Biotecnología

Curso 2010

Clonación y transgénesis animal

Lino Barañao

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario
Clonación

Clonación en distintas especies

Animales transgénicos

Recombinación homóloga

Aplicaciones
Agrobiotecnología

Animales Referencias
transgénicos
 Clonación

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
La clonación
consiste en • En los animales, la clonación se basa en el
la producción uso de la técnica de transplante nuclear.
de individuos • Mediante esta técnica, una célula donante
genéticamente . del individuo a clonar se transfiere a un
. ovocito previamente enucleado.
idénticos

célula donante

ovocito embrión sintético

Agrobiotecnología Enucleación Electrofusión

Animales
transgénicos TRANSPLANTE NUCLEAR
Células embrionarias
(totipotenciales)
Nuevo
individuo

Células diferenciadas

La
Ladiferenciación
diferenciaciónes
esun
unproceso
procesoirreversible
irreversibleasociado
asociadoaalalapérdida
pérdidade
de
totipotencialidad.
totipotencialidad.Sólamente
Sólamentelaslascélulas
célulasembrionarias
embrionariastienen
tienenlala
potencialidad
potencialidaddedegenerar
generarununorganismo
organismocompleto.
completo.DeDeahí
ahíelelestatus
estatus
único
únicodel
delembrión.
embrión.
Dolly
Dollyfue
fueclonada
clonadaaapartir
partirde
deuna
unacélula
célulade
deglándula
glándulamamaria,
mamaria,
demostrando
demostrandoquequeaún
aúnlas
lascélulas
célulassomáticas
somáticasdiferenciadas
diferenciadas
pueden
puedenser
sertotipotenciales.
totipotenciales.
La diferenciación celular sería la consecuencia de la
unión reversible de factores de transcripción tejido-
específicos que regulan la expresión de un grupo
particular de genes.

Embrión Célula somática

Corolario:
Corolario: La
La“potencialidad”
“potencialidad”para
paradar
darun
unnuevo
nuevo
individuo
individuono
noesesprivativa
privativadel
delnúcleo
núcleode
delas
lascélulas
células
embrionarias
embrionarias
Reprogramación: Los factores de transcripción originalmente
presentes en la célula donante se diluyen y son reemplazados por
aquellos presentes en el oocito
• ¿Cuáles son las aplicaciones de la
clonación animal?
Clonación reproductiva de bovinos
Para la clonación de bovinos suele partirse de células fetales como donantes del
material genético. Los ovocitos pueden provenir de animales sacrificados para
consumo ya que sólo aportan el ADN mitocondrial. El embrión obtenido en cultivo
debe ser luego transferido a una hembra receptora para completar su desarrollo.
Células donantes

• Células adultas • Células fetales

- La vida media es de 20 divisiones celulares. - La vida media es de 35 divisiones celulares.
- La tasa de divisiones de 0,8 divisiones por día. Ello permite su manipulación genética.
- Son muy sensibles a la inhibición por contacto. - La tasa de divisiones de 1,3 divisiones por día.
- Se desarrollan en menor proporción. - Son muy sensibles a la inhibición por contacto.
- Se desarrollan en mayor proporción.

cortar el tejido

explanto
Ovocito
recipiente

24 hs

Expansión de las
células del cúmulus

OVOCITOS INMADUROS OVOCITOS MADUROS

Primer cuerpo polar • Los ovocitos obtenidos de

ovarios de animales
sacrificados para consumo
deben ser madurados in vitro.
• La maduración consiste en el
Agrobiotecnología avance de la división meiótica
hasta la metafase II.
Animales
• En este estadío se observa la
transgénicos
extrusión del primer cuerpo
polar.
Transplante
nuclear Para implementar la técnica de transplante nuclear se
requiere disponer de micromanipuladores y de un
microscopio con accesorios para visualizar fluorescencia.

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos

Gentileza de Biosidus S.A.

Transplante nuclear
Gentileza de Biosidus S.A.

Ovocito en MII Enucleación

Célula donante Transplante nuclear

Fusión celular

Gentileza de Biosidus S.A.

Activación

Post-fusión

Post-activación

Desarrollo
embrionario
y preñez
Aplicaciones
de la
clonación
• La clonación reproductiva tiene distintas
aplicaciones en biotecnología animal.

- Clonado con fines agropecuarios

- Clonado de animales de zoológicos
y mascotas
- Clonado para introducir modificaciones
genéticas

• La clonación terapéutica se aplica en medicina

Agrobiotecnología humana.
Animales
transgénicos
 Clonación en distintas especies

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Clonación en ovinos

El primer mamífero clonado a partir de una célula somática

fue una oveja, la ahora mundialmente conocida Dolly.

Tomado de: http://www.roslin.ac.uk/imagelibrary/

Clonación
de bovinos
Uno de los
primeros bovinos
clonados fue
“Second chance”

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos Tomado de: Hill et al., Biol. Reprod., 2000.
 Clonación en la Argentina

(De cómo una sucesión de fracasos puede conducir al éxito)

Clonación
de bovinos “Pampa” fue la primera ternera nacida por clonación
a partir de fibroblastos fetales en Argentina

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Gentileza de Biosidus S.A.
Cerdos clonados obtenidos por transferencia
nuclear de células somáticas de un animal adulto

El clonado de cerdos requirió

modificar la técnica habitual
de transplante nuclear.

Tomado de: Poleiaeva et al., Nature, 2000.

Clonación
de A pesar de que su dueño invirtió más de
mascotas 3 millones de dólares en ello, “Missy”
murió en 2002 sin haber sido clonada.

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
http://www.missyplicity.com
Clonación
de Clon de
Little Gizmo
mascotas

Clon de
Rainbow

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
http://www.savingsandclone.com/clients/our_latest_clones.html
Clonación
de primates

”Neti” y
“Ditto”

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos

Tomado de: Meng et al., Biol. Reprod.,1997.

¿Clonación
de humanos? • La clonación reproductiva carece de
justificación médica.
• Su aplicación masiva es totalmente
improbable en las condiciones actuales

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Clonación terapéutica

• La denominada clonación terapéutica permite generar

tejidos de reemplazo a partir de células del paciente.

Autotransplante

Tejido normal
(ej. fibroblastos)

Transplante nuclear Factores de crecimiento

Matriz extracelular

Embrión (?) sintético

Células precursoras del

Ovocito (donado) Células embrionarias tejido dañado

(pluri o totipotenciales)
 Animales transgénicos

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Animales • Un animal transgénico es aquel que tiene una
transgénicos porción de ADN foráneo en su genoma.
- Los primeros animales transgénicos producidos fueron
. ratones, obtenidos mediante microinyección de cigotas

Macho fértil Hembra superovulada

X

Colecta de
embriones Inyección con ADN
foráneo

Promotor

Implantación de los embriones

en hembras seudopreñadas

Agrobiotecnología Crías

Animales
transgénicos Extracción del ADN y detección de la
presencia del transgen
Elementos
requeridos Promotor original del
en una gen a expresar
exones
construcción
genética ADN
genómico
intrones
ARN
mensajero

ADN copia

Gen
Agrobiotecnología recombinante

Animales Promotor regulable intrón

transgénicos o tejido específico
La técnica de
Microinyección de cigotas bovinos
microinyección
de cigotas
resulta muy
poco eficiente
en bovinos

Eficiencia
Eficiencia en
en la
la producción
producción de
de animales
animales
Transgénicos
Transgénicos por
por microinyección
microinyección
Cigotas microinyectadas 2.800
Sobreviven la microinyección 2.500
Agrobiotecnología
Embriones transferidos a receptoras 250
Animales Preñeces 50
transgénicos
Terneros transgénicos 1
Clonación y
La introducción de genes por transfección y posterior
transgénesis selección de células totipotenciales permite producir
animales transgénicos con muy alta eficiencia.

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos

Gentileza de Biosidus S.A.

 70

60

50
hGH g / day

40

30

20

10

0
10 20 30 40 50 60 70 80 90

Day of milking after lactogenesis

 Res non verba

25 profesionales, 2 empresas, 3 instituciones

• High level expression of bioactive recombinant human growth hormone in the milk of a cloned
transgenic cow (J. Biotechnology, 2006)

• Daniel Salamone1,2, Lino Barañao3 Claudio Santos,1Jorge Artuso1, Carlos Werning1, Leonardo Bussmann6 Aida Prync1Cesar
Carbonetto1, , Susana Dabsys1, , Carlos Munar5 Guillermo Berra4, Ignacio Berra, Roberto Salaberry1, Nahuel Fernández1, Mariana
Papouchado, Marcelo Foti1, Norberto Judewicz1, Ignacio Mujica5, , Luciana Muñoz, Silvana Mannocci 1, Silvina Fenández Alvarez1,
Eliseo González, Juan Zimmermann, Marcelo Criscuolo1, Carlos Melo1.
•
• 1. Biosidus S.A.
• 2. Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires
• 3. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires
• 4. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria
• 5. Munar y Asociados
• 6. Instituto de Biología y Medicina Experimental-CONICET
•PAMPA
August 6, 2002

•PAMPA MANSA
September 24, 2002

•PAMPA MANSA II & III

January 5, 2004

PAMPERO •
December 7, 2004
 Recombinación homóloga

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Recombinación homóloga

contrucción conteniendo un gen

de resistencia a antibiótico
gen endógeno flanqueado por secuencias
homólogas al exón a eliminar
promotor exones
secuencias homólogas
Neo

gen de resistencia a antibiotico

intrones

recombinación
Neo

el alelo en el que se ha
Neo
producido la recombinación
homologa no produce
proteína activa
Recombinación homóloga

• La recombinación homóloga elimina un alelo por vez.

• Los animales resultantes son heterocigotas.

linea celular
de partida

recombinación homóloga

Neo se ha eliminado
uno de los alelos
del gen

transferencia nuclear

el animal resultante
posee todavía una
copia activa del gen
Recombinación homóloga
Para obtener homocigotas (que no expresen la proteína) es necesario
el cruzamiento de machos y hembras genéticamente modificados.

Neo
X
Neo

Neo Neo

Neo Neo

Homocigota
Recombinación
homóloga
“Cupido” y “Diana”, primeros corderos
producidos por la técnica de “gene targeting”

Agrobiotecnología Tomado de: McCreath et al., Nature, 2000.

Animales
transgénicos
Estrategias
alternativas
para la Proteína a suprimir
supresión de
una proteína Traducción

Silenciamiento
por RNAi
X ARNm

Recombinación Transcripción
homóloga
Agrobiotecnología
X ADN
Animales
transgénicos
Silenciamiento
génico La introducción de secuencias cortas (22pb) de
ARNs homólogos de doble cadena desencadena
un proceso que degrada al ARNm blanco y
conduce a la supresión de la proteína respectiva

Degradación
del ARNm
ARN doble
cadena

Agrobiotecnología Transcripción
Animales
transgénicos ADN
Características de los métodos usados
para suprimir proteínas

Recombinación homóloga Silenciamiento por ARNi

- Afecta al ADN (suprime el gen) - Afecta al ARN (suprime al mensajero)

- Requiere dos generaciones para - El fenotipo deseado se obtiene en la

obtener el fenotipo deseado primera generación

- La supresión es total - Pueden obtenerse niveles intermedios

- Proteínas candidatas: PrP, - Proteínas candidatas: lactoglobulina,

lactoglobulina proteínas de la leche, miostatina
 Aplicaciones

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Aplicaciones

•• Producción
Producción de
de alimentos:
alimentos:
-- Incremento
Incremento en
en la
la velocidad
velocidad de
de crecimiento
crecimiento y/o
y/o masa
masa muscular
muscular en
en cerdos
cerdos yy peces
peces
-- Introducción de genes de resistencia a enfermedades
Introducción de genes de resistencia a enfermedades
•• Producción
Producción de
de órganos
órganos para
para xenotransplante:
xenotransplante:
-- Producción
Producción proteínas
proteínas humanas
humanas que
que bloquean
bloquean lala acción
acción del
del complemento
complemento en
en cerdos
cerdos
(ejemplo, CD59)
(ejemplo, CD59)
-- Transplantes
Transplantes temporaríos
temporaríos de
de corazón
corazón oo hígado
hígado hasta
hasta la
la obtener
obtener donantes
donantes compatibles
compatibles
•• Fines
Fines ornamentales:
ornamentales:
-- Peces
Peces que
que expresan
expresan proteinas
proteinas fluorescentes
fluorescentes
•• Producción
Producción de
de fármacos
fármacos (“molecular
(“molecular pharming”)
pharming”)
-- Producción
Producción de
de proteínas
proteínas recombinantes
recombinantes humanas
humanas en
en leche
leche yy suero
suero
•• Modelos
Modelos animales
animales para
para patologías
patologías humanas
humanas
-- Efectos
Efectos de
de sobreexpresión
sobreexpresión de
de genes
genes
-- Eliminación de genes (“knock out”)
Eliminación de genes (“knock out”)
Transgénesis
en bovinos.
Producción
de alimentos
•• Cambios
Cambios cualitativos
cualitativos en
en la
la producción
producción de
de leche:
leche:
-- Producción
Producción de
de lactoferrina
lactoferrina en
en leche
leche bovina
bovina
-- Producción
Producción de
de leches
leches “humanizadas”
“humanizadas”
-- Modificación
Modificación de
de las
las caseínas
caseínas para
para la
la producción
producción de
de
.. quesos
quesos especiales
especiales

•• Cambios
Cambios cualitativos
cualitativos en
en la
la producción
producción de
de carne:
carne:
-- Producción
Producción de
de carne
carne bovina
bovina libre
libre de
de riesgo
riesgo
de
de BSE
BSE
-- Modificaciones
Modificaciones cualitativas
cualitativas
Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Transgénesis
en bovinos.
Producción
de alimentos

Bovinos
genéticamente
modificados
para mejorar
la producción
láctea

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Transgénesis
en peces.
Producción
de alimentos
La introducción
de copias extra
del gen de
hormona de
crecimiento
aumenta
notablemente
la velocidad
de desarrollo
de truchas y
salmones.

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos

Tomado de: Devlin et al., Nature, 2001.

www.aquabounty.com
Transgénesis
en peces.
Expresión de proteínas fluorescentes
Fines
en peces cebra
ornamentales

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos http://www.glofish.com/photos.asp
Transgénesis
El uso de promotores específicos permite detectar
en peces. patrones de expresión durante el desarrollo
Modelos
experimentales

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos

Tomado de: Wittbrodt et al., Nat. Rev. Genet., 2002.

Transgénesis
en insectos:
transformación
de gusanos
de seda

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos

Tomado de: Tomita et al., Nat. Biotechnol., 2003.

Transgénesis
en insectos: • Se está intentando producir mosquitos
mosquitos resistentes al parásito de la malaria.

Tomado de: Catteruccia et al., Nature, 2000.

Agrobiotecnología
Larvas de mosquitos transgénicos (izquierde y centro)
que expresan el gen de la proteína GFP. Panel de la
Animales
izquierda: luz UV; panel de la derecha: luz blanca
transgénicos
Transgénesis
• La expresión de proteínas en la clara de huevo
en aves tiene un enorme potencial.
• La transgénesis en aves se enfrenta todavía
con notables dificultades técnicas derivadas
de los problemas del aislamiento de ovocitos
y cigotas y el posterior cultivo embrionario.
• Se ha logrado expresar enzimas en la clara del
huevo y se obtuvieron quimeras que expresan
genes marcadores. La heredabilidad de estos
caracteres es baja.

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Transgénesis
en cabras
La empresa Nexia (Canadá) ha logrado producir cabras que
expresan fibroína (proteína de la tela de araña) en su leche.

Agrobiotecnología
Tomado de: Keefer et al., Biol. Reprod., 2001.

Animales
transgénicos
Transgénesis • Se han transformado cerdos con el gen de la Green
en cerdos Fluorescent Protein mediante transfección de células
somáticas en cultivo y posterior clonado.
• Xenotransplante:
- La eliminación de genes para la alfa 1-3 galactosil transferasa
permitiría obtener cerdos que no posean el residuo galactosa
en su endotelio y, por lo tanto, sean menos proclives al
rechazo agudo.

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Universidad
de Missouri-Colombia
Immerge BioTherapeutics Inc
ENVIROPIG University of Guelph
Aplicaciones
Producción
de proteínas
recombinantes Capacidad
Capacidad de
de producción
producción de
de proteínas
proteínas
humanas recombinantes
recombinantes en
en la
la leche
leche en
en distintas
distintas especies
especies
en la leche
Litros/año Proteína
animal
Cerdo 250 250
Cabra 400 400
Oveja 500 500
Vaca 10.000 10.000

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Aplicaciones.
Volumen
Volumen del
del mercado
mercado mundial
mundial en
en proteínas
proteínas humanas:
humanas:
Producción
-- U$S
U$S 20.000
20.000 millones
millones
de fármacos
Ejemplos:
Ejemplos:
-- Antitrombina
Antitrombina 3:
3: U$S
U$S 200
200 millones
millones
-- Albúmina
Albúmina sérica:
sérica: U$S
U$S 1.500
1.500 millones
millones

Requerimientos mundiales de proteínas humanas y número

de animales transgénicos necesarios para satisfacerlo
Factor VIII 120 g 2 vacas
10-25 ovejas
Alfa-1-antitripsina 5.000 kg 33.000 ovejas
42.000 cabras
Factor IX 2 kg 13 ovejas
22 cerdos
Agrobiotecnología Albúmina sérica 1000 kg 300 vacas
8.300 cabras
Animales Activador tisular del 75 kg 600 cabras
transgénicos plasminógeno
Aplicaciones
Producción
de proteínas
recombinantes
humanas
en la leche
animal

Vaca transgénica
2 g/L hTPA
1 huevo de oro 10.000 U$S/g
(1,3 kg) por día 30 L por día
Agrobiotecnología
U$S 15.000/día U$S 600.000/día
Animales
transgénicos
Aplicaciones
• El uso de animales transgénicos como
bioreactores permitiría suplir la demanda de
proteínas recombinantes, en particular de
aquellas que requieren producción masiva.

Demanda de capacidad productiva instalada

(datos a nivel mundial)

Agrobiotecnología

Animales
transgénicos
Aplicaciones
• Producción de proteínas recombinantes en leche
de animales transgénicos:

Productividad
de 1 animal transgénico:
1,5 kg de proteína
terapéutica/año =
equivalente a 200.000 L
de fermentación
o sea
1 animal transgénico =
4 fermentadores
de 500 L

Agrobiotecnología
• Demanda anual de hormona de crecimiento (hGH):
Animales
- Mercado latinoamericano: producción de 2 animales transgénicos
transgénicos
- Mercado mundial: producción de 40 animales transgénicos
ANDi
Referencias 1. Palma, G.A. Biotecnología de la Reproducción. Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, Argentina), 2001.
2. Hwang, W.S., Ryu, Y.J., Park, J.H., Park, E.S., Lee, E.G., Koo,
J.M., Jeon, H.Y., Lee, B.C., Kang, S.K., Kim, S.J., Ahn, C.,
Hwang, J.H., Park, K.Y., Cibelli, J.B., Moon, S.Y. Evidence of a
pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned
blastocyst. Science, 303:1669-74, 2004.
3. Cristophides, G.K. Transgenic mosquitoes and malaria
transmission. Cellular Microbiology, 7:325-333, 2005.
4. Wilmut, I. Cloning for Medicine. Scientific American, 279:58-63,
1998.
5. Sitios relacionados con clonación animal:
http://ag.arizona.edu/ANS/courses/cloning2/
http://www.infigen.com/
http://www.advancedcell.com/
http://www.emtran.com/
http://gslc.genetics.utah.edu/units/cloning/whyclone
Agrobiotecnología

Animales
transgénicos