UNIVERSIDAD DE LA HABANA

FACULTAD DE QUÍMICA

DESARROLLO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE

GIBERELINAS Y AUXINAS EN CALDOS DE FERMENTACIÓN

Tesis para optar por el título de Maestro en Química Analítica

Autor: Lic. Grolamys Castillo Portela

Tutor: Dra. Georgina Michelena Álvarez

Dr. Víctor L. González Canavaciolo

Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA)

Ciudad de la Habana

2004
Con todo amor y cariño, a mi hijo Leober
 INDICE

AGRADECIMIENTOS
RESUMEN
INTRODUCCIÓN 1

CAPÍTULO 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3

1.1 Generalidades sobre Fitohormonas y Reguladores del Crecimiento Vegetal 3
1.1.1 Antecedentes históricos 4

1.1.2 Vías de Obtención 5

1.1.3 Aislamiento y Purificación 7

1.1.4 Métodos biológicos y físico-químicos de análisis 9

1.2 Giberelinas 10

1.2.1 Estructura y Propiedades físico-químicas 10

1.2.2 Métodos físico-químicos de análisis 11

1.3 Auxinas 18

1.3.1 Estructura y Propiedades físico-químicas 18

1.3.2 Métodos físico-químicos de análisis 18

1.4 Estudio de Fiabilidad de los Métodos Analíticos 26

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS 29

2.1. Material biológico y condiciones de cultivo 29

2.1.1. Microorganismos 29
2.1.2 Medios de cultivo 29
2.1.3 Condiciones de Fermentación 29

2.2 Reactivos y Materiales 30

2.2.1 Productos químicos analíticos 30

2.2.2 Patrones 30
2.2.3 Disoluciones 30
2.2.4 Equipos 31
2.3 Procesamiento de Resultados 32
2.4 Procedimientos 32
2.4.1 Preparación de muestra 32
2.4.2 Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) 32
A. Giberelinas 32
B. Auxinas 33
2.4.3 Cromatografía de Capa Fina (CCF) 33
A. Giberelinas 33
B. Auxinas 34
2.5 Estudio de Fiabilidad 34

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 37

3.1 Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) 37
3.1.1 Desarrollo de métodos para la determinación de Giberelinas 37
3.1.2 Desarrollo de métodos para la determinación de Auxinas 43
3.2 Cromatografía de Capa Fina (CCF) 50
3.2.1 Método para la determinación de Giberelinas 50
3.2.2 Método para la determinación de Auxinas 52

CONCLUSIONES 54

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 AGRADECIMIENTOS

A mis tutores Dra. Georgina Michelena Álvarez y el Dr. Víctor González, a la primera por
mi introducción en el mundo de las fitohormonas y al segundo, por ser mi guía en mi
formación como profesional de la Analítica.
A todos los compañeros del Departamento de Química Analítica del ICIDCA que de alguna
manera u otra contribuyeron con la tesis. En especial, a los compañeros del laboratorio de
CLAR, donde se desarrolló este trabajo.
A los compañeros del área de Biotecnología que trabajaron junto conmigo en esta
temática.
A los compañeros del Consejo Científico Ramal de Química por sus oportunas
recomendaciones.
Al claustro de profesores de Química Analítica, por impartirnos los conocimientos
necesarios y por sus sugerencias en la presentación de la tesis.
A los Dres. Manuel Acosta y José Sánchez Bravo, de la Universidad de Murcia, por
aceptarme en su laboratorio y facilitarme los patrones de Indoles y Ácido jasmónico, así
como literatura actualizada de la temática. A los amigos del labo, que me brindaron toda la
ayuda posible en mi trabajo y que han colaborado y se han mantenido al tanto de mi
maestría, a pesar de la distancia. Muy en especial a Antonio y Rocío, por siempre estar en
disposición de ayudarme.
A mi familia en general.
A mis padres, a quienes agradezco eternamente todo el apoyo que me brindaron con mi
hijo. A mi esposo e hijo, por estar siempre a mi lado. A mis hermanitas Marisel y Coralia,
por sus recomendaciones y preocupación, a pesar de la lejanía.
A todos los que de alguna manera contribuyeron para que esta tesis se hiciera realidad,
Muchas gracias.
 RESUMEN

Las fitohormonas son sustancias endógenas bioactivas, presentes en las plantas, que
controlan diversos procesos del metabolismo vegetal, y que son sintetizadas por las
mismas en concentraciones fisiológicas según sus requerimientos metabólicos. Dentro de
este grupo de sustancias se encuentran las Giberelinas y Auxinas, que son ampliamente
usadas en la agricultura por los diversos efectos beneficiosos que provocan en una gran
variedad de cultivos. La síntesis biotecnológica de estos compuestos presenta diversas
ventajas, entre las cuales se distingue su mayor compatibilidad con el término de
Agricultura sostenible.

Con el desarrollo de tecnologías nacionales para la producción tanto de Giberelinas (GAs)

como de Auxinas, surgió la necesidad de implementar métodos analíticos para la
determinación de estas sustancias que sirvieran de herramientas analíticas para el
seguimiento y optimización de la fermentación, y también para la evaluación del producto
final que se aplica en los cultivos.

Con el desarrollo de este trabajo se logró la implementación de métodos fiables para la

determinación por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) de las GAs: GA3, GA4
y GA7; y para la determinación, dentro del grupo de las Auxinas, del Ácido Indol Acético
(AIA), en caldos obtenidos por vía fermentativa de determinados microorganismos. En
ambos casos se establecieron las condiciones cromatográficas adecuadas para la
separación, y como parte del estudio de fiabilidad, se demostró que estos métodos
cumplen con los parámetros de linealidad, repetibilidad, precisión intermedia y exactitud
exigidos por la Norma Cubana para Ensayos Químicos del 2001. También se calcularon
los límites de detección y cuantificación. Se implementaron además métodos cualitativos
por Cromatografía de Capa Fina (CCF) para la determinación de Giberelinas y Auxinas,
los que pueden ser utilizados como métodos de rutina en el seguimiento de la
fermentación.
INTRODUCCIÓN
 INTRODUCCIÓN

Las fitohormonas, entre las cuales se encuentran las giberelinas, auxinas, citocininas, el
ácido abscísico y el etileno, son sustancias endógenas bioactivas sintetizadas por las
plantas en concentraciones fisiológicas, con el fin de controlar diversos procesos
metabólicos. De estos tipos de fitohormonas, dos de los más importantes por su
incidencia en el rendimiento y calidad de las cosechas son las Giberelinas (GAs) y las
Auxinas. Las primeras influyen en diversos procesos como: germinación de semillas,
floración y espigamiento, cuajado de los frutos y comportamiento poscosecha de los
mismos, siendo la más importante la GA3 o Ácido Giberélico. Las auxinas, por su parte,
se caracterizan por inducir alargamiento celular, división celular, e iniciación de la raíz,
siendo el Ácido Indolacético (AIA) el miembro más conocido de este grupo.
La síntesis química de estos compuestos no ha resultado viable y sólo se ha estudiado
desde un punto de vista académico, pues involucra varias etapas y reactivos caros, lo
cual no hace rentable su implementación. Sin embargo, el hecho de que varios
microorganismos como bacterias y hongos sean capaces de sintetizar estas fitohormonas
ha propiciado su síntesis biotecnológica, la cual presenta, entre otras ventajas: el ser un
proceso más económico, una mayor compatibilidad con el término de agricultura
sostenible, y el empleo de sustancias de origen biológico, inocuas al hombre; todo lo cual
redunda en el incremento de la productividad y la calidad de las cosechas en las que son
aplicados estos compuestos.
La comunidad científica internacional presta atención creciente a la implementación de
nuevas estrategias para el desarrollo agrícola que apoyen el concepto de agricultura
sostenible, siendo el empleo de fitohormonas de origen microbiano una alternativa
compatible con este concepto, debido a su menor impacto en el medio ambiente y a que
su obtención a escala industrial resulta económicamente más atractiva. En este sentido, y
tomando en cuenta los altos precios de estos productos en el mercado internacional y
las limitaciones para acceder al mismo que nos impone el bloqueo económico, el ICIDCA
ha realizado investigaciones encaminadas a desarrollar tecnologías de producción de
fitohormonas.

1
Como parte del desarrollo de los proyectos nacionales: "Desarrollo de una tecnología
para la producción de giberelinas" y "Desarrollo tecnológico y validación de
Reguladores del Crecimiento Vegetal obtenidos por vía biotecnológica" surgió la
necesidad de implementar métodos analíticos fiables para la determinación de estas
fitohormonas, los que pudieran ser utilizados como herramientas en el seguimiento
cinético y optimización de la fermentación, así como en la evaluación de los productos
finales: caldos fermentados a partir de los microorganismos.
Diversas técnicas como la Cromatografía de Capa Fina (CCF), la Cromatografía de
Gases (CG) y la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) han sido utilizadas
para la determinación de fitohormonas; sin embargo, no se encontraron métodos
establecidos por ninguna otra institución nacional para el análisis de este tipo de
sustancias y la literatura encontrada sobre el tema abarca fundamentalmente la
determinación de fitohormonas endógenas en plantas. Dichos métodos de análisis
resultan imprescindibles para la aplicación de los productos finales en los cultivos y para
la regulación de los efectos en las plantas; además de constituir una exigencia para la
presentación de los Registros de los productos finalmente obtenidos: IC-GIB y BIOINDOL.

Considerando los aspectos anteriormente planteados se realizó este trabajo con los
siguientes objetivos:

Objetivo general.
Implementar métodos analíticos que permitan la determinación fiable de giberelinas y
auxinas utilizando técnicas cromatográficas.

Objetivos específicos.
• Estudiar el procedimiento de separación de giberelinas y auxinas por Cromatografía
Líquida de Alta Resolución (CLAR).
• Estudiar el procedimiento de separación de giberelinas y auxinas por Cromatografía de
Capa Fina (CCF).

2
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Capítulo 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1 Generalidades sobre Fitohormonas y Reguladores del Crecimiento Vegetal

La idea de que el desarrollo vegetal es influido por sustancias químicas especiales de las
plantas no es nueva. Hace unos 100 años, el famoso botánico alemán Julius Von Sachs
sugirió que en las plantas se presentan sustancias específicas para la formación de
órganos. Debido a las concentraciones hormonales tan bajas en plantas, la primera
hormona que se descubrió fue el ácido indolacético y no se identificó hasta la década de
1930, e incluso entonces se purificó a partir de la orina. Como era capaz de provocar
muchas respuestas diferentes cuando se administraba de manera exógena a las plantas,
muchos consideraron que era la única hormona vegetal, noción descartada cuando se
descubrieron los numerosos efectos de las giberelinas en la década de 1950 (Salisbury y
Ross, 1994).

Los fisiologistas de plantas han reconocido muchos compuestos con características que
permiten regular el crecimiento de las plantas y su desarrollo y los han identificado como
Reguladores del Crecimiento Vegetal (RCV). Estos RCV son sustancias orgánicas que
influyen en los procesos fisiológicos de las plantas a muy bajas concentraciones. Cuando
se producen estas sustancias por las plantas se les denomina “Fitohormonas” mientras
que el término de RCV incluye un gran número de compuestos sintéticos y encontrados
naturalmente.

Nickell (1982) definió los RCV como: “Compuestos naturales o sintéticos que son
aplicados directamente a una planta “blanco” para alterar sus procesos de la vida o su
estructura para mejorar su calidad, aun los rendimientos, o facilitar la cosecha”. La
mayoría de los especialistas en fisiología vegetal aceptan una definición que es similar a la
elaborada para hormonas animales. Una hormona vegetal es un compuesto orgánico
que se sintetiza en alguna parte de una planta y que se transloca a otra parte, en donde
concentraciones muy bajas causan una respuesta fisiológica.

En la mayoría de la literatura, ambos términos: RCV y Fitohormonas han sido usados

indistintamente, particularmente cuando se refieren a los cinco grupos de fitohormonas
endógenas establecidos actualmente, los cuales incluyen auxinas, giberelinas, citocininas,
3
ácido abscísico y etileno. Las sustancias biológicamente activas producidas por la
microbiota del suelo también son consideradas como RCV.

A pesar de que las plantas son capaces de sintetizar fitohormonas, ellas también pueden
responder a aplicaciones exógenas de las mismas, durante ciertas fases del crecimiento y
bajo ciertas condiciones de cultivo. Los efectos de las fitohormonas han sido esclarecidos
grandemente a partir de aplicaciones exógenas. Sin embargo, se debe enfatizar que las
fitohormonas no actúan solas, sino que la condición final del crecimiento de la planta y su
desarrollo representa el efecto neto del balance hormonal.

Aunque existen muchas publicaciones referente a las fitohormonas como metabolitos

endógenos de las plantas, la producción microbial de las mismas y sus efectos posteriores
en el crecimiento vegetal han recibido poca atención. Algunos autores han revisado la
producción microbial de determinadas fitohormonas como las auxinas, giberelinas,
citocininas y etileno (Kumar y Lonsane,1989, Lonsane y Kumar, 1992, Nieto y
Frankerberger, 1990, Arshad y Frankerberger, 1992, Fukuda y Ogawa,1991).

1.1.1 Antecedentes históricos.

El descubrimiento de las auxinas data de la fecha de los experimentos sobre fototropismo

conducidos por Darwin en 1880 y publicados en su libro “El poder del movimiento en las
plantas”. Su trabajo sobre la respuesta fototrópica de los coleóptilos indicaron la
transferencia de señal desde la punta a la parte baja de la planta. Esta señal fue
identificada posteriormente como “auxina”. El término auxina proviene del griego auxein,
que significa incrementar y fue utilizado por primera vez por Fritz Went, estudiante
graduado en los Países Bajos en 1926, el cual descubrió que era posible que un
compuesto no identificado causara la curvatura de coleóptilos de avena hacia la luz. La
demostración crítica fue que una sustancia presente en las puntas podía difundirse de
éstas hasta una placa delgada de agar. La actividad de esta auxina se detectó mediante
la curvatura del coleóptilo causada por la facilitación de la elongación en el lado donde se
colocó la placa de agar (Salisbury y Ross, 1994).

En la actualidad se sabe que la auxina descubierta por Went es el ácido indolacético (AIA)
y algunos especialistas en fisiología vegetal aún hoy consideran sinónimos a los términos,

4
AIA y auxina. El AIA fue aislado por primera vez a partir de una planta por Haagen–Smith
y col. en 1942 y después fue confirmado por Berger y Avery en 1944. No fue hasta 1967
que el AIA se aisló y se caracterizó a partir de una segunda fuente de planta, Phaseolus
mungo (Franhenberger y Arshad, 1995).

El descubrimiento de las giberelinas (GAs) se remonta a la búsqueda de las causas de la

fitopatología del arroz conocido como “Bakanae”, ampliamente extendida en Asia en el
siglo pasado. Ya en el año 1898, S. Hori describió un hongo imperfecto aislado a partir de
plantas de arroz con crecimiento excesivo con respecto a las plantas no afectadas.
Wollem-Weber en esos mismos años designa al hongo como Gibberella fujikuroi en su
estado perfecto (Bruckner y Blechschmidt, 1991). Kurosawa en 1926 identifica el principio
activo responsable de la patología en los filtrados de los cultivos del hongo; el cual fue
caracterizado por Yabuta en 1935 y denominado giberelina. Este mismo autor reporta en
trabajos posteriores, la cristalización de dos compuestos activos, giberelina A y B y
algunas de sus propiedades biológicas (Phinney, 1983).

A partir de 1950 distintos grupos de investigadores en Inglaterra, Estados Unidos y Japón,

trabajaron al unísono en la elucidación estructural de las GAs. Los resultados obtenidos
hicieron suponer que las GAs podían constituir una familia de sustancias y que la
composición de las mismas podía variar según el cultivo y la especie del hongo que se
tratara (Kumar y Lonsane, 1989). Múltiples investigaciones sobre los efectos biológicos de
estas sustancias condujeron a la idea de que las GAs podían ser participantes del
metabolismo endógeno de las plantas (Taiz y Zeiger, 1991).

1.1.2 Vías de Obtención

Existen tres vías principales para la obtención de las fitohormonas: la extracción a partir
de plantas, la síntesis química y la síntesis biotecnológica. De forma general, los tejidos
vegetales contienen cantidades fisiológicas de las fitohormonas, es decir sólo la cantidad
indispensable para su metabolismo, las cuales son cantidades muy pequeñas. En el caso
de las GAs están presente en base a peso fresco, en el orden de 1 a 1000 ng/g y las
auxinas, específicamente el AIA está presente en niveles de 1 a 100 ng/g.

5
El procedimiento utilizado para la extracción a partir de plantas involucra la maceración del
tejido con posterior extracción con disolventes y partición de las fitohormonas por
extracción líquido-líquido. Considerando los niveles tan bajos presentes en las plantas,
este método no es factible para una producción a escala comercial, ya que se hace
económicamente no rentable. La síntesis química, tanto de las GAs como de las Auxinas,
conlleva sintetizar distintos compuestos intermediarios y un gran número de reacciones,
en ocasiones con bajos rendimientos y empleando reactivos caros, por lo cual este
método no ha sido empleado para producciones comerciales, siendo sólo de interés
académico (Kumar y Lonsane, 1989).

La biosíntesis microbiana se basa en la capacidad de varios microorganismos tanto

bacterias, levaduras, como variadas especies de hongos para sintetizar fitohormonas. La
fermentación sumergida es el método industrial practicado a escala mundial para la
producción tanto de GAs como Auxinas, que satisface su comercialización a gran escala.
El hongo Gibberella fujikuroi (estado perfecto del Fusarium moniliforme) a partir de cuyos
filtrados fueron aisladas por primera vez las GAs, sigue siendo el microorganismo por
elección para la producción a gran escala, del ácido giberélico (GA3). En la fermentación
específica de la G. fujikuroi normalmente se produce una mezcla de GAs entre las que
predomina la GA3 y le siguen las GA4 y GA7. También es conocido que otros compuestos
concomitantes de diversas características químicas son producidos (Bruckner, 1992).

Varios microorganismos como Rhizobium, Azotobacter, Azospirillun y algas se han

reportado como productores de auxinas. Estudios ”in vitro” han demostrado que se
producen cantidades pequeñas de AIA en la ausencia de un precursor fisiológico. Sin
embargo, la utilización del triptófano ó de triptamina como precursor permite que se
excreten cantidades mucho mayores de AIA y sus derivados. (Franhenberger y Arshad,
1995).

Un aumento de la productividad y el rendimiento de la fermentación puede lograrse por

optimización de parámetros del proceso fermentativo, condiciones de cultivo,
características de los medios nutrientes y con el estudio de diversas cepas productoras.

6
1.1.3 Aislamiento y Purificación

Durante la fermentación, las fitohormonas son secretadas al medio de cultivo. Antes del
aislamiento de las mismas, el micelio debe ser separado del medio por filtración o
centrifugación. Las fitohormonas pueden ser separadas del sobrenadante por adsorción
sobre carbón activado, por varios tipos de resinas y sistemas de intercambio iónico o por
extracción líquido-líquido.

La cromatografía de columna convencional se ha utilizado fundamentalmente para

eliminar pigmentos y compuestos fenólicos, siendo las columnas de Polivinilpirrolidona
(PVP) las más usadas para estos fines. Las columnas de Sephadex LH-20 han sido
usadas con un mecanismo de partición en fase invertida usando etanol acuoso al 35%.
También se han utilizado columnas de Intercambio Iónico en los procedimientos de
limpieza de las muestras. La cromatografía de Adsorción con carbón, celite ó silica gel
ayuda también a la purificación. La exclusión ha permitido separar muchos de los RCV a
partir de plantas sobre la base de una separación en función del tamaño molecular
(Brenner, 1981).

La adsorción sobre carbón activado fue el primer método para la extracción de GA3
desarrollado por investigadores japoneses. Después la elución de las GAs se lleva a
cabo por percolación con disolventes miscibles en agua (ej: metanol y acetona). Sin
embargo este método tiene algunas desventajas como el requerimiento de grandes
cantidades de solventes, bajo recobrado, el carbón no es regenerable, pobre purificación,
etc. Por lo cual requiere de etapas posteriores de purificación con sistemas de buffer y
acetato de etilo (Flores, 1997).

La posibilidad para el recobrado de GAs mediante purificación sobre resinas de

intercambio iónico tanto catiónicas como aniónicas implica la posterior extracción y
concentración de estas fracciones con acetato de etilo, lo que permite obtener cristales
con más de 70 % de GAs, con una eficiencia de extracción cercana al 100%. Sin embargo
la aplicación de esta técnica requiere de grandes cantidades de resinas, ya que además
de las GAs, numerosas impurezas también son adsorbidas y el anillo lactónico de la

7
molécula puede ser destruido, tanto en la adsorción como en la desorción, con la
consiguiente pérdida de la actividad biológica.

La recuperación de las GAs por extracción líquido-líquido se desarrolla empleando

disolventes inmiscibles en agua, tales como acetato de etilo y acetona, acidificados a pH
entre 2 y 4. El recobrado de las GAs a partir del disolvente se basa en la relativa
solubilidad de las GAs libres en la fase orgánica y de sus sales en la fase acuosa. La
eficiencia de extracción puede variar entre el 40 y 100%. La principal desventaja de esta
técnica es la gran cantidad de disolventes que requiere (Pozo y Pérez, 1986a).

La literatura disponible sobre la extracción de indoles está planteada casi exclusivamente

para el AIA. Se utilizan homogenizadores para macerar los tejidos vegetales en un exceso
de solvente frío. El tiempo varía entre laboratorios y el homogenato se filtra
aproximadamente 1h después de la maceración. El tejido se reextrae por 1h más, antes
de ser filtrado de nuevo. La filtración a través de una capa de polvo de celulosa se
considera efectiva y rápida. En los primeros estudios el éter dietílico fue el extractante
común. Actualmente la acetona, el metanol y el etanol son los extractantes más usados
comúnmente para el AIA y sus compuestos relacionados, a partir de tejidos vegetales
(Brenner, 1981). Un problema potencial cuando se usa metanol ó etanol es el riesgo de
una esterificación parcial de los ácidos carboxílicos (Allen y col., 1982), aunque según la
experiencia de Sandberg (1987) esto no constituyen un problema significativo.

Muchos indoles, incluyendo el AIA, son compuestos frágiles que experimentan oxidación
no enzimática en presencia de luz, oxígeno ó peroxidasas. Sin embargo la degradación de
los indoles en general es mínima con la presencia de un antioxidante como el
Hidroxitolueno butilado (BHT) ó el Dietilditiocarbamato de sodio. Si se suministra el
antioxidante a través de la secuencia del análisis y se tiene cuidado en evitar altas
temperaturas e intensidades de luz, la formación espontánea de AIA a partir de otros
indoles se restringe grandemente y también hay una reducción marcada de la
descomposición del AIA, conllevando a la formación de Indol-3-etanol, Indol-3-metanol y
Ácido 3-Indol carboxílico (Sandberg, 1987).

8
La cromatografía de columna de PVP también ha sido utilizada para la purificación de
auxinas. Su popularidad se debe a las altas recuperaciones que se logran y a que es una
técnica simple y flexible, donde el tamaño de la columna se puede ajustar fácilmente al
tamaño de la muestra. Esta columna permite la retención de los compuestos fenólicos por
enlace de H a bajos pH. La cromatografía de Intercambio Iónico se ha utilizado
efectivamente en la purificación de compuestos indólicos y sus derivados. También se ha
reportado el uso de Sephadex LH-20, para purificar AIA y compuestos relacionados. De
cualquier manera los costos de los procedimientos de recobrado, descritos anteriormente,
son mucho más altos que los del proceso de fermentación y ésta es la principal razón del
relativo alto precio en el mercado de las fitohormonas (Sandberg, 1987).

1.1.4 Métodos biológicos y físico-químicos de análisis

La detección primaria de cualquier nueva hormona vegetal depende del bioensayo. La

elección del bioensayo adecuado puede ser problemática, ya que idealmente debe
responder cuantitativamente a todos los miembros de un cierto grupo de fitohormonas,
ser altamente selectivo hacia un grupo particular de compuestos, tener alta sensibilidad y
no ser inhibido por otros compuestos del extracto vegetal. Realmente nunca se logran
estas condiciones en la práctica ya que tienen limitada selectividad y sensibilidad. La
presencia de inhibidores en la mayoría de los extractos de plantas y la naturaleza
logarítmica de la respuesta de la mayoría, lo hacen muy inexacto e impreciso en las
mediciones. Las limitaciones cuantitativas de estos bioensayos han constituido un
estímulo para el desarrollo de los métodos físico-químicos de análisis.

Brenner (1981) planteó que los bioensayos han sido y continuarán siendo de inestimable
valor para la detección de material activo biológicamente con actividad reguladora,
fundamentalmente cuando los compuestos de interés no están químicamente
caracterizados. Sin embargo, cuando se quiere identificar y cuantificar reguladores ya
químicamente caracterizados, los procedimientos físico-químicos son superiores a los
bioensayos.

9
Estos métodos físico-químicos ofrecen mayor especificidad que los bioensayos,
permitiendo la identificación de un compuesto específico con mayor sensibilidad, mayor
precisión, y en un tiempo de análisis más corto. Por tanto, permiten analizar un mayor
número de muestras. En general, el uso de estos métodos y la combinación de algunos de
ellos permite identificar, cuantificar y caracterizar las fitohormonas; por lo que algunos de
ellos constituyen métodos de rutina utilizados en las fermentaciones industriales. Entre
estos métodos tenemos los métodos espectrofotométricos y fluorimétricos que pueden ser
utilizados para la determinación tanto de las GAs como de las Auxinas totales presentes
en la muestra, pero que no permiten la determinación específica de cada uno de ellos por
separado. Sin embargo, los métodos cromatográficos constituyen una vía para la
separación y cuantificación de estas sustancias.

1.2 Giberelinas

1.2.1 Estructura y Propiedades físico-químicas.

Las GAs son una familia de ácidos diterpenoides relacionados estructuralmente por un
sistema de anillos tetracíclicos denominado esqueleto ent-giberelano o gibánico,
caracterizado por presentar un grupo carboxilo en el anillo B, y un enlace lactónico en el
anillo A y difieren fundamentalmente en la presencia y/o posición de las insaturaciones de
este anillo , así como en la cantidad y posición de los grupos hidroxilos y carboxilos, y en
la presencia o no del anillo lactónico (Kumar y Lonsane, 1989; Crozier, 1983). Las GAs se
clasifican en dos grupos: giberelinas C20 que poseen 20 átomos de carbono y las
giberelinas C19 que poseen 19 átomos de carbono, por pérdida biogenética del carbono 20
y presentan la mayor actividad biológica, encontrándose entre ellas las GAs A1, A3, A4 y
A7 (Figura 1).

10
 ES QUELETO GIBÁNICO

1 O 11
2 A 12
19 CO 10 9
B C
3 8 13 OH
5 6 14
HO
4 7 1 5 D 16
COOH 17

Tipo GA1 Ti po G A3

O R1 O H
H
R1
CO CO
R2 R2
HO HO
H H CH2
CH C OO H
CO O H

GA1: R1=H R2=OH GA4: R1=R2=H GA3: R1=H R2=OH GA7: R1=R2=H

Figura 1: Esqueleto Gibánico y Estructura de las giberelinas GA1, GA3, GA4 y GA7

Entre las GAs la más importante es la A3 o ácido giberélico de fórmula global C19H22O6 y
peso molecular de 346 g/mol, caracterizado químicamente como un ácido dihidroxi-γ-
lactónico tetracarbocíclico. Es un sólido cristalino que funde con descomposición entre
233-235 oC. Es ligeramente soluble en agua y éter, moderadamente soluble en acetato de
etilo y soluble en acetona, metanol y álcalis diluidos. Es un ácido monobásico de pK 4.0 y
rotación óptica de + 86 o en etanol (Merck Index, 1989).

Por su diversidad química, las GAs cubren un amplio rango de polaridades, por lo que
difieren considerablemente en sus coeficientes de partición y su solubilidad; según la
cantidad y distribución de grupos hidroxilos y carboxilos en la molécula. Debido al
creciente número de GAs reportadas y para evitar el caos en la clasificación de las
mismas, a partir de 1968 se adoptó internacionalmente la nomenclatura Ax, para
nombrarlas, siendo el número del subíndice una indicación del momento de su
descubrimiento y no implica ninguna similitud química o relación metabólica entre las GAs
con números consecutivos (Pozo y Pérez, 1986a).

11
1.2.2 Métodos físico-químicos de análisis

Entre los métodos físico-químicos empleados para las GAs se encuentran los
espectofotométricos, los fluorimétricos y los cromatográficos. Los métodos
espectrofotométricos se basan en la conversión del GA3 en ácido giberelénico por acción
de ácidos fuertes y medición de la adsorción a 254 nm. También se emplea la reacción de
GAs con ácido fosfomolíbdico, en condiciones específicas y medición de la adsorción a
650 nm. Es posible además la medición en el espectro visible de un compuesto de color
verde formado por GA3 y el complejo de fósforo-wolframio-molibdeno. Los métodos
fluorimétricos se basan en la conversión de los ácidos giberélico y giberelénico en un
compuesto fluorógeno, por reacción con ácido sulfúrico y medición de la excitación a λ de
405 y de la emisión de fluorescencia a λ 455. Este método puede requerir etapas de
purificación para corregir la presencia de ácido giberelénico o proteínas (Kumar y
Lonsane, 1989). Estos métodos como se planteó anteriormente, presentan la limitación de
no permitir la determinación individual de los componentes de una mezcla.

Métodos cromatográficos:

La cromatografia de papel fue uno de los primeros métodos usados para la identificación
de GAs, pero presenta limitaciones por la falta de reproducibilidad en los resultados. La
cromatografía en columna se considera un método efectivo para la purificación de
giberelinas con fines analíticos y se emplea generalmente de forma combinada con otros
métodos de identificación y cuantificación (Ortega y Castillo, 1999).

Cromatografia de Capa Fina (CCF )

El progreso alcanzado durante la década del 60 en la separación e identificación de

giberelinas estuvo relacionado con el desarrollo de la cromatografía sobre capa delgada.
Esta técnica puede ser aplicada con fines preparativos, pero ha sido establecida como
procedimiento más usual para fines analíticos (Pozo, 1986b). Este método fue muy útil al
inicio de las investigaciones en este campo, ya que permitió la separación de varias GAs,
debido a la posibilidad de emplear diferentes sistemas de disolventes y agentes
reveladores, usando generalmente la sílica gel como soporte.

12
Por lo general en CCF se utiliza silicagel G, aunque algunos autores señalan el empleo de
silicagel H, silicagel K, y silicagel F. Algunas giberelinas, como los pares de isómeros de
doble enlace, presentan dificultad para ser resueltas, por ejemplo: el par A1 - A3 y el par A4
-A7, ya que muestran valores de Rf similares con la mayoría de los sistemas de
disolventes. Las giberelinas, después de cromatografiadas pueden ser detectadas por su
fluorescencia y color frente a un reactivo adecuado. El más usado es el ácido sulfúrico
concentrado (solución 5% en etanol) y posterior calentamiento a 120°C durante 10 mins.
Los colores producidos por nueve giberelinas frente algunos reactivos se reportaron por
Paleg en 1965. En la tabla I se muestra una relación de algunos sistemas de disolventes
usados en la separación e identificación de giberelinas (Ortega y Castillo, 1999).

Tabla I: Sistemas de CCF utilizados en la separación de giberelinas.

FASE ESTACIONARIA SISTEMA DE DISOLVENTES

Cloroformo/Acetato de etilo/Acido acético (80:20:1)
Sílica gel K
n-Butanol/Hidróxido de amonio 3 mol/l (5:1)
Eter diisopropílico/Acido acético (95:5)
Sílica gel G
Benceno/n- Butanol/ Acido acético (80:15:5)

Benceno/n- Butanol/ Acido acético (70:25:5)

Isopropanol/Agua (4:1)

Isopropanol/ Hidróxido de amonio 4.5 mol/l (3:1)

Eter diisopropílico/ Acido Acético (98:2)

Eter/ Benceno (4:1)

Acetato de etilo/Cloroformo/Acido Acético (15:1:1)

Benceno/Acetona/ Acido Acético (13: 6:1)

Benceno/éter (100:35)

Cloroformo/Acetato de etilo/Acido acético (5:4:1)

13
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR)

La cromatografía líquida a alta resolución (CLAR) ha encontrado una amplia aplicación en

el campo del análisis de GAs. Múltiples técnicas han sido desarrolladas, tanto a régimen
isocrático como empleando gradiente, en función del grupo de GAs a separar, siendo la
fase invertida, unido a la técnica de supresión iónica, el modo de separación más utilizado.
La misma permite obtener resultados altamente confiables, por el alto grado de resolución
que se logra, y permite la determinación tanto de las GAs libres como de sus derivados
(Hansen y col, 1992; Lin y col 1991; Poling, 1991; Johnson y Coolbaugh, 1990).

CLAR de fase invertida

Para esta técnica se ha reportado el empleo de diferentes tipos de columnas C18 como
son: Zorbax BP-ODS, Versapak C 18, Hypersil ODS, Spherisorb S5ODS, Ultrasphere
ODS, μ-Bondapak C18, Radial-Pak-A, etc. La literatura reporta el uso de técnicas
isocráticas y de gradiente para la separación de los isómeros de doble enlace GA1/GA3,
GA4/GA7 y GA5/GA20, utilizando como fases móviles, diferentes relaciones metanol-
H3PO4 (0.01 mol/L ó 0,1%) ó metanol-agua con 0,05 % de HAc en las técnicas
isocráticas. Las técnicas isocráticas para la determinación de GAs libres permiten la
separación hasta de 10 giberelinas (Lin y Heftmann, 1981). Con respecto a las técnicas de
gradiente se han reportado gradientes de elución metanol-H3PO4 (Anderson, 1988), de
acetonitrilo (Roebeng, 1985) y de metanol (Barendse, 1980 y Johnson, 1990).

Uno de los problemas para el uso de la CLAR en el análisis de las GAs es la detección de
estos compuestos. Diversos autores (Lin y Stafford, 1988; Jensen y col., 1986) eligen la
derivatización por esterificación del C-7 y la lectura de los ésteres resultantes a una
longitud de onda (λ) de 254 nm. Lin y Stafford (1988) reportaron los tiempos de retención
de 23 ésteres metílicos de las GAs. La separación de 20 ésteres glucosílicos y
glucósidos de las GAs en columna Supelcosil LC-18 y con técnicas isocráticas con varias
relaciones de MeOH-H3PO4 (a pH=3) ha sido reportada por Jensen y col. (1986). Sin
embargo, otros plantean la detección de las GAs libres a 203 ó 206 nm (Barendse, 1980 y
Lin y Heftmann, 1981) sin problema de interferencias de la muestra.

14
CLAR de fase normal

La CLAR de fase normal en silica no modificada ha sido poco usada para la separación
de GAs debido a la baja probabilidad de recuperación a causa de la adsorción
irreversible, fundamentalmente de los compuestos más polares y a la baja resolución.
No obstante, algunos autores como Lin y Heftmann (1981) han empleado esta fase,
definiendo el comportamiento de 10 GAs al emplear una columna Zorbax BP-SIL y
elución con n-hexano/etanol/ácido acético (93:7:0.05). Lin y Stafford (1988) plantean el
uso de columna Spherisorb S5W determinando los tiempos de retención de 23 GAs y sus
ésteres metílicos. Las GAs libres fueron eluídas con n-hexano/etanol (90:10) con 0,05%
de HAc, y los ésteres metílicos con n-hexano/etanol (92:8), lográndose la mayor
eficiencia de separación con los ésteres metílicos.

Los ésteres coumaril-metoxílicos de las GAs pueden ser separados en una columna de
silica modificada con un grupo cianopropílico (Hypersil CPS), empleando como fase
móvil 3% de etanol en n-hexano/diclorometano (88:12 ó 80:20) (Crozier, 1982) y
también se reporta su elución isocráticamente en una columna CN nitrilo, con
Diclorometano/n-hexano ó acetato de etilo/n-hexano. Por otra parte, también se ha
reportado el uso de una columna NO2 para separar 12 GAs, el aldehído de la GA12 y
distintos caurenoides mediante un gradiente de n-heptano (saturado a 50% con ácido
fórmico 1 mol/l) a acetato de etilo (con 1% de agua y 0.5% de ácido fórmico) (Ortega y
Castillo, 1999).

Cromatografía Gaseosa (CG)

A partir de los años 60, se produce la aparición y desarrollo de esta cromatografía.

Ikekawa en 1963 introdujo la CG como método de separación e identificación de GAs,
logrando separar mezclas de 6 ésteres metílicos de GAs mediante el empleo de
columnas de 1.5 % de SE-30 (polímero de metil silicona) y 2 % de QF-1 (polímero de
silicona de base alquílica fluorinada). Se han reportado varios métodos que emplean la
CG para la identificación y cuantificación de GAs, siendo necesario un tratamiento previo
de la muestra para obtener derivados volátiles (ésteres metílicos o trimetilsilil éteres). Las
GAs se transforman en sus ésteres metílicos antes de proceder al análisis, lo cual mejora

15
considerablemente sus propiedades cromatográficas y posibilita una mejor resolución.
Las GAs libres son usualmente metiladas con diazometano etéreo, el cual puede
sintetizarse usando un procedimiento a pequeña escala, como el descrito en la literatura
(Ortega y Castillo, 1999).

Además de este proceso, también se efectúa la conversión de las GAs en los

correspondientes derivados trimetilsililados, lo cual permite resoluciones aún
superiores, obteniéndose picos estrechos y tiempos de retención marcadamente
diferentes para los distintos derivados, además permite una mejor detección en CG-MS.
La conversión a éstos últimos es aplicable a la gran mayoría de las GAs, puesto que la
reacción ocurre a expensas de los grupos hidroxilo de la estructura giberelénica,
presentes en una gran parte de éstas. Las GAs hidroxiladas pueden ser convertidas a
trimetilsilil éteres con: N,O-bis-trimetilsililtrifluoracetamida (BSTFA), N-metil-O-trimetil-
sililtrifluoracetamida (MSTFA), Hexametildisilazano-trimetilsililcloruro-piridina (3:1:9)
(Sweeleys Reagent). Se reporta la determinación de ésteres metílicos y éteres trimetilsilil
de los ésteres metílicos de 17 GAs en columnas 2 % QF-1 y SE-33. Para los ésteres
metílicos se mostró una relación entre el tiempo de retención y el número de grupos
hidróxilo, epóxido ó ambos presentes en la molécula.

Las columnas idóneas para el análisis de las GAs y sustancias afines son: QF-1 al 2% y
SE-33 al 2%. Se recomienda también, el uso de XE-60 al 1%, con el fin de separar
ciertos pares de ésteres metílicos como MeA4/MeA7 y MeA5/MeA20. La fase estacionaria
OV-1 (tipo metil silicona) al 3% sobre Chromosorb 70-80 mesh, también se reporta con el
fin de evaluar las GAs presentes en forma de derivados de ésteres metílicos y
trimetilsilil éteres. Existen otras posibilidades en cuanto al empleo de CG para la
determinación de GAs, como la conversión de éstas en sus derivados fluorados, con la
utilización de un detector de captura electrónica y como fases estacionarias: DE-200 al
2% así como SE-30 al 2%. Dicho procedimiento resulta más sensible, exacto y
específico que el que utiliza detector de ionización de llama. Mientras que el nivel de
detección de éste último, está entre 10-2 y 10-1 μg, con el detector de captura
electrónica se detectan GAs en el orden de los picogramos. Sin embargo, el uso de este
detector es más costoso y limitado (Ortega y Castillo, 1999).

16
Métodos Cromatográficos acoplados a Espectrometría de Masas

En 1967 se introdujo el uso de la Cromatografía Gaseosa acoplada a Espectrometría de

Masas (CG-EM) en el análisis de las GAs, con los trabajos reportados por MacMillan y
col. sobre la identificación de las GAs: GA1, GA4, GA5, GA6, GA8 y un isómero de la
GA13, a partir de extractos crudos metilados. Actualmente CG-EM constituye el método
más ampliamente usado para la identificación de las GAs conocidas. Además, es el
método seleccionado para establecer las características de las nuevas GAs aisladas en
pequeñas cantidades de extractos de plantas, cuya identidad se confirma por
comparación con los índices de retención de Kovats (I) y el espectro de masa de
la GA equivalente sintética de estructura conocida. El procedimiento usual en el análisis
de las GAs a partir de extractos consiste en preparar derivados (ésteres metílicos y
trimetilsilil éteres) de muestras anteriormente purificadas (por ejemplo: a partir de grupos
de fracciones después del CLAR).

El Espectrómetro de Masas también puede ser usado para hacer un muestreo de ciertos
iones producidos en el proceso de fragmentación. En la Cromatografía Gaseosa con
Monitoreo del ión seleccionado (CG-MIS), la sensibilidad se incrementa alrededor de 100
veces más que en CG-EM, debido a que se puede hacer un muestreo de cada ión, más
frecuentemente. En CG-EM, el límite de detección de las GAs es del orden de 3 pmol (1
ng) y 30 fmol (10 pg). Mayores sensibilidades pueden lograrse en otros instrumentos;
además se han reportado 50-100 pg en CG-EM y 0.1-1 pg en CG-MIS. El método se usa
para dar cromatogramas de iones, los cuales pueden ser integrados para el análisis
cuantitativo y dar evidencia de la identidad de las GAs presentes en cantidades muy
pequeñas.

El uso de CG-MIS en particular, permite frecuentemente identificar o cuantificar GAs a

partir de muestras que no han sido altamente purificadas. Específicamente para la
mayoría de las GAs hidroxiladas, con derivados que rinden iones moleculares de alta
masa molecular, los cuales es improbable que se contaminen con iones de la
fragmentación de compuestos coeluyentes. Diferentes compilaciones de espectros tanto

17
de los ésteres metílicos como de los derivados trimetilsililados de los mismos, han
sido reportados por diferentes autores (Gaskin, 1991; Ortega y Castillo, 1999).

La introducción reciente de la CLAR acoplada a Masas (CLAR-EM) ha permitido que las

GAs y sus conjugados sean introducidos a MS para su análisis, usualmente a bajas
temperaturas y sin necesidad de derivatizar. Esto constituye una ventaja en especial
para el análisis de conjugados como son los ésteres glucosílicos de las GAs. Diferentes
interfases de CLAR-EM han sido utilizadas para el análisis de las GAs libres y sus
conjugados. En 1992, Murofushi y col. reportaron el empleo de una interfase de
ionización a presión atmosférica para introducir glucósidos y ésteres glucosílicos de las
GAs desde CLAR a EM. La interfase de bombardeo de átomos rápidos para el análisis
de conjugados de GAs, ha sido reportada por Moritz en 1992, lográndose la separación
de los ésteres glucosílicos y glucósidos de las GAs, obteniéndose espectros de masas
completos a partir de inyecciones desde 10 hasta 100 ng del compuesto. Los espectros
de masa obtenidos con esta interfase de otros conjugados de GAs han sido descritos
en la literatura por Voigt en 1985 (Ortega y Castillo, 1999).

1.3 Auxinas

1.3.1 Estructura y Propiedades físico-químicas.

El Indol es el 1-H-benzo pirrol y el átomo de nitrógeno se designa usualmente como la

posición 1 (figura 2), los átomos de carbono del anillo bicíclico han sido enumerados
consecutivamente en contra de las manecillas del reloj y los carbonos de unión de los
anillos son enumerados como 3a y 7a. En el caso del AIA los carbonos de la cadena
lateral son marcados como 1´ y 2´. El ácido indol acético AIA (figura 2), de fórmula global
C10H9NO2 y peso molecular de 175.18 g/mol, está reconocido como la principal auxina de
las plantas superiores. Es un sólido cristalino que funde entre 168 y 170°C. Es ligeramente
soluble en agua o cloroformo, soluble en acetona y éter y muy soluble en etanol. Es un
ácido monobásico de pKa 4.75 (Merck Index, 1989).

18
 AIA
4
3a 3 2´ 1´
5 CH2 COOH

6 1 2
7a N
7 H

Figura 2. Estructura del ácido indolacético (AIA)

Métodos alternativos de enumerar el anillo indólico han sido mostrados en una revisión por
Brown en 1972. La química de los indoles ha sido revisada ampliamente por Sundberg en
1970 y Houlihan en 1972 y 1979 (Sandberg, 1987).

1.3.2 Métodos físico-químicos de análisis

Dentro de estos métodos se encuentran los métodos espectrofotométricos, de los cuales

uno de los más empleados es el colorimétrico conocido como método de Salkowski
reportado por Sen y Leopold en 1954, que se basa en la reacción entre el AIA y los iones
Fe3+ en medio ácido perclórico para dar una coloración violeta Entre los métodos
fluorimétricos, Plieninger y col. en 1964 reportaron un ensayo para el AIA basado en su
reacción con el anhídrido acético para formar 2-metil indol-α-pirona. Este compuesto
fluoresce a 490 nm cuando se excita a 440 nm, permitiendo una detección selectiva en
extractos ácidos de plantas. El procedimiento fue aplicado por primera vez por Stoessl y
Venis en 1970, para la estimación del contenido de AIA en extractos de plantas y ha sido
modificado por otros autores. Debido a que el compuesto fluorescente no es estable, el
producto debe medirse durante el primer minuto después de parada la reacción. Este
ensayo es específico para indoles con la cadena del ácido acético en posición 3. Por lo
cual, si el 5-hidroxi-AIA ó el 4-cloro-AIA están presente en la muestra, habrá una
sobreestimación del AIA presente en la misma. El único modo de eliminar estas posibles
interferencias es mediante una purificación cromatográfica (Sandberg, 1987).

19
Al igual que fue planteado en el acápite de GAs, estos métodos tienen la limitación de que
sólo permiten la determinación del total de los compuestos y no de los componentes
individuales en una mezcla.

Métodos cromatográficos:

Cromatografía de Capa Fina (CCF)

La purificación de los extractos por CCF debe hacerse con cuidado debido a la adsorción
irreversible y daño de los sitios activos, típicamente sobre silica gel, al igual que sucede al
utilizar columnas de adsorción usando medios como silica gel, alúmina o carbón vegetal.
La cromatografía de capa fina, sin embargo, ha sido utilizada exitosamente para la
purificación rápida de AIA (Allen y col. 1982). Esta técnica también ha sido utilizada
ampliamente en el aislamiento de los conjugados de AIA (Cohen, 1982 y Lacan, 1985). La
práctica normal para detectar supuestos indoles se basa en los colores característicos que
desarrollan después de asperjar con reactivo de Salkowski (Ehmann, 1977). La Tabla II
muestra diferentes sistemas de fase móvil empleadas para este tipo de determinación.

Tabla II: Sistemas de CCF utilizados en la separación de auxinas.

FASE ESTACIONARIA SISTEMA DE DISOLVENTES

Silica gel F 254 (Byrd y col., 1974) Diclorometano/etanol/acetato de etilo (80:10:10)

Cloroformo/metanol/ácido acético glacial (80:15:5)

2-propanol/n-heptano (25:75)

Cloroformo/metanol/ácido acético glacial (75:20:5)

2-butanona/n-hexano (35:65)

Silica gel F 254 Benceno/acetato de etilo/ácido acético (70:25:5)

(Fuentes-Ramírez y col., 1993)

Silica gel impregnada con 0.05 mol/l 2-propanol/agua/solución amonio 25% (75:20:5)
de formiato de amonio (pH 4.5)
Cloroformo/n-heptano (65:35)
(Byrd y col., 1974)
1-butanol/etanol/ solución amonio 25% (80:10:10)

Cloroformo/ácido acético glacial (95:5)

20
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR)

During en 1977 y Swetser en 1978, fueron los primeros en reportar el uso del CLAR para
medir AIA en plantas. Múltiples técnicas han sido desarrolladas, tanto a régimen isocrático
como empleando gradiente, siendo la fase invertida unido a la técnica de supresión iónica
el modo de separación más utilizado para este tipo de compuestos. Acorde con su
popularidad general, el CLAR de fase invertida se usa actualmente como método de rutina
en muchos laboratorios para el análisis y/o purificación de indoles. Los análisis utilizando
otros mecanismos de separación no han alcanzado amplia aplicación, aunque existen
algunos reportes de separación de indoles por CLAR de adsorción, fase normal e
intercambio iónico (Sandberg, 1987).

CLAR de fase invertida:

Estudios detallados del CLAR de fase invertida de indoles han sido reportados por Wurst y
col. en 1980 y 1984 (Sandberg, 1987). Prácticamente los indoles acídicos son analizados
usualmente en fase móvil acídica para asegurar que estén en forma no disociada. Esto se
refiere a la técnica de supresión iónica. Si la parte acuosa de la fase móvil no es
tamponada o el pH es tal que la ionización del compuesto de interés es sólo suprimido
parcialmente, el cromatograma se caracterizará por picos anchos o con colas así como
que las partes disociadas y no disociadas tendrán diferentes propiedades de retención. La
elución puede ser bien isocrática o utilizando un gradiente de incremento de la cantidad
del solvente orgánico (metanol, etanol, acetonitrilo) en agua o en un buffer acuoso.
Jensen (1982) investigó la influencia del modificador orgánico sobre la separación,
además de los efectos tanto del pH de la fase móvil como de la cadena alquílica de fase
estacionaria.

Otra posibilidad de análisis de los Indoles acídicos es por CLAR de fase invertida de
pares iónicos. En este modo, la parte acuosa de la fase móvil se tampona a pH 6.5 y se le
añade un contraión lipofílico como es el tetrabutilamonio (TBA+) el cual es de carga
opuesta a la muestra. Mousdale (1981) analizó los sistemas de pares iónicos usando
TBA+ y tetrametilamonio+ como contra ión. Sandberg y col., en 1981, reportaron un estudio
con más detalles de los efectos del pH de la fase móvil y la concentración de metanol y
TBA sobre las retenciones de un grupo de indoles acídicos. Sin embargo, este tipo de
21
cromatografía ha sido utilizado mucho menos que el modo de supresión iónica para el
análisis del AIA (Sandberg, 1987).

CLAR de fase normal:

La fase normal implica el uso de una fase estacionaria polar con un solvente no polar.
Aunque las columnas de sílica gel con nitrilo, nitro, amino, dimetilamino y diol, enlazadas
químicamente están disponibles, su uso con indoles endógenos casi no ha sido explorado.
Los reportes en la literatura plantean casi exclusivamente el uso de columnas nitrilo como
son: CPS Hipersil, Spherisorb CN y Nucleosil CN. En éste caso, la fase móvil contiene
típicamente una relación apropiada de hexano en acetato de etilo o diclorometano al cual
se añade ácido acético (aprox 0.5% v/v) cuando se analizan indoles acídicos. El ácido
acético ayuda a mantener la eficiencia cromatográfica por supresión de la ionización y al
parecer, ayuda al menos a desactivar parcialmente los sitios de adsorción residuales del
soporte. Si fuera necesario una desactivación adicional puede ser lograda por la adición,
o bien de trazas o de etanol al 3% aproximadamente a la fase móvil orgánica.

La cromatografía CLAR de adsorción sobre sílica gel puede ser una herramienta muy útil,
puesto que la manipulación del modificador en la fase orgánica puede brindar cambios en
la selectividad de la columna. Sin embargo, en la práctica, esta técnica ha tenido un uso
muy limitado tanto para el análisis como la purificación del AIA y otros indoles en
extractos de plantas. Lo cual se debe probablemente, a que las columnas de sílica son
difíciles de mantener en una condición equilibrada, y como consecuencia, sólo los análisis
isocráticos son factibles y además en este modo, pequeños cambios en la temperatura
ambiente o las condiciones de fase móvil pueden resultar en volúmenes de retención
fluctuantes y eficiencias reducidas (Sandberg, 1987).

Detección

Para el análisis de indoles endógenos se utilizan distintos tipos de detectores como los de
absorbancia, fluorescencia, electroquímicos y de radioactividad. El indol y la mayoría de
sus derivados 3-sustituidos tienen absorción UV máxima cerca de 280 nm con hombros en
aproximadamente 272 y 288 nm, lo cual permite el uso de la detección por absorbancia.
Sin embargo, el amplio número de compuestos que tienen una respuesta a 280 nm, hace

22
que este tipo de detector no ofrezca ningún grado de selectividad cuando se analizan
indoles endógenos. El límite de detección con CLAR C18 de AIA es en el rango bajo de los
nanogramos (Crozeir y col., 1980). El caso específico del detector de ordenamiento de
diodos (DOD) permite obtener el espectro de absorbancia de los picos individuales del
CLAR mientras se registra el cromatograma.

Las propiedades de fluorescencia de los indoles permiten la detección selectiva de los

mismos utilizando un detector de fluorescencia, el cual es potencialmente más sensible
que el de absorbancia. Aunque la longitud de onda (λ) max individual puede variar
ligeramente, la mayoría de los indoles pueden ser detectados con una excitación a 280 nm
y una emisión a 350 nm. Siendo el indol-3-acetaldehído y el indol-3-aldehído notables
excepciones que no fluorescen. Un valor tan pequeño como un 1 pg que ser detectado
cuando el AIA se analiza por CLAR de fase invertida con este tipo de detector, usando una
fase móvil de 45% de etanol en 20 mM de acetato de amonio (pH 3.5) (Crozier y col.,
1980). Cuando se usa CLAR de fase normal con hexano/acetato de etilo como fase móvil,
la cantidad mínima detectable del AIA es aproximadamente 50 pg.

Los indoles experimentan oxidación electroquímica y por tanto, también pueden ser
monitoreados selectivamente en los eluatos de CLAR con un detector electroquímico, en
el cual la corriente entre los electrodos polarizables y de referencia se mide en función del
voltaje aplicado. Frecuentemente se usa un electrodo de carbón vidrioso o de pasta en
conjunto con un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata. Los indoles, en general,
son monitoreados a +0.8-0.9 V. Sin embargo, cuando el análisis se aplica exclusivamente
a los 5-hidroxi derivados se aplica un potencial aproximado de +0.6 V. La medición de
AIA en extractos de plantas con un detector electroquímico por CLAR fue reportada por
primera vez, por Sweetser y Swartzfager en 1978 y este procedimiento se usa
rutinariamente para analizar indoles en muchos laboratorios clínicos (Semerdjian-
Rouquier, 1981; Shum y col., 1982; Sandberg, 1987).

El límite de detección es del orden de los 50 pg, aunque al igual que el fluorímetro, éste
puede estar influenciado tanto por el instrumento como por las condiciones
cromatográficas. La aplicabilidad del detector electroquímico esta limitada a la
cromatografia CLAR de fase invertida e intercambio iónico, ya que la fase móvil tiene que
23
ser conductiva eléctricamente. En los sistemas de fase invertida se requiere en ocasiones
añadir una concentración adecuada de una sal a la fase móvil, lo cual puede hacerse,
usualmente, sin efectos adversos en la separación. El mantenimiento de la estabilidad del
detector depende fuertemente de la desgasificación efectiva de la fase móvil y de la
asistencia regular al electrodo de carbón de pasta o vidrioso (Sandberg, 1987).

El uso de los detectores de Radioactividad requiere de un monitoreo continuo en flujo

durante el análisis de los compuestos radiactivos por CLAR. Este monitoreo de la
radiación ß de los efluentes del CLAR ha involucrado usualmente, el uso de la técnica de
centelleo. Cuando se analizan indoles endógenos, el tipo de detector usado es muy
importante, siendo el de fluorescencia y el electroquímico, los que ofrecen más
selectividad en la detección. La tabla III muestra un resumen de las condiciones
cromatográficas reportadas por diversos autores para este tipo de análisis.

Tabla III. Condiciones cromatográficas utilizadas para la determinación de auxinas por CLAR.

COLUMNA FASE MÓVIL DETECCIÓN REFERENCIA

Novapak C18 (15 cm) MeOH/H3PO4 (1%) (40:60, v/v) UV 278 nm Balota (1997)

Hypersil ODS MeOH/HAc (0.5 %) Fluorescencia Crozier (1988)

(5 μm, 250 x 5 mm d.i) isocrático y gradiente Exc 280 y Em 350 nm

Spherisorb CN Hexano/Acetato de etilo con Fluorescencia Crozier (1988)

0.5% de HAc
(5 μm, 250 x 5 mm d.i) Exc 280 y Em 350 nm

Lichrosorb C18 Acetonitrilo/Agua (pH=3) UV 236 nm Graham (1991)

ajustado con HAc ó H3PO4
(5 μm, 250 x 4.6 mm d.i.)

Microsorb C18 Acetonitrilo/HAc(1.25%)(20:80) UV 280 nm Brandl (1996)

y MeOH/HAc (0.5%) (28: 72)
(5 μm, 350 x 4.6 mm d.i.)

Econosphere C18 MeOH/ H2O a pH=2.5 con UV 280 nm Frankenberger

(1987)
(5 μm, 250 x 4.6 mm d.i.) H3PO4 (45: 55)

μ-Bondapak C-18 Metanol/ HAc 0.2 N (50:50) UV 280 y 254 nm Badenoch-Jones

24
(5 μm, 300 x 3.9 mm d.i.) (1982)

μ-Bondapak C-18 (5μm) Acetonitrilo-20mM Acetato de UV 254 nm Sánchez Bravo

(1990)
Amonio (1:9) pH= 4.5

C 18 Gradiente de MeOH/ HAc (1%) UV 280 nm Ludwig-Muller

(1993)

Nucleosil C-18 Gradiente de MeOH/HAc (1%) UV 280 nm Minamisawa (1991)

(7 μm, 250 x 4.6 mm d.i.)

Spherisorb ODS C-18 2-propanol/agua bidestilada Detección en serie por Lebuhn (1993)
(14:86) con 5.0 mmol/l UV 233 nm, 280 y 316
( 5 μm, 250 x 4.0 mm d.i.) NaH2PO4 pH=2,15-2,35 nm y por Fluorescencia
ajustado con H3PO4 al 85% Exc 280 y Em 340 nm

μ-Bondapak C-18 MeOH/HAc (0.5%) (40:60) UV 260 nm Jensen (1995)

pH=2.9
( 5 μm, 300 x 3.9 mm d.i.)

Spherisorb ODS C-18 H2O/Acetonitrilo/HAc (78:20:2) Electroquímico +0.85 V Guerrero (2001)

pH=3
( 5 μm, 250 x 4.5 mm d.i.)

Phenomenex C 18 Acetonitrilo/H20 (0.5%) (1:1) DOD/ UV 280 nm Vega-Hdez (2002)

Cromatografía Gaseosa (CG):

La cromatografía gaseosa fue usada para el análisis del AIA por primera vez por Stowe y
Powell en 1964 (Sandberg, 1987). La mayoría de los indoles no son lo suficientemente
volátiles para el análisis directo por CG y requieren ser derivatizados para aumentar su
presión de vapor previo al análisis. Los dos tipos principales de fase estacionaria más
utilizadas para su separación son las fases no polares basadas en dimetilsilicona como la
SE-30, OV-101 y DB-1 y fases con cierta polaridad como la OV-7, OV-17, DC-550 y SP-
2250, que se basan en mezclas de fenil, metil silicona y dimetilsilicona. Cada vez se están
usando con más frecuencia las columnas capilares para el análisis de estos compuestos y
las condiciones cromatográficas utilizadas, varían bastante de una investigación a otra.
(Allen y col., 1982). Se ha reportado el uso de diferentes tipos de detectores como los de
Ionización de llama y de llama alcalina, de Captura Electrónica, Fósforo-Nitrógeno y de
Radioactividad. El detector de Ionización de llama permite la medición de los derivados de
los Indoles en el orden de los nanogramos, pero carece de selectividad y requiere de una

25
purificación de la muestra importante para la obtención de un análisis exacto de los
indoles endógenos (Sandberg, 1987).

Métodos Cromatográficos acoplados a Espectrometría de Masas

Crozier (1988) reporta el uso de CG-EMS para el análisis de los trimetilsilil derivados,
usando una columna capilar de metilsilicona (25m x 0.31 mm d.i.) y Frankenberger (1987)
reporta el uso de una columna capilar DB-5 (30m. 0.25 um de d.i.) con los mismos fines.
Brandl (1996) reporta la determinación con derivatización con BSTFA y una columna DB-5
de 30 m y una rampa de temperatura desde 90 a 280 °C a 7°/min. Los tiempos de
retención y los espectros de masa de 17 derivados trimetilsililados de patrones de indoles
auténticos fueron reportados por Badenoch-Jones (1982). Meuwly (1991) reporta el uso
del monitoreo del ión seleccionado en una columna SE 54 WCOT Hewlett-Packard (25m x
0.31 mm x 0.52 μm). El uso de la CLAR-EM fue reportado por Numan y Danielson (2002)
utilizando una interfase de electrospray a presión atmosférica para la identificación de
derivados indólicos, empleando una ionización positiva. Ostin (1998) reporta también esta
técnica pero con bombardeo de átomos rápidos para el estudio del metabolismo del AIA
en plantas de Arabidopsis crecidas en cultivo líquido.

1.4 Estudio de Fiabilidad de los Métodos Analíticos

La fiabilidad se define como la capacidad de un método analítico para mantener durante

períodos de tiempo apropiados los criterios fundamentales de validación. Las
características de fiabilidad comprenden los cincos criterios fundamentales de validación,
no necesariamente aplicables en todos los casos y de los que derivan en la práctica
todos los parámetros de validación (Castro y col., 1989).

Entre estos parámetros se encuentran la proporcionalidad entre concentración del analito

y respuesta del instrumento, concepto que se relaciona con los parámetros linealidad,
intervalo y también con la sensibilidad; la dispersión de una serie de resultados alrededor
del valor medio o central de un procedimiento analítico, este concepto se relaciona con
los parámetros: precisión, repetibilidad, reproducibilidad y robustez; la diferencia entre el
valor hallado en el análisis y el valor verdadero, concepto relacionado con los
parámetros exactitud y recuperación; la cantidad mínima de analito requerida para
26
obtener un resultado significativo, concepto relacionado con los parámetros sensibilidad,
límite de detección y límite de cuantificación y la capacidad de un método para determinar
el analito sin interferencias de impurezas, productos de degradación, excipientes u
otras sustancias presentes en la muestra, concepto relacionado con los parámetros
selectividad y especificidad (Castro y col., 1989 y Norma Cubana Experimental 2001).

El término de Linealidad incluye la proporcionalidad entre la concentración del analito y la

respuesta, así como el intervalo de concentraciones de analito para el cual el método es
satisfactorio. La linealidad se relaciona, además con la sensibilidad de calibrado o
cociente diferencial entre la señal medida y la concentración de analito.

La precisión es el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida de

ensayos analíticos efectuados sobre una muestra homogénea, o expresada de otra
forma, la distribución de los valores analíticos alrededor de su media. La precisión indica
la capacidad del método para dar resultados semejantes cuando se aplica
repetidamente a una muestra. Se expresa por la media para el valor central y la
desviación estándar para la dispersión de resultados.

Dentro del término precisión del método se encuentran los estudios de Repetibilidad y
Precisión Intermedia. La repetibilidad es la medida de la precisión de un método
efectuado en las mismas condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo analista,
en el mismo laboratorio, con los mismos aparatos y reactivos y en el curso de la misma
serie de análisis efectuados, generalmente, en un corto intervalo de tiempo. El ensayo de
repetibilidad del método se efectúa sobre una serie de alícuotas de una muestra
homogénea que se analizan independientemente desde el principio (preparación de la
muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo analista y el mismo
instrumento. El número de repeticiones del análisis debería ser superior a 5 y la
concentración del analito en la muestra problema suele ser similar a la nominal o
declarada. La precisión intermedia es la medida de la precisión de los resultados de un
método analítico efectuado sobre la misma muestra pero en condiciones diferentes
(diferentes analistas, instrumentos, días, etc).

27
La exactitud indica la capacidad del método analítico para dar resultados lo más
próximos posibles al valor verdadero. Si la diferencia entre el valor hallado y el valor
verdadero es pequeña, la exactitud es buena. Una diferencia grande significa que la
exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores que deberían corregirse. No
deben confundirse exactitud y precisión. La precisión está relacionada con la dispersión
de una serie de mediciones, pero no da ninguna indicación de lo cerca que está del valor
verdadero. Podemos tener mediciones muy precisas pero poco exactas, sin embargo,
para que un método sea exacto se requiere un cierto grado de precisión.
Matemáticamente la exactitud se expresa en forma de porcentaje de recuperación de la
cantidad de analito presente en la muestra o bien en forma de diferencia entre el valor
hallado y el valor verdadero. Estadísticamente suele efectuarse una prueba de t de
Student para determinar si el valor medio hallado y el valor considerado verdadero no
difieren significativamente para un grado de probabilidad determinado.

El límite de detección es la menor concentración o cantidad de analito detectable con

razonable certeza por un procedimiento analítico dado. Es decir, es la cantidad o
concentración mínima de analito a partir de la cual es factible realizar el análisis. El límite
de detección es la menor concentración de analito en una muestra que puede ser
detectada, pero no necesariamente cuantificada, bajo las condiciones experimentales
establecidas. Un resultado "positivo" no es suficiente para que el analista considere
detectado un analito. Se precisa, además conocer el límite de detección en las
condiciones del método, de lo contrario, se puede incurrir en un falso positivo:
suponer el analito presente en la muestra cuando de hecho no lo está. El límite de
detección es un parámetro analítico de gran interés en ensayos límite, análisis de trazas,
contaminantes y productos de degradación. Los términos cualitativos del tipo "ausencia
de ...ó resultado negativo tiene su expresión numérica en el límite detección. Es más
correcto decir "menos de 1 ppm de..." que no ausencia de ..."

El límite de cuantificación es la menor concentración o cantidad de analito de una muestra

que puede ser determinada con aceptable precisión y exactitud bajo las condiciones
experimentales establecidas. El límite de cuantificación es un término cuantitativo
(menor cantidad medible) mientras que el límite de detección es cualitativo (menor

28
cantidad detectable). Numéricamente es mayor el límite de cuantificación y representa
la menor cantidad de analito que puede analizarse con un CV aceptable.
Concentraciones menores pueden detectarse pero no cuantificarse.

Existen varios criterios, (Castro y col., 1989, Norma Cubana Experimental 2001,
International Standard ISO, etc) en cuanto a ensayos de validación, formas de realizarlos y
límites de aceptación, pero de manera general se considera que en el estudio de la
fiabilidad del método, lo que debe primar es el criterio del analista sobre la base de las
normas establecidas, el cual es quien conoce con detalle, la muestra, así como el interés y
alcance del análisis.

29
MATERIALES Y MÉTODOS
Capítulo 2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Material biológico y condiciones de cultivo

2.1.1. Microorganismos

Giberelinas
Se empleó la cepa del hongo Gibberella fujikuroi, IMI 58289, donada por el Dpto. de
Genética, Universidad de Sevilla, España.
Auxinas

Se utilizó la cepa de la bacteria Rhizobium sp. 3, procedente de la colección de

microorganismos de la facultad de Biología, Universidad de la Habana.

2.1.2 Medios de cultivo

Giberelinas

El medio de cultivo empleado estuvo compuesto por harina de trigo, NH4NO3, KH2PO4,
MgSO4 x 7H2O, solución de trazas (mL/L) compuesta por FeSO4 x 7H2O, CuSO4 x 5H2O,
ZnSO4 x 7H2O, MnSO4 x 7H2O, (NH4)6MoO24 x 4H2O, CaCO3.

Auxinas

El medio de cultivo estuvo compuesto por sacarosa, KH2PO4, CaCl2, MgSO4.7H2O,

extracto de levadura, (NH4)2SO4, suplementado con L-triptófano como inductor.

2.1.3 Condiciones de Fermentación

Giberelinas

Se utilizó un volumen de trabajo de 3 L, temperatura 30 ºC, pH 3, agitación 600 rpm, aire

0,75 VVM y un tiempo de fermentación de 168 horas.

Auxinas

Se utilizó un volumen de trabajo de 3 L, temperatura 30 ºC, pH 6,8; agitación 600 rpm,

aire 0,75 VVM y un tiempo de fermentación de 40 horas.

29
2.2 Reactivos y Materiales

2.2.1 Productos químicos analíticos

Acetato de etilo PA 99.5% (Quimipur)
Ácido Acético glacial 99.8% (PA-ACS) (Panreac)
Ácido Fosfórico 85% (Veb Jenapharm-Laborchemie Apolda)
Ácido sulfúrico PA 96% (Panreac)
Ácido perclórico 60% (Quimipur)
Agua bidestilada y desionizada
Benceno (Merck)
Cloroformo PA 99.8% (Fluka)
Cloruro férrico (BDH)
Etanol ACS (Riedel-deHaen)
Hidróxido de Potasio (perlas) (BDH)
Metanol CLAR (Panreac)

2.2.2 Patrones
GA1 (laboratorio de bioquímica del ICIDCA), GA3 (90%), GA4 (90%), GA7 (90%), Ácido
Indol Acético (AIA), Ácido Indol Propiónico (AIP), Ácido Indol Butírico (AIB) (Cell Culture
Reagents, SIGMA) y Ester Etílico del Ácido Indol Acético (EEAIA) (SIGMA).

2.2.3 Disoluciones

Disolución de Salkowski: se tomó 1 mL de cloruro férrico 0,5 mol/L y 50 mL de ácido

perclórico al 35%, se agitó bien y se llevó a un baño de María a 60 °C durante 5 min.

Disolución matriz de GA3: Se preparó a 1000 mg/L en fase móvil. Se realizaron las
diluciones correspondientes para preparar cinco disoluciones de trabajo para la curva
de calibración en un intervalo entre 100 y 1000 mg/L.

Disolución matriz de GA1: Se preparó a 550 mg/L en fase móvil. Se realizaron las
diluciones correspondientes para preparar cuatro disoluciones de trabajo para la curva
de calibración en un intervalo entre 55 y 550 mg/L.

30
Disolución matriz de GA4 y GA7: Se preparó a 500 mg/L de cada patrón en fase móvil.
Se realizaron las diluciones correspondientes para preparar cinco disoluciones de
trabajo para la curva de calibración en un intervalo entre 10 y 500 mg/L para ambas GAs.

Disolución matriz de AIA, AIP, AIB y EEAIA: Se preparó a 220 mg/L de cada patrón en
fase móvil. Se realizaron las diluciones correspondientes para preparar cinco
disoluciones de trabajo para la curva de calibración en un intervalo entre 22 y 220 mg/L
para cada ácido indólico.

2.2.4 Equipos

Balanza Analítica (Sartorius)

Baño de Ultrasonido (Pro Eti S.A.)
Cámaras de CCF 21 x 21 x 9 cm
Fermentadores 5 L (Biostat-MD,B)
Fermentadores 5 L (Marubishi MD-3005 L)
Filtros de jeringuilla Iso Disc 45 μm (Supelco)
Jeringuilla CLAR 50 μl (Hamilton)
Lámpara UV Universal (Camag)
Microbalanza (Sartorius)
Microcomputadora (Compaq)
Microcomputadora (Samsung SPC6100)
Phmetro 26 (Radiometer/Copenhagen)
Placa de Sílica gel G 20 x 20 cm (Merck)
Placa de Sílica gel HF254 (Merck)

Equipo de CLAR 1: Se utilizó una bomba PU 4100 (Philips), un inyector 7125 (Rheodyne)
con lazo de 20 μL, una columna Hypersil ODS (5 μm; 25 cm x 4,6 mm d.i.) con una pre-
columna Hypersil ODS (5 cm x 4,6 mm d.i.) y un detector UV-Visible PU 4110 (Philips).

Equipo de CLAR 2: Se utilizó una bomba K-501 (Knauer), un inyector 7125 (Rheodyne)
con lazo de 20 μL, una columna Hypersil ODS (5 μm; 25 cm x 4,6 mm d.i.) con una pre-
columna Hypersil ODS (5 cm x 4,6 mm d.i.) y un detector de fluorescencia RF-530
(Shimadzu).

31
Equipo de CLAR 3: Se utilizó una bomba K-1001 (Knauer) con desgasificador en línea de
4 canales K-5004 (Knauer) y un organizador del disolvente K-1500 (Knauer) con una
cámara mezcladora, un inyector 7725I (Rheodyne) con lazo de 20 μL, una columna
Hypersil ODS (5 μm; 25 cm x 4,6 mm d.i.) con una pre-columna Hypersil ODS (5 cm x 4,6
mm d.i.) y un detector fotométrico de diodos K-2800 (Knauer).

2.3 Procesamiento de Resultados

Para la adquisición y el procesamiento de los datos cromatográficos se utilizaron los

Programas: Biocrom (CIGB) y ChromGate (Scientific Instruments). Para el procesamiento
estadístico se utilizó el programa Microsoft Excel sobre Windows 2000.

2.4 Procedimientos
2.4.1 Preparación de muestra

A 5 mL del caldo de fermentación, previamente filtrado y centrifugado, se le ajustó el pH

entre 2,5 y 3 con una disolución de HCl (1 mol/L) y se realizó una extracción con acetato
de etilo, en una relación (1:1), la cual se repitió por 3 veces consecutivas. Posteriormente
se rotoevaporó el extracto a sequedad. Para el caso de las técnicas de CLAR, se realizó la
dilución requerida de la muestra en la fase móvil, de manera tal, que la respuesta del
detector estuviera dentro del intervalo correspondiente a la curva de calibración.
Posteriormente, se pasó por filtros de jeringuilla de 0,45 μm para realizar la inyección al
cromatógrafo. Para el análisis por Cromatografía de Capa Fina (CCF), la muestra seca se
resuspendió en 1 ml de metanol.

2.4.2 Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR)

El proceso cromatográfico se realizó a temperatura del laboratorio (25°C) y la

cuantificación se realizó según el método del estándar externo.

A. Giberelinas

Determinación de GA3 y GA1

Se utilizó el equipo de CLAR 1 y la fase móvil consistió en 30% de metanol en 0,01 mol/L
de H3PO4, ajustada a pH=3 con KOH. El flujo fue de 1,3 mL/min. La detección UV se

32
realizó a 206 nm en un rango de 1 y el tiempo de corrida fue de 20 min. Se empleó el
software BIOCROM para la adquisición y procesamiento de los datos.

Determinación de GA4 y GA7

Se utilizó el equipo de CLAR 1 y la fase móvil consistió en 40% de metanol en 0,01 mol/L
de H3PO4, ajustada a pH=6 con KOH. El flujo fue de 1,2 mL/min. La detección UV se
realizó a 206 nm en un rango de 0,5 y el tiempo de corrida fue de 30 min. Se empleó el
software Biocrom para la adquisición y procesamiento de los datos.

B. Auxinas

CLAR con detección de Fluorescencia

Se utilizó el equipo de CLAR 2 y la fase móvil consistió en una relación metanol-ácido

acético 0,5% (v/v) (6:4). Se empleó un flujo de 0,7 mL/min. La detección se realizó por
fluorescencia a una λ de excitación de 280 nm y de emisión de 340 nm, a una sensibilidad
baja. Se empleó el software Biocrom para la adquisición y procesamiento de los datos.

CLAR con detección fotométrica de ordenamiento de diodos

Se utilizó el equipo de CLAR 3 y un gradiente de fase móvil compuesto de metanol: ácido

acético 0.5% (v/v), que varió de 20% de metanol a 80 % en 20 min a un flujo de 1,5
mL/min. La detección se realizó a 280 nm y la lectura en un intervalo de longitudes de
onda de 200 a 400 nm. Se empleó el software ChromGate para la adquisición y
procesamiento de los datos.

2.4.3 Cromatografía de capa fina (CCF)

Se pesó 1 mg de cada patrón y se disolvió en 1 ml de metanol. Se aplicó 10 μl de los

patrones y de las muestras.

A. Giberelinas

Se utilizó una placa de Sílica gel G y como sistema de disolventes cloroformo/acetato de

etilo/ácido acético glacial (5:4:1). El revelador consistió en una mezcla de ácido sulfúrico–
etanol (95:5) (Kumar y Lonsane, 1986).

33
B. Auxinas

Se utilizó una placa de Sílica gel HF254 y como sistema de disolventes benceno/acetato de
etilo/ácido acético (70:25:5). Se utilizó como revelador la disolución de Salkowski
(Fuentes-Ramírez, 1993).

2.5 Estudio de Fiabilidad

• Linealidad

Se realizó la inyección de las disoluciones matrices y de trabajo, cada una por triplicado.
Se tomó como criterio de aceptación el cumplimiento de los parámetros de linealidad
planteados en la Norma Cubana (2001): obtener coeficientes de correlación (r) mayores
que 0,999; que los coeficientes de variación (CV) de los factores de respuesta (Fr) sean
inferiores al 5%, que la desviación estándar relativa de la pendiente (Sbrel) sea inferior al
2% y que los límites de confianza (LC1 y LC2) del intercepto (a) incluyan al cero.

• Determinación de los límites de detección y cuantificación

Se inyectó un “blanco” (fase móvil) y disoluciones patrones diluidas, por tres veces
consecutivas. El cálculo se realizó según la fórmula:

S/N = 2H/h

Donde:

S/N: relación señal/ruido

H: altura del pico de la disolución patrón desde la línea base

h: amplitud del ruido de la línea base causada por el blanco en la posición del pico en un
intervalo de 20 veces el ancho a la mitad de la altura del pico de la solución patrón.

Se consideró como límite de detección la concentración de la disolución patrón a la cual la

relación S/N fue igual a 3. Se consideró como límite de cuantificación la concentración de
la solución patrón a la cual la relación S/N fue igual a 10.

34
• Estudio de Precisión

Se realizó con muestras representativas de los caldos, o sea, con concentración similar al
valor medio esperado (250 mg/L para el GA3, 100 mg/L para el GA4 y para el GA7, y 110
mg/L para el AIA).

a) Repetibilidad

El estudio de repetibilidad del sistema instrumental, se realizó con un extracto, el cual se

inyectó 10 veces consecutivamente en el cromatógrafo CLAR. Se evaluó la media del área
del pico de interés, la desviación estándar y el coeficiente de variación.

El estudio de repetibilidad del método se realizó con una muestra que se extrajo por 6
veces consecutivas y cada extracto se inyectó por triplicado consecutivamente en el
cromatógrafo CLAR. Se evaluó la media del área, la desviación estándar y el coeficiente
de variación.

b) Precisión Intermedia

La muestra se extrajo 3 veces y cada extracto se inyectó por triplicado en el cromatógrafo

CLAR durante tres días consecutivos, se evaluó la media del área, la desviación estándar
y el coeficiente de variación. Se tuvo en cuenta, como criterio de aceptación, el
cumplimiento de los parámetros de precisión planteados en la Norma Cubana (2001) para
los niveles de concentración empleados: que la precisión del sistema instrumental es
adecuada cuando el CV está entre un 2 y 3% y que la precisión del método es adecuada
cuando el CV está entre un 4 y 5 %.

• Estudio de Exactitud

La exactitud se evaluó por el método de adición del patrón y se utilizó una muestra
representativa del caldo con concentración similar al valor medio declarado. Se tomaron
tres alícuotas de la misma y a dos de ellas se le añadieron concentraciones conocidas del
analito patrón y se analizaron en paralelo.

Se halló la respuesta experimental neta ((blanco + analito) – blanco)) y se comparó con los
resultados obtenidos por interpolación en la recta de calibración para las mismas
concentraciones del analito. A partir de estos valores se calculó el porcentaje de
35
recuperación (R) y se determinó la media, su desviación estándar y el coeficiente de
variación. Posteriormente se realizó la prueba t de Student para determinar si el valor
medio hallado y el valor considerado verdadero difieren significativamente para un grado
de probabilidad determinado.

Tomando como hipótesis nula que R =100 %, en dicha prueba la texp. se comparó con el
valor crítico tabulado para α=0,05 y n-1 grados de libertad. La texp se determinó mediante
la siguiente expresión:

100 − R n
t exp =
CV

Donde:

R : valor medio del porciento de recuperación

CV: coeficiente de variación de la determinación de R

n: número de determinaciones.

36
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Capítulo 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tomando en cuenta la importancia que tiene el desarrollo agrícola para nuestro país y la
necesidad del uso de sustancias como las fitohormonas biosintéticas, compatibles con el
proyecto de desarrollo sostenible y capaces de ayudar en el empeño de dar un salto
cualitativo y cuantitativo en el rendimiento y calidad de las cosechas, el ICIDCA ha
realizado investigaciones encaminadas a desarrollar distintas tecnologías de producción
de fitohormonas.

Como un elemento imprescindible de dichas investigaciones surgió la necesidad de

implementar metodologías analíticas para la determinación de las fitohormonas
producidas, y por tal motivo se realizó el presente trabajo. Así, las muestras utilizadas en
el desarrollo de los métodos que presentaremos a continuación proceden de
biopreparados libres de células, obtenidos por fermentación sumergida, tanto del hongo
Gibberella fujikuroi, para el caso de las GAs, como de la bacteria Rhizobium sp. 3, para el
caso de las Auxinas. Transcurrido el tiempo de producción se realizó la etapa de
separación por centrifugación para obtener un sobrenadante libre de células que
permitiera la realización posterior de los análisis.

3.1 Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR)

La CLAR ha incrementado su rol en el análisis de los bioproductos y en el estudio de

procesos biotecnológicos, como la fermentación. Esta técnica constituye actualmente un
método utilizado como rutina tanto en la purificación y separación de GAs como de
Auxinas. La fase invertida C18, unida a la técnica de supresión iónica, ha sido el modo de
separación más utilizado por diversos autores (Brenner, 1981 y Sandberg, 1987).

3.1.1 Desarrollo de métodos para la determinación de Giberelinas

Las giberelinas abarcan un amplio intervalo de polaridad. Desde las más polares como la
GA3 y GA1 hasta las menos polares como la GA9 por lo cual pueden ser separadas

37
empleando un gradiente de polaridad. Sin embargo, coincidiendo con lo planteado por
(Lebuhn, 1993), el uso del gradiente de elución implica consumo de tiempo y solvente, ya
que requiere del reequilibrio de la columna después de cada corrida y además implica el
uso de bombas más costosas. Estas desventajas pueden evitarse con el uso de sistemas
isocráticos optimizados, que resultan de gran utilidad en los análisis de rutina ya que
permiten disponer de métodos más sencillos y fáciles de implementar.

Considerando lo planteado por Barendse y col. (1980), sobre la posibilidad de lograr una
buena separación de un par de isómeros de doble enlace de las GAs, en presencia de
ácido fosfórico 0,01 mol/L con una concentración particular de metanol a un pH
determinado, se realizó el estudio de las condiciones cromatográficas adecuadas para
establecer dos técnicas analíticas isocráticas, una para el par de doble enlace GA3 y GA1
y otra para el par GA4 y GA7; usando la técnica de supresión iónica, sin necesidad de
realizar una derivatización. Las GAs son ácidos débiles y por tanto, la técnica de
supresión iónica, que implica la regulación del pH de la fase móvil, resulta adecuada para
la separación de estos compuestos, lo cual permite el uso de las columnas de fase
invertida C18 en estos análisis, con éxito (Brenner, 1981).

Otro aspecto importante a destacar es el problema de la detección de las giberelinas, ya

que las mismas absorben a bajas longitudes de onda UV, donde los disolventes utilizados
como fase móvil pudieran interferir. Diversos autores (Lin y Stafford, 1988; Jensen y col.,
1986) refieren el uso de la derivatización de las giberelinas para ser detectadas a 254 nm,
como posible solución a este problema. Sin embargo, esto complicaría la técnica analítica,
aún más, cuando la preparación de la muestra requiere una extracción previa. En las
técnicas implementadas se empleó la detección UV a 206 nm, al igual que otros autores
(Barendse y col., 1980), considerando además lo planteado por Lin y Heftman (1981): que
en el metabolismo de las GAs de la G. Fujikuroi, no se han observado interferencias a esta
longitud de onda, a partir de los contaminantes del extracto de la fracción acídica. En los
métodos implementados para los dos pares de isómeros de GAs, se logró una buena
altura de los picos y una buena exactitud del método a la sensibilidad utilizada para la
determinación.

38
La preparación de muestras a partir de caldos fermentados conteniendo fitohormonas se
realizó en tres etapas de extracción líquido-líquido, con previo ajuste de pH a valores entre
2,5 y 3, con lo cual se garantiza la extracción de estos compuestos en forma no disociada,
considerando lo reportado por diversos autores (Brenner, 1981 y Sandberg, 1987).

Con el objetivo de establecer las condiciones cromatográficas requeridas para la

separación cromatográfica de los dos pares de isómeros de las GAs se estudió la
composición de la fase móvil, respecto a polaridad y pH. Las fases móviles con las que se
lograron resoluciones a nivel de línea base superiores a las reportadas por Barendse y col.
(1980), fueron un 30% de metanol en presencia de H3PO4 (0,01 mol/L) ajustada a pH=3
para el par GA3 y GA 1, y un 40% de metanol en presencia de H3PO4 (0,01 mol/L) ajustada
a pH=6 para el par GA4 y GA7 ; lo cual puede apreciarse en las figuras 3 y 4.

Patrón GA 3

Muestra
GA 1

min
0 5 10 15 20

Figura 3. Cromatograma por CLAR de los patrones de GA3 y GA1 y de un extracto de un caldo
(columna Hypersil ODS, fase móvil 30% de metanol en 0.01 mol/L de H3PO4 (pH=3), flujo 1,3 mL/min,
detección UV a 206 nm)

39
 GA 7

GA 4

m in
0 5 10 15 20 25 30

Figura 4. Cromatograma por CLAR de los patrones de GA4 y GA7 y de un extracto de un caldo
(columna Hypersil ODS, fase móvil 40% de metanol en 0.01 mol/L de H3PO4 (pH=6), flujo 1,2 mL/min,
detección UV a 206 nm).

Teniendo en cuenta que la columna de fase invertida C18 ha sido la más utilizada por
diversos autores (Brenner, 1981 y Sandberg, 1987) para el ánalisis de las GAs, se utilizó
una Hypersil C18 (25 cm x 4.6 mm i.d.). En la tabla IV se muestran los tiempos de
retención (media, error absoluto y coeficientes de variación) de las distintas giberelinas, los
cuales presentaron una variabilidad menor/igual que 0,7 % para n=15 en todos los casos.

Tabla IV. Tiempos de Retención de las GAs en CLAR

Giberelina Media (min) CV (%)
GA3 14,91 ± 0,02 0,17
GA1 17,50 ± 0,03 0,18
GA7 18,44 ± 0,14 0,70
GA4 22,45 ± 0,11 0,50

40
Para realizar el estudio de linealidad del método para cada GA, primero se verificó que los
datos obtenidos estuvieran libres de errores burdos, luego se verificó la homogeneidad de
las varianzas para las diferentes muestras analizadas y se realizó una regresión lineal
simple según el modelo y = a + b x , donde “y” es el área del pico cromatográfico y “x” es
la concentración real de cada GA en cada disolución inyectada.

Como puede apreciarse en la Tabla V se obtuvieron coeficientes de correlación (r)

mayores que 0,999 para todas las GAs, los CV de los factores de respuesta (Fr) fueron
inferiores al 5%, la desviación estándar relativa de la pendiente (Sbrel) fue inferior al 2%
para cada GA y los límites de confianza (LC1 y LC2) del intercepto (a) incluyeron al cero;
cumpliéndose así con los criterios de linealidad planteados en la Norma Cubana (2001).

Tabla V. Estudio de linealidad de GAs por CLAR.

GA Intervalo de r CV(%) del b Sbrel a LC1 LC2

Conc. (mg/L) Fr (%)

GA3 100 a 1000 0,9998 2,8 196,25 0,6 1,04 -0,3 2,4
GA1 55 a 550 0,9991 4,4 106,90 1,3 -0,50 -1,5 0,5
GA4 10 a 500 0,9991 4,5 348,08 1,7 1,67 -1,9 5,2
GA7 10 a 500 0,9996 3,9 417,84 1,1 1,55 -0,9 4,0

Considerando la posibilidad de utilizar la técnica analítica en el seguimiento de la cinética

de la fermentación desde las primeras horas, se realizó la determinación de los límites de
detección y cuantificación obtenidos en las condiciones de análisis, los cuales fueron
expresados en ng inyectados en la columna, según se muestran en la tabla VI.

Tabla VI. Límites de detección y cuantificación de GAs obtenidos en CLAR

Giberelina Límite de Detección (ng) Límite de Cuantificación (ng)
(S/N=3) (S/N=10)
GA3 40 110
GA7 80 280
GA4 80 280

41
En la tabla VII se muestran los resultados obtenidos en el estudio de precisión del método
cromatográfico para cada giberelina, en el cual se determinó la repetibilidad tanto del
sistema instrumental como del método y la precisión intermedia del método.

Tabla VII. Estudio de precisión de los métodos de CLAR para las GAs

Conc. Media REPETIBILIDAD PRECISIÓN

de GA INTERMEDIA
(mg/L) Sistema Instrumental Método Método
CV (%) n=10 CV (%) n=6 CV (%) n=9

GA3 257 0,4 2,1 2,97

GA7 80 1,3 3,1 3,38
GA4 78 1,1 3,1 3,86

Como se puede apreciar en la Tabla VII, la precisión del sistema instrumental fue
adecuada para todas las GAs, al presentar en todos los casos CV< 2%. La precisión del
método, tanto la repetibilidad como la precisión intermedia, también fue adecuada, al estar
dada por CV < 4%, los cuales cumplen con los criterios planteados por la Norma Cubana
(2001).

La exactitud se evaluó por adición del patrón antes de realizar la extracción líquido-líquido,
ya que no se disponía de una muestra de concentración conocida, ni de un placebo y la
misma se expresó en forma de porcentaje de recuperación. La tabla VIII muestra los
resultados del estudio de exactitud para cada GA en un caldo al cual se le añadió la
disolución del patrón. La recuperación media para las giberelinas fue: 98,1 % para la GA3 y
97,7-97,9 % para la GA7 y la GA4. En todos los casos, la recuperación se puede
considerar satisfactoria ya que al aplicar el prueba de la t de Student se encontró que no
existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100%, siendo la texp menor
que la tabulada.

42
 Tabla VIII. Estudio de exactitud para las GAs de los métodos de CLAR

Giberelina Conc. Añadida (mg/L) Recuperación (%)

GA3 108 98,1
GA7 14,31 97,7
GA4 18,58 97,9

Como resultado del desarrollo analítico, se logró establecer dos técnicas cromatográficas
isocráticas por HPLC para la determinación de Giberelinas: una para la GA3 y la GA1 y otra
para la GA4 y la GA7, con muy buena resolución y sin necesidad de una preparación
complicada de la muestra ni de derivatización. Se estudió la fiabilidad para ambas
técnicas, obteniéndose el cumplimiento de los parámetros de linealidad y una buena
precisión y exactitud.

Los métodos de CLAR desarrollados permitieron separar los pares de isómeros de doble
enlace de las giberelinas y cuantificarlas con exactitud y precisión en los extractos de
caldos fermentados obtenidos a partir del microorganismo. El desarrollo de estos métodos
permitió conocer que el crudo fermentado presentó en cantidad mayoritaria al Ácido
Giberélico (GA3), y que se producen otras giberelinas como la GA1, la GA4 y la GA7, en
menor cantidad, durante el metabolismo de la G. Fujikoroi. Además, permitió definir las
condiciones óptimas de fermentación, y realizar el estudio de cepas productoras. Dichos
métodos fueron descritos en el expediente presentado para el registro del producto final
obtenido IC-GIB.

3.1.2 Desarrollo de métodos para la determinación de Auxinas

Para el desarrollo de estos métodos se realizó inicialmente el estudio de las condiciones

cromatográficas, con el objetivo de establecer una técnica isocrática para la
determinación, dentro del grupo de las Auxinas, de los indoles acídicos AIA, AIP, AIB y
EEAIA, sin necesidad de derivatización, al igual que se logró con los métodos

43
implementados para las GAs. Considerando las diferentes opciones de detección que
mostró el estudio bibliográfico (Sandberg, 1987), se probó la utilización, tanto de la
detección UV como la de Fluorescencia, teniendo en cuenta, las ventajas de la detección
por fluorescencia, que siempre se resalta por diversos autores (Lebuhn, 1993).

Detección UV
Para la detección UV se empleó un Detector fotométrico de ordenamiento de diodos
(DOD). Al implementar una técnica isocrática, se observó que se lograba la resolución de
los patrones de Indoles, pero no de la muestra. Ante esta situación se requirió implementar
un gradiente de elución que permitiera la separación e identificación de los picos de los
indoles acídicos en la muestra. Con este objetivo se realizaron pruebas con diferentes
gradientes y se encontró que con una variación lineal del 20 al 80% de metanol durante 20
min a un flujo de 1,5 mL/min, se logra una resolución adecuada en un tiempo de corrida de
30 min, aunque el cromatograma de la muestra se observa complejo por el gran número
de picos. La figura 5 muestra el cromatograma de los patrones y la muestra.

K-2800[1] K-2800[1]
250
MP-AIA -A M-
EEAIA
AIA AIP
200
AIB

150

mA
100

50

-50

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Minutes

Figura 5. Cromatograma por CLAR con detección UV de los patrones de Indoles y de un extracto de
un caldo fermentado (columna Hypersil ODS, fase móvil metanol: ácido acético 0.5%, que varió de
20% de metanol a 80 % en 20 min a un flujo de 1,5 mL/min, UV 280 nm)

44
Además, se estudió la influencia del BHT como antioxidante, durante la extracción líquido-
líquido utilizada en la preparación de la muestra y se concluyó que no existe diferencia
significativa entre los valores obtenidos con y sin dicho compuesto, siempre que se tengan
los mínimos cuidados de protección de la luz durante la preparación de la muestra. Esto
puede deberse a las mayores concentraciones presentes en el caldo fermentado y al
menor tiempo de esta extracción con respecto al utilizado en el procedimiento para tejidos
vegetales, para los que sí es necesario el uso de un antioxidante (Sandberg, 1987).

Con el objetivo de determinar la pureza del pico de AIA, se aprovechó la ventaja que
brinda este tipo de detector DOD y se estudió el grado de similitud entre los espectros del
pico, en el patrón y la muestra; como resultado de lo cual se obtuvo una similitud de 0,98,
comparación que puede apreciarse en la figura 6. Esto constituyó un elemento más para la
identificación del pico, ya que la comparación cromatográfica con patrones no es
suficiente.

500 500
Muestra Patrón

400 Library: C:/|ChromGate/Data/Library 400

General.Lib
Source:
C:/|ChromGate/Projects/AIA/Data/MP-AIA
Retention Time: 13.17 min
300 Similarity: 0.98 300

mAU
200 200

100 100

0 0

200 300 400 500

W avelength
Figura 6. Comparación de los espectros del pico de AIA del patrón y de la muestra para el estudio de
pureza (Detector DOD, intervalo de λ entre 200 y 500 nm)

45
Detección por fluorescencia

Considerando que al implementar una técnica isocrática utilizando la detección UV no se

logró la resolución de los picos en las muestras, se estudió, en el caso de la detección de
Fluorescencia, diferentes composiciones de fase móvil y se logró un resultado satisfactorio
con una relación de Metanol: Acido Acético 0.5% (v/v) (60:40) (v/v), la que coincide con la
reportada por diversos autores (Crozier, 1988 y Jensen, 1995). Se estudiaron diferentes
flujos de fase móvil y se decidió utilizar 0,7 mL/min, ya que con éste se logró una
resolución a nivel de línea base en un tiempo de análisis de 20 min. Se realizó el estudio
de sensibilidad con patrones y se observó saturación de los picos al utilizar sensibilidad
alta, por lo cual se decidió utilizar sensibilidad baja, con un rango de 16, lo que permitió
obtener alturas adecuadas de los picos (figura 7).

Patrón AIP
Muestra AIA

AIB

EEAIA

0 5 10 15 20 min
Figura 7. Cromatograma por CLAR y detección de Fluorescencia de los patrones de Indoles y de una
muestra (columna Hypersil ODS, fase móvil metanol: ácido acético 0.5% (v/v) (60:40) (v/v), flujo de 0,7
mL/min, detección por fluorescencia λ exc 280 nm y de λ em 340 nm)

46
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, al estudiar las condiciones cromatográficas
utilizando ambos tipos de detección, se decidió utilizar la detección por Fluorescencia,
considerando la limpieza de los cromatogramas de las muestras respecto a los obtenidos
por UV. Esto corrobora lo planteado por diferentes autores (Sandberg, 1987) sobre la
mayor selectividad y sensibilidad de este tipo de detección, la cual puede ser usada por la
propiedad inherente de la mayoría de los indoles de fluorescer, y evita la derivatización de
la muestra.

Considerando, que la columna de fase invertida C18 es la más reportada en la literatura

para el ánalisis de los Indoles, se utilizó una Hypersil C18 (25 cm x 4,6 mm i.d.). En la
tabla IX se muestran los tiempos de retención (media, error absoluto y coeficientes de
variación) de los distintos indoles, mostrando una variabilidad menor que el 0,5% para
n=15 en todos los casos.

Tabla IX. Tiempos de Retención por CLAR de los Indoles

Indoles Tiempo de Retención
Media (Min) CV (%)
AIA 9,08 ± 0,03 0,33
AIP 10,81 ± 0,04 0,37
AIB 13,02 ± 0,06 0,46
EEAIA 17,56 ± 0,07 0,39

Aunque de los Indoles patrones, el que nos interesa es el AIA, en el estudio de linealidad
se incluyeron los demás, considerando una futura posibilidad de utilizar este método para
la determinación de estos compuestos. Para el estudio, primero se verificó que los datos
obtenidos estuvieran libres de errores burdos y luego se verificó la homogeneidad de las
varianzas para las diferentes muestras analizadas y se realizó una regresión lineal simple
según el modelo y = a + b x , donde “y” es el área del pico cromatográfico y “x” es la
concentración real de cada Indol en cada disolución inyectada.

47
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla X, donde la evaluación de la linealidad
de la técnica para cada ácido indólico, con la detección por Fluorescencia, se realizó
considerando un intervalo entre el 20 y 200% del valor nominal de concentración (de 22 a
220 mg/L).

Tabla X. Estudio de linealidad de los Indoles por CLAR.

Indoles r CV(%) b Sbrel (%) a LC1 LC2

del Fr

AIA 0,9995 1,6 1128,94 1,7 1,09 -4,5 6,7

AIP 0,9997 2,6 1231,98 1,2 -2,20 -6,3 1,9
AIB 0,9997 4,1 1140,37 1,2 -1,52 -5,3 2,3
EEAIA 0,9998 3,9 934,02 1,1 -1,65 -4,6 1,3

Como puede apreciarse en la Tabla anterior, se obtuvieron coeficientes de correlación (r)

mayores que 0,999 para todas los Indoles, los CV de los factores de respuesta fueron
inferiores al 5%, la desviación estándar relativa de la pendiente (Sbrel) fue inferior al 2%
para cada Indol y los límites de confianza (LC1 y LC2) del intercepto (a) incluyeron al cero;
cumpliéndose así con los criterios de linealidad planteados en la Norma Cubana (2001).

Considerando la posibilidad de utilizar la técnica analítica en el seguimiento de la cinética

de la fermentación se realizó la determinación de los límites de detección y cuantificación
para el AIA, obtenidos en las condiciones de análisis, los cuales fueron expresados en ng
inyectados en la columna. Los resultados obtenidos fueron 5 ng y 20 ng respectivamente,
lo cual permite la determinación de este producto aún en la primeras etapas del proceso
de fermentación.

En la tabla XI se muestran los resultados obtenidos en el estudio de precisión del método

cromatográfico para el AIA, en el cual se determinó la repetibilidad tanto del sistema
instrumental como del método y la precisión intermedia del método.

48
 Tabla XI. Estudio de precisión del método para el AIA
Conc. Media Repetibilidad Precisión Intermedia
De AIA Sistema Instrumental Método Método
(mg/L) CV (%) n=10 CV (%) n=6 CV (%) n=9
114 0,5 1,7 2,1

Como se puede apreciar en la tabla anterior, la precisión del sistema instrumental para el
AIA resultó adecuada al presentar CV = 0,5%, la repetibilidad y precisión intermedia del
método también resultaron adecuadas, al estar dadas por CV < 4%.

La exactitud se evaluó por adición del patrón antes de realizar la extracción líquido-líquido,
ya que no se disponía de una muestra de concentración conocida, ni de un placebo, y la
misma se expresó en forma de porcentaje de recuperación. La tabla XII muestra los
resultados del estudio de exactitud para el AIA con un caldo al cual se le añadió la
disolución del patrón. La recuperación media fue de 98,8 %, la cual se puede considerar
satisfactoria ya que al aplicar la prueba de la t de Student se encontró que no existe
diferencia significativa entre la recuperación media y el 100%,al ser la texp menor que la
tabulada.

Tabla XII. Estudio de exactitud del método para el AIA

CONC. AÑADIDA (mg/L) RECUPERACIÓN (%)

99,64 98,8

Como resultado del desarrollo analítico, se establecieron dos técnicas por CLAR, una con
gradiente y con un detector DOD y otra isocrática con detección por fluorescencia con muy
buena resolución, para la determinación de AIA, AIP, AIB y EEAIA. Se estudió la fiabilidad
de esta última, para la determinación de AIA, obteniéndose el cumplimiento de los
parámetros de linealidad y una buena precisión y exactitud del método. Se corroboró la
mayor selectividad y sensibilidad de la detección por fluorescencia con respecto a la

49
detección UV para la determinación de auxinas. El desarrollo de estos métodos permitió
conocer que el crudo fermentado presentó en cantidad mayoritaria al Ácido Indol Acético
(AIA). Además, permitió definir las condiciones óptimas de fermentación, y realizar el
estudio de cepas productoras. Dichos métodos fueron descritos en el expediente
presentado para el registro del producto final obtenido BIOINDOL.

3.2 Cromatografía de Capa Fina (CCF)

Con el objetivo de tener métodos alternativos cualitativos más sencillos y menos costosos,
se decidió implementar métodos por cromatografía de capa fina que pudieran ser
utilizados en el laboratorio, de forma rutinaria, en el seguimiento de la fermentación.
3.2.1 Método para la determinación de Giberelinas
Para la determinación de las GAs por CCF se reprodujeron las condiciones
cromatográficas reportadas por Kumar y Lonsane (1986), para ello se aplicaron los
patrones de GAs y la misma muestra en forma de caldo crudo y después de realizar la
extracción. La figura 8 muestra las manchas y Rf obtenidos, y como se puede apreciar, no
se logra la separación de los pares de isómeros de doble enlace: GA3 /GA1 y GA4/GA7, lo
cual coincide con lo planteado en la literatura (Ortega y Castillo, 1999) acerca de la
dificultad para separarlos por esta técnica.

Las manchas observadas correspondientes a los patrones GA3 y GA1 presentaron color
azul intenso bajo luz ultravioleta-visible después de ser revelada la placa. En el caldo
crudo fueron detectadas manchas con fluorescencias de color azul correspondientes a
valores de Rf 0,34 y 0,40; siendo la primera más intensa y coincidiendo con los patrones
de GA3 y GA1, lo cual indica la presencia del Ácido giberélico y de la GA1 en la muestra.
La coloración azul intensa es específica para las giberelinas A1, A2, A3, y A9. Además,
fueron observadas manchas de color carmelita a los valores de Rf 0,46 ; 0,51; 0,61; 0,70
con diferentes intensidades, dicha coloración está reportada para las giberelinas A4 y A7
(Pozo, 1986). Las giberelinas GA4 y GA7 presentaron Rf de 0,45 y 0,46; coincidentes con
los observados en el caldo y el extracto, pero que resultaron de menor intensidad con
respecto al ácido giberélico. Después de realizar la extracción se dejan de observar lgunas
manchas; la primera, que coincide con el ácido giberélico, siguió siendo la más intensa.

50
 Rf

0.70

0.61

0.51

0.46
0.45

0.40

0.34
0.33

0.00 ........ ....... ........ ........ ......... .........

GA3 GA1 GA4 GA7 Caldo Extracto

Figura 8. Cromatograma de CCF de los patrones de GAs y una muestra (caldo y

extracto) (Silica gel G, Sistema de Disolventes: Cloroformo/Acetato de Etilo/ Ácido
acético (5:4:1), revelador mezcla de ácido sulfúrico–etanol (95:5)) (Kumar y
Lonsane, 1986).

51
3.2.2 Método para la determinación de Auxinas
Para la determinación de los Indoles por CCF, se utilizó el sistema de disolventes
reportado por Fuentes-Ramírez (1993): benceno/acetato de etilo/ácido acético (70:25:5) y
se aplicaron los patrones y la misma muestra en forma de caldo crudo y después de
realizar la extracción. La figura 9 muestra las manchas y los Rf obtenidos.

Rf

0.61

0.57

0.55

0.50

0.45

0.40

0.30

0.26

0.16

0.00 ........ ....... ....... ....... ....... ........ ........

AIA AIP AIB AILác. AIPir. Caldo Extracto

Figura 9. Cromatograma de CCF de los patrones de Indoles y una muestra (caldo y extracto)
(Silica gel HF254, Sistema de Disolventes: benceno/acetato de etilo/ácido acético (70:25:5),
revelador disolución de Salkowski (Fuentes-Ramírez, 1993)

52
Como puede apreciarse en la figura 9, al analizar el extracto de la muestra se observó una
mancha con el mismo Rf del ácido indol acético (0,50), la cual presentó una coloración
rosada intensa después de ser asperjada con la disolución de salkowski, y bajo luz UV a
366 nm se observó de color violeta azulado. El Rf del patrón de AIB (0,57) coincide con el
de una de las manchas observadas para la muestra, pero su color es muy tenue, debido a
que está presente en una concentración mucho menor que la del AIA. También se observó
una mancha con Rf 0,16 en el caldo crudo, la que fluoresce con una coloración amarilla
intensa bajo luz UV a 366 nm y que no coincide con ninguno de los patrones aplicados. No
se observó evidencia de que la muestra contenga Acido Indol Pirúvico (AIPir.) ni Acido
Indol Láctico (AILac.), al no coincidir las manchas de estos patrones con ninguna de las de
la muestra.

En la figura se aprecia que después de realizada la extracción se eliminan algunas

manchas; y considerando los resultados obtenidos, se puede concluir que el crudo
fermentado contiene además de AIA, el AIB en mucha menor concentración. Además, se
aprecia la presencia de otros metabolitos que también se extraen y que se logran separar
con el sistema de disolventes utilizado, pero que no fueron identificados.

Las técnicas de Cromatografía de Capa Fina, establecidas tanto para las Giberelinas
como para las Auxinas, permitieron definir que la extracción líquido-líquido, permite
purificar de cierta manera los caldos de fermentación y verificar la presencia de estos
compuestos, y otros metabolitos, en los caldos fermentados y en sus extractos.

53
CONCLUSIONES
 CONCLUSIONES

• Se logró poner a punto métodos analíticos isocráticos por CLAR, con buena resolución
y sin necesidad de derivatización, para las giberelinas: GA3, GA4 y GA7, así como para el
Ácido Indol Acético (AIA). Dichos métodos demostraron cumplir con los criterios de
linealidad, precisión y exactitud exigidos por la Norma Cubana para ensayos Químicos del
2001.
• Como parte del desarrollo del método por CLAR para la determinación de AIA se
corroboró la mayor selectividad y sensibilidad de la detección por fluorescencia con
respecto a la detección UV, así como la posibilidad de utilizar la detección fotométrica de
ordenamiento de diodos.
• Se logró la implementación de técnicas por Cromatografía de Capa Fina como posibles
métodos alternativos cualitativos para determinar la presencia de Giberelinas y Auxinas
en el seguimiento de la fermentación.

54
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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