en la textura de las gelatinas, así como la diferencia de
adicionar el principio activo encapsulándolo o sin encapsular, a través de un análisis

220
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

instrumental del perfil de textura (TPA) y el ensayo de resistencia, así como su

evolución con el tiempo de almacenamiento.
Se analizaron cinco tipos de gelatinas, las cuales se prepararon a partir de
gelatina natural neutra en cilindros de plástico. A tres muestras de gelatina se les
incorporaron esferas de alginato, a una de éstas se incorporaron esferas de alginato
2% p/p (sin extracto de cacao) o GEA, a otra muestra se adicionaron esferas
alginato 2%/cacao 3% p/p (cápsulas bioactivas) o GEC y en la tercera se
incorporaron las cápsulas bioactivas a la gelatina natural neutra aromatizada,
coloreada y endulzada con la misma formulación de las gelatinas enriquecidas tipo
postre o GP (apartado 4.5.1), preparadas para el consumidor. Todas las esferas se
prepararon por extrusión y formaron por gelificación interna para una alta
concentración de calcio (1·10-3 moles Ca+2/g alginato). Por otra parte, se analizó otro
tipo de gelatina preparada con la adición del principio activo sin encapsularlo, es
decir, el extracto de cacao se añadió directamente a la gelatina natural neutra o GLC
y, por último, otras más se prepararon con gelatina natural neutra sin la
incorporación de esferas de alginato/cacao ni la adición del extracto de cacao o GN.
Al adicionar directamente el extracto de cacao a la gelatina neutra (sin
encapsular o GLC), con la concentración de cacao utilizada para la preparación de
las esferas alginato 2%/cacao 3% p/p, se observó que no ocurrió la gelificación de la
misma, quedando partes líquidas y observándose la formación de un precipitado.
Este aspecto se atribuye a interacciones entre los compuestos polifenólicos y la
gelatina que impidieron una gelificación adecuada. Para que se produjera dicha
gelificación, se duplicó la concentración de gelatina en la preparación de las GLC.
Por ello, las muestras de gelatina natural neutra (GN) se prepararon considerando el
doble de concentración de gelatina a fin de ser comparadas éstas con las muestras
de GCL.
El análisis del perfil de textura (TPA) se realizó para los diferentes tipos de
gelatinas a distintos tiempos de almacenamiento. El análisis instrumental de las
muestras se llevó a cabo en un reómetro programado para realizar mediciones con
fuerza normal a una velocidad de 0,025 mm/s y 17% de deformación durante dos
ciclos de compresión sin provocar destrucción de las muestras, lo que permitió
obtener las curvas fuerza-tiempo a través de las cuales se midieron las propiedades
mecánicas de dureza, cohesividad y elasticidad, y calcularon otras más como
gomosidad y masticabilidad. Por otra parte, se realizó el ensayo de resistencia (ER)
221
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

para todas las muestras de gelatinas con y sin encapsulados durante los 27 días de
almacenamiento. Este ensayo de resistencia se realizó a una velocidad de
compresión de 0,025 mm/s y un 70% de deformación (prueba destructiva que
ocasiona el aplastamiento irreversible de la muestra) con la finalidad de medir la
fuerza máxima o límite de cedencia, permitiendo así obtener una medida de la
firmeza o consistencia de éstas y de sus posibles cambios de textura con el tiempo
de almacenamiento. Todas las muestras de gelatinas de forma cilíndrica se cortaron
desde su superficie manteniendo un espesor de 10 mm para los diferentes análisis
de textura, los cuales se realizaron a una temperatura controlada de 5 ±0,5 ºC a fin
de simular las condiciones de refrigeración y almacenamiento de las gelatinas.
Dichas pruebas se realizaron al menos por triplicado para las muestras de gelatinas
preparadas a partir de gelatina neutra y con la incorporación de las cápsulas
bioactivas o esferas de alginato 2%/cacao 3% p/p (GEC).

4.5.2.1 Análisis del perfil de textura y ensayo de resistencia de las gelatinas

con el principio activo adicionado directamente y sin añadidos y evolución con
el tiempo de almacenamiento.

En la Tabla 4.15 se pueden observar los valores de dureza, cohesividad y

elasticidad obtenidos para las gelatinas con el principio activo añadido directamente
y sin éste. Los valores de la GCL (gelatinas con el principio activo libre o sin
encapsular) se mostraron menores respecto a los obtenidos con la gelatina natural
(GN) sin principio activo. Este resultado es esperable, dada la formación del
precipitado observado durante el proceso de preparación de la GCL, lo que
probablemente provocó la falta de una gelificación adecuada y en donde, a pesar de
haber utilizado una mayor concentración de gelatina para lograr la gelificación, se
pudo observar que los valores de dureza se presentaron inferiores respecto a los
valores de dureza obtenidos para la GN, la cual se preparó con la misma cantidad
de gelatina utilizada en las gelatinas con cacao libre o sin encapsular (GCL). Este
aspecto parece indicar que existen interacciones entre los compuestos polifenólicos
del extracto de cacao y la gelatina que provocan una gelificación inadecuada y, por
tanto, la formación de un gel menos rígido y poco homogéneo y, por tanto, la adición
del extracto libre de cacao no es adecuada para la preparación de los postres de
gelatina enriquecidos.

222
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 4.15 Propiedades mecánicas medidas a través del TPA para las gelatinas con extracto de
cacao adicionado directamente y sin añadidos.

Dureza (N) Cohesividad Elasticidad

Días/Muestras GCL GN GCL GN GCL GN
1 0,364 1,777 0,437 0,863 0,800 0,794
2 0,288 2,801 0,514 0,849 0,799 0,799
3 0,657 2,131 0,362 0,894 0,824 0,799
6 0,423 1,565 0,409 0,808 0,817 0,792
9 0,639 0,776 0,693 0,613 0,792 0,808
13 0,539 0,756 0,267 0,649 0,800 0,792
16 0,512 0,702 0,352 0,800 0,792 0,792
20 0,450 0,961 0,260 0,680 0,800 0,792
23 0,445 0,912 0,608 0,699 0,792 0,799
27 0,445 0,820 0,608 0,427 0,792 0,792
Gelatina natural neutra con extracto de cacao libre (sin encapsular), GCL; Gelatina natural neutra sin añadidos,
GN; Periodo de almacenamiento, 27 días bajo refrigeración a 5 ºC.

Por otro lado, los valores de dureza para la GN mostraron un descenso

importante entre el primer día y el noveno de almacenamiento (Tabla 4.15), este
efecto también se pudo apreciar en los resultados obtenidos al aplicar a las
muestras el ER, ya que se observó un descenso abrupto de la fuerza para el mismo
periodo de estudio (Figura 4.43). Este aspecto puede ser atribuido a una
degradación de la gelatina natural neutra con el tiempo de almacenamiento, ya que
por observación directa, éstas mostraron cambios visibles en la apariencia, tal como
agujeros en la superficie, presencia de puntos blancos en su interior y pérdida de
consistencia, lo que probablemente se produjo debido a la presencia de
microorganismos ya que no se utilizó ningún conservante para su preparación.
En lo que respecta al atributo cohesividad, el cual representa la fuerza de los
enlaces internos del producto analizado, se puede observar que los valores de
cohesión para las GCL fluctuaron a lo largo de los 27 días de almacenamiento
(Tabla 4.15), este comportamiento podría ser explicado debido a la presencia de
diferentes zonas en su estructura como consecuencia de una gelificación
inadecuada. En ese sentido, se puede apreciar en la Figura 4.43 que los valores de
fuerza o límite de cedencia de las GCL fueron bastante inferiores a los obtenidos
para las GN, lo que incluso resultó en una pérdida de su consistencia con el tiempo
tal que impidió la realización del ensayo de resistencia a partir del día 23 de
almacenamiento ya que el sensor del instrumento no pudo detectar la superficie del
gel.

223
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 4.43 Ensayo de Resistencia de las gelatinas con el principio activo adicionado directamente y
sin éste. ○ GCL, gelatina natural neutra con extracto de cacao adicionado directamente o sin
encapsular; ● GN, gelatina natural neutra. Gelatinas preparadas con el doble de concentración de
gelatina natural neutra respecto al utilizado para el resto de las diferentes gelatinas estudiadas con la
incorporación de esferas alginato/cacao; 27 días de almacenamiento bajo refrigeración a 5 ± 0,5 ºC.
Foto: Aspecto de la GN a los 13 días de almacenamiento.

Los valores de elasticidad obtenidos para las muestras de GCL y GN se

mostraron muy similares en el tiempo, este aspecto permite inferir que dadas las
condiciones del TPA, las gelatinas parecen recuperarse tras los dos ciclos de
compresión aplicados. Por otra parte, estos valores del índice de elasticidad más
cercanos a uno, muestran que las texturas de las GCL y GN son de tipo gomoso. En
la Tabla 4.16, se tienen las propiedades mecánicas calculadas a partir del TPA,
especificadas como gomosidad y masticabilidad. Se puede observar que los valores
de gomosidad muestran comportamientos similares a los obtenidos para la dureza
de ambas muestras de gelatinas (GCL y GN), este efecto se produce debido a la
importante contribución de la dureza en este atributo. Por ello, se puede inferir que la
GCL requiere una menor energía para su desintegración dados los valores inferiores
de gomosidad obtenidos (0,913-0,270 N) respecto a los valores de gomosidad en las
GN (1,533-0,349 N). En ambos casos se observa que los valores disminuyen con el
tiempo, aspecto que se atribuye a un cambio progresivo en su estructura y, que
como se ha explicado anteriormente para el caso de las GCL éste puede ser
producto de las interacciones entre los polifenoles y la gelatina; mientras que para
las GN se puede inferir que este efecto es promovido por el posible ataque de

224
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

microorganismos dada las observaciones de su apariencia y la pérdida de

consistencia.

Tabla 4.16 Propiedades mecánicas calculadas a partir de las curvas fuerza-tiempo (TPA) en las
gelatinas con extracto de cacao adicionado directamente y sin añadidos.

Gomosidad (N) Masticabilidad (N)

Días/Muestras GCL GN GCL GN
1 0,913 1,533 0,111 1,214
2 0,148 2,377 0,118 1,901
3 0,238 1,906 0,196 1,525
6 0,173 1,264 0,141 1,001
9 0,443 0,476 0,351 0,384
13 0,144 0,491 0,116 0,389
16 0,180 0,562 0,143 0,445
20 0,117 0,654 0,194 0,517
23 0,274 0,708 0,214 0,566
27 0,270 0,349 0,214 0,277
Gelatina con extracto de cacao libre (sin encapsular), GCL; Gelatina natural neutra
sin añadidos, GN; Periodo de almacenamiento, 27 días bajo refrigeración a 5 ºC.

Por otra parte, los valores de masticabilidad obtenidos para las GCL y GN,
son esperables, considerando que este atributo es producto de la gomosidad por la
elasticidad expresada en unidades de fuerza, lo que se relaciona con la energía
requerida para masticar un producto hasta un estado adecuado para la deglución, y
está íntimamente vinculado a los parámetros primarios de dureza, cohesividad y
elasticidad. Por tanto, estos valores en todo caso reflejan las tendencias ya
observadas y explicadas para el atributo de gomosidad.

4.5.2.2 Análisis del perfil de textura y ensayo de resistencia de las gelatinas

con la incorporación de esferas de alginato y el principio activo encapsulado y
su evolución con el tiempo de almacenamiento.

En la Tabla 4.17 se pueden observar las propiedades texturales obtenidas a

partir de las curvas fuerza-tiempo del TPA correspondientes a la dureza,
cohesividad, elasticidad, gomosidad y masticabilidad de las diferentes gelatinas
preparadas a partir de gelatina natural neutra y la incorporación de esferas de
alginato 2% p/p (GEA), otras gelatinas con la adición de cápsulas bioactivas (esferas

225
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

alginato 2%/cacao 3% p/p) o GEC y, otras más tipo postre preparadas con la
gelatina neutra endulzada, coloreada, aromatizada y con la incorporación de las
cápsulas bioactivas o esferas alginato 2%/cacao 3% p/p (GP). Los valores obtenidos
de los parámetros texturales para las muestras de gelatinas tipo GEC (realizadas por
triplicado) evidencian una variabilidad adecuada considerando que los valores del
coeficiente de variabilidad se presentaron menores al 10% (Chacón-Villalobos y
Pineda-Castro, 2009). Los valores de dureza se presentaron, en general, muy
irregulares para todas las muestras de gelatinas analizadas con el tiempo de
almacenamiento, lo que se puede atribuir a la falta de homogeneidad presentada por
la distribución aleatoria de las esferas o cápsulas en las gelatinas.

Tabla 4.17 Propiedades mecánicas medidas a través del TPA de las diferentes gelatinas preparadas
con la incorporación de esferas de alginato y cápsulas bioactivas.

Dureza (N) Cohesividad Elasticidad

Días/Muestras
GEA GP GECprom GEA GP GECprom GEA GP GECprom
1 1,791 1,791 0,847±0,076 0,688 0,694 0,762±0,066 0,775 0,792 0,797±0,005
2 1,832 1,733 0,856±0,070 0,855 0,657 0,709±0,100 0,792 0,799 0,797±0,009
3 1,530 1,614 0,867±0,073 0,823 0,741 0,727±0,044 0,793 0,792 0,794±0,004
6 2,131 1,602 1,085±0,099 0,859 0,732 0,698±0,084 0,702 0,799 0,797±0,004
9 1,314 1,588 1,044±0,069 0,846 0,808 0,813±0,009 0,799 0,808 0,799±0,001
13 1,731 1,907 0,952±0,069 0,823 0,727 0,816±0,014 0,792 0,792 0,792±0,000
16 1,535 1,919 1,062±0,055 0,843 0,759 0,832±0,028 0,800 0,792 0,792±0,000
20 2,163 1,727 1,429±0,089 0,864 0,691 0,844±0,028 0,799 0,792 0,797±0,004
23 2,386 1,573 1,362±0,116 0,820 0,743 0,834±0,002 0,800 0,799 0,797±0,005
27 2,235 1,573 1,404±0,112 0,833 0,743 0,779±0,069 0,799 0,799 0,794±0,004
Gomosidad (N) Masticabilidad (N)
Días/Muestras
GEA GP GECprom GEA GP GECprom
1 1,232 1,243 0,645±0,048 0,955 0,984 0,514±0,041
2 1,566 1,482 0,607±0,112 1,240 1,184 0,483±0,091
3 1,259 1,196 0,630±0,089 0,998 0,947 0,500±0,069
6 1,830 1,173 0,757±0,181 1,285 0,937 0,603±0,084
9 1,112 1,283 0,849±0,048 0,888 1,037 0,678±0,038
13 1,425 1,386 0,777±0,050 1,129 1,098 0,615±0,014
16 1,294 1,458 0,884±0,072 1,035 1,155 0,700±0,057
20 1,869 1,193 1,206±0,105 1,493 0,945 0,961±0,087
23 1,958 1,169 1,136±0,094 1,566 0,934 0,905±0,069
27 1,863 1,169 1,094±0,094 1,489 0,934 0,869±0,071
Gelatinas preparadas a partir de gelatina natural neutra con esferas alginato 2% p/p (sin extracto de cacao), GEA; Gelatina natural neutra aromatizada, coloreada y
endulzada con la incoporación de cápsulas bioacticas (esferas alginato 2%/cacao 3% p/p) tipo postre, GP; Gelatina natural neutra con la incorporación de
cápsulas bioactivas (esferas alginato 2%/cacao 3% p/p), GEC (valor medio±desviación estándar). Esferas preparadas por extrusión y gelificación interna con alta
concentración de calcio, 1·10-3 moles Ca+2/g alginato. Almacenamiento durante 27 días bajo refrigeración a 5±0,5 ºC.

En lo que respecta a los valores de dureza, se puede observar que las

gelatinas que contienen las esferas de alginato 2% p/p (GEA) muestran valores
superiores, salvo para algunas excepciones, respecto a los valores de dureza
obtenidos para las gelatinas tipo postre (GP) y, para todos los casos respecto a las
GEC. En la Figura 4.44, se observan resultados similares en la fuerza o límite de

226
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

cedencia estas gelatinas con el tiempo. Las GEA presentaron un límite de cedencia
o fuerza superior respecto a las GP y GEC, es decir, se mostraron más firmes las
gelatinas con esferas de alginato 2% p/p (sin extracto de cacao) que las gelatinas
con la incorporación de las cápsulas bioactivas. Este aspecto podría ser atribuido a
la formación de puentes entre los iones calcio y los compuestos polifenólicos
presentes en el extracto de cacao que ha sido encapsulado en las esferas
alginato/cacao o cápsulas bioactivas y, que por tanto, como ya se ha comentado,
impiden la formación de mayores puntos de gelificación entre el alginato y los iones
calcio disponibles (Yamada et al., 2007). En este sentido, las posibles diferencias de
dureza proporcionadas por las cápsulas bioactivas y las esferas de alginato sin el
principio activo preparadas ambas por gelificación interna con la misma
concentración de calcio a través del método de extrusión, parecen contribuir de
forma distinta en la dureza final de las gelatinas preparadas con éstas.

Figura 4.44 Ensayo de Resistencia de las gelatinas con la incorporación de esferas alginato y
cápsulas bioactivas. Gelatinas preparadas a partir de gelatina natural neutra: gelatina natural
endulzada, coloreada, aromatizada y con la adición de cápsulas bioactivas o esferas alginato
2%/cacao 3% p/p tipo postre, ● GP; Gelatina natural neutra con la incorporación de esferas alginato
2% p/p, ♦ GEA; Gelatinas natural con la incorporación de cápsulas bioactivas o esferas alginato
2%/cacao 3% p/p, - GEC (valor medio±desviación estándar). Almacenamiento durante 27 días bajo
refrigeración a 5 ± 0,5 ºC. Esferas de alginato 2% y esferas alginato 2%/cacao 3% p/p preparadas por
extrusión y gelificación interna.

En la Figura 4.44 se puede observar que respecto a la fuerza o límite de

cedencia de las gelatinas GP y GEC se comportaron de forma similar hasta el día 13
de su almacenamiento, desde este punto, se mostraron variaciones en los valores

227
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

de fuerza para las GEC y, por el contrario, los valores de fuerza para las muestras
de GP permanecieron prácticamente constantes en el tiempo. En referencia a las
variaciones observadas en los valores de fuerza o límite de cedencia de las
muestras de GEC y, considerando que éstas se analizaron por triplicado, al aplicar
un ANOVA se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa (p ˂ 0,05) entre
los valores de fuerza o límite de cedencia del día 6 y los valores dados a partir del
día 13 de almacenamiento. Cabe resaltar que la fuerza o límite de cedencia de un
producto se relaciona con la consistencia o firmeza de éste y, por tanto, con el
término dureza, en cuyo caso estos valores se muestran diferentes entre las
gelatinas (GP y GEC), siendo en general superiores los observados para las
gelatinas GP, y que son también observados en sus valores de gomosidad. Este
efecto, como se ha dicho, es esperable, dada la importante contribución de la dureza
en los valores de gomosidad, sin embargo, el atributo cohesividad puede también
contribuir en su valor final. En este sentido, se muestra en la Tabla 4.15 que los
valores de cohesividad de las GP son menores respecto a los obtenidos en las GEC.
Las posibles diferencias entre los valores de cohesividad de las GP y GEC, se
pueden explicar debido a la presencia de ingredientes adicionales tales como la
fructosa, colorante y aroma añadidos a la gelatina natural neutra para la preparación
de la gelatina tipo postre (GP) y que, por tanto, han proporcionado una estructura
interna diferente en el producto final. Por otra parte, durante el corte de las muestras
(GP y GEC) y, a partir del día 13 de almacenamiento, se pudo apreciar visualmente
la presencia de líquido en las GEC mientras que para la GP éste no se percibió,
dicho efecto probablemente causó las fluctuaciones observadas desde este período.
Esto podría explicarse debido al proceso de sinéresis que se produce en las esferas
de alginato/cacao (Chan y Dobashi, 2003; Chan et al, 2011). Para las gelatinas tipo
postre (GP) con un contenido de fructosa, este efecto probablemente ocurrió pero no
fue percibido debido a la capacidad de los azúcares para formar enlaces de
hidrógeno con el agua, lo que por tanto produjo su retención (Cassini et al., 2013) y
se evidenció con valores de fuerza de ruptura prácticamente constantes hasta el
último día de almacenamiento.
Los valores de elasticidad se mostraron muy similares para todas las
gelatinas preparadas con la incorporación de esferas y cápsulas bioactivas, lo que
permite inferir que la presencia de las diferentes esferas en el producto proporciona
una textura muy parecida de tipo gomoso debido a sus valores cercanos a la unidad,

228
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

la cual parece ser controlada principalmente por la contribución de la gelatina neutra

utilizada para la preparación de las diferentes muestras (Tabla 4.15), ya que estos
valores de elasticidad se presentaron muy similares a los obtenidos con la GN.
Los resultados de gomosidad y masticabilidad de las muestran permiten inferir
que dados los valores superiores de éstos en las GP respecto a las GEC, se
requiere una mayor energía para su desintegración en boca, diferencia que es
atribuida a la formulación de la gelatina tipo postre que permite mantener una
consistencia del producto en el tiempo de almacenamiento estudiado, gracias a la
presencia de la fructosa que facilita la retención del agua liberada por las cápsulas
bioactivas debido al proceso natural de sinéresis. Esta diferencia de consistencia y
aspecto entre las muestras de GEC y GP puede observarse en la Figura 4.45.

Figura 4.45 Gelatinas preparadas con cápsulas bioactivas para el análisis de TPA y ER. Gelatinas
preparadas a partir de gelatina natural neutra con la incorporación de cápsulas bioactivas o esferas
de alginato 2%/cacao 3% p/p, GEC (a); Gelatina natural neutra endulzada, coloreada, aromatizada y
con la adición de cápsulas bioactivas tipo postre, GP (b). Fotos de las muestras a los 13 días de
almacenamiento bajo refrigeración a 5±0,5 ºC.

4.5.3 Evolución de la concentración de principio activo en las gelatinas con el

tiempo.

En la Figura 4.46 se muestra el contenido de polifenoles totales expresado en

equivalentes de ácido gálico (EAG) y su variación con el tiempo en muestras de
gelatina natural neutra con la adición directa del extracto de cacao (sin encapsular o
libre, GCL) y otras muestras preparadas con gelatina natural neutra y la
incorporación de las cápsulas bioactivas o esferas de alginato 2%/cacao 3% p/p
(GEC) obtenidas por gelificación interna con una alta concentración de calcio (1·10-3

229
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

moles Ca+2/g alginato) por extrusión. Se puede observar que la concentración de los
polifenoles totales en la GCL disminuye continuamente durante los 27 días de
almacenamiento establecidos en el estudio con un decremento total aproximado del
46% respecto a la concentración inicial (Día 1) una vez trascurrido el periodo de
estudio, lo que se atribuye a una degradación de los compuestos fenólicos causada
por la humedad, el oxígeno y la luz (Fang y Bhandari, 2010). Cabe destacar que el
efecto causado por la luz ocurriría en menor proporción al considerar que las
muestras se encontraban debidamente protegidas.

Figura 4.46 Evolución de los polifenoles en las gelatina con el tiempo. Línea continua gelatina natural
neutra con extracto de cacao añadido directamente (sin encapsular o libre), GCL; Línea segmentada
gelatina natural neutra con la incorporación de las cápsulas bioactivas o esferas alginato 2%/cacao
-3 +2
3% p/p, GEC. Esferas preparadas por GI con 1·10 moles Ca /g alginato. Polifenoles totales
expresados en equivalentes de ácido gálico, EAG (ppm). Almacenadas bajo refrigeración a 5±0,5 ºC
durante 27 días.

Por otra parte, al analizar el contenido de polifenoles totales difundidos en las

muestras de gelatina con esferas alginato/cacao (GEC), es decir, desde las cápsulas
a la gelatina natural neutra tomando únicamente para el análisis la gelatina fundida
(sin esferas), se pudo observar que sólo una pequeña cantidad del compuesto activo
fue liberado desde las mismas, ya que los valores de concentración presentaron
únicamente una variación del 3% (Día 1) al 7% (último día) en el periodo de
almacenamiento, los cuales se expresan en EAG y calcularon respecto a la
concentración inicial utilizada para la preparación de los encapsulados o esferas
alginato 2%/cacao 3% p/p incorporadas a las gelatinas (Figura 4.46). Este resultado

230
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

permite inferir que una gran cantidad de los polifenoles (alrededor del 93%) se
mantuvieron dentro de las esferas, y por tanto, podría decirse que el principio activo
encapsulado se encontró protegido de las agresiones ambientales, por lo menos,
durante los 27 días de almacenamiento bajo refrigeración establecidos en el estudio.

4.5.4 Influencia del principio activo en la presencia de microorganismos en las

gelatinas.

Se realizó una prueba sencilla microbiológica a muestras de GN, GCL y GEC

con la finalidad de detectar la posible presencia de microorganismos una vez
trascurridos los 27 días de almacenamiento. En este sentido, se prepararon varias
placas tipo Petri para realizar el ensayo por siembra directa en un medio para el
crecimiento de una amplia gama de organismos con agar/soja/triptona. Para el
aislamiento de hongos y levaduras se preparó un medio de pH ácido con
agar/dextrosa/Sabouraud y solución de antibiótico (cloranfenicol) en el agar
esterilizado, cada muestra se inoculó utilizando un bastoncillo de algodón sobre la
superficie de cada medio haciendo movimientos en zig-zag. Todas las muestras se
incubaron a 37 °C durante 72 horas. El crecimiento o no de microorganismo se
confirmó por observación directa de las diferentes muestras de gelatinas inoculadas
(GN, GCL y GEC) tras el periodo de incubación (Figura 4.47).

Figura 4.47 Crecimiento de microorganismos en las diferentes gelatinas tras 27 días de

almacenamiento. Medio de cultivo con bactericida, a; Medio de cultivo sin bactericida, b. Bactericida:
solución de antibiótico con cloranfenicol. Inoculación de las gelatinas a 37 ºC por 72 horas. Gelatinas
almacenadas durante 27 días bajo refrigeración a 5±0,5 ºC. Gelatinas preparadas con gelatina natural
neutra y la adición directa de extracto de cacao (sin encapsular o libre), GCL; Gelatina natural neutra
con la incorporación de esferas alginato 2%/cacao 3% p/p, GEC; Gelatina natural neutra, GN.

231
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El ensayo permitió confirmar la presencia de microorganismos en las

muestras de GN y GEC. Para el caso de la gelatina natural neutra (GN), fue un
resultado esperable considerando que se había visualizado la presencia de puntos
blancos en su interior, así como la pérdida de consistencia y zonas ahuecadas (Foto:
Figura 4.43). Por el contrario, no se observó crecimiento de hongos ni levaduras en
la gelatina con extracto de cacao libre, GCL (Figura 4.47a). Este efecto se puede
atribuir a la alta concentración de polifenoles añadidos directamente a la gelatina, los
cuales parecen actuar como un agente antimicótico, propiedad de los extractos
naturales ricos en polifenoles que ha sido estudiada por diferentes autores
(Benavente-García et al., 1997; Daglia, 2012).
Por otro lado, la presencia de microorganismos en las muestras de gelatinas
con las cápsulas bioactivas o esferas de alginato 2%/cacao 3% p/p (GEC) pudo
indicar que los polifenoles difundidos desde las esferas (aproximadamente del 7%)
no fueron suficientes para causar el mismo efecto de protección ante el crecimiento
de hongos y levaduras observado en la GCL. En ese sentido, cabe resaltar que el
objetivo planteado en este trabajo hizo referencia a la aplicación de los
encapsulados para la elaboración de un alimento de tipo funcional, el cual fue
alcanzado satisfactoriamente al confirmar que una cantidad importante del
compuesto activo (93% de polifenoles) se encontró retenido por las esferas de
alginato/cacao o cápsulas bioactivas tras 27 días de almacenamiento. A este postre
con los polifenoles encapsulados habría que añadirle algún tipo de conservante. Con
el fin de evaluar alguna otra aplicación, se podría plantear la utilización del extracto
de cacao rico en polifenoles como un agente conservante o que forme parte de una
formulación con otros componentes conservantes para evaluar su acción
antimicrobiana, por tanto, sería necesario realizar mayores estudios que permitan
determinar su efecto y la concentración requerida de extracto de cacao libre para
lograr una acción protectora ante el crecimiento de microorganismos durante el
almacenamiento de un producto alimentario.

232
HOJA DE PRESENTACIÓN CONCLUSIONES

5. CONCLUSIONES

233
HOJA DE PRESENTACIÓN CONCLUSIONES

234
 CONCLUSIONES

En este trabajo de investigación se ha estudiado la gelificación de alginatos

para encapsulación, llevando a cabo la caracterización del alginato, la preparación
de las esferas con el principio activo encapsulado y su aplicación en alimentos
funcionales. Las principales conclusiones del trabajo, clasificadas según el estudio
específico al que corresponden, se presentan a continuación:

Caracterización del alginato sódico como material de partida para la

preparación de los geles de alginato de calcio.

1. El ratio M/G de sus monómeros constituyentes indica una distribución de bloques

heterogénea que sugiere una contribución equilibrada de cada uno éstos, lo que por
tanto proporciona mayor flexibilidad al gel formado. Presenta un alto peso molecular
promedio y un gran índice de polidispersidad, características que le confieren un
mayor poder espesante, susceptibilidad a una degradación polimérica por cambios
bruscos de pH y mayor grado de sinéresis. La presencia de sacarosa en la muestra
es considerada una impureza inerte.

Caracterización reológica de los geles de alginato obtenidos con diferentes

sales de calcio y mecanismos de gelificación.

1. En general, las características de los geles indican que un aumento de la [Ca +2]
incrementa el módulo de almacenamiento producto de la formación de un gel más
reticulado. Los geles obtenidos se muestran más o menos compactos según el tipo
de gelificación:
a) Los geles preparados por GE muestran un incremento de las propiedades
viscoelásticas al aumentar la [Ca+2]. Este mecanismo de gelificación produce
la formación de una capa de gel más reticulado en la interfase
(alginato/solución CaCl2) que ralentiza la difusión de los iones calcio al interior
del polímero. Por tanto, estos geles son poco homogéneos, al disminuir su
grado de reticulación a medida que nos adentramos en el gel.
b) Los geles preparados por GI con diferentes fuentes de calcio y para el
intervalo inferior de [Ca+2], indican que los más fuertes pero más
heterogéneos se forman a partir de Ca(OH)2 como consecuencia de su mayor
producto de solubilidad que, por tanto, provoca una reacción instantánea de
gelificación inicial y, por ello, una estructura de gel más irregular. Los geles

235
 CONCLUSIONES

con menores propiedades viscoelásticas se obtienen al utilizar CaCO3,

aspecto atribuido a la presencia de poros en su estructura formados por la
liberación de CO2 durante la gelificación. Finalmente, los geles de
características viscoelásticas intermedias con una estructura más homogénea
y mejor reproducibilidad son los formados con citrato cálcico. Para la [Ca +2]
mayor utilizada en el estudio, las propiedades reológicas se presentan
independientes de la fuente de calcio utilizada.
c) Las diferencias viscoelásticas se atribuyen principalmente a la estructura
del gel formado según el tipo de gelificación, siendo los geles por GI más
homogéneos en su conjunto pero de red más abierta y, los geles formados
por GE con una parte externa más reticulada y, por tanto, más rígida y una
parte interna mucho menos reticulada debido a un déficit de calcio en el
interior del gel al verse ralentizada su difusión a través de la capa externa del
gel.
2. La influencia del pH en las propiedades reológicas de los geles preparados a
partir de un valor de calcio superior al mínimo requerido que garantice una buena
gelificación, indica que se obtiene un gel adecuadamente formado en un intervalo de
pH de 4 a 10 debido a que sus propiedades viscoelásticas y aspecto visual
homogéneo se presentan similares en todo el intervalo.

Estudio del método de preparación de las microesferas de alginato en

emulsión por gelificación interna.

1. La naturaleza de la sal de calcio utilizada en la preparación de las microesferas

afecta significativamente la distribución de tamaño de éstas al apreciarse tamaños
medios sensiblemente menores en las obtenidas a partir de citrato cálcico en el
rango de concentración estudiado, éstos tamaños son considerados más adecuados
para ser añadidos en alimentos sin cambiar sus propiedades sensoriales.
2. La presencia de poros en la superficie de las microesferas preparadas con CaCO3
atribuida al CO2 liberado en el proceso de gelificación podría ocasionar una
liberación prematura del compuesto activo encapsulado si se utiliza esta sal.
3. Las emulsiones preparadas a partir de Spans muestran muy poca estabilidad, con
un alto grado de coalescencia, que no mejora al aumentar la concentración de
tensioactivo. Por el contrario, las emulsiones formadas con PGPR se presentan muy

236
 CONCLUSIONES

estables para todas las concentraciones de tensioactivo utilizadas y con un grado de

coalescencia considerablemente menor.
4. La distribución de tamaños de las microesferas obtenidas a partir de las
emulsiones preparadas con los diferentes tensioactivos y citrato cálcico indica que
las microesferas de menor tamaño se producen con PGPR, seguidas en orden
creciente con S85, S80 y S80-T80. Esto se atribuye a que el PGPR provee las
emulsiones más estables y, por tanto, las microesferas de menor tamaño y menos
polidispersas.
5. La correlación entre la distribución del tamaño de gota de las emulsiones y las
microesferas muestra una contracción ≈80%, producto del fenómeno de sinéresis o
expulsión del agua durante la gelificación.

Estudio de las variables de composición y preparación para la obtención de las

microesferas en emulsión por gelificación interna con el principio activo a
encapsular.

1. Para las variables de composición, un aumento de la cantidad de fase dispersa

produce un efecto significativo sobre la cantidad del principio activo encapsulado al
apreciarse un incremento en el porcentaje retenido de polifenoles en las
microesferas.
2. Para las variables de preparación, se observa una influencia significativa de la
velocidad de agitación sobre el diámetro medio y la polidispersidad de las
microesferas con extracto de cacao, donde su aumento induce a la formación de
microesferas más pequeñas y menos polidispersas debido al rompimiento de la fase
dispersa en la oleosa en gotas más pequeñas y, por tanto, de sus microesferas.
3. La poca reproducibilidad en el diseño completo se atribuye a que en la fase
dispersa el ligero aporte de acidez por parte del extracto de cacao provoca una
pregelificación del alginato no controlada antes de la emulsificación.
4. Al utilizar una fase dispersa a pH controlado en el diseño fraccionado se obtiene
reproducibilidad de los resultados. En este caso se tiene como único efecto
significativo que un incremento de la cantidad de fase dispersa produce un aumento
del porcentaje de polifenoles retenidos por las microesferas.
5. Las variables propuestas para el diseño con Catequina, uno de los principales
constituyentes del extracto de cacao, no afectan significativamente a las

237
 CONCLUSIONES

propiedades de las microesferas en el rango de trabajo estudiado. Por otro lado, su

porcentaje medio de retención permite inferir que una cantidad importante de ésta se
encuentra entre los polifenoles encapsulados en las microesferas con extracto de
cacao.
6. La liberación de los polifenoles desde las microesferas se ajusta adecuadamente
al modelo de Peppas-Sahlin.

Estudio de las esferas de alginato con principio activo preparadas por

extrusión con diferentes mecanismos de gelificación.

1. El aumento de la [Ca+2] produce una disminución en el diámetro de las esferas,

efecto reportado por otros autores y atribuido a la formación de un gel más reticulado
y compacto que produce más sinéresis.
2. La estructura interna se ve influenciada por el tipo de gelificación, siendo las
esferas obtenidas por GE de matriz heterogénea con un núcleo poco reticulado y
una capa externa tipo cáscara, mucho más compacta. Por el contrario, las esferas
formadas por GI se presentan más homogéneas debido a que el calcio ya está
presente en toda la esfera y no ha de migrar de afuera hacia dentro.
3. Las propiedades texturales de las esferas obtenidas para las diferentes
formulaciones indican que:
a) La dureza de las esferas formadas por GE es superior a la de las obtenidas
por GI, debido a la existencia de una capa mucho más rígida en la superficie
de las esferas cuando se utiliza la GE.
b) La cohesividad es superior en las preparadas por GI debido a su estructura
interna más compacta y homogénea.
c) La cantidad de extracto y el tipo de gelificación afectan al índice de
elasticidad de las esferas cuando se utiliza una misma [Ca +2], siendo más
elásticas las esferas formadas por GI respecto a las obtenidas por GE.
d) Se presentan menos gomosas las esferas por GI, por tanto, éstas
requerirán menor energía para su ruptura en boca.
4. La liberación de los polifenoles desde las esferas muestra un buen ajuste al
modelo de Peppas-Sahlin, mostrando una cinética dominada por la difusión del
compuesto activo a través de los poros de una matriz hinchada producto del
mecanismo disolución/relajación.

238
 CONCLUSIONES

5. Un aumento de la [Ca+2] induce un retraso en la liberación de los polifenoles

desde las diferentes esferas debido a que el gel está más reticulado, siendo más
notable en las obtenidas por GI.

Estudio de un producto alimentario de aplicación funcional con la

incorporación de los encapsulados (gelatina con aroma a frambuesa y esferas
en su interior).

1. El análisis sensorial muestra que el sabor del extracto de cacao es

satisfactoriamente enmascarado a través de su encapsulación al no ser percibido
por la mayoría de los panelistas.
2. El análisis del perfil de textura y el ensayo de resistencia de las diferentes
gelatinas estudiadas y su evolución con el tiempo de almacenamiento indican que:
a) La utilización del extracto de cacao como añadido directo en gelatinas no
es adecuada ya que la gelatina no se forma apropiadamente y además se
degradan rápidamente los polifenoles debido a factores adversos del entorno.
b) La incorporación de esferas alginato/cacao en gelatinas se presentan
menos firmes respecto a las gelatinas con esferas de alginato sin aditivo, lo
que se atribuye a la formación de puentes entre iones calcio y polifenoles que
disminuyen la disponibilidad de estos para la formación de mayores puntos de
gelificación alginato/calcio y, por tanto, esferas menos reticuladas que
contribuyen a una gelatina menos dura.
c) Las diferencias de dureza y cohesividad entre la gelatina tipo postre y la
natural neutra se atribuyen a los ingredientes añadidos, donde la fructosa
contribuye a una mayor consistencia debido a su capacidad para retener el
agua expulsada por parte de las esferas.
d) El bajo contenido fenólico total difundido desde las esferas alginato/cacao a
la gelatina evidencia que una cantidad importante permanece encapsulada.

239
 CONCLUSIONES

240
HOJA PRESENTACIÓN RECOMENDACIONES

6. RECOMENDACIONES

241
HOJA PRESENTACIÓN RECOMENDACIONES

242
 RECOMENDACIONES

Dado los resultados obtenidos del estudio de encapsulación de principios

activos con alginato a través de diferentes mecanismos de gelificación y varias
técnicas para la preparación de los encapsulados como la emulsificación y la
extrusión tradicionalmente utilizada, se cree conveniente hacer las siguientes
recomendaciones para futuras investigaciones:

.- Estudio y optimización de un método de separación que permita mejorar la

cantidad de compuesto activo encapsulado en microesferas de alginato preparadas
en emulsión por gelificación interna.

.- Estudio de la producción masiva de cápsulas bioactivas de alginato por gelificación

interna a través de diferentes dispositivos extrusores.

.- En vista a su aplicación práctica, sería interesante evaluar y comparar la

incorporación de las microesferas alginato/cacao húmedas y liofilizadas en un
producto alimentario a fin de hacerlo funcional.

.- Estudiar el efecto de los polifenoles difundidos desde encapsulados de alginato

con extracto de cacao y su acción conservante en un producto alimentario.

243
 RECOMENDACIONES

244
 HOJA PRESENTACIÓN GLOSARIO

7. BIBLIOGRAFÍA

245
 HOJA PRESENTACIÓN GLOSARIO

246
 BIBLIOGRAFÍA

Anal, A.K. y Singh, H. (2007). Recent advances in microencapsulation of probiotics

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262
 HP GLOSARIO

8. GLOSARIO

263
 HP GLOSARIO

264
 GLOSARIO

Símbolos

𝐴̇ tamaño de poro del hidrogel en las columnas empleadas para CET

Å Angstrom, unidad de longitud de onda

A1 área bajo la curva fuerza-tiempo de un TPA dada por la primera compresión

A2 área bajo la curva fuerza-tiempo de un TPA dada por la segunda compresión

A3 área de fuerza negativa dada al final de la primera compresión en un TPA

b fracción total del compuesto liberado por el efecto estallido [-]

𝐵𝑆𝑖𝑛 back scattering inicial

𝐵𝑆𝑓 back scattering final

𝐶 concentración de sólido en solución libre a un tiempo t [g.dL-1]

𝐶𝑆 concentración de saturación del sólido en el medio de disolución [g.dL -1]

𝐶𝑖 concentración inicial

𝐶𝑓 concentración final

𝐶𝑠𝑜𝑙 concentración en solución de polifenoles totales liberados

𝐶𝑇𝐹𝑙𝑖𝑏 contenido total fenólico liberado

𝐷 número de Deborah [-]

coeficiente de difusión del compuesto activo [cm2.s-1]

𝐷𝑒 diámetro de esfera (μm)

𝐷𝑔 diámetro de gota de la emulsión (μm)

𝐷[4,3] diámetro medio del volumen equivalente (μm)

𝐷10 diámetro medio volumen acumulado para 10% de las partículas

𝐷50 diámetro medio volumen acumulado para 50% de las partículas

265
 GLOSARIO

𝐷90 diámetro medio volumen acumulado para 90% de las partículas

F fuerza normal [N]

FM frecuencia mónada del ácido β-D-manurónico [-]

FG frecuencia mónada del ácido α-L-gulurónico [-]

FGG frecuencia díada sección del homopolímero tipo de bloque-G [-]

FMM frecuencia díada sección del homopolímero tipo de bloque-M [-]

FGM frecuencia díada sección del heteropolímero donde los bloques G y M se

alternan [-]

FMG frecuencia díada sección del heteropolímero donde los bloques M y G se

alternan [-]

FMGM frecuencia tríada sección del heteropolímero donde los bloques M y G se

alternan [-]

FGGM frecuencia tríada sección del heteropolímero donde los bloques M y G se

alternan [-]

𝑓𝑡 fracción del compuesto liberado en el tiempo t en el modelo Gallagher-

Corrigan [-]

𝑓𝑡𝑚𝑎𝑥 fracción máxima de compuesto liberado durante el proceso en el modelo

Gallagher-Corrigan [-]

𝑓𝐵 fracción del compuesto activo liberado durante la primera etapa o “efecto

estallido” en el modelo Gallagher-Corrigan [-]

𝐺 monómeros de ácido α-L-gulurónico o 1-4 enlace ácido α-gulopyranosyluronic

[-]

constante de proporcionalidad o módulo elástico de la Ley de Hooke [Pa]

𝐺𝐺 enlace glucosídico diaxial del monómero ácido α-L-gulurónico

𝑀𝐺 enlace glucosídico ecuatorial-axial de los monómeros M y G

266
 GLOSARIO

𝐺∗ módulo complejo en cizalla [Pa]

𝐺´ módulo de almacenamiento en cizalla [Pa]

𝐺 ´´ módulo de pérdidas en cizalla [Pa]

𝐻 masa molecular de los grupos hidrofílicos de la molécula tensioactiva [Da]

𝐽(𝑡) capacitancia en cizalla [1/Pa]

𝑘 índice de consistencia [-]

número de factores en un diseño factorial [-]

constante cinética que depende de las condiciones experimentales y refleja

las características estructurales y geométricas del sistema
polimérico/compuesto activo [s-1, min-1]

𝑘𝐼 constante de proporcionalidad para el modelo de primer orden [s-1, min-1]

𝑘´ constante cinética al modelo de Higuchi empleada hasta un 60% de liberación

del compuesto activo [s-1, min-1]

𝑘1 constante que representa el proceso de difusión en el modelo Peppas-Sahlin

[s-1, min-1]

constante cinética de primer orden en el modelo Gallagher-Corrigan [s-1, min-1]

𝑘2 constante que refleja la relajación del polímero en el modelo Peppas-

Sahlin [s-1, min-1]

constante cinética de la segunda etapa de liberación en el modelo Gallagher-

Corrigan [s-1, min-1]

𝐾𝑐𝑔 factor de contracción por gelificación

𝐿 masa molecular de los grupos lipofílicos de la molécula tensioactiva [Da]

𝑀 monómeros de ácido β-D-manurónico o 1,4-enlace ácido β-D-

mannopyranosyluronic [-]

𝑀𝑀 enlace glucosídico diecuatorial del monómero ácido β-D-manurónico

267
 GLOSARIO

𝑀𝑡 cantidad de compuesto activo liberado en el tiempo t [mg]

𝑀0 cantidad de compuesto activo inicial en solución [mg]

𝑀∞ cantidad de compuesto activo que se liberaría a tiempo infinito [mg]

𝑀⁄𝐺 relación entre los bloques 𝑀 y 𝐺 en la estructura polimérica del alginato [-]

𝑚 exponente de difusión Fickiano válido para cualquier geometría del sistema

de liberación modelo de Peppas y Sahlin [-]

𝑛 exponente cinético que describe el mecanismo de liberación [-]

𝑛1 , 𝑛2 tamaño de las muestras

𝑁𝐺>1 longitud media de bloques-G mayores de 1 [-]

𝑆𝑝 desviación estándar ponderada

𝑡 tiempo [s, min]

𝑡𝑟𝑒𝑡 tiempo de retraso en el que se percibe una cantidad de compuesto activo

liberado una vez ocurrido el efecto estallido [s, min]

𝑡2𝑚𝑎𝑥 tiempo máximo del ratio de liberación del compuesto activo en el modelo
Gallagher-Corrigan [s, min]

𝑤 fracción en peso [-]

𝑥1, 𝑥2 variables de estudio en un diseño experimental

y deformación [-]

Griegas

∝ primer átomo unido al grupo funcional, enlace O-glucosídico mediante el cual

se unen entre sí dos o más monosacáridos [-]

distancia desde un punto central a un punto del diseño axial o estrella [-]

factor de probabilidad estadístico dado para un nivel de confianza

268
 GLOSARIO

𝛽 segundo átomo unido al grupo funcional, enlace O-glucosídico mediante el

cual se unen entre sí dos o más monosacáridos [-]

𝛿 desfase entre el error y la deformación [rad]

𝜀 porosidad de la matriz

𝜏 factor de tortuosidad del sistema

𝛾 deformación instantánea [-]

𝛾̇ gradiente de velocidad o velocidad de deformación [s-1]

𝛾0 amplitud máxima de deformación en cizalla oscilatoria [-]

𝑛 viscosidad [Pa.s]

índice de comportamiento [-]

𝑛´ viscosidad aparente [Pa.s]

𝜑 fracción de volumen ocupada por la fase dispersa [-]

𝜇 viscosidad dinámica [Pa.s]

𝜎 esfuerzo cortante [Pa]

𝜎0 esfuerzo umbral [Pa]

𝜎̇ velocidad de cambio del esfuerzo cortante [Pa/s]

∅ diámetro de gota en emulsiones

𝜔 frecuencia de oscilación [rad.s-1, Hz]

Acrónimos

ANOVA análisis de varianza

BS back scattering o retrodifusión de la luz dispersada en una muestra

CAD consumo aceptable diaria en peso corporal por día [mg/kg]

CCD diseño central compuesto

269
 GLOSARIO

CET cromatografía de exclusión por tamaño

DE desviación estándar

DRX difracción de rayos X

DSC calorimetría diferencial de barrido

EAG equivalentes de ácido gálico análisis de Folin-Ciocalteau

ER ensayo de resistencia

GCL gelatina con extracto de cacao libre o sin encapsular

GE mecanismo de gelificación externa

GEC gelatinas con esferas de alginato/cacao

GEA gelatinas con esferas de alginato

GI mecanismo de gelificación interna

GN gelatina natural neutra

GPE gelatinas tipo postre enriquecidas con las esferas alginato/cacao

HLB balance hidrofílico-lipofílico de los tensioactivos

HPLC cromatografía líquida de alta resolución

IP índice de polidispersidad respecto a los peso moleculares

IR índice de refracción

LC límite de cedencia

RMN resonancia magnética nuclear o espectroscopía de alta resolución

S80 tensioactivo Span 80

S85 tensioactivo Span 85

SEM microscopía electrónica de barrido

270
 GLOSARIO

SPAN factor de polidispersidad o amplitud de la distribución de tamaño de la

muestra

T20 tensioactivo Tween 20

T80 tensioactivo Tween 80

TPA análisis de perfil de textura para medición de propiedades mecánicas

O/W emulsiones aceite en agua

O/W/O emulsión de aceite en agua en aceite

PGPR polirricinoleato de poliglicerol

UPLC cromatografía líquida de ultra resolución

W/O emulsiones agua en aceite

W/O/W emulsión de agua en aceite en agua

271
 GLOSARIO

272
 HOJA P APÉNDICE

9. APÉNDICES

273
 HOJA P APÉNDICE

274
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

9.1 Datos para la caracterización del alginato sódico por RMN, CET, DSC y
Refractometría.

Figura 9.1 Espectro del alginato sódico (20 mg/ml) sin hidrolizar a partir de la adquisición del espectro
H1 a 80 ºC obtenido por RMN.

275
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Figura 9.2 Espectro del alginato de sodio (20 mg/ml) decovolución de los picos a partir del programa
MestreNova v.8.1.2 para el cálculo de su composición monomérica.

Figura 9.3 Ecuación de ajuste obtenida del calibrado con dextranos para la determinación del peso
molecular del alginato sódico por CET.

276
APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Figura 9.4 Termograma del alginato sódico Lote 1 (Panreac).

Figura 9.5 Termograma del alginato sódico Lote 2 (Panreac).

277
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Figura 9.6 Termograma del alginato sódico (Solé Graell).

Figura 9.7 Recta de calibrado realizada a partir de alginato sódico 2% p/p (Solé Graell) y sacarosa
comercial a diferentes concentraciones. IR: índice de refracción.

278
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

9.2 Propiedades reológicas de los geles de alginato preparados con diferentes

fuentes de calcio y mecanismos de gelificación.

Tabla 9.1 Geles preparados por gelificación externa con diferentes concentraciones de calcio a partir
de soluciones acuosas de CaCl2.

1,2·10-3 moles Ca +2/g alginato 0,6·10-3 moles Ca +2/g alginato

f (Hz) G1' (Pa) G2" (Pa) G1' (Pa) G2" (Pa) G`Prom DS G1' (Pa) G2" (Pa) G1' (Pa) G2" (Pa) G`Prom DS
0,01 4601 670,4 5849 2011 5225,0 624,0 1138 115,8 985,7 92,25 1061,9 76,15
0,014 4580 1345 7167 88,34 5873,5 1293,5 1158 94,03 989,8 77,25 1073,9 84,10
0,022 5107 971,6 7305 619,1 6206,0 1099,0 1175 88,97 995,3 68,72 1085,2 89,85
0,032 5247 687,4 7220 1041 6233,5 986,5 1190 85,78 1003 65,60 1096,5 93,50
0,046 5338 755,2 7348 795,7 6343,0 1005,0 1206 85,10 1010 62,74 1108,0 98,0
0,068 5439 523,0 7757 800,7 6598,0 1159,0 1222 85,25 1018 61,80 1120,0 102,0
0,1 5545 498,9 8025 818,9 6785,0 1240,0 1239 86,05 1027 60,49 1133,0 106,0
0,147 5627 519,1 8299 790,6 6963,0 1336,0 1257 89,69 1036 64,38 1146,5 110,5
0,215 5716 481,3 8533 794,6 7124,5 1408,5 1276 94,42 1047 65,49 1161,5 114,5
0,316 5808 472,1 8740 802,6 7274,0 1466,0 1296 98,01 1058 65,56 1177,0 119,0
0,464 5911 478,6 8970 836,9 7440,5 1529,5 1317 104,7 1070 69,29 1193,5 123,5
0,681 6001 475,1 9174 853,7 7587,5 1586,5 1339 111,2 1084 73,30 1211,5 127,5
1,0 6102 501,5 9378 890,2 7740,0 1638,0 1371 123,1 1099 80,75 1235,0 136,0
1,468 6217 514,1 9586 914,8 7901,5 1684,5 1372 146,3 1115 87,51 1243,5 128,5
2,154 6296 582,5 9801 932,4 8048,5 1752,5 1505 94,54 1135 98,52 1320,0 185,0
3,162 6400 567,2 10020 902,5 8210,0 1810,0 1491 291,0 1160 101,5 1325,5 165,5
4,642 6654 1121 10280 1085 8467,0 1813,0 1342 220,7 1200 117,0 1271,0 71,0
6,813 6477 1050 10090 778,5 8283,5 1806,5 1369 501,7 1254 64,53 1311,5 57,5
10,0 6142 777,0 11330 1503 8736,0 2594,0 1639 1663 1255 262,2 1447,0 192,0

0,4·10-3 moles Ca +2/g alginato 0,1·10-3 moles Ca +2/g alginato

f (Hz) G1' (Pa) G2" (Pa) G1' (Pa) G2" (Pa) G`Prom DS G1' (Pa) G2" (Pa) G1' (Pa) G2" (Pa) G`Prom DS
0,01 61,34 48,42 280,5 89,19 170,9 109,6 21,41 13,09 0,048 0,385 10,73 10,60
0,014 68,54 52,59 330,8 49,44 199,7 131,1 26,17 13,34 0,058 0,478 13,11 13,01
0,022 81,86 56,14 342,9 44,52 212,4 130,5 30,14 13,99 0,088 0,651 15,11 15,03
0,032 97,24 59,57 353,2 42,80 225,2 127,9 33,65 14,82 0,145 0,916 16,89 16,75
0,046 113,1 62,07 362,4 42,85 237,8 124,7 37,25 15,78 0,234 1.292 18,74 18,51
0,068 128,9 64,04 371,3 43,70 250,1 121,2 41,05 16,88 0,378 1.822 20,71 20,34
0,1 144,9 65,43 380,3 44,60 262,6 117,7 45,02 18,13 0,611 2.557 22,82 22,20
0,147 160,6 67,19 389,6 46,78 275,1 114,5 49,18 19,77 0,967 3.555 25,07 24,11
0,215 175,8 69,47 399,5 49,51 287,7 111,9 53,61 21,79 1.497 4.891 27,55 26,06
0,316 191,7 71,86 410,2 52,0 300,9 109,3 58,47 24,28 2.296 6.660 30,38 28,09
0,464 207,3 75,68 421,7 55,86 314,5 107,2 63,76 27,61 3.425 8.968 33,59 30,17
0,681 223,5 80,59 434,3 60,09 328,9 105,4 69,70 31,82 5.031 11,92 37,37 32,33
1,0 239,1 87,02 447,9 66,37 343,5 104,4 75,28 36,20 7.248 15,69 41,26 34,02
1,468 256,4 96,85 462,7 72,54 359,6 103,2 85,57 43,62 10,30 20,33 47,94 37,64
2,154 257,5 115,1 478,6 80,80 368,1 110,6 109,6 12,66 14,43 25,82 62,02 47,59
3,162 326,3 136,6 500,1 88,90 413,2 86,89 444,6 90,47 20,08 32,41 23,23 212,3
4,642 39,75 409,8 517,2 95,78 278,5 238,7 163,6 196,2 25,42 37,55 94,51 69,09
6,813 575,8 2044 550,6 116,6 563,2 12,60 783,7 444,3 28,65 46,53 406,18 377,5
10,0 150,8 1047 524,8 147,3 337,8 187,0 335,4 514,9 54,41 53,92 194,91 140,5
prom: promedio; DS: desviación estándar.

279
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.2 Barrido de frecuencia para la cuantificación de calcio mínimo requerido para la gelificación
de los geles de alginato preparados por gelificación externa.

f (Hz) 0,1 1,0 1,5

+2 -3
moles Ca /g alginato (·10 ) G´ (Pa) G´´ (Pa) G* (Pa) G´ (Pa) G´´ (Pa) G* (Pa) G´ (Pa) G´´ (Pa) G* (Pa)
0,011 0,36 2,25 2,28 5,13 15,7 16,5 6,32 19,6 20,6
0,034 45,0 18,1 48,5 75,3 36,2 83,5 85,6 43,6 96,1
0,056 87,5 29,8 92,4 137,1 55,1 147,8 145,1 63,4 158,3
0,079 145,0 65,4 159,0 239,1 87,0 254,4 256,4 96,9 274,0
0,113 1239 86,1 1242 1371 123,1 1376 1372 146,3 1380
0,146 1027 60,5 1029 1099 80,8 1102 1115 87,5 1118
0,169 1093 80,7 1096 1168 94,4 1172 1198 103,6 1203
0,203 3042 316,2 3059 3349 289,6 3362 3408 296,1 3421
0,225 5545 498,9 5567 6102 501,5 6123 6217 514,1 6239
0,338 8025 818,9 8067 9378 890,2 9420 9586 914,8 9630
0,451 22670 3244 22900 27480 3355 27680 28290 3357 28480

f (Hz) 2,0 5,0

+2 -3
moles Ca /g alginato (·10 ) G´ (Pa) G´´ (Pa) G* (Pa) G´ (Pa) G´´ (Pa) G* (Pa)
0,011 12,3 27,3 29,9 43,1 43,1 60,9
0,034 109,6 12,7 110,3 163,6 196,2 255,5
0,056 177,0 82,4 195,3 327,5 5,35 327,5
0,079 257,5 115,1 282,1 39,8 409,8 411,7
0,113 1505 94,5 1508 1342 220,7 1360
0,146 1135 98,5 1139 1200 117,0 1206
0,169 1197 98,6 1201 1241 80,72 1244
0,203 3464 317,6 3478 3819 405,4 3840
0,225 6296 582,5 6323 6654 1121 6748
0,338 9801 932,4 9845 10280 1085 10330
0,451 28970 3725 29210 30590 3762 30820

280
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.3 Propiedades reológicas de los geles de alginato a diferentes pH.

pH 0,5 3 4 5 6 8 11 13
f (Hz) G* (Pa) G* (Pa) G* (Pa) G* (Pa) G* (Pa) G* (Pa) G* (Pa) G* (Pa)
0,01 5668 3181 3591 3166 1947 2254 1087 638,6
0,014 6118 3356 3612 1909 2129 2272 1075 647,4
0,022 6304 3468 3628 2665 2177 2293 1077 653,1
0,032 6401 3536 3613 2167 2222 2324 1092 659,4
0,046 6546 3623 3644 2970 2260 2338 1107 667,3
0,068 6671 3696 3673 3024 2297 2378 1123 676,1
0,10 6777 3771 3710 3115 2329 2406 1136 685,8
0,147 6883 3842 3750 3212 2366 2434 1149 697,1
0,215 6986 3928 3790 3237 2401 2464 1165 710,1
0,316 7082 4009 3833 3269 2436 2504 1180 725,2
0,464 7170 4087 3876 3302 2472 2536 1195 742,1
0,681 7263 4169 3923 3352 2511 2568 1218 760,5
1,0 7356 4252 3961 3398 2538 2611 1216 777,8
1,468 7467 4340 3988 3389 2565 2616 1300 819,8
2,154 7587 4462 3888 3465 2719 2790 1168 837,2
3,162 7555 4573 4072 3607 2556 2724 1412 801,6
4,642 8072 4538 4049 3372 3108 3466 1242 919,1
6,813 7538 4560 3637 3263 2601 2636 2103 5027
10,0 7001 4598 4831 3694 4511 4739 2158 2387

281
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.4 Geles preparados por gelificación interna con diferentes concentraciones de Ca(OH)2.

1,2·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,6·10-3 moles Ca+2/g alginato

f (Hz) G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE
0,01 2609 496,8 4438 474,1 3523,5 914,5 681,1 47,0 2243 315,8 1462,1 780,9
0,014 2705 475,5 4480 473,7 3592,5 887,5 673,0 40,2 2299 236,4 1486,0 813,0
0,022 2789 423,8 4528 454,8 3658,5 869,5 671,0 37,9 2320 205,3 1495,5 824,5
0,032 2870 412,6 4581 431,3 3725,5 855,5 672,2 37,9 2343 200,3 1507,6 835,4
0,046 2950 402,9 4645 413,2 3797,5 847,5 675,1 37,4 2370 188,8 1522,6 847,5
0,068 3035 395,9 4713 400,6 3874,0 839,0 678,9 38,1 2400 186,4 1539,5 860,6
0,1 3117 388,6 4788 386,1 3952,5 835,5 684,4 37,7 2434 181,3 1559,2 874,8
0,147 3200 390,5 4864 386,4 4032,0 832,0 690,4 39,1 2467 181,4 1578,7 888,3
0,215 3283 392,7 4943 390,6 4113,0 830,0 697,0 41,6 2503 185,6 1600,0 903,0
0,316 3368 391,3 5026 386,8 4197,0 829,0 704,6 43,0 2540 186,1 1622,3 917,7
0,464 3453 398,1 5111 397,2 4282,0 829,0 711,8 46,9 2577 193,6 1644,4 932,6
0,681 3541 402,6 5199 406,9 4370,0 829,0 721,9 51,3 2617 198,6 1669,5 947,6
1,0 3628 421,3 5287 435,5 4457,5 829,5 743,4 58,0 2655 215,4 1699,2 955,8
1,468 3719 432,6 5383 452,2 4551,0 832,0 722,0 66,8 2712 221,6 1717,0 995,0
2,154 3827 442,7 5503 468,8 4665,0 838 740,4 87,5 2747 240,8 1743,7 1003,3
3,162 3944 470,2 5624 483,2 4784,0 840,0 750,0 18,8 2750 323,5 1750,0 1000,0
4,642 4038 406,7 5556 474,2 4797,0 759,0 774,5 168,7 2755 242,4 1764,8 990,3
6,813 4622 983,9 5599 497,0 5110,5 488,5 1718 497,0 2566 199,4 2142,0 424,0
10,0 4051 796,8 5346 456,7 4698,5 647,5 3234 1066 3123 516,3 3178,5 55,50

0,4·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,1·10-3 moles Ca+2/g alginato

f (Hz) G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE
0,01 757,4 140,4 2396 759,2 1576,7 819,3 247,8 34,46 921,1 77,97 584,5 336,7
0,014 772,2 116,5 2712 555,3 1742,1 969,9 270,4 34,09 939,4 54,55 604,9 334,5
0,022 783,3 106,2 2826 479,5 1804,7 1021,4 283,9 32,92 944,5 48,24 614,2 330,3
0,032 795,9 99,78 2920 408,4 1857,9 1062,1 294,0 32,93 949,6 46,38 621,8 327,8
0,046 809,0 95,33 2995 369,4 1902,0 1093,0 302,7 33,47 956,3 46,39 629,5 326,8
0,068 822,8 92,13 3066 348,1 1944,4 1121,6 310,6 34,50 963,3 46,72 636,9 326,4
0,1 837,3 88,75 3134 331,8 1985,7 1148,4 318,3 36,03 971,9 48,71 645,1 326,8
0,147 852,1 87,91 3195 323,2 2023,6 1171,5 325,9 38,17 981,5 51,89 653,7 327,8
0,215 867,3 88,44 3261 314,7 2064,2 1196,9 333,8 41,04 992,1 56,15 662,9 329,2
0,316 883,3 88,06 3323 312,7 2103,2 1219,9 342,3 44,75 1004 61,46 673,2 330,9
0,464 899,8 90,71 3386 314,3 2142,9 1243,1 351,5 49,39 1017 68,0 684,3 332,8
0,681 916,1 93,62 3450 316,2 2183,1 1266,9 361,5 55,06 1032 76,16 696,8 335,3
1,0 938,4 99,56 3518 322,4 2228,2 1289,8 373,0 62,86 1046 86,37 709,5 336,5
1,468 952,2 113,6 3583 333,4 2267,6 1315,4 379,9 73,62 1068 95,63 723,9 344,1
2,154 1009 68,70 3655 351,0 2332,0 1323,0 394,1 78,47 1079 116,5 736,6 342,5
3,162 1090 116,8 3704 370,7 2397,0 1307,0 425,3 113,6 1140 129,6 782,7 357,4
4,642 941,7 197,2 3726 340,3 2333,9 1392,2 559,1 53,47 1089 195,0 824,1 264,9
6,813 1425 139,6 3866 356,7 2645,5 1220,5 388,5 63,10 1413 80,62 900,8 512,3
10,0 1174 3691 4016 567,9 2595,0 1421,0 547,7 108,7 882,4 62,56 715,1 167,4
prom: promedio; DE: desviación estándar.

282
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.5 Geles preparados por gelificación interna con diferentes concentraciones de CaCO 3.

1,2·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,6·10-3 moles Ca+2/g alginato

f (Hz) G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE
0,01 4063 612,6 3747 742,2 3905,0 158,0 517,0 16,52 483,7 23,16 500,4 16,65
0,014 4032 506,5 3760 543,3 3896,0 136,0 513,0 15,55 479,3 20,95 496,2 16,85
0,022 4046 449,3 3775 450,3 3910,5 135,5 511,7 15,56 478,2 20,49 494,9 16,75
0,032 4079 399,4 3811 394,0 3945,0 134,0 511,8 15,99 478,8 20,45 495,3 16,50
0,046 4120 358,2 3855 355,8 3987,5 132,5 513,0 16,80 480,5 20,95 496,8 16,25
0,068 4166 328,2 3901 327,4 4033,5 132,5 514,9 17,96 482,7 21,71 498,8 16,10
0,1 4213 303,9 3951 302,7 4082,0 131,0 517,4 18,70 485,6 22,11 501,5 15,90
0,147 4261 291,7 4004 291,1 4132,5 128,5 520,7 20,86 489,1 23,91 504,9 15,80
0,215 4312 287,3 4057 287,1 4184,5 127,5 524,4 23,63 493,2 26,33 508,8 15,60
0,316 4366 274,4 4114 277,6 4240,0 126,0 529,0 25,73 497,8 28,24 513,4 15,60
0,464 4419 276,0 4171 280,2 4295,0 124,0 535,4 29,65 503,2 31,85 519,3 16,10
0,681 4474 277,2 4227 282,0 4350,5 123,5 538,0 35,23 512,8 36,15 525,4 12,60
1,0 4520 296,1 4296 297,5 4408,0 112,0 538,4 44,55 512,1 46,25 525,3 13,15
1,468 4567 299,4 4335 311,3 4451,0 116,0 587,3 53,68 569,9 42,33 578,6 8,69
2,154 4598 389,5 4439 316,6 4518,5 79,5 555,3 68,41 527,4 072,4 541,4 13,95
3,162 4586 449,0 4374 502,6 4480,0 106,0 544,2 71,05 522,2 73,0 533,2 11,0
4,642 4970 745,4 4736 482,7 4853,0 117,0 598,0 191,4 587,4 245,1 592,7 5,30
6,813 4542 669,0 4512 1151 4527,0 15,0 1406,0 538,6 1211 302,0 1308,5 97,5
10,0 4484 723,7 4341 674,6 4412,5 71,5 2855 1379 3214 1103 3034,5 179,5

0,4·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,1·10-3 moles Ca+2/g alginato

f (Hz) G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE
0,01 135,2 57,47 101,7 38,96 118,5 16,8 85,13 19,48 43,29 11,92 64,21 20,92
0,014 143,6 52,56 101,6 33,77 122,6 21,0 86,67 15,99 45,42 10,09 66,05 20,63
0,022 154,1 48,85 105,0 29,96 129,6 24,5 88,01 13,95 46,98 9,29 67,49 20,52
0,032 163,8 45,89 106,8 27,43 135,3 28,5 89,81 13,42 48,63 9121 69,22 20,59
0,046 172,9 43,58 111,0 25,79 141,9 30,9 91,90 13,51 50,19 9321 71,05 20,86
0,068 181,6 41,59 115,3 24,99 148,5 33,2 94,24 14,33 51,86 10,03 73,05 21,19
0,1 189,9 39,69 119,8 24,86 154,9 35,1 96,87 15,69 53,71 11,13 75,29 21,58
0,147 197,7 38,80 124,3 25,72 161,0 36,7 99,84 17,72 55,74 12,72 77,79 22,05
0,215 205,4 38,82 129,2 27,41 167,3 38,1 103,3 20,45 58,11 14,83 80,71 22,59
0,316 213,2 39,30 134,5 29,67 173,9 39,4 107,3 23,92 60,91 17,53 84,11 23,19
0,464 221,2 41,27 140,4 33,16 180,8 40,4 112,1 28,26 64,33 20,96 88,22 23,89
0,681 229,6 44,26 147,0 37,63 188,3 41,3 117,8 33,54 68,43 25,14 93,12 24,69
1,0 240,8 49,37 154,6 43,51 197,7 43,1 124,7 39,95 73,22 30,03 98,96 25,74
1,468 253,6 57,38 165,8 48,87 209,7 43,9 130,9 49,24 78,29 35,68 104,59 26,31
2,154 243,7 61,55 173,2 72,57 208,5 35,3 143,3 56,71 67,37 38,74 105,34 37,97
3,162 274,1 87,95 266,7 64,40 270,4 3,70 159,2 59,37 66,64 70,61 112,92 46,28
4,642 2977 3694,0 204,8 130,6 1591,0 1386,1 135,2 202,9 73,07 47,29 104,14 31,07
6,813 274,2 1693,0 649,5 1040,0 461,9 187,7 290,0 47,33 44,87 37,31 167,44 122,6
10,0 584,0 404,50 37,42 825,3 310,7 273,3 490,5 207,4 1039 475,3 764,75 274,3
prom: promedio; DE: desviación estándar.

283
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.6 Geles preparados por gelificación interna con diferentes concentraciones de citrato de
calcio.

1,2·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,6·10-3 moles Ca+2/g alginato

f (Hz) G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE
0,01 3698 635,9 3691 457,9 3694,5 3,50 1496 107,9 1576 91,10 1536,0 40,0
0,014 3746 525,6 3701 396,4 3723,5 22,5 1489 93,36 1561 78,39 1525,0 36,0
0,022 3794 456,6 3727 354,3 3760,5 33,5 1489 88,75 1557 72,61 1523,0 34,0
0,032 3838 402,9 3764 318,9 3801,0 37,0 1496 81,51 1558 67,90 1527,0 31,0
0,046 3885 371,1 3806 296,4 3845,5 39,5 1504 79,10 1563 65,02 1533,5 29,5
0,068 3935 345,7 3851 283,0 3893,0 42,0 1515 77,47 1571 63,92 1543,0 28,0
0,1 3986 325,0 3900 269,2 3943,0 43,0 1526 74,33 1580 61,24 1553,0 27,0
0,147 4039 316,8 3950 265,6 3994,5 44,5 1538 75,29 1590 62,0 1564,0 26,0
0,215 4094 312,7 4002 266,9 4048,0 46,0 1552 77,86 1602 64,83 1577,0 25,0
0,316 4152 304,2 4056 260,0 4104,0 48,0 1566 77,73 1614 64,76 1590,0 24,0
0,464 4210 307,2 4111 264,6 4160,5 49,5 1582 81,68 1627 69,35 1604,5 22,5
0,681 4268 309,3 4164 267,7 4216,0 52,0 1595 85,97 1638 74,03 1616,5 21,5
1,0 4337 326,9 4228 281,6 4282,5 54,5 1611 98,29 1646 87,94 1628,5 17,5
1,468 4377 344,1 4266 306,4 4321,5 55,5 1637 108,8 1692 91,40 1664,5 27,5
2,154 4479 363,6 4404 283,1 4441,5 37,5 1657 80,04 1706 52,42 1681,5 24,5
3,162 4406 557,4 4303 552,0 4354,5 51,5 1623 93,01 1647 97,14 1635,0 12,0
4,642 4753 251,1 4583 162,3 4668,0 85,0 1648 114,9 1650 220,0 1649,0 1,0
6,813 4614 1155,0 4593 1420,0 4603,5 10,5 1709 307,1 1733 307,8 1721,0 12,0
10,0 4347 723,4 4259 647,2 4303,0 44,0 3799 440,4 3704 375,7 3751,5 47,5

0,4·10-3 moles Ca+2/g alginato· 0,1·10-3 moles Ca+2/g alginato

f (Hz) G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE G1' (Pa) G1" (Pa) G2' (Pa) G2" (Pa) G' prom DE
0,01 1036 49,69 1125 75,76 1080,5 44,50 388,2 55,84 427,1 58,13 407,65 19,45
0,014 1021 40,15 1100 59,15 1060,5 39,50 354,5 57,52 430,5 37,51 392,50 38,0
0,022 1014 36,17 1089 52,25 1051,5 37,50 364,5 34,12 430,7 34,4 397,60 33,10
0,032 1011 34,05 1085 49,56 1048,0 37,0 365,0 28,65 432,1 30,02 398,55 33,55
0,046 1012 33,24 1085 48,56 1048,5 36,50 367,0 26,88 434,0 29,06 400,50 33,50
0,068 1014 33,42 1088 48,30 1051,0 37,0 370,5 26,29 437,1 29,73 403,80 33,30
0,1 1018 32,54 1093 48,73 1055,5 37,50 374,7 26,91 440,4 30,95 407,55 32,85
0,147 1023 34,38 1099 49,73 1061,0 38,0 379,3 28,42 445,2 32,11 412,25 32,95
0,215 1029 37,16 1106 51,61 1067,5 38,5 384,6 30,80 450,8 34,47 417,70 33,10
0,316 1036 38,35 1115 54,31 1075,5 39,5 390,6 34,07 457,2 37,97 423,90 33,30
0,464 1042 42,86 1125 57,90 1083,5 41,5 397,5 38,20 464,5 42,61 431,0 33,50
0,681 1051 47,13 1135 62,28 1093,0 42,0 405,6 43,25 473,1 48,61 439,35 33,75
1,0 1074 54,09 1141 70,32 1107,5 33,50 410,8 51,21 481,8 55,01 446,30 35,50
1,468 1044 78,97 1172 64,14 1108,0 64,0 416,8 60,94 492,6 60,34 454,70 37,90
2,154 1187 19,05 1161 69,43 1174,0 13,0 434,4 63,69 507,2 83,65 470,80 36,40
3,162 1134 243,1 1225 64,07 1179,5 45,50 457,5 105,0 502,6 115,6 480,05 22,55
4,642 1027 125,1 1136 195,8 1081,5 54,50 580,1 338,0 676,5 191,8 628,30 48,20
6,813 1556 442,1 1554 134,6 1555,0 1,0 364,5 81,26 499,0 70,81 431,75 67,25
10,0 8629 14100 3972 1590 6300,5 2328,5 644,0 2049 1139 243,1 891,50 247,5
prom: promedio; DE: desviación estándar.

284
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.7 Influencia de la concentración de acético en los geles preparados con citrato de calcio a
diferentes concentraciones para 1 Hz de frecuencia a partir de una solución de ácido acético al
-3
4,02·10 M (A).

A 0,16·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,32·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,39·10-3 moles Ca+2/g alginato
f (Hz) G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS
0,01 0,16 0,16 0,16 0,001 0,37 0,32 0,35 0,025 93,5 90,1 91,8 1,71
0,014 0,25 0,25 0,25 0,002 0,54 0,54 0,54 0,004 97,7 95,9 96,8 0,89
0,022 0,37 0,37 0,37 0,002 0,77 0,72 0,75 0,025 101,0 99,9 100,5 0,56
0,032 0,55 0,55 0,55 0,001 1,11 178 14,45 0,339 103,6 102,4 103,0 0,59
0,046 0,82 0,82 0,82 0,003 1,57 1,56 1,56 0,006 106,6 105,4 106,0 0,59
0,068 1,21 1,22 12,13 0,005 2,22 2,68 24,49 0,234 109,9 108,5 109,2 0,70
0,100 1,77 1,79 1,78 0,008 311 3,42 3,26 0,156 113,8 112,2 113,0 0,79
0,147 2,59 2,60 25,95 0,006 432 4,43 43,76 0,059 118,3 116,3 117,3 1,0
0,215 3,75 3,85 3,80 0,053 5,94 5,82 5,88 0,058 123,4 120,9 122,2 1,25
0,316 5,37 5,49 5,43 0,057 8,12 7,71 79,12 0,207 129,4 126,4 127,9 1,50
0,464 7,61 7,49 75,47 0,061 10,98 10,22 10,59 0,381 136,5 132,7 134,6 1,90
0,681 10,61 10,98 10,79 0,185 14,72 13,53 14,13 0,595 144,9 140,1 142,5 2,40
1,0 14,58 15,68 15,13 0,550 19,55 17,85 18,70 0,850 154,5 148,1 151,3 3,20
1,468 19,64 21,65 20,65 1,005 25,65 23,38 2,45 1,135 166,5 158,6 162,6 3,95
2,154 25,91 28,94 27,43 1,515 33,18 30,24 31,71 1,470 180,0 170,2 175,1 4,90
3,162 33,34 38,97 36,16 2,815 42,71 38,82 40,77 1,945 194,9 183,0 188,9 5,95
4,642 41,02 47,68 44,35 3,330 52,64 46,04 49,34 3,300 211,9 198,7 205,3 6,60
6,813 52,16 59,77 55,97 3,805 61,18 53,05 57,12 4,065 234,0 214,3 224,2 9,85
10,0 59,80 76,33 68,07 8,265 81,27 75,92 78,59 2,675 285,6 277,5 281,6 4,05

A 0,43·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,45·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,47·10-3 moles Ca+2/g alginato
f (Hz) G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS
0,01 262,5 322,1 292,3 29,8 241,1 235,1 238,1 3,0 665,9 465,2 565,6 100,4
0,014 286,4 311,5 298,9 12,6 250,0 246,0 248,0 2,0 675,8 500,5 588,2 87,7
0,022 296,5 314,8 305,7 9,15 257,3 255,1 256,2 1,1 666,2 511,0 588,6 77,6
0,032 303,7 317,8 310,8 7,05 262,2 260,8 261,5 0,69 675,7 517,1 596,4 79,3
0,046 309,1 321,6 315,4 6,25 265,1 263,7 264,4 0,70 676,4 524,2 600,3 76,1
0,068 314,7 326,1 320,4 5,70 268,8 267,3 268,1 0,75 681,3 532,3 606,8 74,5
0,100 321,0 331,2 326,1 5,09 273,5 272,0 272,8 0,75 690,5 541,2 615,9 74,7
0,147 327,8 337,1 332,5 4,65 279,1 277,5 278,3 0,80 697,9 551,2 624,6 73,4
0,215 335,6 343,6 339,6 4,0 285,4 283,4 284,4 1,0 707,2 561,9 634,6 72,7
0,316 344,6 350,9 347,8 3,15 292,7 290,5 291,6 1,09 716,8 573,7 645,3 71,6
0,464 354,7 359,4 357,1 2,35 301,1 298,3 299,7 1,40 727,8 586,5 657,2 70,7
0,681 366,0 368,9 367,5 1,45 311,0 307,5 309,3 1,75 740,1 600,4 670,3 69,9
1,0 378,0 379,8 378,9 0,90 322,3 318,0 320,2 2,15 753,7 616,0 684,9 68,9
1,468 397,0 392,3 394,7 2,35 335,5 330,0 332,8 2,75 769,4 632,9 701,2 68,3
2,154 412,9 407,5 410,2 2,69 351,0 343,9 347,5 3,55 788,1 651,4 719,9 68,4
3,162 402,9 421,2 412,1 9,15 368,4 359,6 364,0 4,39 808,8 669,1 738,9 69,9
4,642 464,5 433,9 449,2 15,3 384,9 373,7 379,3 5,59 819,0 695,4 757,2 61,8
6,813 1384 470,5 927,3 456,8 401,7 392,6 397,2 4,55 823,4 702,0 762,7 60,7
10,0 2979 488,3 1733,7 1245,4 447,5 423,3 435,4 12,1 829,8 695,2 762,5 67,3
prom: promedio; DS: desviación estándar.

285
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.8 Influencia de la concentración de acético en los geles preparados con citrato de calcio a
diferentes concentraciones para 1 Hz de frecuencia a partir de una solución de ácido acético al
-5
9,42·10 M (B).

B 0,16·10-3 moles Ca +2/g alginato 0,32·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,39·10-3 moles Ca +2/g alginato
f (Hz) G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS
0,010 0,15 0,15 0,15 0,004 17,2 15,3 16,3 1,0 28,2 18,8 23,5 4,7
0,014 0,22 0,23 0,22 0,005 18,4 16,6 17,5 0,9 29,7 19,8 24,8 4,9
0,022 0,33 0,34 0,34 0,007 19,7 17,7 18,7 0,9 31,2 20,8 26,0 5,2
0,032 0,49 0,51 0,49 0,009 21,1 18,7 19,9 1,2 32,9 22,1 27,5 5,4
0,046 0,73 0,75 0,74 0,011 22,9 20,4 21,6 1,2 34,7 23,5 29,1 5,6
0,068 1,10 1,10 1,10 0,016 24,9 21,8 23,5 1,7 36,9 25,2 31,1 5,8
0,100 1,60 1,60 1,60 0,022 27,5 23,9 25,7 1,9 39,4 27,4 33,4 6,0
0,147 2,30 2,30 2,30 0,029 30,6 26,9 28,7 1,9 42,4 30,1 36,3 6,2
0,215 3,30 3,40 3,37 0,043 34,5 29,8 32,3 2,3 46,1 33,4 39,7 6,4
0,316 4,80 4,90 4,85 0,059 39,2 34,7 36,9 2,2 50,4 37,4 43,9 6,5
0,464 6,80 7,00 6,90 0,085 44,9 39,4 42,1 2,8 55,7 42,4 49,1 6,6
0,681 9,60 9,80 9,70 0,126 51,8 46,8 49,3 2,5 62,1 48,6 55,3 6,7
1,0 13,4 14 13,5 0,180 60,3 53,4 56,8 3,4 69,9 56,0 62,9 6,9
1,468 18,3 18,8 18,6 0,260 70,3 62,4 66,3 4,0 79,1 65,0 72,1 7,0
2,154 24,7 25,4 25,0 0,360 82,2 72,8 77,5 4,7 89,9 75,8 82,9 7,1
3,162 32,3 33,4 32,8 0,565 96,3 76,6 86,5 9,8 102,7 88,4 95,6 7,1
4,642 38,9 40,7 39,8 0,879 113,1 90,2 101,6 11,5 117,9 104,4 111,2 6,8
6,813 50,3 52,8 51,6 1,250 131,0 129,0 130,0 1,0 141,3 122,3 131,8 9,5
10,0 60,9 67,0 64,0 3,030 126,5 97,8 112,2 14,3 119,4 82,8 101,1 18,3

B 0,43·10-3 moles Ca +2/g alginato 0,45·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,47·10-3 moles Ca +2/g alginato
f (Hz) G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS
0,01 68,9 236,4 152,6 83,7 98,3 80,6 89,5 8,9 362,3 461,8 412,1 49,8
0,014 72,4 249,2 160,8 88,4 102,7 82,9 92,8 9,8 367,7 468,6 418,2 50,5
0,022 74,6 252,5 163,6 88,9 106,1 85,2 95,6 10,5 379,4 481,1 430,3 50,8
0,032 76,9 255,9 166,4 89,5 109,6 87,8 98,7 10,9 385,5 483,4 434,5 48,9
0,046 79,6 260,0 169,8 90,2 113,3 90,8 102,1 11,3 389,5 487,2 438,4 48,8
0,068 82,5 264,7 173,6 91,1 117,3 94,2 105,7 11,6 394,4 491,2 442,8 48,4
0,100 85,9 270,2 178,0 92,2 121,8 97,9 109,9 11,9 400,0 496,5 448,3 48,3
0,147 89,8 276,3 183,1 93,2 126,6 102,2 114,4 12,2 406,2 502,7 454,5 48,3
0,215 94,5 283,1 188,8 94,3 132,2 107,2 119,7 12,5 413,5 509,9 461,7 48,2
0,316 100,1 290,8 195,5 95,3 138,5 113,1 125,8 12,7 422,0 517,8 469,9 47,9
0,464 106,8 299,5 203,2 96,4 145,9 120,1 133,0 12,9 431,3 527,3 479,3 48,0
0,681 114,7 309,2 212,5 97,3 154,6 128,3 141,5 13,2 441,9 537,9 489,9 48,0
1,0 124,2 320,3 222,3 98,1 164,7 138,1 151,4 13,3 453,7 549,8 501,8 48,1
1,468 135,3 332,9 234,1 98,8 176,6 149,6 163,1 13,5 467,1 563,2 515,2 48,1
2,154 148,3 347,5 247,9 99,6 190,2 163,0 176,6 13,6 481,5 580,0 530,8 49,3
3,162 163,4 362,8 263,1 99,7 205,2 178,4 191,8 13,4 503,4 600,4 551,9 48,5
4,642 176,9 378,8 277,9 100,1 224,1 193,6 208,8 15,3 515,9 633,5 574,7 58,8
6,813 204,6 383,3 294,0 89,4 242,6 218,7 230,6 12,0 563,2 644,6 603,9 40,7
10,0 221,1 441,1 331,1 110,0 281,7 255,3 268,5 13,2 534,1 609,2 571,7 37,6
prom: promedio; DS: desviación estándar.

286
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.9 Influencia de la concentración de acético en los geles preparados con citrato de calcio a
diferentes concentraciones para 1 Hz de frecuencia a partir de una solución de ácido acético al
-6
6,36·10 M (C).

C 0,16·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,32·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,39·10-3 moles Ca+2/g alginato
f (Hz) G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS
0,01 0,14 0,20 0,17 0,03 6,39 5,76 6,08 0,32 63,8 53,4 58,6 5,22
0,014 0,20 0,31 0,26 0,06 7,27 6,62 6,94 0,33 65,5 55,9 60,7 4,79
0,022 0,30 0,40 0,35 0,05 8,09 7,36 7,72 0,37 67,2 58,2 62,7 4,47
0,032 0,45 0,52 0,48 0,04 9,01 8,14 8,57 0,43 69,1 60,6 64,9 4,21
0,046 0,66 0,71 0,68 0,02 10,0 8,95 9,49 0,53 71,2 63,3 67,2 3,96
0,068 0,97 0,99 0,98 0,01 11,2 9,88 10,6 0,68 73,7 66,3 69,9 3,72
0,100 1,43 1,57 1,49 0,07 12,7 10,9 11,9 0,87 76,7 69,7 73,2 3,49
0,147 2,08 2,17 2,12 0,04 14,6 12,3 13,4 1,14 80,1 73,7 76,9 3,19
0,215 3,02 3,47 3,24 0,22 16,9 13,9 15,4 1,49 84,3 78,5 81,4 2,88
0,316 4,34 4,78 4,56 0,22 19,8 15,9 17,8 1,93 89,2 84,2 86,7 2,45
0,464 6,17 7,02 6,59 0,43 23,3 18,3 20,8 2,51 95,1 91,1 93,1 2,04
0,681 8,66 8,88 8,77 0,11 27,8 21,4 24,6 3,20 102,3 99,3 100,8 1,52
1,0 11,9 12,2 12,1 0,12 33,4 25,2 29,3 4,10 110,7 109,0 109,9 0,90
1,468 16,3 16,8 16,6 0,28 40,2 29,9 35,0 5,10 120,7 120,5 120,6 0,10
2,154 21,6 21,9 21,7 0,14 48,2 35,6 41,9 6,31 132,6 134,1 133,4 0,75
3,162 28,1 29,7 28,9 0,79 58,3 42,9 50,6 7,70 146,8 150,3 148,6 1,75
4,642 34,6 36,4 35,5 0,94 71,0 54,2 62,6 8,41 158,7 165,4 162,1 3,35
6,813 43,7 45,5 44,6 0,89 75,2 58,1 66,6 8,57 186,1 192,9 189,5 3,40
10,0 53,7 58,5 56,1 2,42 72,3 42,8 57,5 14,7 188,0 208,9 198,5 10,5

C 0,43·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,45·10-3 moles Ca+2/g alginato 0,47·10-3 moles Ca+2/g alginato
f (Hz) G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS G1* G2* G*prom DS
0,01 153,8 170,5 162,2 8,30 174,4 236,4 205,4 31,0 441,1 407,1 424,1 17,0
0,014 159,5 173,9 166,7 7,20 180,4 249,2 214,8 34,4 455,1 406,6 430,9 24,3
0,022 162,2 177,5 169,9 7,70 183,0 252,5 217,8 34,8 460,2 411,0 435,6 24,6
0,032 165,1 181,4 173,3 8,20 185,8 255,9 220,9 35,0 465,5 415,1 440,3 25,2
0,046 168,3 185,9 177,1 8,80 188,7 260,0 224,4 35,7 471,0 418,3 444,7 26,3
0,068 172,0 190,8 181,4 9,40 192,1 264,7 228,4 36,3 477,1 422,1 449,6 27,5
0,100 176,1 196,2 186,2 10,1 196,0 270,2 233,1 37,1 484,2 426,7 455,5 28,8
0,147 180,8 202,3 191,6 10,8 200,4 276,3 238,4 37,9 492,2 432,1 462,2 30,1
0,215 186,3 209,0 197,7 11,4 205,5 283,1 244,3 38,8 501,2 438,3 469,8 31,5
0,316 192,6 216,7 204,7 12,1 211,4 290,8 251,1 39,7 511,0 445,3 478,2 32,9
0,464 199,9 225,4 212,7 12,8 218,4 299,5 259,0 40,6 521,9 453,5 487,7 34,2
0,681 208,4 235,9 222,2 13,8 226,6 309,2 267,9 41,3 534,0 462,9 498,5 35,6
1,0 218,4 247,7 233,1 14,7 236,4 320,3 278,4 41,9 547,5 473,6 510,6 36,9
1,468 229,8 261,3 245,6 15,8 247,7 332,9 290,3 42,6 562,7 485,9 524,3 38,4
2,154 243,5 277,1 260,3 16,8 261,0 347,5 304,3 43,3 580,9 499,6 540,3 40,7
3,162 259,0 296,6 277,8 18,8 277,3 362,8 320,1 42,8 600,9 521,0 560,9 39,9
4,642 283,7 316,8 300,3 16,6 298,8 378,8 338,8 40,0 638,3 537,1 587,7 50,6
6,813 285,8 320,3 303,1 17,3 296,0 383,3 339,7 43,7 638,4 570,5 604,5 33,9
10,0 351,2 384,8 368,0 16,8 359,5 441,1 400,3 40,8 610,3 547,7 579,0 31,3
prom: promedio; DS: desviación estándar.

287
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

9.3 Datos para la caracterización de las microesferas de alginato preparadas

en emulsión por gelificación interna.

Tabla 9.10 Diámetros de las microesferas de alginato analizadas por microscopía óptica a partir de
diferentes concentraciones y sales de calcio.

Carbonato 0,05 M / Diámetro (µm) Carbonato 0,15 M / Diámetro (µm) Citrato 0,05 M / Diámetro (µm)
5,6 37,9 60,2 83,2 3,9 35,0 57,5 82,7 3,7 15,7 27,9 44,2
7,1 38,1 60,2 84,0 7,0 35,0 58,8 82,7 5,4 16,3 28,0 44,2
8,4 39,0 60,2 84,1 7,0 35,1 58,9 84,0 5,5 16,3 28,0 44,9
8,9 39,2 60,3 84,1 7,0 35,3 58,9 84,3 6,1 16,4 28,6 44,9
9,4 39,2 61,6 85,4 7,0 35,8 58,9 85,1 6,1 16,9 28,6 44,9
9,9 39,3 61,6 85,4 7,1 36,4 60,2 85,4 6,1 16,9 28,8 45,0
10,0 39,4 61,6 85,4 7,1 36,4 60,2 85,6 6,8 16,9 29,4 45,5
11,2 40,6 61,6 85,4 7,1 36,5 60,3 86,0 6,8 17,0 29,4 46,2
11,2 40,7 61,6 85,5 8,4 36,5 60,4 86,1 6,8 17,0 29,4 46,9
12,0 40,7 61,6 86,8 8,4 37,8 60,5 86,9 7,0 17,0 30,6 47,6
12,6 40,7 61,7 86,8 8,9 37,9 60,6 86,9 7,1 17,7 30,6 47,6
12,6 40,7 61,7 86,9 9,8 37,9 61,6 86,9 7,5 17,7 30,6 47,6
12,7 42,0 61,7 87,1 9,9 38,9 61,6 87,1 7,5 17,7 30,6 47,6
12,9 42,1 63,0 88,2 10,2 39,2 61,6 87,1 7,5 17,8 30,8 47,7
14,0 43,4 63,0 88,2 11,2 39,2 61,6 87,4 8,2 18,2 30,8 49,0
14,1 43,4 63,1 91,0 11,3 39,2 61,6 88,2 8,2 18,2 30,8 50,3
14,1 43,5 63,1 91,0 11,3 39,4 61,7 88,6 8,2 18,2 30,8 50,9
15,0 43,6 63,1 92,5 12,3 40,6 62,0 89,1 8,2 18,4 30,8 51,1
15,0 44,8 64,4 92,6 12,6 40,6 63,0 89,6 8,2 18,4 30,9 52,0
15,4 44,9 64,4 95,2 12,7 42,0 63,0 91,0 8,5 18,4 31,3 52,3
16,8 44,9 64,5 96,6 12,9 42,0 63,0 91,1 8,8 18,4 31,9 52,4
16,8 45,0 65,0 96,6 14,0 42,0 63,0 92,1 8,8 19,0 31,9 52,4
17,0 46,2 65,1 96,6 14,0 42,2 63,1 92,4 8,9 19,0 32,1 53,2
18,2 46,2 65,8 96,7 14,0 42,2 63,1 92,4 8,9 19,0 32,2 53,2
18,3 46,2 65,8 98,0 14,1 43,4 63,1 92,4 8,9 19,6 32,3 53,7
19,6 46,2 65,8 98,0 14,3 43,4 64,5 92,4 9,1 19,7 32,6 54,6
19,7 46,2 65,8 98,0 15,4 43,4 64,5 92,6 9,5 19,7 32,7 54,7
19,8 47,0 65,9 98,1 15,4 43,5 65,5 93,8 9,5 19,7 32,7 55,1
21,1 47,9 66,0 98,2 15,4 43,5 65,8 93,8 9,5 19,7 33,6 56,1
21,2 49,0 67,2 99,4 15,5 43,6 65,8 95,2 9,5 19,7 33,6 56,1
22,4 49,0 67,2 99,8 16,8 44,2 65,9 95,2 9,5 19,8 33,9 56,1
23,8 49,0 67,3 100,0 16,8 44,8 65,9 95,2 9,5 19,8 33,9 57,4
23,8 49,0 67,3 100,8 16,9 44,8 66,8 95,3 9,6 20,4 33,9 57,4
23,8 49,1 67,3 100,9 17,0 44,8 67,2 96,5 9,6 20,4 34,7 57,8
23,8 50,1 67,4 102,2 18,2 44,8 67,3 96,6 9,7 20,4 35,0 58,5
23,9 50,3 68,6 103,6 18,2 44,9 67,3 98,0 10,2 21,0 35,0 60,2
23,9 50,4 68,7 103,6 18,2 45,3 67,3 99,4 10,2 21,0 35,0 60,3
25,2 50,4 68,7 105,0 18,3 46,2 68,6 100,8 10,9 21,0 35,3 61,0
26,2 50,4 68,7 105,2 19,6 46,2 68,6 100,8 10,9 21,1 35,4 62,0
26,6 51,8 68,8 105,3 21,0 46,3 68,6 100,8 10,9 21,8 35,4 62,5
26,6 51,8 69,0 106,1 21,0 46,4 70,0 102,2 10,9 22,4 36,4 62,5
26,6 51,8 70,0 106,4 21,1 47,6 70,0 103,6 11,1 22,4 36,5 63,1
28,0 51,9 70,0 107,9 21,6 47,7 70,1 103,6 11,1 22,4 36,7 64,4
28,0 51,9 70,1 109,2 22,4 49,0 70,1 103,8 11,2 22,4 37,0 64,4
28,0 51,9 70,2 109,2 22,4 49,0 72,8 105,0 11,2 22,4 37,4 65,9
28,0 52,1 71,4 109,2 22,4 49,1 72,8 105,0 11,2 22,5 37,4 65,9
28,1 53,0 71,4 109,2 22,4 49,1 72,8 106,6 11,3 23,1 37,4 65,9
28,1 53,2 71,4 110,6 23,8 50,4 72,9 107,8 11,3 23,8 37,8 66,3
29,4 53,2 71,4 114,8 23,8 50,4 73,5 109,2 11,6 23,9 37,8 67,2
29,4 53,2 71,9 115,1 24,7 50,4 74,2 109,2 11,8 24,0 37,8 67,2
29,4 53,3 72,0 116,2 25,2 50,4 74,3 109,3 11,6 24,5 37,8 67,3
29,4 53,5 72,1 116,2 25,2 50,4 74,3 110,6 11,6 24,5 38,1 67,9
29,4 54,6 73,0 116,6 25,2 50,5 74,3 112,0 12,0 24,5 38,1 68,6
30,8 54,6 74,2 117,6 25,2 51,8 74,3 112,0 12,2 25,0 38,1 68,7
30,8 54,7 75,7 118,0 25,2 51,8 75,4 112,6 12,2 25,2 38,7 70,1
32,2 54,7 75,7 119,0 26,6 51,9 75,6 113,5 12,3 25,2 38,8 70,7
32,2 54,8 75,7 119,1 26,6 51,9 75,7 114,8 12,3 25,2 39,2 71,4
32,3 54,9 75,7 120,4 26,6 52,3 75,7 117,6 12,6 25,2 39,2 74,7
33,1 56,0 75,9 121,8 26,8 53,2 76,8 119,0 12,6 25,2 39,2 77,0
33,6 56,0 77,0 121,8 28,0 53,2 77,0 119,0 12,9 25,8 39,4 78,0
33,6 56,0 77,0 122,0 28,0 53,3 77,1 120,4 12,9 25,9 40,1 81,3
33,7 56,0 77,0 123,2 28,0 54,6 77,1 120,6 12,9 26,5 40,2 84,2
35,0 56,1 77,1 126,1 28,1 54,6 77,1 120,6 13,0 26,5 40,6 84,9
35,0 56,1 78,7 126,1 29,4 54,7 77,9 134,4 13,6 26,5 41,5 85,0
35,0 57,4 78,7 135,8 29,4 54,7 78,0 135,9 13,6 26,6 42,0 89,6
35,0 57,6 79,8 135,8 29,4 56,0 78,4 138,9 13,6 26,6 42,0 89,9
36,4 57,7 79,9 135,9 29,7 56,0 78,4 138,9 13,7 26,6 42,1 91,1
36,4 57,7 79,9 135,9 29,7 56,0 78,6 142,8 13,9 27,2 42,1 93,0
36,4 58,1 81,2 137,3 30,8 56,0 79,8 142,9 14,0 27,2 42,2 96,7
36,5 58,8 81,3 142,8 30,8 56,1 80,0 145,6 14,3 27,2 42,2 99,9
37,0 58,8 81,3 147,1 32,2 56,1 82,6 148,4 14,3 27,2 42,8 103,6
37,8 58,8 81,3 149,9 32,3 56,2 82,6 166,7 14,9 27,2 42,8 103,6
37,8 58,9 82,6 152,6 33,3 57,1 82,6 172,2 15,0 27,2 43,5 120,4
37,8 58,9 82,6 161,2 33,6 57,4 82,7 193,4 15,7 27,9 43,5 124,7
37,8 60,1 82,7 379,4 33,6 57,4 82,7 364,0 15,7 27,9 44,0 141,5

288
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.11 Tabla de la Distribución t-Student con n grados de libertad.

289
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.12 Valores de retrodifusión (BS) de las emulsiones preparadas con varios tensioactivos (S80,
S85, S80T80 y PGPR) a 10% p/p para la preparación de microesferas.

Tensioactivo 10% p/p

Tiempo (min) 𝐵𝑆 , S801 𝐵𝑆 , S802 𝐵𝑆 , S80prom DS 𝐵𝑆, S851 𝐵𝑆 , S852 𝐵𝑆 , S85prom DS
0 28,94 32,22 30,58 1,64 25,72 20,16 22,94 2,78
1 24,02 27,74 25,88 1,86 24,03 18,86 21,45 2,58
2 21,13 23,69 22,41 1,28 23,05 18,01 20,53 2,52
3 20,08 21,38 20,73 0,65 22,28 17,41 19,85 2,44
4 19,67 20,19 19,93 0,26 21,63 16,95 19,29 2,34
5 19,44 19,48 19,46 0,01 21,01 16,55 18,78 2,23
6 19,20 19,0 19,1 0,09 20,47 16,19 18,33 2,14
7 19,05 18,60 18,83 0,23 20,01 15,84 17,94 2,09
8 18,88 18,30 18,59 0,29 19,57 15,54 17,56 2,02
9 18,74 18,09 18,42 0,32 19,13 15,31 17,22 1,91
10 18,60 17,91 18,26 0,35 18,69 15,11 16,90 1,79
11 18,48 17,74 18,11 0,37 18,23 14,94 16,59 1,65
12 18,36 17,62 17,99 0,37 17,80 14,71 16,26 155
13 18,24 17,50 17,87 0,37 17,41 14,51 15,96 1,45
14 18,14 17,39 17,77 0,38 17,02 14,26 15,64 1,38

Tiempo (min) 𝐵𝑆 , (S80-T80)1 𝐵𝑆, (S80-T80)2 𝐵𝑆, (S80-T80)prom DS 𝐵𝑆 , PGPR1 𝐵𝑆, PGPR2 𝐵𝑆, PGPRprom DS
0 28,03 29,08 28,56 0,52 23,39 22,21 22,79 0,84
1 27,56 28,46 28,01 0,45 23,38 22,12 22,75 0,89
2 27,08 28,02 27,55 0,47 23,17 22,15 22,66 0,72
3 26,68 27,64 27,16 0,48 23,36 22,13 22,74 0,86
4 26,34 27,21 26,78 0,44 23,28 22,12 22,69 0,82
5 25,96 26,80 26,38 0,42 23,18 21,99 22,59 0,84
6 25,68 26,47 26,08 0,39 23,20 22,09 22,65 0,79
7 25,39 26,13 25,76 0,37 23,27 22,01 22,64 0,89
8 25,14 25,80 25,47 0,33 23,20 21,98 22,59 0,86
9 24,93 25,54 25,24 0,31 23,13 22,08 22,60 0,74
10 24,71 25,26 24,99 0,28 23,15 21,99 22,57 0,82
11 24,48 24,98 24,73 0,25 23,15 22,09 22,62 0,74
12 24,30 24,73 24,52 0,22 23,12 22,11 22,61 0,72
13 24,03 24,46 24,25 0,22 23,18 21,99 22,58 0,84
14 23,81 24,20 24,01 0,19 23,27 21,98 22,63 0,91
valor medio de Back Scattering; Span 80, S80; Span 85, S85; Span 80-Tween 80, S80-T80; Polirricinoleato de poliglicerol, PGPR.

290
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.13 Valores de retrodifusión (BS) de las emulsiones preparadas con varios tensioactivos (S80,
S85, S80T80 y PGPR) a 5% p/p para la preparación de microesferas.

Tensioactivo 5% p/p
Tiempo (min) 𝐵𝑆 , S801 𝐵𝑆 , S802 𝐵𝑆 , S80prom DS 𝐵𝑆 , S851 𝐵𝑆, S852 𝐵𝑆 , S85prom DS
0 20,35 21,79 21,07 1,02 17,13 16,40 16,77 0,52
1 18,05 18,34 18,19 0,21 15,91 15,09 15,50 0,58
2 17,71 17,19 17,45 0,37 14,93 14,12 14,53 0,57
3 17,06 16,46 16,76 0,42 14,01 13,39 13,70 0,44
4 16,73 16,02 16,38 0,50 13,22 12,72 12,97 0,35
5 16,45 15,67 16,06 0,55 12,65 12,23 12,44 0,29
6 16,26 15,36 15,81 0,64 12,12 11,88 12,0 0,17
7 16,14 15,17 15,66 0,69 11,77 11,56 11,67 0,15
8 15,95 14,95 15,45 0,71 11,53 11,31 11,42 0,16
9 15,77 14,76 15,27 0,71 11,29 11,06 11,18 0,16
10 15,67 14,65 15,16 0,72 11,16 10,89 11,03 0,19
11 15,56 14,52 15,04 0,74 11,04 10,75 10,89 0,21
12 15,51 14,47 14,99 0,74 11,11 10,68 10,89 0,30
13 15,50 14,40 14,95 0,78 10,90 10,59 10,75 0,22
14 15,39 14,34 14,87 0,74 10,79 10,50 10,65 0,21

Tiempo (min) 𝐵𝑆 , (S80-T80)1 𝐵𝑆, (S80-T80)2 𝐵𝑆, (S80-T80)prom DS 𝐵𝑆 , PGPR1 𝐵𝑆, PGPR2 𝐵𝑆, PGPRprom DS
0 19,11 19,21 19,16 0,07 25,85 25,90 25,88 0,04
1 18,11 18,20 18,16 0,06 25,76 25,82 25,79 0,04
2 17,56 17,20 17,38 0,25 25,67 25,69 25,68 0,01
3 17,06 16,54 16,80 0,37 25,59 25,60 25,59 0,01
4 16,55 16,09 16,32 0,33 25,50 25,52 25,51 0,01
5 16,18 15,59 15,89 0,42 25,35 25,42 25,39 0,05
6 15,81 15,18 15,49 0,45 25,31 25,35 25,33 0,03
7 15,50 14,89 15,19 0,43 25,21 25,28 25,25 0,05
8 15,22 14,63 14,93 0,42 25,16 25,16 25,16 0,0
9 14,90 14,40 14,65 0,35 25,07 25,05 25,06 0,01
10 14,63 14,23 14,43 0,28 24,98 24,99 24,99 0,01
11 14,38 13,88 14,13 0,35 24,85 24,84 24,85 0,01
12 14,22 13,51 13,87 0,50 24,76 24,73 24,75 0,02
13 14,04 13,24 13,64 0,57 24,71 24,63 24,67 0,06
14 13,87 13,07 13,47 0,57 24,59 24,34 24,47 0,18
valor medio de Back Scattering; Span 80, S80; Span 85, S85; Span 80-Tween 80, S80-T80; Polirricinoleato de poliglicerol, PGPR.

291
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.14 Valores de retrodifusión (BS) de las emulsiones preparadas con varios tensioactivos (S80,
S85, S80T80 y PGPR) a 2% p/p para la preparación de microesferas.

Tensioactivo 2% p/p
Tiempo (min) 𝐵𝑆 , S801 𝐵𝑆 , S802 𝐵𝑆 , S80prom DS 𝐵𝑆, S851 𝐵𝑆, S852 𝐵𝑆 , S85prom DS
0 26,79 27,81 27,30 0,51 15,98 15,69 15,84 0,21
1 24,97 26,18 25,58 0,61 15,32 15,26 15,29 0,04
2 23,66 24,32 23,99 0,33 14,94 14,90 14,92 0,03
3 22,63 23,29 22,96 0,33 14,52 14,58 14,55 0,04
4 21,69 22,24 21,97 0,27 14,22 14,25 14,24 0,02
5 20,94 21,49 21,22 0,27 13,94 13,93 13,94 0,01
6 20,26 20,74 20,50 0,24 13,69 13,63 13,66 0,0
7 19,62 20,11 19,87 0,24 13,44 13,38 13,41 0,04
8 19,07 19,44 19,26 0,19 13,25 13,13 13,19 0,08
9 18,57 18,82 18,69 0,13 13,04 12,92 12,98 0,08
10 18,14 18,24 18,19 0,05 12,81 12,72 12,77 0,06
11 17,72 17,85 17,79 0,07 12,69 12,56 12,63 0,09
12 17,33 17,46 17,39 0,07 12,51 12,38 12,45 0,09
13 16,93 16,99 16,96 0,03 12,34 12,20 12,27 0,09
14 16,59 16,63 16,61 0,02 12,20 12,07 12,14 0,09

Tiempo (min) 𝐵𝑆 , (S80-T80)1 𝐵𝑆, (S80-T80)2 𝐵𝑆, (S80-T80)prom DS 𝐵𝑆, PGPR1 𝐵𝑆, PGPR2 𝐵𝑆 , PGPRprom DS
0 13,10 13,13 13,12 0,02 25,57 25,53 25,55 0,03
1 12,83 12,46 12,65 0,26 25,45 25,44 25,45 0,01
2 12,67 12,19 12,43 0,34 25,38 25,36 25,37 0,01
3 12,41 12,01 12,21 0,28 25,29 25,3 25,29 0,01
4 12,28 11,80 12,04 0,34 25,18 25,23 25,21 0,04
5 12,13 11,64 11,88 0,35 25,14 25,16 25,15 0,01
6 12,05 11,51 11,78 0,38 25,03 25,05 25,04 0,01
7 11,87 11,39 11,63 0,34 24,94 24,97 24,96 0,02
8 11,75 11,24 11,49 0,36 24,83 24,89 24,86 0,04
9 11,62 11,12 11,37 0,35 24,76 24,78 24,77 0,01
10 11,55 11,03 11,29 0,37 24,65 24,68 24,67 0,02
11 11,48 10,90 11,19 0,41 24,56 24,63 24,59 0,05
12 11,37 10,80 11,09 0,40 24,41 24,53 24,47 0,08
13 11,31 10,69 11,0 0,44 24,35 24,51 24,43 0,11
14 11,22 10,57 10,89 0,46 24,34 24,44 24,39 0,07
valor medio de Back Scattering; Span 80, S80; Span 85, S85; Span 80-Tween 80, S80-T80; Polirricinoleato de poliglicerol, PGPR.

292
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.15 Diámetros de las microesferas preparadas a partir de citrato de calcio y 5% p/p de varios
tensioactivos (S80, S85, S80-T80 y PGPR).

S80 S85 S80-T80

3,66 12,91 22,52 33,86 50,30 4,76 11,55 16,37 21,75 29,90 7,14 26,56 37,90 51,82 75,60
5,44 12,93 23,12 33,98 50,98 4,76 11,55 16,37 21,76 29,91 9,0 26,60 38,03 51,97 75,61
5,48 13,0 23,80 33,98 51,13 4,81 11,55 16,99 21,76 29,91 9,80 26,93 38,44 54,60 75,61
6,12 13,59 23,94 34,66 52,0 4,90 11,55 16,99 21,76 29,93 9,80 28,0 39,20 54,62 77,0
6,12 13,59 24,02 35,0 52,33 5,44 11,55 16,99 21,76 30,58 11,29 28,0 39,22 54,62 77,01
6,12 13,61 24,47 35,0 52,37 5,48 11,55 16,99 21,76 30,59 12,0 28,03 39,22 54,62 77,11
6,83 13,74 24,48 35,03 52,37 5,48 11,57 17,0 21,76 30,61 12,60 28,03 39,42 54,67 77,32
6,83 13,86 24,48 35,25 53,20 5,48 11,57 17,0 21,76 30,70 12,68 28,14 39,42 54,67 78,40
6,83 14,0 25,0 35,35 53,22 6,12 11,63 17,0 21,76 31,26 12,68 28,86 40,09 54,76 78,41
7,0 14,27 25,15 35,35 53,71 6,12 11,73 17,0 21,79 31,29 14,0 29,43 40,60 56,0 78,41
7,10 14,29 25,15 36,43 54,62 6,12 12,23 17,0 21,84 31,94 14,07 29,43 40,60 56,0 78,45
7,48 14,97 25,18 36,51 54,67 6,12 12,23 17,04 22,43 31,97 14,28 29,43 40,82 56,02 79,80
7,48 15,01 25,23 36,70 55,05 6,15 12,23 17,68 22,43 33,33 14,62 29,53 41,77 56,16 79,81
7,51 15,65 25,24 37,0 56,07 6,27 12,23 17,68 22,44 33,99 15,40 29,53 42,0 56,28 81,21
8,16 15,69 25,83 37,38 56,07 6,80 12,25 17,68 22,44 33,99 15,40 29,53 42,0 57,40 81,21
8,16 15,69 25,86 37,40 56,07 6,80 12,25 17,68 22,44 34,01 15,46 29,93 42,0 57,47 81,31
8,16 16,31 26,50 37,40 57,40 6,80 12,25 17,68 22,44 34,04 15,65 30,83 42,02 57,47 81,79
8,16 16,32 26,54 37,80 57,42 6,80 12,25 17,68 22,44 35,34 15,65 30,83 42,02 58,8 81,97
8,18 16,37 26,54 37,80 57,83 6,80 12,91 17,68 22,44 35,57 15,65 30,93 42,02 58,82 82,61
8,52 16,86 26,60 37,83 58,46 6,80 12,91 17,72 22,44 36,02 16,80 30,93 42,09 58,82 82,71
8,83 16,99 26,60 37,83 60,22 7,48 12,91 17,72 23,79 36,04 16,86 30,93 43,40 58,82 83,18
8,83 16,99 26,64 38,06 60,27 7,51 12,91 18,35 23,80 36,70 16,86 32,20 43,42 58,82 84,0
8,86 17,0 27,18 38,06 61,01 7,51 12,91 18,36 24,47 37,38 18,20 32,23 43,42 58,87 85,45
8,86 17,0 27,18 38,11 62,01 8,16 12,93 18,36 24,48 38,74 18,20 32,23 43,49 58,87 86,98
8,94 17,04 27,19 38,74 62,53 8,16 12,93 18,40 24,48 39,42 18,20 32,32 43,60 58,87 87,08
9,06 17,68 27,19 38,79 62,54 8,16 12,93 18,46 24,48 39,42 18,25 33,60 44,80 59,07 88,20
9,51 17,72 27,22 39,20 63,06 8,16 13,59 18,46 24,48 39,42 18,41 33,60 44,82 60,20 88,30
9,51 17,72 27,22 39,22 64,42 8,18 13,59 18,46 24,48 39,44 18,41 33,60 44,82 60,20 89,61
9,51 17,79 27,86 39,22 64,42 8,18 13,61 19,03 24,50 40,40 19,60 33,60 44,89 60,22 89,61
9,51 18,20 27,87 39,42 65,92 8,83 13,61 19,03 24,50 40,78 19,60 33,63 45,0 60,27 89,61
9,51 18,20 27,9 40,12 65,94 8,83 13,61 19,03 25,18 42,14 19,60 33,63 45,0 61,62 91,17
9,54 18,20 28,0 40,20 65,95 8,83 13,74 19,03 25,29 42,82 19,60 33,63 45,0 61,66 92,41
9,61 18,35 28,03 40,60 66,27 8,83 14,01 19,04 25,83 42,84 19,65 33,63 46,20 61,66 93,81
9,61 18,36 28,58 41,48 67,21 8,83 14,27 19,08 25,83 43,50 19,65 33,72 46,20 63,06 93,97
9,73 18,36 28,58 42,0 67,21 8,86 14,29 19,08 25,83 43,52 19,65 33,72 46,20 63,14 98,09
10,19 18,41 28,75 42,0 67,26 8,86 14,42 19,08 25,83 43,54 20,81 33,72 46,20 63,14 100,0
10,19 19,0 29,35 42,14 67,96 8,86 14,53 19,33 26,50 44,18 21,0 33,86 46,22 64,4 100,8
10,87 19,03 29,43 42,14 68,61 8,86 14,95 19,71 26,51 44,87 21,05 33,86 46,22 64,46 102,2
10,89 19,04 29,43 42,16 68,66 8,94 14,95 19,72 26,54 45,55 21,05 34,06 46,22 64,46 103,6
10,89 19,6 30,58 42,22 70,13 9,51 14,95 19,72 27,18 45,55 21,05 34,06 46,28 64,46 103,6
10,89 19,65 30,59 42,82 70,69 9,51 14,97 20,39 27,18 46,21 21,42 35,0 46,28 65,81 105,5
11,05 19,65 30,61 42,84 71,37 9,51 14,97 20,39 27,19 47,59 22,40 35,0 46,39 65,86 106,4
11,06 19,71 30,61 43,49 74,67 9,54 14,97 20,39 27,22 48,25 22,40 35,0 47,0 65,86 106,4
11,20 19,71 30,80 43,50 77,0 9,54 14,97 20,40 27,22 48,94 22,44 35,03 47,60 65,93 109,2
11,20 19,72 30,83 44,0 78,01 9,61 15,63 20,40 27,86 49,61 22,44 35,03 47,60 67,20 112,0
11,20 19,76 30,83 44,17 81,25 10,19 15,63 20,40 27,87 50,31 22,44 35,45 47,60 67,21 112,1
11,29 19,76 30,83 44,17 84,19 10,19 15,65 20,40 27,90 51,67 23,84 36,35 47,60 67,33 113,4
11,29 20,39 30,83 44,85 84,96 10,19 15,65 20,40 27,90 51,87 23,84 36,40 47,60 68,61 114,8
11,55 20,4 30,93 44,85 85,01 10,22 15,65 20,49 27,90 52,33 23,84 36,40 47,62 68,61 116,7
11,57 20,43 31,29 44,86 89,61 10,22 15,65 20,67 28,54 52,35 23,84 36,43 47,62 68,66 120,6
11,63 21,0 31,94 45,04 89,87 10,22 15,65 21,07 28,54 54,41 23,96 36,43 47,68 68,66 123,3
11,63 21,0 31,97 45,54 91,05 10,28 15,69 21,08 28,55 56,41 24,45 36,43 47,93 68,73 124,7
12,04 21,0 32,06 46,22 93,02 10,87 16,31 21,08 28,55 56,41 25,0 36,64 49,0 70,0 126,1
12,23 21,07 32,23 46,89 96,69 10,87 16,31 21,08 28,58 58,45 25,20 36,83 49,02 70,0 138,6
12,23 21,75 32,32 47,58 99,91 10,89 16,31 21,11 28,58 58,48 25,20 37,80 50,40 70,35 148,0
12,31 22,40 32,62 47,60 103,6 10,96 16,31 21,11 29,23 60,49 25,20 37,83 50,42 72,81 151,4
12,31 22,40 32,65 47,60 103,6 11,55 16,31 21,11 29,23 61,20 25,24 37,83 50,48 73,02 154,0
12,60 22,40 32,68 47,62 120,4 11,55 16,31 21,75 29,25 63,90 25,36 37,83 50,48 73,14 219,8
12,60 22,40 33,60 47,68 124,7 11,55 16,31 21,75 29,25 63,97 25,55 37,83 50,57 74,20 219,9
12,91 22,43 33,60 49,0 141,5 11,55 16,32 21,75 29,25 73,41 25,81 37,90 50,57 74,32 260,5
PGPR
1,66 3,13 3,66 4,10 4,76 5,44 6,12 6,80 7,48 8,18 8,86 10,87 12,25 14,95 21,84
1,66 3,15 3,71 4,13 4,76 5,44 6,12 6,80 7,48 8,18 8,96 10,87 12,25 14,97 21,92
1,99 3,15 3,71 4,13 4,81 5,44 6,12 6,80 7,48 8,21 8,96 10,87 12,32 15,26 22,60
2,02 3,32 3,78 4,13 4,81 5,44 6,15 6,80 7,51 8,27 9,29 10,95 12,44 15,63 23,12
2,10 3,32 3,87 4,20 4,81 5,48 6,27 6,83 7,51 8,29 9,37 10,95 12,62 15,76 26,75
2,10 3,32 3,87 4,31 4,98 5,64 6,30 6,83 7,60 8,29 9,51 10,96 12,91 16,31 27,0
2,15 3,32 3,88 4,31 4,98 5,64 6,31 6,97 7,60 8,30 9,54 10,97 12,91 16,32 27,18
2,32 3,33 3,98 4,31 4,98 5,64 6,31 6,97 7,63 8,32 9,54 11,06 13,59 16,37 32,54
2,39 3,33 3,98 4,31 4,99 5,65 6,31 7,0 7,64 8,35 9,54 11,30 13,59 16,95 33,41
2,65 3,33 3,98 4,33 4,99 5,65 6,34 7,0 7,64 8,41 9,61 11,30 13,60 17,26 33,99
2,65 3,33 3,98 4,33 5,02 5,68 6,34 7,0 7,69 8,41 9,61 11,55 13,61 17,79 42,14
2,67 3,40 3,98 4,33 5,31 5,68 6,64 7,09 7,75 8,63 9,63 11,55 13,66 17,91 59,13
2,67 3,40 3,98 4,36 5,31 5,88 6,64 7,10 7,96 8,63 9,63 11,55 14,03 17,94 75,44
2,67 3,40 4,04 4,36 5,32 5,98 6,64 7,30 8,16 8,83 10,19 11,55 14,27 18,46 84,27
2,74 3,40 4,04 4,66 5,35 6,05 6,67 7,31 8,16 8,83 10,19 11,57 14,27 18,91 91,95
2,74 3,65 4,04 4,66 5,35 6,05 6,80 7,33 8,16 8,83 10,22 11,63 14,28 19,08 97,87
2,99 3,66 4,08 4,66 5,35 6,12 6,80 7,33 8,16 8,83 10,22 11,63 14,34 19,58 106,0
3,0 3,66 4,08 4,69 5,36 6,12 6,80 7,42 8,16 8,83 10,31 11,73 14,34 19,76 115,1
3,0 3,66 4,08 4,69 5,40 6,12 6,80 7,48 8,16 8,83 10,40 11,95 14,53 19,91 188,3
3,0 3,66 4,08 4,75 5,44 6,12 6,80 7,48 8,18 8,86 10,64 12,23 14,73 21,76 313,4

293
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

9.4 Datos para caracterización del extracto de cacao.

1.2

1.0

0.8
Absorbancia

0.6

y = 0,097x - 0,175
0.4
R² = 0,997

0.2

0.0
0 5 10 15

mg EAG/L (ppm)

Figura 9.8 Recta de calibrado con ácido gálico para el método espectrofotométrico de Folin-
Ciocalteau para la cuantificación de los polifenoles totales en el extracto de cacao encapsulado.

294
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Figura 9.9 Espectros UPLC de los patrones de (-) Epicatequina y (+) Catequina.

Figura 9.10 Espectros UPLC del extracto de cacao en solución de 1000 ppm.

295
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

9.5 Viscosidad estacionaria de la fase dispersa para el estudio de preparación

de las microesferas en emulsión con el extracto de cacao.

Tabla 9.16 Viscosidad estacionaria de la fase dispersa a pH ácido y neutro y su evolución con el
tiempo.

t1 t2 t´1 t´2
FD pH neutro FD pH ácido
γ (1/s) η (Pa.s) η´ (Pa.s)
0,01 2,159 2,881 10,01 89,90
0,015 2,390 3,021 14,14 151,9
0,022 2,575 2,887 16,03 163,5
0,033 2,706 2,792 14,66 135,2
0,049 2,857 2,831 15,66 120,8
0,074 2,915 2,707 13,75 102,8
0,111 2,873 2,612 11,28 80,28
0,165 2,888 2,542 9,835 63,66
0,246 2,901 2,536 8,615 50,58
0,368 2,895 2,508 7,727 36,03
0,549 2,878 2,550 7,418 28,25
0,819 2,838 2,514 6,746 21,67
1,222 2,779 2,503 6,235 17,07
1,824 2,687 2,495 5,674 13,90
2,722 2,561 2,453 5,054 10,93
4,062 2,410 2,393 4,441 8,147
6,063 2,227 2,309 3,855 5,911
9,049 2,022 2,198 3,270 4,356
13,51 1,845 2,058 2,758 3,465
20,16 1,721 1,904 2,226 3,012
30,08 1,515 1,721 1,868 2,38
44,9 1,295 1,515 1,544 1,977
67,01 1,106 1,295 1,265 1,556
100,0 1,089 1,089 1,028 1,236
FD: fase dispersa; pH ácido, 4,5 pH; pH neutro, 6,5-6,8; t1, tiempo 6 min;
t2, tiempo 32 min; γ, gradiente de velocidad y η, viscosidad estacionaria.

296
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

9.6 Caracterización de las esferas de alginato/cacao preparadas por extrusión

con diferentes mecanismos de gelificación: diámetros, morfología y textura.

Tabla 9.17 Diámetros de las esferas de alginato/cacao.

Diámetros número-longitud (mm)

Esferas E1 E2 E3 E4 I1 I2 I3 I4
1 3,17 3,38 3,05 4,12 4,5 4,15 4,49 4,68
2 4,01 3,35 4,08 3,57 4,37 4,46 4,23 4,93
3 3,95 3,19 4,59 3,12 4,63 3,99 5,18 4,52
4 4,04 3,08 3,48 3,46 4,29 4,19 4,5 4,75
5 3,96 3,76 4,75 3,58 4,55 3,72 5,07 4,29
6 4,08 3,88 4,56 4,24 3,94 4,29 4,48 3,96
7 3,46 3,7 3,91 3,77 4,6 4,45 4,4 4,27
8 3,28 3,64 3,92 3,69 4,37 4,23 4,3 3,89
9 3,49 3,87 3,58 3,53 4,25 4,07 4,01 4,23
10 3,03 3,51 3,69 3,68 4,69 4,99 4,27 3,78
11 3,54 2,72 4,37 3,9 4,73 4,08 4,22 4,41
12 3,42 3,38 4,51 3,42 3,72 3,67 4,41 4,89
13 4,1 3,55 3,7 4,02 4,40 3,61 4,04 4,19
14 3,37 3,59 3,93 3,67 4,88 4,42 3,84 4,29
15 3,8 3,35 4,34 3,29 4,31 4,2 4,1 3,89
dl medio 3,65 3,46 4,03 3,67 4,42 4,17 4,37 4,33
DE 0,36 0,31 0,48 0,31 0,30 0,35 0,36 0,35
Gelificación externa, E; Gelificación interna, I; Subíndices 1 y 2 para 1% p/p y subíndices 3 y 4 para 3% p/p extracto de cacao
encapsulado; Además, subíndices 1 y 3 para las esferas preparadas con 0,4·10-3 moles Ca+2/g alginato y los subíndices 2 y 4
para las esferas preparadas con 1·10-3 moles Ca+2/g alginato; Diámetro medio número-longitud, dl (±desviación estándar, DE).

297
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

(a) (c)

(b) (d)

(e) (f)

-3 +2
Figura 9.11 Imágenes de SEM para las esferas liofilizadas obtenidas a partir de 0,4·10 moles Ca /g
alginato (baja concentración de calcio). Alginato 2%/cacao 1% p/p por GE, (a); Alginato 2%/cacao 1%
p/p por GI, (b); Alginato 2%/cacao 3% p/p por GE, (c); Alginato 2%/cacao 3% p/p por GI, (d); Esferas
de alginato 2% p/p control por GE, (e) y Esferas de alginato 2% p/p control por GI, (f).

298
 APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.18 Propiedades mecánicas de textura de las esferas alginato/cacao para las diferentes
formulaciones.

Formulación Dureza (N) Elasticidad

Fn D1 D2 D3 Dprom DE E1 E2 E3 Eprom DE
E1 2,811 2,291 3,039 2,714 0,383 0,792 0,792 0,792 0,792 0,000
E2 2,579 3,213 3,714 3,169 0,569 0,80 0,799 0,799 0,799 0,001
I1 0,256 0,218 0,199 0,224 0,029 0,792 0,792 0,792 0,792 0,000
I2 0,911 0,986 0,971 0,956 0,040 0,808 0,833 0,842 0,828 0,018
E3 3,141 2,290 3,08 2,837 0,475 0,792 0,792 0,808 0,797 0,009
E4 2,247 2,056 2,541 2,281 0,244 0,799 0,792 0,808 0,800 0,008
I3 0,574 0,552 0,275 0,467 0,167 0,799 0,799 0,833 0,810 0,020
I4 1,111 0,869 0,869 0,950 0,140 0,834 0,825 0,800 0,820 0,018
Formulación Cohesividad Gomosidad (N)
Fn C1 C2 C3 Cprom DE G1 G2 G3 Gprom DE
E1 0,534 0,506 0,482 0,507 0,026 2,635 1,538 1,354 1,842 0,693
E2 0,489 0,470 0,465 0,475 0,013 1,262 1,747 1,495 1,501 0,243
I1 0,628 0,607 0,726 0,654 0,064 0,327 0,132 0,161 0,207 0,105
I2 0,622 0,641 0,724 0,662 0,054 0,567 0,632 0,703 0,634 0,068
E3 0,496 0,478 0,467 0,480 0,015 1,556 1,094 1,836 1,495 0,375
E4 0,431 0,459 0,448 0,446 0,014 0,886 1,909 0,952 1,249 0,573
I3 0,619 0,559 0,574 0,584 0,031 0,409 0,416 0,164 0,329 0,144
I4 0,714 0,754 0,604 0,619 0,078 0,452 0,151 0,438 0,347 0,170
Formulación Masticabilidad
Fn M1 M2 M3 Mprom DE
E1 0,821 1,084 1,230 1,045 0,207
E2 2,286 1,384 1,184 1,618 0,587
I1 0,127 0,105 0,269 0,167 0,089
I2 0,458 0,526 0,592 0,525 0,067
E3 0,701 1,476 0,866 1,014 0,408
E4 1,749 1,543 1,233 1,508 0,259
I3 0,342 0,343 0,361 0,349 0,011
I4 0,700 0,661 0,781 0,714 0,061
Formulación, Fn; Gelificación extterna, E; Gelificación interna, I; Subíndice 1 y 2 para las esferas con 1% p/p y subíndices 3 y 4
para las esferas con 3% p/p de extracto de cacao encapsulado; Donde subíndice 1 y 3 se utiliza 0,4·10-3 moles Ca+2/g alginato
y subíndices 2 y 4 se utiliza 1·10-3 moles Ca+2/g alginato para la preparación de esferas alginato/cacao; Dureza de las muestras
1, 2, 3 (D1, D2, D3) y su valor medio, Dprom; Cohesividad de las muestras 1, 2, 3 (C 1, C2, C3) y su valor medio, Cprom; Elasticidad de
las muestras 1, 2, 3 (E1, E2, E3) y su valor medio, Eprom; Gomosidad de las muestras 1, 2, 3 (G 1, G2, G3) y su valor medio, Gprom;
Masticabilidad de las muestras 1, 2, 3 (M1, M2, M3) y su valor medio, Mprom; Desviación estándar, DE; Unidad de Fuerza, N.

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APÉNDICEHOJA P APÉNDICEAPÉNDICES: TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla 9.19 Datos estadísticos para el Test Triangular.

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9.7 Publicaciones.

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