Fasdfaf

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE AGRONOMÍA
ÁREA TECNOLÓGICA
SUBÁREA DE PROTECCIÓN DE PLANTAS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA
SEGUNDO SEMESTRE 2019
MANUAL DE PRÁCTICAS
MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA
Ing. Agr. Gustavo Adolfo Álvarez Valenzuela

P. Agra. Jackeline Montes de Oca Cordova
EDICIÓN 2019
PRESENTACIÓN
El instructivo de prácticas de laboratorio para el curso de microbiología agrícola es

una herramienta pedagógica que debe innovarse constantemente para acoplarse a
los avances científicos dentro de la disciplina, es por ello que la presente edición
presenta un reordenamiento de las prácticas y cambios en los procesos de las
mismas para el presente ciclo de estudios.
El curso de Microbiología Agrícola explica las interacciones microbianas con la

Agronomía de los fenómenos que son favorables o detrimentales en la producción,
ya sea agrícola o forestal, es un enfoque amplio y sienta las bases de conocimientos
para su complementación en los cursos posteriores.
El instructivo agrupa las prácticas que se imparten según el programa del curso, se
utiliza la metodología enseñanza-aprendizaje de tipo constructivista, donde se
garantiza mayor comprensión del estudiante, fija conocimiento de tal manera que
es él quien desarrolla toda la investigación, desde el planteamiento básico del
problema hasta la comprensión total del fenómeno.
Cada una de las prácticas tiene el siguiente contenido:

 Presentación del fenómeno: en forma muy general; sirve de guía al estudiante
para reconocer los límites del fenómeno a investigar.
 Objetivos: indican qué conocimientos se espera obtener de la práctica a
realizar.
 Instrucciones pre-práctica: indican al estudiante qué tópicos deberá investigar,
qué materiales debe colectar, y qué actividades debe realizar previo a la
práctica en el laboratorio.
 Ingreso al laboratorio: es claro sobre lo que debe aportar cada estudiante para
poder desarrollar la actividad de la práctica.
 Material y equipo: enumera todos los materiales y el equipo a utilizar para el
desarrollo de la práctica.
 Procedimiento experimental: explica en forma lógica y ordenada todos los
procesos a realizar para el estudio de los fenómenos.
 Cuadro de observaciones y apuntes de laboratorio: es un espacio para que el
estudiante anote, describa y esquematice todos los procesos desarrollados en
el laboratorio con el objeto que le sirvan de referencia para el desarrollo del
informe final.
 Actividad post-práctica: indica al estudiante lo que debe hacer para
complementar la práctica, que va desde el seguimiento del desarrollo de la
práctica hasta la obtención de resultados y la elaboración del informe final, en
el cual debe explicar lo obtenido y lo comprendido. Puede incluir un informe
final con una comprensión de conocimientos o simplemente un informe de
resultados, esto dependerá de cada tipo de práctica a desarrollar.
INDICE DE PRÁCTICAS
NO. DE
PRÁCTICA NOMBRE DE LA PRACTICA
SESIONES
1 El laboratorio de Microbiología Agrícola 1
Microscopía, técnicas de montaje y observación de

2 microorganismos 1
Métodos de esterilización y preparación de medios

3 1
de cultivo
Omnipresencia de los microorganismos en la

4 1
naturaleza
5 Reconocimiento e identificación de microorganismos 1
6 Diatomeas y el cambio climático 1
7 Medición y conteo de microorganismos 1
8 Fijación simbiótica de nitrógeno 1
9 Microorganismos del suelo 1
10 Microbiología de la leche 1
El papel de las micorrizas en la rizosfera (micorrizas

11 1
arbusculares y ectomicorrizas)
12 Técnicas de aislamiento y cultivo de microorganismos 1
Preparaciones microscópicas y estudio de morfología

13 1
de hongos verdaderos y hongos no verdaderos
NORMATIVA PARA EL USO DE LAS INSTALACIONES DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA
Conducta dentro del laboratorio. Los estudiantes se deben de conducir dentro de

las instalaciones observando las normas de urbanidad e higiene por respeto
asimismo y a sus compañeros y personal docente y de laboratorio.
Horarios y puntualidad. Los estudiantes deberán presentarse puntualmente a la

sesión de laboratorio según el día y hora asignados de lo contrario no se les
permitirá el ingreso.
Materiales de laboratorio. Para ingresar al laboratorio deberá entregar los

materiales solicitados para la ejecución de la práctica correspondiente al día de
laboratorio, de lo contrario no podrá ingresar.
Reportes. Los reportes electrónicos deberán ser enviados un día antes de la

práctica y en el caso de trabajos escritos al momento de ingresar al laboratorio.
Reposición de laboratorios. No se permite realizar la práctica otro día al que se

asignó el estudiante para evitar problemas de hacinamiento, descontrol de grupos
de trabajo y escasez de equipos, salvo situaciones derivadas de feriados o casos
fortuitos de cierre de edificios.
Sistemas de comunicación. Se prohíbe el uso de IPod, Tablet, celulares, radios

etc, en horarios de impartición de laboratorio.
Tareas. La realización de tareas se deberá acoplar al horario de las instalaciones y

personal del mismo de 9:00 a 17:00 horas.
Uso de bata. El uso de la bata es necesario y obligado para evitar que

derramamientos o salpicaduras de reactivos manchen o afecten la ropa, así como
la piel, además puede proteger de quemaduras.
Uso y cuidados del equipo de laboratorio. Es obligación de los estudiantes usar

equipo con responsabilidad y con el cuidado necesario para evitar daños o pérdidas.
PRÁCTICA 1
EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Un laboratorio de microbiología constituye un lugar de trabajo, enseñanza y de

investigación de microrganismos, por lo tanto, debe tener estructura física mínima y
consiste en ambientes con finalidades específicas e incluye las siguientes áreas:
mesas de trabajo, bodega, cuarto estéril para aislamiento, así como el equipo básico
para el manejo de microorganismos, cristalería y reactivos básicos para su
operatividad.
I. OBJETIVOS
 Mostrar a los estudiantes las áreas de trabajo, equipo, reactivos y la
organización que debe tener un laboratorio de microbiología agrícola.
 Indicar el uso correcto del laboratorio, normas de comportamiento y
seguridad para evitar accidentes.
II. INSTRUCCIONES PRE-PRÁCTICA

 Preparar un documento hecho a mano e investigar en base a búsqueda en
libros de Biología, Microbiología, páginas de Internet, etc. sobre el siguiente
tópico: Características de un laboratorio de microbiología (TODAS LAS
PRACTICAS DE LABORATORIO SE REALIZARAN CON ESTA
DINAMICA).
 Preparar una caja especial de instrumentos (puede ser una cajilla de
herramientas pequeña), la cual utilizará durante todo el semestre y en los
siguientes cursos del área. Deberá presentarla individualmente. Dicha cajilla
deberá contener:
 Tres frascos con goteros  10 hojas de cartoncillo o
pequeños. cartulina blanca de 8 x 8
 Un paquete de porta cm.
objetos.  Dos agujas de disección
 Una onza de cubre de punta fina.
objetos (1 caja).  Lápiz, un marcador punto
 Un paquete de hisopos. fino indeleble.
 Un paquete de hojas de  Pinzas de punta fina.
afeitar marca Gillette o en  Un blíster de etiquetas
su defecto, hojas de pequeñas autoadhesivas,
bisturí con su respectivo arandelas autoadhesivas
mango. y en el futuro ira
 Un paquete de palillos de agregando otros
dientes. materiales que considere
 Un paquete de papel necesarios para la
kleenex facial. realización de las
prácticas.
III. AL INGRESO A LABORATORIO
 Entregar el informe de pre-práctica No.1 y presentar la caja especial al
ingresar al laboratorio.
IV. MATERIAL Y EQUIPO

 Autoclave, olla de presión
 Horno
 Cámara de flujo laminar
 Microscopio y estereoscopio
 Reactivos
 Cristalería
 Colorantes
 Mesas de trabajo
 Otros.
V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Reconocimiento del laboratorio de microbiología agrícola
 Proyección de video sobre las áreas de un laboratorio de microbiología.
 Proyección de un video sobre la seguridad de un laboratorio de microbiología.
 Recorrido por el laboratorio de microbiología de la FAUSAC. Se indicará a
los estudiantes, los ambientes utilizados en la manipulación o el estudio de
microorganismos y el equipo correspondiente. Se hará un reconocimiento de:
 Área de esterilización
 Área de aislamiento y manipulación de microorganismos
 Área de trabajo
 Área de bodega
VI. ACTIVIDADES POST-PRÁCTICA

Resuelva los siguientes enunciados:
 Escriba los cuidados que se deben de tener en el manejo del equipo que se
utiliza en el laboratorio (Ej. Autoclave, ollas, microscopio, etc.). Dibuje o
adjunte cada equipo y señale sus partes.
 Según su criterio diseñe un laboratorio de microbiología agrícola, considere
los aspectos vistos en la práctica.
 Haga un análisis del laboratorio de microbiología de la FAUSAC, justifique
sus observaciones.
PRÁCTICA 2
MICROSCOPÍA, TECNICAS DE MONTAJE Y OBSERVACION DE
MICROORGANISMOS
La Microbiología es la rama de la Biología que se ocupa del estudio de los

microorganismos, los cuales no pueden ser apreciados a simple vista, por ello ésta
rama de la ciencia evolucionó y se desarrolló a partir de la invención del microscopio,
con ello pudo observarse el universo de las criaturas microscópicas.
I. OBJETIVOS
 Conocer el uso y cuidados del equipo de microscopía.
 Conocer y manejar el equipo de laboratorio para la observación de
microorganismos.
 Diferenciar grupos de microorganismos en base a la observación.

 Preparar el documento hecho a mano e investigar en base a búsqueda en
libros de Biología, Microbiología, páginas de Internet, etc. sobre los
siguientes tópicos: Microscopía, Tipos de microscopio (lentes simples o
lupas, estereoscopio y microscopio), sistemas del microscopio
compuesto, sus usos y cuidados y tipos estereoscopio.

 Entregar el informe de pre-práctica No. 2 y pos-práctica No. 1 al ingresar al
laboratorio.
 Presentar la caja de equipo de laboratorio y bata. No se permitirá el ingreso
a la práctica si no cumple con este requisito en especial.

 Muestras de material biológico.
 Cajas con instrumental para laboratorio.
 Microscopios, estereoscopios.
 Vidrios de reloj, cajas de Petri, tubos de ensayo, etc.
 Medios de cultivo, reactivos, aceite de inmersión.
 Lactofenol claro, rojo y azul, montajes preparados.
 Agua destilada estéril, hojas de afeitar, papel toalla, papel filtro, algodón.
 El Microscopio
Se hará una exposición teórico-práctica sobre: partes, funcionamiento y cuidados
del microscopio y estereoscopio para la resolución de las dudas generadas durante
el proceso de investigación. (Complete esta imagen con los datos de que son y para
qué sirven las partes que señalan las líneas, para responder al examen que se hará
al inicio de la práctica) (Incluirla en el resumen).
Microscopio óptico
 USO Y CUIDADOS DEL MICROSCOPIO

 Levante siempre el microscopio por el brazo.
 No tocar las lentes con los dedos, ni permitir el contacto con líquidos
 No hacer derrame de líquidos sobre la platina.
 guardarlos siempre para protegerlos del polvo.
 Portaobjetos y cubreobjetos deben estar secos y limpios.
 Siempre examine el objeto de la siguiente manera:
o A la vista de una lupa.
o Con el estereoscopio.
o Con el microscopio.
o Utilizar porta y cubreobjetos
o En el microscopio no observe sin que el objeto a observar esté provisto
de un cubreobjetos.
o Enfoque: primero se realiza con aumento pequeño (objetivo 4X, 10X)
para acercar el objetivo lentamente al objeto, hasta que esté en el
centro del campo, mediante el tornillo macrométrico (enfoque
grosero), y luego girando el tornillo micrométrico para dar un enfoque
más preciso (enfoque fino).
o Al usar condensador, se debe enfocar cuidadosamente, debido que
algunos tipos están casi en contacto con la superficie inferior del
portaobjetos.
o Observe a través del microscopio con ambos ojos a la vez.
o Mantenga una libreta u hoja de papel para realizar las anotaciones.
o Estudie el objeto cuidadosamente antes de iniciar a dibujarlo.
o Cuando se utilice el lente 100x o de inmersión debe colocar una gota
de aceite previo a ubicar el lente objetivo sobre el objeto de
observación.
o Después de utilizar el objetivo de inmersión, limpie cuidadosamente el
aceite del objetivo y del portaobjetos utilizando alcohol aplicado a un
paño suave y limpio o en papel absorbente suave.
o Limpiar la superficie externa de las lentes, si están empolvadas con
una gamuza limpia y suave. Puede usarse un paño mojado con
alcohol cuando la suciedad es mayor.
o Nunca desmonte los lentes oculares y objetivos.
o El polvo es el peor enemigo de los instrumentos ópticos, por lo que
deben protegerse cubriéndolos cuando no se están utilizando.
 OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO
La observación microscópica constituye la primera etapa del estudio de los
microorganismos y también del diagnóstico microbiológico. Permite conocer
características de los microorganismos como: forma, disposición o agrupación,
presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc.
Existen numerosas técnicas para la observación de los microorganismos y

dependiendo del tipo del que se trate se podrán aplicar diferentes técnicas.
Para la observación de microorganismos se deben de considerar:

 Preparar adecuadamente su equipo de microscopía para su uso, (ubicación,
limpieza, encendido, calibrado etc.).
 Observar los materiales biológicos y agua, utilizando el equipo necesario. Se
observará primeramente al estereoscopio a utilizando los aumentos que
proporciona (x 20, x 30, x 40).
Microorganismos del agua

 Colocar 5 cc de agua de la muestra que se le proporcionara en un vidrio
de reloj y observarla al estereoscopio (hacer anotaciones y dibujo de lo
observado)
 Con ayuda de un palillo de dientes agitar la
muestra en el vidrio de reloj y tomar una gota de
agua y colocarla en un portaobjetos y poner
cubreobjetos para observar en el microscopio.
Observarla en 3.5x (si tiene el lente el
microscopio), 10x y 40x.
 Realizar el mismo montaje de la gota de agua,
sólo que ahora mezcle una gota de solución de
goma arábiga.
 Repita el montaje solo que ahora con una gota de Protozoos.
formaldehido al 10%.
 Dibuje lo observado y anote resultados.
Preparaciones de hongos
 Se le entregaran laminilla de montajes permanentes de hongos.
 Proceda a colocarlo en la platina del microscopio.
 Con el lente de menor aumento ubique el espécimen y afine la visión.
 Pase al lente de mayor aumento (10X) describa y dibuje lo observado.
 Coloque el lente 40X y afine la visión, describa y dibuje lo observado.
Observación de bacterias
 En fresco
 Se le proporcionara un medio de cultivo o una solución en la cual
habrán en suspensión bacterias.
 Con un gotero colocar una gota de la suspensión en uno de los
extremos de la porta objetos.
 Colocarle un cubre objetos y observar con el lente de menor aumento,
describir lo observado.
 Proceda a aumentar la visión con el lente 40X o 45X, describa y dibuje
lo observado.
 Retire el lente 45X y baje levemente la platina.
 Coloque una gota de aceite de inmersión en el punto bajo observación.
 Proceda a colocar en la posición el lente 100X.
 Suba lentamente la platina hasta entrar en contacto con el aceite.
 A partir de ese momento mueva lentamente el tornillo micrométrico y
ajuste la visión.
 Ubique las bacterias por su forma y movimiento describa y dibuje lo
observado.
 En seco
 Realice un frotis de bacterias.
 Con la ayuda de un asa, tomar una pequeña porción de bacterias a
partir de un medio de cultivo.
 En el extremo de un portaobjetos, colocar una gota de agua destilada
estéril.
 Diluir la asada de bacterias en la gota de agua, cuidando de que no
quede ni muy concentrado, ni muy diluido.
 Secar el montaje al medio ambiente o flameado ligeramente en un
mechero.
 Coloque el montaje sobre la platina cuidando de que las bacterias
queden hacia la parte superior.
 No coloque cubreobjetos.
 Coloque el lente 10X y observe.
 Realice los pasos d) a j) del inciso anterior.
Observación de nematodos
Los nematodos son organismos pertenecientes del reino Animal, microscópicos por
lo que se necesita de equipo de microscopia para el estudio de características de
tamaño y coloración.
 Agitar la muestra de 20 cc de una extracción de nematodos que se le
proporcione en el laboratorio.
 Con ayuda de una pipeta obtener una porción y trasladarla a un vidrio de
reloj.
 Observar al estereoscopio utilizando luz difractante.
 Anotar lo observado.
 Hacer anotaciones de sus observaciones en los espacios preparados en el
instructivo y en el cuaderno de laboratorio.
 Realizar una revisión bibliográfica completa sobre los temas desarrollados y
sobre lo observado en el laboratorio. Describa que otros equipos que se
utilizan en el laboratorio de microbiología Discutir y comparar los resultados
con esta revisión.
 Presentar un reporte post-práctica que incluya el análisis y discusión de los
resultados apoyados por la investigación realizada.
 Entregar el siguiente cuestionario como anexo al reporte post-práctica:
 ¿Qué significan los números que tienen los lentes objetivos de los
equipos de microscopia?
 ¿Qué aumento se logra con la combinación de lentes oculares y
objetivos según el equipo que utilizo, describa la marca y el modelo?
PRÁCTICA 3
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Los microorganismos son omnipresentes, en todo el medio ambiente, en el aire la

presencia es de forma transitoria mientras llegan a un sustrato donde puedan
reproducirse. Cuando son indeseables en el substrato se les denomina
contaminantes y para eliminarlos es necesario desarrollar el proceso denominado
esterilización.
Además, como parte del estudio de los microorganismos es necesario aislarlos en
sustratos adecuados para el crecimiento de los mismos. A éstos se les denomina
medios de cultivo.
I. OBJETIVOS
 Conocer las técnicas de esterilización utilizadas en laboratorios de
microbiología.
 Conocer los distintos tipos de medios de cultivo que existen.
 Elaborar medios de cultivos básicos para el aislamiento de hongos y
bacterias.

 Efectúe investigación in situ en los laboratorios de microbiología de la
Facultad de Agronomía sobre los aparatos para esterilización y los métodos
más utilizados. Además, realice búsqueda de información en libros de
Microbiología, páginas de Internet, etc. sobre los siguientes tópicos:
desinfección, sanitización, esterilización, asepsia, métodos, técnicas y
equipo necesario para la esterilización en laboratorios microbiológicos
y esterilización usando el microondas, medios de cultivo, componentes
y sus características, preparación de medios de cultivo.
 Traer al laboratorio en pareja: dos papas medianas y un jugo V-8 importado
(no de marca nacional).

 Entregar los materiales solicitados.
 Entregar el informe de pre-práctica No. 3 y pos-práctica No. 2 al ingresar al
laboratorio.

 Materiales para preparación de medios de cultivo
 Reactivos
 Instrumental de laboratorio, cristalería
 Horno Pasteur
 Autoclaves
 Cámara de aislamiento
Se realizará la exposición sobre los métodos y técnicas de esterilización y
elaboración de medios de cultivo. Seguidamente se procederá a la ejecución de la
parte práctica.
ESTERILIZACIÓN CON CALOR

 Calor Seco
Horno Pasteur: esterilización de cristalería y otros materiales.
 Prepare el material a esterilizar según las instrucciones de laboratorio. Para
el efecto, se preparan pipetas, vidrios de reloj y cajas Petri en cilindros
contenedores y en papel y como otro material, aceite mineral contenido en
Erlenmeyer.
 Encender el Horno Pasteur.
 Calibrar el horno en 160° C.
 Coloque el material preparado en el horno.
 Cerrar el horno.
 Esperar a que alcance la temperatura de
calibración.
 A partir de este momento, esperar el periodo
de 90 minutos.
 Pasado el tiempo, debe apagar el horno.
 Retire los materiales esterilizados.
Fuego Directo: esterilización de instrumental metálico como pinzas, agujas, asas,

boquillas de pipetas y frascos, bordes de cajas Petri.
 Encienda el mechero.
 Tome un asa y colóquela sobre la llama, hasta que
se ponga al rojo vivo. El asa se coloca vertical
sobre la llama, la aguja de disección se coloca en
forma inclinada y las pinzas en forma horizontal.
 Enfríe el instrumento en alcohol.
 Flameo de boquillas de pipeta, frascos, cajas de
Petri y para el efecto se procederá a practicar bajo
la instrucción del profesor.
 Calor Húmedo
Se explicará el funcionamiento del autoclave y de la olla de presión. Se utilizarán
ambos en la demostración.
Autoclave: esterilización de agua, medios de cultivo tanto líquidos como

semisólidos a base de agar, cristalería, y materiales o sustancias inflamables que
no pueden ser esterilizadas con calor seco.
 Verifique que la llave del chaleco y cámara estén cerradas.
 Verifique que los manómetros no marquen presión y el termómetro no
marque temperatura.
 Encienda el autoclave, espere de 10 a 15 minutos mientras el vapor de agua
se concentra en el chaleco.
 Esperar que la presión alcance las 20 PSI.
 Abra la autoclave, verifique siempre que el
manómetro de la cámara no marque ninguna
presión.
 Coloque los materiales a esterilizar y cierre la
autoclave.
 Abra la llave de paso del chaleco a la cámara,
observar que la presión en el manómetro marque
20 PSI.
 Espere a que la presión en la cámara se
estandarice a 20 PSI y 120° C.
 Espere 20 minutos a partir de la estandarización.
 Cuando haya terminado el periodo de
esterilización, apague la autoclave. Abra
lentamente la llave de purga del aparato.
 Espere a que baje la presión totalmente y saque
el material estéril.
Olla de presión
 Abra la olla y verifique que tiene la parrilla.
 Llene de agua hasta el borde superior de la resistencia
(observe la marca indicadora).
 Coloque los materiales que esterilizará ordenados
debidamente y sin colocar sobrecarga. Los materiales
deberán estar acomodados sin colocar unos sobre
otros.
 Coloque la tapa, cierre los sistemas de seguridad.
 Conecte la olla y enciéndala.
 Esperar cinco minutos. Cuando el manómetro indique que existe presión,
proceda a realizar el proceso de purga. Éste consiste en abrir la válvula de
seguridad para dejar que escape aire y vapor. Repita este procedimiento dos
veces llevando el manómetro a cero.
 Espere a que suba nuevamente la presión, hasta alcanzar las 20 PSI.
 Tome el tiempo de esterilización (20 minutos) a partir de este momento.
 Cada dos a tres minutos verifique que la presión no sobrepase la escala de
20 PSI (área roja del manómetro).
 Cuando se sobrepase de la presión, realice purgas suaves, regresando a la
presión deseada utilizando la válvula de escape de la olla.
 Una vez terminado el periodo de esterilización, proceda a apagar el aparato.
 Abra nuevamente la llave de purga y proceda a vaciar todo el vapor, hasta
llegar el manómetro a 0 PSI.
 Una vez terminada dicha operación, proceda a retirar los materiales, dejarlos
enfriar y resguardarlos según sea el caso.
ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
 Filtración de líquidos: uso de un sistema de vacío y filtros Buchner en forma
demostrativa.
 Filtración de Aire: se visitará el salón donde se encuentra la cámara de
aislamiento y se explicará el funcionamiento.
ESTERILIZACIÓN POR IRRADIACIÓN

 Uso de la luz ultravioleta: se visitará el salón donde se encuentra la cámara
de aislamiento y se explicará su funcionamiento.
ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ELECTROMAGNETICA NO IONIZANTE

 Uso del microondas: utilizado para la esterilización de cristalería y materiales
plásticos a temperatura alta y corto tiempo, haciéndose posible un
calentamiento selectivo de microorganismos al contener agua. Se debe de
considerar que la temperatura de vapor que escapa generalmente no es
suficiente alta para destruir las esporas de microrganismos.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
 Medio para hongos

A excepción de algunas especies de hongos, la mayoría de los mismos se
desarrollan bien sobre un medio que contenga papa, dextrosa y agar (PDA). Se
prepara de la siguiente forma:
o Pese 37.5 gramos de papa, previamente lavadas.
o Pese 2.4 gramos de dextrosa.
o Rodaje la papa de manera que los pedazos quepan en un Erlenmeyer de 250
ml, donde previamente se han agregado 75 ml de agua destilada.
o Haga hervir la mezcla durante 30 minutos.
o En un Erlenmeyer de 250 ml, agregue 75 ml de agua destilada y la dextrosa.
o Filtrar el caldo de papa utilizando como filtro, algodón cubierto de gasa y un
embudo. Mezclar el filtrado en el otro Erlenmeyer que contiene la dextrosa.
o Ajuste el volumen a 150 ml y agregue agar, 1.6% de volumen.
o Caliente y espere hasta que el agar se disuelva.
o Ajustar el pH a 6 utilizando HCl 1N. Aplicar gota a gota verificando con papel
pH.
o Tome 6 tubos de ensayo y coloque a cada uno 10 ml de medio.
o Coloque un tapón de algodón respectivo a cada tubo y esterilizar en el
autoclave.
o Sacar el material estéril de la autoclave.
o Tome tres tubos y colóquelos en un plano inclinado hasta que el medio se
solidifique.
o Tome tres tubos y, con el medio estéril de cada tubo, preparar 3 cajas Petri
de la siguiente manera:
 Coloque los tubos en una gradilla.
 Espere que la temperatura baje en el medio.
 Lávese las manos con jabón.
 Encienda el mechero.
 Esterilice con alcohol, pasando un algodón sobre la mesa de
trabajo y coloque el paquete con 3 cajas de Petri que le serán
entregadas.
 Coloque en el área de trabajo, los tubos y destape el paquete de
cajas de Petri esterilizadas, sin abrir estas últimas, colocándolas
de tal manera que la caja quede hacia arriba y las tapas debajo.
 Tome una caja con la mano izquierda, voltee lentamente y deje que
la caja quede ahora abajo, sin abrir la caja, flamee el borde.
 Cerca del mechero, destape el tubo conteniendo el medio,
tomando el algodón con el dedo meñique de la mano izquierda,
esto sin soltar la caja, ni el algodón.
 Flamee la boca del tubo y vuelva a flamear la caja

 Vierta el medio en cada caja, teniendo el cuidado de que la
aplicación se haga en el mínimo tiempo posible, cerca de un
mechero y sin derramar.
 Medio para bacterias
El medio para bacterias a utilizar es el conocido como agar nutritivo (AN) se utiliza
para el aislamiento de la mayoría de bacterias, como medio en la identificación. Se
prepara de la siguiente forma:
Ingredientes:
Extracto de carne 0.45 g
Peptona 1.5 g
Agar 1.8 % del volumen
Agua destilada 150 ml.
o En un Erlenmeyer de 250 cc, agregue 150 cc de agua destilada.

o Calentar el agua, y agregar los ingredientes.
o Esperar que los ingredientes se homogenicen.
o Ajustar el volumen a 150 CC.
o Ajustar el pH a 7.5 utilizando NaCl 1N, agregándolo gota a gota y
verificándolo con papel pH.
o Colocar un tapón de algodón y papel aluminio; esterilizar en el autoclave.
 Medio enriquecido
Agar V-8
Este medio es muy útil para promover la esporulación de ciertos hongos y para el
desarrollo de otros muy exigentes en nutrientes. El jugo V-8 es un producto que
contiene extractos de tomate, zanahoria, apio, perejil, lechuga, espinaca y berro,
con contenidos altos de vitaminas y minerales.
Ingredientes:
Jugo V-8 30 cc
Carbonato de Calcio 0.33 g
Agar 1.8 % del volumen
Agua destilada 120 cc
o En un Erlenmeyer de 250 cc, agregar 120 cc de agua destilada.

o Calentar el agua, agregue el jugo V-8 cuando el agua esté tibia y luego los
otros ingredientes.
o Calentar hasta diluir el agar.
o Ajustar el volumen hasta 150 CC.
o Tapar el recipiente con algodón y papel kraft; esterilizar al autoclave.
 Medios diferenciales
Medio YDC (extracto de levadura, dextrosa y calcio): se utiliza para la identificación
de bacterias del género Xanthomonas y Erwinia, las cuales dan un color amarillento
en este medio.
Ingredientes:
Extracto de levadura 1.5 g
Dextrosa 3 g
Carbonato de Calcio 3 g
Agar 2 % del volumen
Agua destilada 150 cc
o En un Erlenmeyer de 250 cc agregar, 150 cc de agua destilada; calentar el

agua.
o En el agua tibia agregar los ingredientes.
o Calentar hasta que se haya diluido el agar.
o Ajustar el volumen a 150 cc.
o Tapar el recipiente con algodón y papel kraft.
o Esterilizar al autoclave.
Al finalizar la esterilización de los medios de cultivo preparados, esperar a que se

enfríe el medio hasta aproximadamente 45 ºC y luego verter en las cajas de Petri.
Esta actividad se realizará en la campana de flujo laminar.

 Preparar una investigación sobre un recetario de medios de cultivo para la
detección de hongos y bacterias fitopatógenas.
 Investigue sobre otros métodos de esterilización existentes para uso de
laboratorios de microbiología.
PRÁCTICA 4
OMNIPRESENCIA DE LOS MICROORGANISMOS
Los microorganismos pueden encontrarse en el aire, en el agua, en el suelo,

permanecen sobre objetos animados e inanimados como individuos independientes
o en colonias, desarrollan diversidad de relaciones ecológicas que van desde el
simple neutralismo hasta la forma más evolucionada de simbiosis, el
hiperparasitismo. Cada ambiente tiene una microbiota particular y cada elemento
de ella desarrolla un rol determinado y determinante para su propio micro-
ecosistema.
I. OBJETIVOS
 Conocer los distintos grupos de microorganismos que habitan en diferentes
ambientes.
 Recrear los métodos de laboratorio para la extracción de microorganismos
de cada grupo.

 Preparar el documento de investigación, sobre los siguientes tópicos: Qué
son los microorganismos, omnipresencia de los microorganismos en la
naturaleza. en base a búsqueda en libros de Biología, Microbiología, páginas
de Internet, etc.
 Colectar material vegetal (hojas, tallos, flores, frutos)
con indicios de la presencia de microorganismos que
estén desarrollándose sobre su superficie así mismo
también material biológico (alimentos en
descomposición) con indicios de la presencia de
hongos y bacterias.
 Colocarlo cuidadosamente en un recipiente plástico
sobre una cama de papel mayordomo humedecido,
con uno o dos días de anticipación al día de práctica.
Deberá ser transportado con cuidado para que no se Material biológico
estropee dentro del recipiente. enfermo, en cámara
húmeda
 Entregar el informe de pre-práctica No.4 y pos-práctica No.3 al ingresar al
laboratorio.
 Entregar los materiales biológicos solicitados.

 Muestras de material biológico
 Cajas con instrumental para laboratorio
 Microscopios, estereoscopios
 Vidrios de reloj, cajas de Petri, tubos de ensayo, etc.
 Medios de cultivo, reactivos, aceite de inmersión,
 Lactofenol claro, rojo y azul, montajes preparados
 Agua destilada estéril, hojas de afeitar, papel toalla, papel filtro, algodón.
 Los estudiantes trabajaran en forma individual o se organizarán en parejas.
 En cada punto de trabajo de laboratorio estarán colocadas cajas Petri con
medio de cultivo estéril.
 No abrir las cajas hasta que esté realizando los procedimientos que
posteriormente se le indican.
 Identificar con marcador indeleble las cajas Petri que será utilizada para las
diferentes pruebas con un código, del cual en su cuaderno de trabajo tendrá
la información siguiente: medio de cultivo, ambiente estudiado, nombre de
los estudiantes que lo realizaron, fecha y hora.
 Microorganismos en el ambiente
 Tomar una caja Petri con medio de cultivo, abrirla y exponerla al ambiente
por espacio de 15 minutos.
 Una vez transcurrido el tiempo, cerrarla, sellarla con Parafilm o Plastic Wrap,
identificarla y proceder a colocarla en la incubadora.
 Tomar lecturas cada 24 horas durante tres días.
 Microorganismos en vegetales
 Del material vegetal con indicio de la presencia de
microorganismos, obtener 8 porciones de
aproximadamente ½ cm² a partir del borde de la lesión
infectada, con la finalidad de contar con tejido sano y
enfermo.
 Separar dos grupos de 4 porciones de hojas:
Primer grupo: proceder a colocarlos en una caja Petri sin pasar
las muestras por ningún proceso de desinfección, cerrarla,
sellarla con Parafilm o Plastic Wrap, identificarla y proceder a colocarla en la
incubadora.
Segundo grupo: de las 4 porciones proceder de la siguiente forma: colocar los

cortes en las soluciones que muestra el esquema de desinfección. Posteriormente
colocarlos en papel absorbente estéril seco para recoger los excesos de humedad.
 Tomar los cuatro cortes desinfectados y colocarlos sobre el medio en la caja
Petri, distribuidos radialmente.
 Sellar las cajas Petri trabajadas con Parafilm o Plastic Wrap.
 Identificar la caja y proceda a colocarla en la incubadora.
Esquema de desinfección de muestras de tejido vegetal enfermo.
 Microorganismos del suelo

Se utilizará la técnica de diluciones, que consiste en:
 Medir un gramo de suelo y mezclarlo con 9 mL de agua destilada (dilución
1:10).
 De la dilución 1:10, con una pipeta estéril, tomar 1 ml y diluirlo en otros 9 ml
de agua destilada estéril (dilución 1:100).
 Continuar diluyendo hasta 1:10000.
 Utilizar 1 ml de las soluciones 1:100, 1:1000 y 1:10000 y verterlo en igual
número de cajas Petri, las cuales deberán estar previamente identificadas.
 Sellar las cajas Petri con Parafilm o Plastic Wrap.
 Colocar las cajas en la incubadora.

 Hacer anotaciones de sus observaciones en los espacios preparados en el
instructivo y en el cuaderno de laboratorio de las lecturas tomadas cada 24
horas hasta las 72 horas después de la siembra.
 Realizar una revisión bibliográfica completa sobre los temas desarrollados y
sobre lo observado en el laboratorio. Discutir y comparar los resultados con
esta revisión.
 Presentar un reporte post-práctica que incluya el análisis y discusión de los
resultados apoyados por la investigación realizada.
 Entregar el siguiente cuestionario como anexo al reporte post-práctica:
 A que se refiere la Exobiología.
 Pueden los microorganismos sobrevivir en el aire
 Que hace especiales a los Archaea
PRÁCTICA 5
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS
En la naturaleza existen millones de especies de microorganismos diversos tales

como Bacterias, Hongos, Protozoos, Oomycetos, Algas y Virus. Se diferencian en
base al nivel de organización y especialización celular. Los nematodos, son
organismos pertenecientes al reino Animalia, que se estudian en esta área debido
a que no son observados a simple vista por sus características de tamaño y
coloración. Los virus son un grupo especial debido a que no se clasifican dentro de
los niveles reconocidos filogenéticamente; son entes que están en el limbo de lo
animado e inanimado.
I. OBJETIVOS
 Reconocer las características anatómicas y morfológicas que distinguen a
cada grupo de microorganismos.
 Conocer la categorización taxonómica de los grupos de microorganismos.

 Investigar en libros de Biología, Microbiología, Zoología, páginas de Internet,
etc. sobre los siguientes tópicos: la organización de los reinos según
Whittaker y compararla con la taxonomía y clasificación de los
microorganismos actualizada al 2019, para ello debe visitar la página
“Diversity of life” http://comenius.susqu.edu/biol/202/taxa.htm para
obtener la información de la descripción de las características
anatómicas y morfológicas de cada grupo de microorganismos según
los Dominios y los Super grupos (Unikonta, Excavata, Chromalveolata,
Archaeplastida). Además investigar sobre métodos y técnicas de
montaje para la observación de microorganismos.
 Preparar un informe sintetizado sobre RECONOCIMIENTO E
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.
 Colectar una muestra de suelo proveniente de un jardín ò campo de cultivo,
trasladarla al laboratorio dos días antes de la práctica y solicitar al técnico
de laboratorio que le proporcione un embudo con manguera de hule, una
pinza Mohr, una arandela y una porción de papel mayordomo para preparar
un Embudo de Baerman (investigue qué es, para qué sirve y cómo se
prepara) y proceda a preparar la muestra.
 Colectar una muestra de Nueva Guinea (Impatiens spp), también conocida
como chinita o chatilla, (si no la conoce consulte con su catedrático o el
técnico de laboratorio), incluyendo raíces y aproximadamente una libra de
suelo, procedente de un jardín. Verificar que las raíces tengan abultamientos
(agallas) en buena cantidad, trasladar al laboratorio en una bolsa plástica a
manera de maceta, para evitar que el material se pierda.
Impatiens spp
III. AL INGRESO A LA PRÁCTICA

 Entregar el informe de la pre-práctica No.5, la post-práctica No.4 y los
materiales solicitados.

 Muestras de material biológico
 Cajas con instrumental para laboratorio
 Microscopios, estereoscopios
 Cristalería de laboratorio
 Medios de cultivo, reactivos, colorantes y aceite de inmersión, Agua destilada
estéril
 Hojas de afeitar
 Dos Sierras de Endodoncia # 6 (una para estudiante y otra para quedarse en
el laboratorio)
 Papel toalla, papel filtro, algodón
 Montajes preparados
Se hará la exposición sobre las características generales de los microorganismos
resolviendo dudas sobre la investigación realizada. Seguidamente, se procederá a
realizar la parte práctica de laboratorio, para la cual se utilizarán los materiales
biológicos colectados y las cajas Petri de la práctica pasada.
 Estudio de la anatomía de los hongos
 Observación y descripción macroscópica
o En las cajas Petri, observar el desarrollo de micelio de hongos. Estos se
reconocen porque en medios de cultivo presentan apariencia algodonosa
con coloraciones blancas, grises, negras, anaranjadas, verdes, etc.
o Observar los cultivos en el estereoscopio para realizar la descripción de
las características que presentan.
 Observación y descripción microscópica: de los hongos observados, se

elaborarán montajes de la siguiente manera:
o Colocar una gota de lactofenol en un portaobjetos.
o Con la ayuda de agujas de disección, tomar una pequeña porción del
hongo.
o Los micelios obtenidos en la punta de la aguja, se colocan en la gota de
lactofenol y se observan bajo el estereoscopio, mientras se extienden con
la ayuda de otra aguja de disección.
o Colocar el cubreobjetos, teniendo cuidado de que no queden burbujas de
aire.
o Observar en el microscopio en los aumentos de 10X y 40X.
o Describir lo observado.
 Estudio de la anatomía y forma de las bacterias

Las bacterias en medios de cultivo se diferencian de los hongos porque las colonias
son de consistencia pastosa o mucoide y de colores variados.
 Bacterias en medio de cultivo.

o Observación y descripción macroscópica
 Observar al estereoscopio características de las colonias como color,
brillantez, forma, tamaño, contorno, etc.
 Describir las características observadas.
 Observación y descripción microscópica

o Con una aguja de disección o un asa bacteriológica, tomar una pequeña
porción de la colonia.
o Colocarla en una gota de agua destilada estéril.
o Dispersar la porción de la colonia bacteriana en el agua con ayuda del
asa.
o Colocar un cubreobjetos teniendo cuidado que no queden burbujas de
aire.
o Observar al microscopio en objetivos 10X, 40X y 100X.
o Anotar y discutir lo observado.
 Tinción de bacterias
o Con la ayuda de un asa, tomar una pequeña porción de bacterias a partir
de la misma colonia.
o En el extremo de un portaobjetos, colocar una gota de agua destilada
estéril.
o Diluir la asada de bacterias en la gota de agua, cuidando de que no quede
ni muy concentrado, ni muy diluido.
o Secar el montaje al medio ambiente o flameado ligeramente en un
mechero.
o Cuando se haya secado completamente, colocar una gota de cristal
violeta o safranina sobre las bacterias deshidratadas.
o Esperar de 30 segundos a un minuto.
o Lavar el montaje en el chorro.
o Secarlo nuevamente como lo hizo anteriormente.
o Cocarlo al microscopio sin cubreobjetos y observar en 10x, 40x
o Obsérvelo en 100x, previamente agregue una gota de aceite de inmersión
sobre la preparación realizada y luego desplace el lente sobre la gota y
calibre con el macrométrico y luego con el micrométrico hasta que sean
visibles las estructuras en forma individual.
o Tomar datos y dibuje lo observado.
 Estudio de la forma y anatomía de las algas y protozoos

 Observación y descripción macroscópica
o Agitar la muestra de agua procedente de lago, laguna o poza, etc., que
ha traído al laboratorio.
o Colocar una pequeña porción en un vidrio de reloj.
o Observarla al estereoscopio.
o Tomar datos y describir lo observado.
 Observación y descripción microscópica

o Tomar una gota de agua donde observe mayor actividad biológica.
o Colocarla en el portaobjetos.
o Colocar el cubreobjetos cuidadosamente.
o Observar al microscopio con los objetivos 10 y 40X.
o Describir lo observado.
Alga Protozoo
o Realizar el mismo montaje de la gota de agua, sólo que ahora mezcle una
gota de solución de goma arábiga y la gota de agua.
o Repita el montaje solo que ahora con una gota de formaldehido al 10% y
la gota de agua.
o Dibuje lo observado y anote resultados.
 Estudio de la forma y anatomía de los nematodos
 Nematodos filiformes
o De la muestra de suelo colocada en el embudo de Baerman, extraer 10
cc de solución filtrada en el fondo de la manguera (consulte a su
catedrático o instructor antes de obtener la muestra).
o Agitar la muestra y, con ayuda de una pipeta, obtener una porción y
trasladarla a un vidrio de reloj.
o Observar al estereoscopio, utilizando la luz difractante.
o Anotar lo observado.
o Con ayuda de un pescador preparado con una sierra de endodoncia # 6
(el instructor le habrá indicado previamente como prepararla), proceder a
capturar los nematodos.
o Colocar los especímenes obtenidos en una gota de formalina al 10%.
o Verificar en el estereoscopio que los especímenes están depositados en
la gota de formalina y con ayuda del hilo, trate de agruparlos el centro.
o Colocar el cubreobjetos delicadamente.
o Observar al microscopio en objetivos 10 y 40X.
 Nematodos globosos
o Se utilizaran las plantas de Impatiens hibrida colectadas por los
estudiantes con presencia del nematodo Meloidogyne spp.
o Lavar las raíces en el grifo del laboratorio a manera de eliminar restos de
suelo.
o Separar secciones de raíces que presenten abultamientos.
o Coloque las raíces con indicios de abultamientos en el estereoscopio.
o Con ayuda de dos agujas de disección realizar pequeñas incisiones a lo
largo y ancho de los nódulos hasta encontrar pequeños cuerpos de color
blanco brillantes en forma de perla.
o Proceder a recogerlos con la punta de la aguja y colocarlos en un
portaobjetos dentro de una gota de agua.
o Observe la estructura con ayuda de estereoscopio.
o Describa lo observado.
o Con ayuda de una hoja de afeitar corte la mitad del nematodo hembra.
o Coloque un cubre objetos y suavemente presione los cuerpos de las
hembras de Meloidogyne.
o Colóquelo al microscopio y observe los componentes internos del cuerpo
de la hembra madura de Meloidogyne.

 Preparar un reporte explicando lo observado de cada grupo de
microorganismos, con ayuda de la información de la pre-práctica y con nueva
información de soporte. Situar a cada organismo observado en el grupo
taxonómico que le corresponde y describir las características macroscópicas
y microscópicas observadas.
PRÁCTICA 6
DIATOMEAS COMO INDICADORAS DE CAMBIOS CLIMÁTICOS
Las diatomeas son algas unicelulares microscópicas que forman parte del
fitoplancton y no se degradan con el paso del tiempo, por lo que funcionan como
microfósiles, poseen la característica de que viven dentro de una cápsula parecida
a una concha de sílice y al morir se depositan al fondo del agua donde habitan, se
integran a los sedimentos y no se descomponen, convirtiéndose en fósiles al paso
del tiempo y reflejando las condiciones ambientales del pasado en el que habitaron
(Martínez, 2014). En la actualidad son utilizadas en estudios experimentales para
indicar que la viabilidad ambiental acuática ocasionada por los cambios climáticos
que originan la pérdida de diversidad debido a la homogeneidad del ambiente.
I. OBJETIVOS
 Realizar extracciones de muestras de diatomeas de aguas limpias y
contaminadas.
 Preparar montajes de las muestras de diatomeas para observar la diversidad
de formas y tamaños en ambientes de aguas limpias y contaminadas.
II. INSTRUCCIONES PRE-PRACTICA

 Preparar el documento de investigación, científica sobre: Taxonomía,
anatomías, morfología y hábitat de las diatomeas, la importancia como
indicadores de calidad de agua y su papel en el cambio climático en
ambientes acuáticos.
 Recolectar piedras de rio de aguas limpias y sucias, que sean de superficie
plana con diámetros de 10 a 20 centímetros, indicar la ubicación del lugar de
colecta con coordenadas geográficas y fotografías del lugar.

 Entregar el informe de la pre-práctica No.6, post-práctica No.5 y los

 Pipetas
 Bandejas
 Cepillos
 Erlenmeyer
 Jabón liquido
 Centrifugadoras
 Agua destilada
 Microscopio
 Porta y cubreobjetos
 Medio para montaje
 Mecheros
 Cepillo
 Colecta y extracción de muestra de diatomeas
Procedimiento:
 Escoger una piedra de superficie plana de 10 a 12 centímetros de
diámetro de coloración café oscura, en las orillas del hábitat acuático.
 Trasladar la piedra al laboratorio en bolsas platicas, además tome

datos del lugar.
 En el laboratorio, colocar la piedra en una bandeja, donde raspara la
superficie que queda en dirección a la superficie del agua con ayuda
de un cepillo, regularmente adicionando agua destilada.
 Finalmente usando agua destilada, la superficie de la piedra quedara

limpia.
 Las diatomeas recolectadas quedaran en el agua que quedo en la
bandeja.
 Trasladar la muestra a un Erlenmeyer.

 Preparar montajes del precipitado de la muestra con ayuda de una
pipeta.
 Observar al microscopio.
 Montajes permanentes
Los montajes permanentes ayudan a observar las partes y formas de una diatomea,
además es una técnica para determinar especies o la diversidad del hábitat
acuático.
Procedimiento:
 De la muestra recolectada de diatomeas del inciso anterior, retirar el
sedimento de la muestra con una pipeta y colocarlo en los tubos de
centrifugación.
 Esperar que sedimente la muestra del tubo y retirar el sobrenadante
con ayuda de una pipeta.
 Agregarle de dos a tres veces la cantidad de muestra de jabón líquido
y mezclar con una pipeta cuidadosamente, tratando de no derramar la
muestra.
 Esperar 20 minutos, agitar dos veces la muestra durante ese lapso de
tiempo.
 Diluir la muestra, agregando agua destilada al tubo de centrifugación,
sabiendo que todos los tubos deben quedar a nivel.
 Centrifugar los tubos durante tres minutos y desechar el
sobrenadante.
 Agregar nuevamente agua destilada y centrifugar durante tres minutos
nuevamente, repetir 3 veces para que la muestra quede limpia y libre
de jabón.
 Para preparar un montaje permanente, adicionar a la muestra limpia
agua destilada hasta que se torne una colocación gris.
 Adicionar una gotas de la muestra de diluida a un cubre objetos y fijar

la muestra con ayuda de un mechero, evaporando el agua y fijando
las diatomeas.
 Colocar el cubreobjetos con diatomeas fijadas invertido a un

portaobjetos y sellado.
 Ver al microscopio la diversidad de estos microorganismos.

 Otra alternativa de montaje permanente, es utilizar un medio de
montaje, el cual se colocara en el portaobjetos y luego se colocara el
cubreobjetos con diatomeas, calentar el montaje, evitando burbujas
de aire y luego sellar.
 Observar las formas de las diatomeas al microscopio.

 Preparar un informe sobre sus resultados obtenidos, analice y concluya la
calidad del agua con ayuda de la información obtenida en la pre-práctica.
 Determine qué tipos de diatomeas están presentes en las muestras, para
ello visite las páginas
 https://www.researchgate.net/profile/William_Harding3/publication/2641950
13_An_Illustrated_Guide_to_Some_Common_Diatom_Species_from_South
_Africa_An_Illustrated_Guide_to_Some_Common_Diatom_Species_from_S
outh_Africa/links/53d15ffd0cf2a7fbb2e641e1/An-Illustrated-Guide-to-Some-
Common-Diatom-Species-from-South-Africa-An-Illustrated-Guide-to-Some-
Common-Diatom-Species-from-South-Africa.pdf
 http://www.br.fgov.be/RESEARCH/EDITION/keydiato_BR.html#SF1
PRÁCTICA 7
MEDICIÓN Y CONTEO DE MICROORGANISMOS
Los microorganismos difieren mucho en cuanto a forma y tamaño. Las bacterias

generalmente son más pequeñas que los hongos, protozoos y algas, pero, a pesar
del tamaño tan pequeño de todos ellos, es posible determinar su tamaño real.
I. OBJETIVOS
 Conocer las técnicas de medición de microorganismos.
 Establecer las dimensiones de los microorganismos bajo estudio.
 Conocer las técnicas para conteo de microorganismos.

 Realizar investigación en libros de Microbiología, páginas de Internet, etc.
sobre los siguientes tópicos: Como se miden los microorganismos, que
es un Hematocitómetro o Cámara de Neubauer, contador de colonias
Quebec, usos y cuidados.

 Entregar el informe de la pre-práctica No.7 y post-practica No.6.
 No se permitirá el ingreso sin bata y sin la caja de instrumentos (recuerde
que es individual).

 Cultivos de microorganismos (hongos y bacterias)
 Aguas conteniendo algas y protozoos
 Soluciones extraídas de nematodos
 Micrómetro ocular
 Micrómetro objetivo
 Hematocitómetro
 Cámara de conteo de nematodos
 Instrumental de laboratorio
 Cristalería
 Medios de cultivo en tubos estériles
 Cajas de Petri estériles
 Agua destilada
 Medición de microorganismos
Calibración del equipo: para calibrar el ocular micrométrico se debe realizar el
siguiente procedimiento:
 Observar que el ocular micrométrico ya se encuentra en el tubo del

microscopio (es simplemente un disco de vidrio en el cual se han grabado
divisiones equidistantes entre sí pero no tienen escala de medición).
 Antes de efectuar la medida hay que calibrar la escala empleando un
micrómetro objetivo en el plano focal del campo del microscopio, en el cual
están grabadas líneas paralelas separadas a 0.1 y 0.01 milímetros.
 Colocar en la platina del microscopio, el micrómetro objetivo. Tener mucho

cuidado al manipular este portaobjetos.
 Utilizando los tornillos macrométrico y micrométrico, enfocar las líneas del
micrómetro objetivo con la escala graduada al centro de la impresión.
 Seleccionar el aumento con que se quiera medir los microrganismos.
 Ajustar el retículo del ocular y el micrómetro objetivo sin que haya paralaje
entre ellos.
 Situar el micrométrico objetivo próximo y paralelo al retículo del ocular.
 Coincidir las líneas del micrómetro ocular (líneas negras) sobre las líneas del
micrómetro objetivo (líneas blancas). De preferencia, la primera línea del
micrómetro ocular debe coincidir exactamente con la primera línea del
micrómetro objetivo.
 A partir de la primera línea, contar las divisiones que hay de cada uno de los
micrómetros, hasta el punto en que coinciden exactamente de nuevo las
líneas de los dos micrómetros.
Micrómetro ocular
Micrómetro objetivo
 Determinar cuántas unidades del micrométrico ocular se superponen a una

distancia conocida del micrométrico objetivo, de esa manera se puede
calcular la distancia que mide cada división del ocular en el campo del
microscopio.
 Puesto que cada división del micrométrico objetivo es igual a 10 micras en
los espacios reducidos y 100 micras en los espacios amplios, y como se sabe
cuántas divisiones del micrómetro ocular equivalen a una división del
micrométrico objetos, se puede calcular el coeficiente de calibración en
micras que mide cada divisor de la escala ocular de la siguiente manera:
𝑀𝑖𝑐𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑖𝑐𝑟ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑖𝑣𝑜 (𝑋)

𝐾𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝐸𝑠𝑝𝑎𝑐𝑖𝑜𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑖𝑐𝑟ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 (𝑌)
 Calibrar para cada uno de los objetivos del microscopio. Al hace cambio de
objetivo, ubicar de nuevo las líneas del portaobjetos micrométrico, solamente
manipulando el tornillo micrométrico y realizar los pasos antes mencionados.
 El tamaño de los microrganismos medidos en el microscopio se obtendrá
multiplicando el número de intervalos que mida dicho microorganismos por
la constante de calibración.
 Medir los diferentes microorganismos existentes en el laboratorio (una
bacteria, una espora de hongo, un cuerpo fructífero de hongo, un nematodo,
un alga, un protozoario), anotar y discutir los resultados.
 Conteo de poblaciones de microorganismos
Hematocitómetro o cámara de Neubauer
Se tendran solución de algas, protozoos, hongos y se preparará en el laboratorio
una disolución de bacterias en relación 1:10, 1:100 y 1:1000 para realizar conteos
en la cámara de Neubauer.
 Agitar la solución de microorganismos a contar, para homogenizarla.

 Tomar una alícuota con una micropipeta.
 Colocar un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer, y se coloca en
posición horizontal sobre la mesa.
 Coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de
la cámara de Neubauer, dejar que el líquido penetre entre la cámara y el
cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad.
 Se suelta el pistón suavemente mientras se supervisa que el líquido está
entrando correctamente y de forma uniforme en la cámara.
 Espere 2 minutos para permitir el precipitado de las esporas.
 En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo

no haya salido bien, repetir la operación.
 Colocar la cámara de Neubauer en la bandeja del microscopio.
 Encender la luz del microscopio y enfocar hasta que pueden ver las células
o los microorganismos que se vayan a contabilizar.
 Buscar el cuadro donde vaya a realizarse el recuento, dependiendo del
tamaño de la espora defina en donde realizar el conteo.
Detalle de la cámara de Neubauer
 En caso de que la concentración de esporas sea muy alta y sea fácil perderse
en el recuento, realizarlo en forma de zig-zag.
 Contabilizar las esporas encontradas en cada cuadro y calcule el promedio,

entre más cuadros se contabilice, mayor será la precisión de los datos.
 Calcule el número de esporas por volumen de suspensión utilizando las
formulas descritas a continuación.
Cuadro 1
Cuadro 2
Cuadro 3
Cuadro 4
Fuente: Celeromics, 2012
En el caso de que haya aplicado una dilución, deberá trasformar la concentración

obtenida durante el recuento de esporas en la concentración de la muestra. En este
caso se dividir el resultado por la dilución aplicada.
Nota: si las células tocan el límite superior o el límite izquierdo del cuadro deben ser
contabilizadas, si las células tocan el límite inferior o el límite derecho, no deben ser
contadas.
Contar
No contar
 Conteo de colonias en la cámara de Quebec

Para este caso, se utilizan cultivos suspensión de esporas, dilución de colonias, etc.
que han sido incubados el tiempo requerido y para los cuales se necesita saber la
concentración original.
 Se colocara la caja Petri con colonias de bacterias sobre la cámara de

Quebec.
 Se contabilizara tres cuadrantes donde se tomara el cuadrante con una
carga alta de colonias, carga media y carga baja.
 Se realizará la sumatoria de los tres cuadrantes tomados y se sacara un
promedio, luego se multiplicará por 65 (factor de la cámara), obteniendo
el número de colonias en la caja Petri.
𝐶𝐴 + 𝐶𝑀 + 𝐶𝐵
𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 = ( ) ∗ 65
3
 Estimación de poblaciones de nematodos
 A partir de una solución de nematodos procedente de un volumen de 200 cc
de suelo, estimar la población de nematodos presentes en la muestra de
volumen conocido que se le proporcione.
 Primeramente, homogenizar la muestra con ayuda de una jeringa o una
pipeta.
 Tomar 2 cc de muestra en suspensión.
 Colocar los 2 cc de suspensión en la cámara de conteo de nematodos.
 Colocar la cámara en la platina del microscopio bajo el lente 4x, 5x o 10 x
 Visualizar la región cuadriculada, situándose en uno de los vértices de la
misma.
 Iniciar el recorrido de izquierda a derecha sobre una misma fila y luego de
regreso en la fila siguiente hasta completar todas las filas de la cámara.
 Proceder a contar la cantidad de nematodos por cada una de las cuadriculas
que observe.
 Contabilizar la cantidad de nematodos Fitoparasíticos y de vida libre
presentes en la cámara.
 Realizar tres repeticiones para tener un dato representativo.
 Estimar la población de nematodos en la muestra original con el promedio de
número de nematodos contabilizados.
200 𝑐𝑐 ∗ 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑛𝑒𝑚𝑎𝑡𝑜𝑑𝑜𝑠 𝑒𝑛𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠

𝑃𝑜𝑏𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑛𝑒𝑚𝑎𝑡𝑜𝑑𝑜𝑠 =
2 𝑐𝑐

Preparar un reporte sobre los resultados obtenidos en los procesos de medición y
conteo de microorganismos. Asimismo, realizar una revisión sobre las relaciones
de tamaño de los microorganismos observados.
Y completar el siguiente cuestionario:
 Métodos de fijación de nematodos que existen.
 Cuál es la importancia de un análisis de viabilidad y pureza de un
producto biológico.
PRÁCTICA 8
FIJACIÓN SIMBIÓTICA DE NITRÓGENO
Una de las fuentes de nitrógeno en el suelo son las bacterias nitrificantes que entran
en simbiosis con leguminosas. Éstas fijan el nitrógeno atmosférico y lo hacen
asimilable para la planta, mientras que la planta le proporciona fuentes de carbono
y un ambiente para que funcione el complejo de nitrogenasa a las bacterias.
I. OBJETIVOS
 Conocer la eficiencia de las bacterias fijadoras de nitrógeno.
 Recrear los métodos de inoculación de Rhizobium a una leguminosa.

 Investigar en libros de Biología, Microbiología y en páginas de Internet sobre
los siguientes aspectos de Rhizobium leguminosarum: biología, ecología,
ciclo de vida, métodos y técnicas de aislamiento e inoculación artificial,
eficiencia en la fijación del nitrógeno atmosférico y mecanismo de la
fijación simbiótica.
 En pareja presentar los siguientes materiales y prepararlos para la práctica.
 30 semillas de cualquier cultivo de Fabaceae.
 7 macetas pequeñas con arena blanca cernida, previamente
esterilizada (traer la arena una semana antes al laboratorio para su
esterilización).
 7 platos desechables pequeños hondos para colocar las macetas y
paletas para identificar los tratamientos.
 Colectar dos o tres plantas cualquier Fabaceae, específicamente el
sistema radicular cuidando de obtener las raíces con sus nódulos.
Conservarla en una bolsa plástica con el suelo de origen.

 Entregar el informe de la pre-práctica No. 8 y post-practica No.7.
 Presentar los materiales que se les han solicitado por pareja.

 Macetas 1 L de capacidad (5” diámetro x 5” altura)
 Platos plásticos para colocar las macetas
 Arena blanca cernida, esterilizada
 Semillas del cultivo asignado
 5 hojas de papel periódico
 Vidrios de reloj, cajas Petri
 Cristalería de laboratorio
 Medios de cultivo, reactivos, aceite de inmersión
 Agua destilada estéril
 Hojas de afeitar
 Papel toalla, papel filtro, algodón
Se hará presentación sobre la metodología de trabajo a seguir:
 Preparación del sustrato

Un día antes de la práctica se esterilizará la arena blanca cernida, por lo que
previamente ha de ser trasladada por los estudiantes hacia el laboratorio para
su esterilización (la arena se entregará esterilizada a los estudiantes).
 Preparación de las macetas

Llenar las macetas con arena estéril, dejando un reborde de 2 cm e identificarlas
según los tratamientos que se describen a continuación:
 Maceta 1: inoculación de la semilla
 Maceta 2: inoculación del sustrato
 Maceta 3: inoculación tardía del sustrato (dos macetas)
 Maceta 4: inoculación tardía de las plantas (debe dejar preparado material
para esta actividad)
 Maceta 5: inoculo natural del suelo (ver inciso correspondiente)
 Maceta 6: sin inocular “testigo”.
 Preparación del inóculo
 Separar cuidadosamente del suelo las raíces de la planta asignada para
recolectar los nódulos.
 Lavar las raíces con nódulos cuidando que éstos no se desprendan y pierdan.
 Colocar las raíces lavadas en papel toalla para secarlas.
 Separar cuidadosamente por lo menos 20 nódulos sin lastimarlos y
trasladarlos a un vidrio de reloj con agua destilada estéril.
 Trasladar los nódulos a un vidrio de reloj que contenga hipoclorito de sodio
al 0.05%, durante dos minutos.
 Trasladarlos con pinzas estériles a otro vidrio de reloj que contenga agua
estéril, repitiendo ambos pasos 3 veces.
 Colocar los nódulos en un mortero, agregar 20 mL agua destilada estéril y
macerarlos con ayuda de pistilo. Esta suspensión será la fuente de
inoculante que se utilizará la práctica.
 Preparación de las semillas

Previo a efectuar la siembra se debe de lavar y desinfectar las semillas de la
siguiente forma (ver esquema abajo):
 Tomar las 30 semillas (5 por maceta) y colocarlas en un vidrio de reloj con
alcohol etílico al 95% y sumergirlas durante 30 segundos.
 Con pinzas estériles, (flamear las pinzas en cada uno de los pasos), decantar
el alcohol y transferir las semillas a otro vidrio de reloj con hipoclorito de sodio
al 0.05%; mantenerlas allí por 2 minutos.
 Con pinzas estériles, trasladar las semillas a una caja de Petri que contenga
20 ml de agua estéril para lavar el exceso de los reactivos.
 Repetir el paso anterior 2 veces más como lo muestra el esquema; utilice
soluciones diferentes.
Esquema de batería de desinfección de las semillas de arveja.
 Siembra de semillas
Sembrar 5 semillas desinfectadas en cada maceta, a una profundidad de 2 o 3 veces
el tamaño de la semilla, aplicando previamente el tratamiento descrito. Cuando
emerjan, seleccionar las dos plantas más vigorosas de cada tratamiento y
eliminar el resto.
 Maceta 1: inoculación de la semilla

Colocar 5 semillas de arveja dentro del inóculo de Rhizobium, durante un minuto y
luego sembrarlas.
 Maceta 2: inoculación del sustrato
De la solución de inoculantes, tomar 5 mL, diluir en 45 mL de agua y aplicar el
inóculo de Rhizobium a manera de riego en la maceta; dejar que drene.
Posteriormente, sembrar 5 semillas.
 Maceta 3: inoculación tardía del sustrato

Sembrar 5 semillas de arveja sin aplicarles ningún tratamiento, y en otra maceta con
arena, realizar una inoculación al sustrato, como el proceso anterior. Ocho días
después de la siembra, seleccionar las dos plantas más vigorosas y trasplantarlas
a las macetas con el inóculo.
 Maceta 4: inoculación tardía de las plantas

Sembrar 5 semillas sin aplicarles ningún tratamiento. Quince días después de la
siembra, preparar una pequeña cantidad de inóculo como lo preparado en el inciso
respectivo. Extraer las plantas con mucho cuidado, cortar un poco las puntas de las
raíces y colocar las mismas dentro de una solución de inóculo de Rhizobium.
Sembrarlas de nuevo, con cuidado, en la maceta.
 Maceta 5: inóculo natural

Del suelo de las plantas que usted ha colectado, preparar una mezcla 1:1 con arena
estéril para el llenado de la maceta, homogenizarla adecuadamente y
posteriormente sembrar 5 semillas.
 Maceta 6: sin inoculación “testigo”

Sembrar 5 semillas en una maceta, sin aplicarles ningún tratamiento.

 Regar las macetas diariamente con agua destilada, teniendo el cuidado de
no descubrir la semilla y observar el desarrollo de las mismas hasta 30 días
después de la germinación.
 Transcurrido este tiempo, extraer las plantas de cada tratamiento y medir las
siguientes variables de respuesta:
 Altura promedio de las plantas
 No. total y promedio de hojas/maceta
 No. de nudos promedio
 Longitud promedio de raíz
 Número y peso fresco promedio de nódulos radiculares
 Biomasa
 Analizar la información según el diseño de bloques completamente al azar
con seis tratamientos y n repeticiones, considerando que cada pareja por día
de laboratorio es una repetición.
 Preparar un informe técnico, en cual se discutan los resultados y preparar las
conclusiones en base a los resultados obtenidos.
PRÁCTICA 9
MICROORGANISMOS DEL SUELO
La microbiología del suelo surge de la importancia del reconocimiento de numerosos

procesos natural realizados por bacterias, hongos y otros microorganismos que
afecta o beneficias el ambiente. Los microorganismos que habitan en el suelo se
relacionan con las plantas de diferentes formas: como saprofitos, parásitos o
establecen relaciones simbióticas. Hay tres tipos de microorganismos que
establecen simbiosis con las raíces de las plantas: bacterias promotoras del
crecimiento vegetal, hongos formadores de micorrizas y bacterias fijadoras de
nitrógeno atmosférico. Empleando medios selectivos se pueden aislar
microorganismos con una característica fisiológica determinada, por ejemplo si
carece de una fuente de nitrógeno soluble sólo crecerán las bacterias capaces de
reducir el nitrógeno gaseoso disuelto, procedente de la atmósfera.
I. OBJETIVOS
 Demostrar la biodiversidad de los microorganismos del suelo mediante
cultivos selectivos que provean las condiciones ambientales y disponibilidad
de nutrientes adecuadas.

 Realice investigación en libros de Biología, Microbiología, páginas de
Internet, etc. sobre los siguientes tópicos: Amonificación, Nitrificación,
Desnitrificación, Fijación de nitrógeno molecular, Sulfato-reducción,
Celulólisis, Amilolisis, Solubilización de fosfatos.
 Traer al laboratorio, en pareja, un paquete sellado de cajas de Petri plásticas
y estériles de 90 x 15 mm.

 Entregar el informe de la pre-práctica No.9 y los materiales solicitados.

 Medios de cultivo
 Reactivos
 Cristalería
 Horno Pasteur
 Autoclaves
V.
VI. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
 Fijación de nitrógeno molecular
Medio para Azotobacter
Ingredientes para un litro de agua destilada:
Sacarosa 20 g
Fosfato dipotásico 0.05 g
Fosfato monopotásico 0.15 g
Cloruro de calcio 0.01 g
Sulfato de magnesio heptahidratado 0.2 g
Molibdato de sodio 0.002 g
Cloruro férrico 0.01 g
Azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 2 mL
Carbonato de calcio 1g
pH 6.8
 Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razón

de 50 mL en cada uno y se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos en la
autoclave.
 Verter el medio estéril en caja Petri en la cámara de flujo laminar.
 Listas el medio de cultivo en las cajas Petri, realizar la siembra de unos
gránulos de suelo, sellar, identificar e incubar a 25-27°C durante 7 días.
 Observar las colonias que se desarrollan y montarlas al microscopio.
 Nitrificación
Medio de cultivo
Sulfato de amonio 0.5 g
Carbonato de calcio 1g
Solución salina 50 mL
El medio para productores de nitratos contiene 1 g de nitrito de sodio en lugar del

sulfato de amonio
 Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razón

de 50 mL en cada uno y esterilizar a 110ºC durante 20 minutos.
 Sembrar unos gránulos de suelo en ambos matraces e incubar a 25-27ºC
durante dos semanas.
 Celulólisis
Medio de cultivo
Nitrato de amonio 1g
Solución de oligoelementos 1 mL
 Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza a 110ºC
durante 20 minutos.
 Sembrar unas gotas de una suspensión de suelo, que haya sido abonado
con estiércol, e incubar dos a tres semanas a 25-27C.
 Donde el papel sobresale del líquido se acumulan las bacterias celulolíticas
aerobias y suelen colorearlo.
 Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque
de las fibras bajo la lupa.
 Comprobar si se disgrega con facilidad al tocarla con el asa.
 Amilólisis
El medio de cultivo
Almidón soluble 2g
Nitrato de amonio 1g
Solución de oligoelementos 1 mL
Agar 15 g.
 Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos.

 Distribuir en cajas Petri.
 Sembrar con unos gránulos de suelo e incubar a 25-27ºC.
 Cubrir la superficie con solución acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La
zona de hidrólisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre
un fondo azul.
 Solubilización de fosfatos
El medio de cultivo
Extracto de levadura 2g
Glucosa 20 g
Agar 15 g
Fosfato tricálcico 2g
 Se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos y se distribuye en caja de Petri.

 Sembrar unos gránulos e incubar a 25-27ºC.
 Observar la formación de una zona transparente alrededor de las colonias.
VII. ACTIVIDADES POST-PRÁCTICA
 Observar el desarrollo de los diferentes medios cada 24 -48 horas, anotar los
cambios que se dan en cada uno de los medios.
 A los 8 días, observar los medios, tomar lectura de los diferentes tipos de
microorganismos que se desarrollaron y preparar montajes para su posible
determinación.
 Prepare un reporte sobre los datos obtenidos, basándose en la información
obtenida en la pre-práctica.
PRÁCTICA 10
MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE
La leche, debido a su composición orgánica rica en carbohidratos que se encuentran

en suspensión acuosa, es un magnífico sustrato para el crecimiento de una
diversidad de microorganismos. Algunos son beneficiosos (como las bacterias
lácticas), algunos son alterantes y otros son perjudiciales para la salud.
I. OBJETIVOS
 Conocer los métodos de análisis físicos y bioquímicos para la detección de
microorganismos que contaminan la leche.
 Establecer la presencia de microorganismos en distintos tipos de leche cruda
y procesada.
 Realizar un proceso de transformación láctea donde exista una relación
fundamental de los microorganismos.

 Preparar un documento de investigación científica sobre: la relación de los
microorganismos en los procesos de industrialización de la leche y qué
microorganismos son contaminantes de la leche.
 Organizarse en el laboratorio para que se adquiera:
 Cualquiera de las presentaciones comerciales (vaso, medio litro, litro)
de al menos cuatro marcas diferentes de leche pasteurizada (leche
fluida, no reconstituida) y de medio a un litro de leche fluida natural no
pasteurizada que se comercializa en las colonias o pequeños establos
de barrios.
 Un yogurt.
 Estudiante que tenga conocimientos sobre una trasformación láctea que se
logre realizar en el periodo de ejecución del laboratorio, presentar propuesta
y metodología.


 Pipetas y goteros
 Baño termorregulador ( 45 ± 1°C)
 Estufa de incubación 32 o 35 ± 1°C
 Porta y cubre objetos
 Microscopio
 Solución de fosfato (pH 7.2)
 Agua para dilución
 Azul de Metileno.
 Eficiencia de la homogeneización
La homogeneización es un proceso que busca reducir el tamaño de los glóbulos
grasos para evitar así su separación durante el almacenamiento de la leche
pasteurizada. A efectos de comprobar si este proceso fue realizado correctamente
puede analizarse por medio del método microscópico.
Los glóbulos grasos de una leche bien homogeneizada deben presentar un tamaño
promedio menor de 2 micras, la reducción del tamaño depende de las presiones
aplicadas durante el proceso. Para una presión de 1500 lb/pulg 2 el tamaño se
reduce a un promedio de 1.4 micras, mientras que para una presión de 2,500
lb/pulg2, se alcanza un tamaño promedio de 0.99 micras. La observación al
microscopio de una muestra diluida de leche permite evaluar además la uniformidad
en el tamaño de los glóbulos, y con la ayuda de objetivos especiales puede
determinarse el tamaño de los mismos.
La figura siguiente muestra un idea de cómo pueden observarse los glóbulos de

grasa homogeneizados.
LECHE HOMOGENEIZADA LECHE CRUDA
Procedimiento:
 Colocar una gota de leche sobre un portaobjetos.
 Colocar cubreobjetos
 Observar los glóbulos grasos al microscopio. Medirlos y anotar su tamaño.
 Realizar los pasos anteriores para todas las marcas de leche.
 Presencia de movimiento bacteriano

La leche es un medio de cultivo ideal para cualquier microorganismo por lo que es
muy susceptible de contaminación. La presencia de movimiento browniano indica
que la leche presenta contaminación bacteriana.
Movimiento browniano
Procedimiento:
 Diluir a 1:100 la leche a analizar.
 Tomar un mililitro de esta dilución y colocarlo en un portaobjetos, y completar
el montaje para observar al microscopio.
 Observar al microscopio, discutir y esquematizar lo observado.
 Método del azul de metileno

Procedimiento:
 Agitar la leche y agregar 10 mililitros a un tubo de ensayo. Realizar dos
ensayos para la muestra de leche.
 Colocar 1 mililitro de azul de metileno a cada tubo de ensayo.
 Tapar los tubos de ensayo y colocarlos en baño de maría a 37 °C junto a un

patrón (tubo de ensayo sin indicar de azul de metileno).
 Cuando la temperatura alcance los 37°C mezclar el contenido de los tubos
por inversión para obtener una perfecta homogeneidad del colorante y leche.
 Tapar el baño maría para evitar el contacto de la luz hacia los tubos.
 Iniciar el tiempo de reducción en el momento en que se invierten los tubos y

observar su color frecuentemente, sin agitarlos.
 Realizar lecturas cada 15 minutos durante 3 horas, anotando el tiempo que
tarda en ser decolorado el azul de metileno.
T=0 hrs T=3hrs
 Realice la interpretación de tiempo con ayuda de siguiente cuadro y discuta.
Tiempo en horas Calidad de la leche

0.5 Muy mala
1.5 Mala
1.5-2 Regular
2-2.5 Aceptable
>3 Buena
 Evaluación de la acidez o alcalinidad de la leche

Prueba de alcohol
Esta prueba sirve para determinar la facilidad de coagulación de la leche expuesta
al calor; si la leche coagula en presencia de alcohol significa que no puede ser
sometida a tratamiento térmico. La coagulación de la leche en esta prueba puede
ser debida a la presencia de calostro, de la leche ácida, leche de lactancia avanzada
o leche con de desbalance de sales; por ello no se puede depender de esta prueba
para aceptar o rechazar leche en una planta.
Esta norma permite detectar de forma rápida y cualitativamente la termoestabilidad

de una leche cruda, por medio de la prueba del alcohol.
Procedimiento:
 Homogenizar la leche a analizar con una varilla agitadora.
 En un tubo de ensayo colocar 5 mL de leche 5 mL de alcohol etílico de 68%.
 Mezclar invirtiendo el tubo varias veces.
 Examine la muestra y la presencia de coágulos, considere que la presencia
de coágulos es indicativo de una leche inestable.
 Discuta y analice.
Existe una buena correspondencia entre esta prueba y la estabilidad de la

suspensión coloidal, aunque ésta depende sólo de la acidificación de la leche por
las bacterias. Las leches con un contenido elevado de calcio iónico o de
composición anormal, especialmente las del final de la lactación, pueden coagular
por el alcohol sin ser ácidas. Esta limitación de la prueba no se refiere más que a
leches de pequeñas mezclas. En realidad, la prueba se utiliza mucho para la
selección de las leches a su llegada a la fábrica. Puede añadirse un indicador al
alcohol de pH para hacer la prueba más significativa.
 Prueba de pH
El pH se mide para determinar fermentación de la lactosa (acidificación), caseolisis
(digestión, disolución) y coagulación de la caseína. Si aparece color rosa indica
fermentación de la lactosa, si no cambia el color no se ha utilizado la lactosa ni los
compuestos nitrogenados, un color azul indica reacción alcalina y significa que no
se ha utilizado la lactosa y sí los compuestos nitrogenados.
Procedimiento:
 De las muestras de leche proporcionadas y del yogurt, medir en su envase
original el pH por medio de tiras de papel tornasol.
 Observar el rango, investigar el porqué de la reacción y comente en la post-
práctica.
 Prueba del Indol

En este medio ciertos microorganismos forman Indol por descomposición del
aminoácido triptófano (indol-alanina) mediante el enzima triptófanasa presente en
la triptona. Después del periodo de incubación, la presencia del Indol se reconoce
con el reactivo de Kovacs, integrado por p-dimetil-amino-benzaldehído, alcohol
amílico y HCl concentrado, con el cual forma un estrato superficial de color rojo en
el tubo de reacción. La cepa más común de Escherichia coli (variedad I) da esta
reacción positiva, mientras que la cepa más común de Enterobacter aerogenes
(variedad I) la da negativa.
Procedimiento:
 De cada una de las muestras de leche proporcionadas, tomar 2 ml con una
pipeta estéril con todas las medidas de asepsia (mecheros), según lo indique
el instructor.
 Colocar cada muestra en un tubo de ensayo conteniendo caldo de triptona
con NaCl al 0.5% (la triptona presenta abundante triptófano).
 Dejar incubar por 24 horas.
 A las 24 horas, agregar a cada tubo 5 gotas del reactivo de Kovacs.
Si hay presencia de bacteria que poseen la enzima triptofanasa, al añadir 5 gotas

del reactivo de Kovacs, se formará Indol por descomposición del aminoácido
triptófano (indol-alanina) presente en la tristona y se producirá un anillo de color rojo
en la superficie del caldo. De ser así, la prueba será considerada positiva.
 Elaboración de yogurt
Procedimiento:
 Colocar 200 cc de leche en un Erlenmeyer de 500 cc previamente
esterilizado.
 Calentar la leche a 45°C verificando la temperatura con el termómetro.
 Retirar de la estufa el Erlenmeyer y agregar 10 mililitros de cultivo láctico
(cualquier tipo de yogurt), mezclando durante 3 minutos.
 Verter la mezcla a un recipiente (botella) y cubrir este con papel aluminio, si
quiere el yogurt con sabor, agregar jugo o trozos de fruta de su preferencia
antes de verter al recipiente.
 Incubar a 28 °C.
 Se harán observaciones cada 24 horas hasta determinar el punto (tiempo)
en que esté listo el yogurt, y el proceso se haya completado.
Agregar el
cultivo láctico
(yogurt)

 Preparar un informe sobre sus resultados, basándose en la información
obtenida en la pre-práctica.
 Observar el desarrollo de proceso del yogurt, cada 24 horas.
 Realice una investigación acerca de otras pruebas microbiológicas para
evaluar la calidad de la leche y ponga en práctica alguna de ellas y repórtela
adjunta a sus resultados de laboratorio.
PRÁCTICA 11
EL PAPEL DE LAS MICORRIZAS EN LA RIZÓSFERA
La micorriza es una relación simbiótica mutualista entre un hongo y una planta. Es

la unión entre raíces y micelios de hongos del suelo, donde obtienen beneficios
mutuos. La relación es caracterizada por la perfecta integración de funciones,
intercambio de metabolitos y señales moleculares. Los hongos asociados a raíces
obtienen carbono y otros nutrientes de la planta hospedera y éste le suministra a la
planta compuestos inorgánicos (sales minerales) que esta necesita para su
nutrición. Las micorrizas, asociación simbiótica entre hongos y plantas, juegan un
papel importante en el suelo por su actividad mineralizadora, absorción de
nutrientes y agua, y provee a la planta resistencia a sequía, fitopatógenos, etc.
I. OBJETIVOS
 Mostrar estructuras de micorrizas asociadas a raíces de plantas.
 Realizar extracción y tinción de micorrizas a partir de muestras vegetales.
 Mostrar estructuras de algunas micorrizas en preparaciones microscópicas.
 Conocer el papel y la importancia de la simbiosis de las micorrizas en las
plantas.

 Preparar el reporte de investigación sobre los siguientes tópicos: Micorrizas,
Tipo de micorrizas, géneros importantes, hospederos, importancia de
las micorrizas en la agricultura, efectos en las plantas, métodos y
técnicas de inoculación.
 Colectar dos plantas de pino provenientes de un vivero inoculas con
micorrizas.

 Plantas de vivero
 Microscopios y estereoscopios
 Porta-objetos y cubreobjetos
 Hojas de afeitar, agujas de disección
 Lactofenol claro, rojo y azúl
 Tubos de ensayo
 Cajas de Petri
 Beaker de 50 ml
 pipetas graduadas de 5 y 10 ml
 Estufa
 Solución de etanol al 50% como preservativos de raíces.
 KOH al 10%, reacción exotérmica.
 HCl al 1 o 2%, reacción exotérmica
 Colorante: azul de tripano 0.05% (w/v) en lactoglicerol.
 Glicerina al 50% ó lactoglicerol como decolorante y preservativo.
 H2O2 al 10 % cuando se requiere aclaramiento adicional.
 Equipo personal: guantes, gafas y tapa boca con el fin de evitar contactos
con la piel e inhalaciones.
 Cuantificación de raíces ectomicorrizadas
 Tomar las dos plantas de Pinus spp y eliminar la bolsa plástica con sumo
cuidado para no rasgar las raíces. Observar la composición de las raíces
expuestas al nylon de la bolsa, describir lo observado.
 Separar el suelo de las raíces con el cuidado de no dañar las raicillas, durante
este proceso deberá observarse la composición del manto fúngico y las
raicillas.
 Una vez separadas las raíces del suelo, observar al estereoscopio y describir
lo observado.
 Lavar las raíces cuidadosamente y luego secar con papel mayordomo.
 Observar al estereoscopio y describir las características tales como color,
tamaño, presencia de cordones miceliales y rizomorfas, comparándolas con
raíces no micorrizadas.
 Tomar un sector del sistema radicular y contar entre 100 y 200 raíces cortas,
anotando él número de raíces micorrizadas y raíces no micorrizadas.
Raíces con micorrizas
Raíces con Raíces sin

micorrizas micorrizas
 Tinción para observar la presencia de micorrizas arbusculares

 Lavar con mucho cuidado las raíces para eliminar residuos del suelo e
impurezas, enjuagando.
 Seleccionar las raíces finas, deben extenderse para que no se queden
apretadas en los tubos o beacker.
 Tinción con azul de Tripano

 Las raíces se colocan en tubos de ensayo o beacker y cubrirlas con KOH al
10%.
 Calentar en baño maría a 60 -90 °C hasta punto de ebullición (3 a 5 minutos).
 Luego lavar con abundante agua cuidando que las raicillas no se pierdan.
 Luego agregar HCl al 2% cubriéndolas, y dejándolas por un minuto. Pasado
ese tiempo lavar las raíces con agua.
 Colocar las raíces en azul de Tripano durante 5 minutos en baño maría.
 Lavar las raíces teñidas con agua y eliminar los excesos con glicerina o
lactoglicerol.
 Las muestras de raíces teñidas se retiran del tubo y se depositan en las cajas
Petri para su observación en el estereoscopio.
 Realizar preparaciones de las raíces, utilizar como medio lactoglicerol y
cubrirlas con cubreobjetos.
 Observar en el microscopio.
 Realice dibujos o esquemas de las estructuras observadas.
 Medición de la colonización de micorrizas

 En un porta objetos colocar las raicillas teñidas y con ayuda de una aguja de
disección se colocan 10 segmentos de aproximadamente 1 cm, usando como
medio lactoglicerol.
 Cubrir con un cubreobjetos y eliminar las burbujas.
 Evaluar por medio de la observación microscópica con aumento de 10X y
40X.
 Determinar el porcentaje colonizado de la longitud de la raíz, observando
arbúsculos, vesículas e hifas (características de los hongos micorrizicos
arbusculares).
 Calcular el porcentaje de colonización de la micorriza (%CM) con la siguiente

formula:
𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑔𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜𝑠
%𝐶𝑀 = ∗ 100
𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑔𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠

 Preparar un informe post-práctica con sus resultados, discusión y
conclusiones. Apoye sus conclusiones con revisión de literatura.
 Investigue el beneficio potencial de las micorrizas en la agricultura.
PRÁCTICA 12
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE AGENTES FITOPATOGENOS
Al igual que los demás seres vivos, los microorganismos necesitan nutrientes
apropiados así como condiciones ambientales favorables para el crecimiento. En
este laboratorio se darán los lineamientos para poder realizar el cultivo de
microorganismos, principalmente de aquellos que causan enfermedades en las
plantas.
I. OBJETIVOS
 Conocer las técnicas para el aislamiento de agentes fitopatógenos a partir de
material vegetal.

 Realizar una investigación en libros de Microbiología, páginas de Internet,
etc. sobre los siguientes tópicos: Agentes Fitopatógenos, síntomas y
signos ocasionados, técnicas de aislamiento utilizando cultivos trampa
(hongos y bacterias) y material vegetal que se puede utilizar.
 En parejas, traer al laboratorio una muestra de material vegetal enfermo
afectado por hongo (que no sea del tipo roya o carbón) y una ocasionada por
bacteria. (para seleccionar las muestras, deberá investigar de lo que se trata
cada una).
 Entregar los materiales biológicos solicitados
 Entregar el informe de pre-práctica No. 12 y pos-práctica No. 11 al ingresar
al laboratorio.
 No se permitirá el ingreso al laboratorio sin bata.

 Material vegetal enfermo
 Cristalería
 Medios de cultivo
 Incubadora
Sembrar por pareja, muestras vegetales en dos cajas con PDA, dos cajas con medio
V-8 agar y dos cajas con medio B de King.
 Organización de materiales
 Al inicio del laboratorio se dará una breve exposición sobre el cultivo de los
microorganismos.
 Todo el material a utilizar durante el proceso de cultivo de microorganismos
debe estar esterilizado (cristalería, medios de cultivo, papel y agua).
 La mesa o el lugar de trabajo debe estar lo más ordenado posible y libre de
cualquier artículo o material que no se vaya a utilizar durante el proceso
cultivo de microorganismos.
 Preparación del laboratorista

 Antes de iniciar el trabajo, lavarse las manos con agua y jabón; luego deberá
humedecérselas con alcohol etílico.
 Cuando esté trabajando, no deberá respirar sobre la caja Petri, tubo de
ensayo, frasco o recipiente que contiene el medio y en el cual va a cultivar el
microorganismo.
 Cuando introduzca el tejido enfermo en la caja Petri, deberá hacerlo rápido y
sin que el mismo roce las paredes internas o externas del recipiente. Así
mismo, no debe tocar otra superficie que no sea el medio y el instrumento
que se utiliza para el traslado del tejido enfermo.
 Preparación de la muestra infectada

 Cortar porciones de tejido vegetal de aproximadamente 0.5 x 0.5 cm.,
tratando de abarcar tejido sano y enfermo.
 Colocar 4 porciones por caja Petri.
 Los cuadritos deberán colocarse en papel filtro.
 Preparación de la mesa e instrumentos de trabajo
 Para esterilizar los instrumentos de trabajo (pinza, asas, agujas, etc.) deben
colocarse en alcohol etílico y flamearlos en un mechero antes y después de
utilizarse.
 Desempacar los vidrios de reloj y colocarlos en fila al lado izquierdo del
mechero. En el primer vidrio de reloj, verter agua estéril; en el segundo,
alcohol etílico; en el tercero, agua estéril; en el cuarto, hipoclorito de sodio al
0.5% o sea 10% de solución comercial de cloro; en el quinto y en el sexto,
agua estéril. Los instrumentos a utilizar, el frasco con alcohol y las cajas de
Petri deberán colocarse al lado derecho del mechero (ver esquema abajo).
 Procedimiento para efectuar la siembra

 Depositar las porciones de tejido vegetal en el primer vidrio de reloj (agua
estéril).
 Seguidamente, trasladarlas al vidrio de reloj que contiene alcohol y
permanecer aquí durante 30 segundos.
 Trasladar al siguiente vidrio de reloj que contiene agua estéril, para
eliminar el exceso de alcohol.
 Luego, pasarlos al siguiente vidrio de reloj con hipoclorito de sodio;
permanecer aquí durante a 30 segundos.
 Pasarlos sucesivamente en los dos vidrios de reloj que contienen agua
estéril.
 Colocar las porciones de tejido sobre una hoja de papel filtro estéril, para
quitarles el exceso de agua.
 Previo a introducir el tejido enfermo, flamear la boca del recipiente donde
se cultivará el microorganismo.
 Depositar las porciones de tejido en la caja Petri donde se hará crecer el
microorganismo.
 Cuidar que el recipiente se encuentre cerca de la llama del mechero y que
la respiración sea contenida un poco.
 Las cajas Petri deberán sellarse e identificarse con el nombre del
estudiante y día de laboratorio e incubarse a 28 ºC por espacio de 8 días.

 Tomar datos del desarrollo del cultivo cada 24 horas.
 Determinar las características observadas del microorganismo aislado.
 Preparar un reporte de las actividades realizadas, los resultados obtenidos y
realizar una investigación sobre el siguiente tópico:
 ¿Qué tipo de medios selectivos son utilizados para aislar algunos
microorganismos (hongos y bacterias), sus componentes y que
función tiene cada uno de los componentes?
PRÁCTICA 13
PREPARACIONES MICROSCÓPICAS Y ESTUDIO DE MORFOLOGÍA DE
HONGOS VERDADEROS Y HONGOS NO VERDADEROS
Los hongos verdaderos son organismos eucarióticos, se reproducen por medio de

esporas sexuales o asexuales. Son microorganismos heterótrofos, carecen de
clorofila y se alimentan por absorción. La pared celular de estos hongos está
compuesta sobre todo de quitina. El talo es unicelular o filamentoso. La forma de
vida es muy variada, poder ser saprofitos, parásitos o simbiontes. Estos hongos
están Chytridiomycota, Mucoromycota, Ascomycota y Basidiomycota. Los hongos
anamórficos son estadios asexuales, ya no constituyen un grupo aparte, sino que
se conectan con Ascomycota o raramente Basidiomycota. Los hongos no
verdaderos del reino Chromista son heterótrofos, saprófitos y parásitos que, en
ciertos casos son dañinos para la Agricultura. Se caracterizan por poseer paredes
celulares mayoritariamente de celulosa, y por presentar esporas asexuales
denominadas zoosporas flageladas uno tipo “tinsel” con mastigonemas y otro tipo
chicote. Esto último hace que su reproducción y desarrollo estén muy ligados al
agua aunque, algunos grupos se las han ingeniado para dispersarse por vía aérea.
Su nutrición se realiza por absorción, su talo puede ser desde unicelular hasta un
micelio cenocítico bien desarrollado, y la reproducción sexual es a través de
oosporas.
I. OBJETIVOS
 Reconocer las principales características morfológicas utilizadas en el
estudio de hongos pertenecientes al reino Fungi y los hongos no verdaderos
del reino Chromista.
 Aprender a realizar montajes de microorganismos pertenecientes al reino
Fungi y reino Chromista.

 Realizar una investigación en libros de Microbiología, páginas de Internet,
etc. sobre los siguientes tópicos: Agentes Fitopatógenos del reino Fungi y del
reino Chromista, síntomas y signos que ocasionan, técnicas de preparación
o montajes para el estudio de las estructuras, medios de montaje, selladores
e identificación de montajes.
 En grupos de trabajo traer al laboratorio muestras de material vegetal
enfermo afectado por hongos verdaderos y no verdaderos (una muestra por
persona).
Síntomas y signos de hongos verdaderos
Síntomas y signos de hongos no verdaderos

 Presentar los materiales vegetales solicitados.
 Entregar el informe de pre-práctica No. 13 y pos práctica No. 12 al ingresar
al laboratorio.
 No se permitirá el ingreso al laboratorio sin bata y sin caja de instrumentos.

 Material vegetal enfermo
 Microscopia de laboratorio
 Agujas de disección
 Bisturí
 Portaobjetos
 Cubreobjetos
 Lactofenol
 Gelatina
 Esmalte de uñas
 Preparaciones microscópicas correspondiente a cada grupo de hongos
 Etiquetas y arandelas
Se realizará demostración de cómo hacer preparaciones de hongos temporales y
permanentes, luego, los estudiantes del laboratorio realizarán preparaciones
microscópicas de los grupos de hongos pertenecientes al reino Fungi y del reino
Chromista, realizar anotaciones de lo observado.
 Raspado
Técnica es útil cuando se hacen preparaciones de estructuras que se desarrollan
superficialmente en las lesiones de las plantas o a partir de cepas que crecen en
medio de cultivo. Procedimiento:
 Colocar una pequeña gota de agua destilada u otro medio de montaje en un
portaobjetos.
 Tomar una aguja, desinfestarla con fuego, enfriar, luego mojar la punta de la
aguja en esa gota y luego pasarla ligeramente sobre las estructuras que se
encuentren en las lesiones o en el medio de cultivo.
 Pasar a la gota que esta sobre el portaobjetos, colocar el cubreobjetos,
aclarar en la flama y observar en el microscopio.
 Cortes
Cortes de cuerpos fructíferos, utilizado para observar estructuras que se encuentran
parcial o totalmente inmersas en el hospedero y/o encerradas en cuerpos
fructíferos, es necesario hacer cortes transversales que permitan observar
perfectamente la forma y ubicación interna de las esporas. Estos cortes se pueden
hacer con aparatos especiales, pero generalmente se efectúan de manera manual
mediante el siguiente método:
 Coloque el material enfermo bajo el estéreo microscopio, separe una porción
superficial del tejido enfermo mediante un corte longitudinal procurando no
dañar los cuerpos fungosos, porciones de aproximadamente 1 a 3 cm de
largo por 1 a 3 mm de ancho, con un grosor de 0.5 a 2 mm.
 Con un bisturí, separe el tejido adyacente que se encuentra adelante y a los
lados del cuerpo fructífero; este quedará delimitado y listo para los cortes
definitivos.
 Coloque el dedo índice de la mano izquierda junto al cuerpo a cortar, cuide
de no presionar directamente al cuerpo, de tal forma que al recargar el bisturí
en el dedo índice, este guíe y regule el espesor de los cortes, estos deben
ser lo más delgado posible.
 Los cortes que van quedando adheridos o por un lado del bisturí, se toman
con una aguja de disección humedecida y se colocan en el portaobjetos, que
previamente contenga una gota de medio de montaje.
 Coloque un cubreobjetos y observe al microscopio.
V. ACTIVIDADES POS-PRÁCTICA
 Dibujar en el cuaderno las estructuras microscópicas vistas en el laboratorio.
 Cada estudiante deberá realizar una preparación o montaje de hongo
permanente, el cual debe ir debidamente sellado e identificado.

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o En un Erlenmeyer de 250 cc, agregue 150 cc de agua destilada.

o En un Erlenmeyer de 250 cc, agregar 120 cc de agua destilada.

o En un Erlenmeyer de 250 cc agregar, 150 cc de agua destilada; calentar el

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