FORMACIÓN DE NÓDULO POR RHIZOBIUM

A. Fijación de nitrógeno

Entre todas las bacterias con capacidad para la fijación biológica de nitrógeno, son
de destacar aquéllas pertenecientes a los géneros Rhizobium, Sinorhizobium,
Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium y Allorhizobium (denominadas
colectivamente Rhizobium), que se establecen en simbiosis con plantas leguminosas para
llevar a cabo el proceso de fijación del dinitrógeno atmosférico. Su importancia viene
determinada, además de por el volumen de nitrógeno fijado que dichas simbiosis aportan a
la biosfera, por las siguientes razones:
La eficiencia fijadora de esta simbiosis es 10-20 veces mayor que en la mayoría de
diazotrofos libres, debido al ambiente casi ideal que proporcional el nódulo radical, el
órgano fijador por excelencia.
La nitrogenasa de este sistema utiliza energía directamente derivada de la fotosíntesis.
El nitrógeno fijado es utilizado y almacenado directamente en los tejidos vegetales.
La importancia agronómica de las leguminosas, que constituyen la principal fuente de
proteínas vegetales para humanos y animales.
B. Especificidad de la simbiosis
La interacción Rhizobium-leguminosa es altamente específica, lo que significa que
en general cada especie bacteriana se establece en simbiosis con uno o pocos géneros o
especies vegetales, si bien existen ejemplos de bacterias con amplio rango de hospedador,
capaces de nodular a un elevado número de géneros de leguminosas. Aunque pueda parecer
que no existe una aparente correlación entre especie bacteriana y plantas hospedadora, la
especificidad de hospedador viene determinada por el tipo de moléculas señal producida por
cada pareja bacteria-planta.

1. ETAPAS DEL PROCESO DE NODULACIÓN

En general los nódulos de las leguminosas se forman en las raíces de la planta, si bien
existen casos de formación de nódulos en tallos, como en Sesbania. La formación del nódulo
fijador depende de un continuo y adecuado intercambio de señales entre los simbiontes. Este
intercambio de señales comienza incluso antes de que los simbiontes entren en contacto
físico.
1.1. Quimiotaxis y colonización de la raíz.
Antes de llevarse a cabo la infección de las raíces de leguminosas por Rhizobium debe de haber
un crecimiento bacteriano en la rizosfera, inducido por compuestos exudados por las raíces de
leguminosas. Estos compuestos, entre los que se encuentran ácidos orgánicos, azúcares,
aminoácidos y flavonoides, actúan como quimioatrayentes y estimulan el crecimiento de
Rhizobium. La composición del exudado varía dependiendo de la planta hospedadora, de su estado
de desarrollo y de factores medio ambientales. De especial importancia durante las etapas iniciales
son los compuestos de tipo flavonoide, que cumplen varias funciones:
1.- Quimioatrayendo a Rhizobium hasta las raíces de plantas leguminosas.
2.- Estimulando el crecimiento bacteriano alrededor de la raíz.
 3.- Induciendo la activación de genes de nodulación bacterianos.

1.2. Adhesión de las bacterias a la raíz

Tras la colonización de la superficie de la raíz, los Rhizobium se adhieren a los
pelos radicales jóvenes. Esta adhesión tiene lugar de forma polar, es decir, es el extremo
de la célula bacteriana el que contacta con el pelo radical.

Se sabe poco a cerca de los mecanismos que controlan la adhesión de las bacterias
a la superficie celular vegetal, aunque existen pruebas de que comienza con una unión
débil inicial, seguida por un anclaje con filamentos de celulosa sintetizados por la
bacteria. Aunque la unión inicial es esencial para la nodulación, la etapa de anclaje no lo
es tanto, ya que mutantes incapaces de producir este anclaje no se ven afectados en la
nodulación. En el proceso de adhesión pueden estar implicados componentes
superficiales de Rhizobium, como exopolisacáridos, lipopolisacáridos, antígenos
capsulares y proteínas superficiales, como ricadhesina y Bj38. Por parte de la planta,
parecen ser necesarios compuestos como lectinas o un homólogo de vitronectina. Estas
lectinas estarían implicadas en la adhesión utilizando los componentes superficiales
bacterianos como sitios de unión.

La ricadhesina es una proteína superficial de unión a calcio que actuaría uniéndose

a fibrillas de celulosas sintetizada por la bacteria. La adhesina Bj38 se ha caracterizado
en Bradyrhizobium, donde mutantes en el gen que codifica para esta proteína están
afectados en adhesión y nodulación

1.3. Curvatura de pelos radicales y formación del cordón de infección

La adhesión de Rhizobium a los pelos radicales jóvenes provoca la primera
respuesta microscópicamente visible: la deformación y curvatura del pelo radical. Esta
curvatura se produce por una estimulación local del crecimiento del extremo apical del
pelo radical y no por una inhibición del crecimiento. La correcta expresión de genes nod
y genes implicados en la síntesis de exopolisacáridos son necesarios para la inducción de
estos cambios en los pelos radicales.

Cuando las células de Rhizobium inducen la curvatura de los pelos radicales,

algunas quedan atrapadas en ella, desencadenando el proceso de infección, que comienza
con una hidrólisis muy localizada de la pared celular vegetal en el punto de curvatura del
pelo radical. Como consecuencia, se produce una invaginación de la membrana
plasmática y el depósito de nuevo material, parecido en composición a la pared vegetal,
en la parte externa de dicha membrana. El crecimiento continuo de esta estructura origina
el cordón de infección. Dentro de este cordón las bacterias se multiplican activamente y
se encapsulan en polisacáridos extracelulares.

1.4. Formación del primordio nodular

Simultáneamente a la formación del cordón de infección, determinadas células del
córtex sufren una serie de cambios morfológicos, como reorganización de los
microtúbulos, migración del núcleo hacia el centro de la célula y la formación radial de
nuevas paredes celulares, lo que se traduce en una reactivación de la actividad mitótica,
que origina lo que se denomina como primordio nodular. Dependiendo de cuáles sean las
células del córtex que se dividen, se originará un nódulo de tipo indeterminado ó
determinado. Los nódulos indeterminados tienen un meristemo apical persistente que se
origina como consecuencia de la actividad mitótica de células localizadas en la parte
interna del córtex. Este tipo de nódulos indeterminados son característicos de leguminosas
de clima templado. En cambio, las leguminosas de origen tropical, tales como soja y judía,
forman nódulos determinados en los que la actividad mitótica del córtex externo de la raíz
cesa durante el desarrollo, siendo la expansión celular la responsable de la forma globosa
del nódulo.

El cordón de infección transportará las bacterias desde el extremo del pelo radical
hasta el primordio nodular. El porcentaje de infecciones que finalmente dan lugar a la
formación de nódulos fijadores es muy bajo. Esto es como consecuencia del aborto de
muchos de los canales de infección que se originan. Se ha sugerido que dichos abortos
están asociados con una respuesta de hipersensibilidad de la planta.

1.5. Endocitosis de las bacterias y diferenciación en bacteroides

La liberación de las bacterias al interior de las células del primordio ocurre
mediante un mecanismo de endocitosis específico, por el que las bacterias son liberadas
al citoplasma rodeadas de una membrana de origen vegetal, la membrana peribacteroidal.
Esta membrana resultará fundamental para el intercambio de metabolitos entre la bacteria
y la planta. Una vez dentro de la célula vegetal, el rizobio puede dividirse una o pocas
veces más. La membrana peribacteroidal se divide en sincronía con la división de la
bacteria, por lo que finalmente cada bacteroide quedará encerrado en su propia membrana
formando la unidad simbiótica denominada simbiosoma. En el simbiosoma cesa la
multiplicación de las bacterias, que se transforman en los llamados bacteroides, de mayor
tamaño y con una morfología irregular. En el bacteroide se lleva a cabo la reducción del
dinitrógeno hasta amonio, el cual es exportado a la célula vegetal. Aunque hasta hace
poco se pensaba que el amonio era exportado directamente, estudios recientes indican que
el producto de la nitrogenasa es exportado desde el bacteroide en forma de alanina, si bien
en la membrana peribacteoridal ha sido caracterizado un canal de amonio que podría estar
implicado en la transferencia del nitrógeno fijado a la célula hospedadora.

2. ESTRUCTURA DE LOS NÓDULOS DE LAS LEGUMINOSAS

2.1. Tipos de nódulos de leguminosas

Dependiendo de si el primordio nodular tiene su origen en el córtex interno o en
el córtex externo de la raíz, las células meristemáticas mantendrán o no su actividad
mitótica durante el desarrollo del nódulo. Estas diferencias determinan la estructura y la
morfología del nódulo maduro, pudiéndose clasificar en dos tipos: nódulos
indeterminados y nódulos determinados.

Tabla 1. Diferencias entre nódulos indeterminados y nódulos determinados.

 Indeterminado Determinado
Origen del Primordio Córtex interno Córtex externo
Nodular
Crecimiento del Nódulo División celular Expansión
celular
Forma del Nódulo Alargada Redondeada
Tipo de Leguminosa Clima templado Clima tropical

2.2. Estructura del nódulo

En un corte trasnversal de un nódulo de leguminosa pueden observarse dos zonas
concéntricas:

 Tejido periférico: consta de un córtex externo, una endodermis y un parénquima

o córtex interno. El córtex externo está formado por células muy vacuoladas, que
protegen al nódulo del medio externo. El parénquima posee una estructura
compacta con pocos espacios intercelulares, y funciona como una barrera para la
difusión del oxígeno. Es aquí donde se encuentran los haces vasculares (Figura1).
 Tejido central: se encuentran células infectadas y no infectadas. Este tejido
central es muy distinto según se trate de un nódulo determinado ó de un nódulo
indeterminado. En un nódulo determinado no existe un meristemo persistente, por
lo que todas las células del tejido central presentan en cada momento el mismo
estado de desarrollo. Su crecimiento, basado fundamentalmente en el aumento del
tamaño de sus células, junto con la ausencia de un meristemo apical, determinan
su forma esférica (Figura1). En este tejido central, dentro de las células no
infectadas, tiene lugar parte de la asimilación y transporte del amonio producido
en las células infectadas.
El desarrollo de un nódulo indeterminado es un proceso continuo y dinámico. Así,
en una sección longitudinal de un nódulo maduro se pueden observar simultáneamente
los distintos estadíos de desarrollo del mismo, ya que presenta un gradiente de
diferenciación típico desde la parte más distal, donde se localiza el meristemo, hasta la
parte más próxima a la raíz, donde se encuentran las células más viejas. De esta forma en
el tejido central de un nódulo indeterminado se pueden distinguir 4 zonas (Fig.1),
utilizando como criterios los cambios estructurales de las células vegetales y bacteriana,
la morfología del bacteroide, la acumulación de almidón y el comienzo de la fijación de
nitrógeno:
 Zona I ó zona meristemática: constituye el meristemo apical persistente,
y está compuesto por pequeñas células en continua división, de ahí el
crecimiento continuado del nódulo. Esta zona genera constantemente
nuevas células que van diferenciándose progresivamente a través de las
distintas zonas del tejido central del nódulo.
Zona II ó zona de invasión ó de prefijación: es la región adyacente al
meristemo apical. En su parte más distal, el cordón de infección
comienza a penetrar en las células meristemáticas, que dejan de dividirse,
y las bacterias son liberadas al interior de las células vegetales rodeadas
por la membrana peribacteroidal.
Interzona II-III: localizada entre la zona II de prefijación y la zona III
de fijación. Se caracteriza por la acumulación de almidón en las células
infectadas, llenas de bacteroides, y la inducción de los genes nif.
Zona III ó de zona de fijación: donde las células vegetales han
alcanzado su máximo tamaño y se encuentran llenas de bacteroides que
realizan la fijación simbiótica de nitrógeno. También aparecen pequeñas
células no infectadas que proporcionan el soporte metabólico necesario
para el proceso de fijación. Las células infectadas de esta zona presentan
un color rosado característico, debido a la presencia de leghemoglobina
en su interior. Esta proteína juega un papel fundamental en el aporte
controlado de oxígeno al bacteroide, clave para el adecuado
funcionamiento de la nitrogenasa.
Zona IV ó zona de senescencia: formada por células infectadas que han
perdido la capacidad de fijar nitrógeno, y que al igual que los bacteroides,
degeneran y mueren.
La degeneración de ambos simbiontes ha sido hasta ahora considerada el punto
final de la interacción simbiótica. Sin embargo, recientemente se ha descrito la existencia
de una denominada zona V, adjacente a la zona IV, presente en nódulos de alfalfa de más
de 6 semanas. En esta zona V ocurre una nueva ronda de liberación de bacterias de los
cordones de infección viejos, lo que conlleva la reinvasión de células vegetales
senescentes. Al parecer, en esta zona V existe una concentración de oxígeno compatible
con la multiplicación celular y la expresión de genes nif, si bien no se ha detectado en ella
actividad nitrogenasa. Se ha propuesto que esta zona V representa un nicho ecológico
donde las bacterias realizan un tipo de vida saprofítico en el interior de las células
vegetales degeneradas.

La planta se beneficia de la fijación de nitrógeno por formas bacterianas que no

son viables para la multiplicación, mientras que la bacteria se beneficia
fundamentalmente tras la degeneración del nódulo y su liberación al suelo.
3. LOS GENES DE LA NODULACIÓN EN RHIZOBIUM

En muchas especies de rizobios, la mayoría de los genes de nodulación se

encuentran localizados en el plásmido simbiótico (pSym), aunque en Azorhizobium,
Bradyrhizobium y Mesorhizobium loti los genes se encuentran localizados en el
cromosoma. Los genes de la nodulación, denominados nod, nol y noe, se definen
como genes que están implicados en nodulación ó que están coordinadamente
regulados con éstos.
Originalmente los genes de nodulación se clasificaron en base a su
conservación ó su relación con el rango de hospedador de los distintos géneros de
Rhizobium, en genes de nodulación comunes (nodABCDIJ), presentes en todas las
cepas de Rhizobium e intercambiables entre diferentes especies, genes que
determinan la especificidad de hospedador (genes hsn), y genes que determinan la
nodulación específica de un genotipo o cultivar (genes gsn y csn). Actualmente se
clasifican en base a la función que tienen los productos génicos que codifican, como
regulación, biosíntesis y secreción de factores Nod. Algunos genes, como nodA,
nodB y nodC, están presentes en una sola copia, mientras que otros como nodM,
nodP, nodQ y nodT, tienen secuencias homólogas en otras partes del genoma. Como
se verá más adelante, muchos de los genes de la nodulación están implicados en la
biosíntesis de moléculas señal que disparan distintas respuestas en la planta
relacionadas con la formación e infección del nódulo. El caso de nodD es especial,
pues codifica para un regulador de la transcripción del resto de genes de nodulación.
En muchos casos, los genes de nodulación se encuentran cercanos unos de
otros, y organizados en operones, los cuales están frecuentemente conservados en
distintas especies rizobianas. (Fig.2).

3.1. Regulación de la expresión de los genes de la nodulación

La mayoría de los genes de nodulación se expresan a niveles muy bajos

cuando Rhizobium crece en ausencia de su planta hospedadora. La inducción de la
expresión de estos genes necesita de ciertos compuestos excretados por las raíces de
la planta hospedadora específica. Estos son compuestos de tipo flavonoide,
generalmente flavonas y flavononas, aunque en el caso de Bradyrhizobium se trata
de isoflavonas. La planta también puede producir flavonoides que actúan como anti-
inductores, reduciendo la expresión de los genes de la nodulación. Para la activación
de la expresión se requiere además la proteína NodD, un regulador transcripcional
que funciona tras interaccionar con los flavonoides de la planta. La proteína NodD
reconoce las secuencias conservadas en las cajas nod, y se une a ellas de manera
permanente.

3.2. Expresión de nodD

En muchas especies de Rhizobium, el gen regulador nodD se transcribe de

forma divergente a operones de genes nod regulados por él, y con frecuencia los
promotores se solapan. Un posible papel de esta transcripción divergente puede ser
el incremento local de ARN polimerasa para elevar los niveles de transcripción
desde los promotores menos activos.
La regulación y el nivel de expresión de los genes nodD muestran diferentes
variaciones dependiendo de la especie, e incluso entre cepas de la misma especie.
En general, nodD es expresado constitutivamente en aquellos Rhizobium que poseen
sólo una copia de nodD (R. leguminosarum bv. viciae y bv. trifolii, B. parasponia,
A. caulinodans y M. loti). nodD puede ser negativamente autorregulado por su
propio producto, como en R

3.3. La proteína NodD

Las proteínas NodD funcionan como activadores transcripcionales de los

genes de nodulación que están por debajo de las cajas nod.
Generalmente las proteínas NodD requieren moléculas señal excretadas
por la planta, flavonoides, que actúan como coinductores en la regulación de la
transcripción de genes de nodulación, excepto NodD3, que no necesita
inductores y cuya actividad está regulada a nivel de expresión génica.
3.4. Factores adicionales que modulan la expresión de genes de la nodulación

La formación del nódulo está influenciada por numerosos factores

ambientales. Entre los más importantes están el pH y factores asociados con la
acidez del suelo. La sensibilidad a la acidez es muy pronunciada durante los
primeros estadíos de la simbiosis, especialmente antes y durante la formación de
la curvatura de pelos radicales. La influencia del pH sobre la inducción de genes
de nodulación se manifiesta de distintas maneras: (i) Pobre crecimiento de
 Rhizobium a bajo pH; (ii) Baja producción de flavonoides inductores por parte de
la planta en suelos de bajo pH; (iii) La acumulación de flavonoides inductores en
la bacteria está influenciada por el pH.
También los altos niveles de nitrógeno combinado tienen efectos negativos en la
producción y excreción de compuestos fenólicos por la raíz, lo cual puede ser un factor
limitante para la inducción de genes de la nodulación y para el establecimiento de la
simbiosis.

Bibliografía
Eficiencia en la nodulación por rizobios nativos, procedentes de nódulos de Pisum
sativum “arveja” colectados de diferentes Departamentos del Perú. Scientia
Agropecuaria 7 (3): 165 – 172 (2016