Informe 4
Informe 4
Informe 4
SAN MARCOS
Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA
CULTIVO DE MICROORGANISMOS,
PRÁCTICA #04
MÉTODOS DE SIEMBRA.
AUTORES:
BALDERA OLIVOS LILIANA ESTEFANY 17160300
GUTIERREZ AQUISE ROXANA 17160316
RODRIGUEZ LAUREANO FERNANDO 17160308
2018
I. INTRODUCCIÓN
En la naturaleza encontramos diversos tipos de microorganismos, algunos de estos
se encuentran en ambientes de elevadas temperaturas, otros en lugares fríos. Sin
embargo, también se han encontrado lugares donde no se ha demostrado la
presencia de los mismos, como los volcanes en ebullición.
En el presente informe desarrollaremos los distintos métodos de siembra en medios
nutritivos naturales o artificiales, para poder aislar un tipo de microorganismo
específico de una fuente natural o también llamado cultivo monoxénico.
Cultivos puros
En primer lugar, el recipiente de cultivo debe estar inicialmente estéril (libre de
microorganismos vivos). Si se inocula una muestra en un medio de cultivo sólido en una placa
Petri se podrá obtener un cultivo puro, es decir un cultivo que contiene una única clase de
microorganismo. En un cultivo puro la población de microorganismos desciende una sola
célula. Se estima que solamente el 1% de los procariontes pueden ser cultivados in vitro, entre
los cuales se encuentra la mayoría de los microorganismos de importancia clínica.La vasta
mayoría de microorganismos ambientales no son cultivables.
Es necesario obtener un cultivo puro a partir de una placa de aislamiento primario, que
suele ser un cultivo mixto. En algunas ocasiones es fácil seleccionar las colonias aisladas
para su subcultivo (volver a sembrar la colonia previamente aislada a partir de una muestra),
pero en otras pueden presentarse muy amontonadas de tal manera que es difícil elegir
colonias individuales aisladas.
El subcultivo directo, que consiste en tocar con cuidado la superficie de la colonia deseada
con el asa de siembra en punta o en aro (en punta si las colonias están muy cercanas entre
sí) y estriar una nueva placa para el aislamiento.
El uso de medios selectivos, que consiste en subcultivar la colonia de interés sobre un agar
que inhibirá el crecimiento de las colonias no deseadas; por ejemplo, subcultivar un bacilo
gramnegativo sobre un agar MacConkey para separarlo de cocos grampositivos.
El uso de sustancias químicas inhibitorias incorporadas dentro del agar (análogo a un medio
selectivo), que consiste en subcultivar la colonia de interés sobre un agar que contenga
antibióticos o sustancias químicas que inhibirán el crecimiento de las colonias no deseadas.
Hay varios métodos para conservar microorganismos dependiendo del tiempo que se les
desea mantener viables y sus características fisiológicas. Se tienen métodos a largo plazo,
métodos a corto plazo y métodos alternativos.
Métodos de conservación a largo plazo
Conservación por congelación
Se congelan las células en suspensión en un líquido o caldo de cultivo crecido joven con un
agente crioprotector(50% de glicerol para congelar a -20oC y al 14-20% para congelar a -70
o 80oC). Los críoprotectores más usados son el glicerol y el dimetilsulfóxido (DMSO).
Mediante este método las células no disponen de agua en forma líquida, por tanto no hay
crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan
subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de
vista, la viabilidad de los microrganismos es de varios años. Las desventajas son la de requerir
congeladores que sean costosos y el riesgo de que haya algún fallo del sistema eléctrico que
produzca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento.
Métodos de siembra
Método de siembra de la placa estriada o agotamiento por
estrías
Es el método más comúnmente utilizado para aislar bacterias. El procedimiento de estriado
para aislar microorganismos fue ideado por Loeffer y Gaffky en el laboratorio de Koch.
Implica la separación de bacterias física y espacialmente estriándolas sistemáticamente
sobre una superficie de agar en una placa Petri. Si una célula microbiana única se encuentra
un punto de la superficie del medio sólido esta se multiplicará hasta alcanzar una masa de
millones de células que forman una colonial, la cual puede verse fácilmente a simple vista.
Este método permite tener colonias aisladas en la placa.
El éxito en obtener colonias aisladas está en función de la cantidad y densidad (población
microbiana) del inóculo, lo cual a veces es difícil de juzgar, y de la manera de hacer el
estriado. La destreza en esta técnica se adquiere solo con la práctica. Hay varias maneras
de hacer un estriado la placa Petri: en uno, dos, tres, o cuatro cuadrantes.
Recomendamos este último porque es el que probablemente dará mejores resultados con
suspensiones que tengan un amplio rango en densidad microbiana.
Para el procedimiento del estriado se usa un asa de siembra en aro estéril o, en algunos
casos, un hisopo estéril para inocular el medio de cultivo. Se hace una ligera presión con el
asa en la superficie del medio y se procede a estriar como se observa en las ilustraciones.
Cuando se tiene un inóculo medio, y sabiendo que la colonia procede una sola célula, se
puede saber el número de colonias que pueden crecer sobre el medio cultivo, entonces se
habla de unidades formadoras de colonias (UFC).
Las colonias aparecen distribuidas por toda la masa del agar. Aquella que está en la
superficie tendrá distintas características, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las
colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tiene forma lenticular,
aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por
tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no
se diferencian unas de otras por su morfología. Aunque con esta técnica se obtiene colonias
aisladas, generalmente solo se utiliza para determinar el número de microorganismos
viables en una muestra cuando estos son anaeróbicos facultativos o microaerófilos.
Figura 2. Método de siembra por incorporación.
Se emplea este método, con el fin de adelgazar la muestra para que en la superficie
del agar queden las colonias separadas y para esparcir la muestra se utiliza una
espátula de Drigalsky, previamente esterilizada.
IV. RESULTADOS
MEDIO DE
MÉTODO DE SIEMBRA MICROORGANISMO CULTIVO
Medio Agar
SIEMBRA POR DISEMINACIÓN Bacillus(Bacteria) Nutritivo
Pichia (levadura)
Medio YPG
SIEMBRA DE AGOTAMIENTO POR
ESTRÍAS
Medio Kin B
Pseudomona(Bacteria)
V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Una vez que ya tenemos los medios de cultivo preparados, hay que inocularlos, y para
ello se necesita:
Medio de cultivo.
Condiciones óptimas de incubación como temperatura, pH, presión, condiciones
atmosféricas (concentración de O2). Estos medios de cultivo son sólidos (cultivos en
reposo), o líquidos (para cultivos en agitación)
Se debe tener en cuenta el tiempo de incubación, para bacterias es de 24 a 48 horas
y para levaduras es hasta más de 48 horas.
El método de siembra por puntura es el más indicado en cuanto a hongos, ya que más
adelante se pudo observar el crecimiento radial.
Con respecto a la incubación de los microorganismos, para bacterias y levaduras la
placa Petri se voltea, en cambio para los hongos la placa Petri no se voltea.
VI. CONCLUSIONES
Podemos concluir a partir de los conocimientos adquiridos en esta experiencia que los
procesos de desinfección, esterilización y demás son importantísimos en la
microbiología ya que son la puerta para la siembra y aislamiento de colonias de
microorganismos.
Para realizar esta práctica tenemos que tener en cuenta que para cada
microorganismo existe un medio en particular donde está se puede desarrollar.
El objetivo principal de esta práctica, adquirir habilidades necesarias para realizar las
principales técnicas de siembra, ha sido cumplido de forma exitosa.
Para el método por estriamiento se necesita mucha técnica en cuanto a la
manipulación de la placa Petri y el asa de siembra en simultáneo.
VII. RECOMENDACIONES
Se recomienda, antes de cualquier uso de laboratorio, utilizar los métodos de asepsia
con el fin de no contaminar las muestras.
Se recomienda, al momento de hacer la respectiva siembra, no alejarse de la flama
que nos proporciona el mechero bunsen, con la finalidad de mantener la muestra
alejada y aislada de otros microorganismos.
Se recomienda, en todo momento, utilizar guantes y mascarillas para no contaminar
la muestra.
VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Existen otros tipos de cultivo aparte del monoxenico, de acuerdo al número de
microorganismos?
De acuerdo al número de microorganismos existen:
a) Cultivo Axénico: Cultivo de una sola especie no contaminado ni asociado
con algún otro organismo viviente.
b) Cultivo Monoxénico: Cultivo que contiene una especie que crece en
presencia de otra especie.
c) Cultivo mixto: Existen muchas y diferentes especies de forma conjunta.
2. ¿Cuáles son otros tipos de Crioprotectores?
El método de siembra utilizado dependerá del organismo que se quiere aislar, por
ejemplo si se quiere aislar bacterias, se utiliza mayormente el método de siembra de
placa estriada. Si se quiere cultivar hongos utilizará el método de siembra por puntura
en placa, donde se utiliza un tubo de ensayo estéril con medio de cultivo semisólido.
IX. BIBLIOGRAFÍA
United States Department of Agriculture (National Agriculture Library)
Pérez, María.2004.Laboratorio Microbiología General.1ra edición. Universidad
Autónoma Metropolitana.México.pp.36-40
Montoya, I.O. (1999).Manual de Microbiología. Universidad Nacional de Colombia.