El plastoma y su potencial biotecnológico.

Blanca Ruiz Muñoz

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga,
Bulevar Louis Pasteur, 31, 29010 Málaga

1.Introducción
El cloroplasto es sin duda el plástido vegetal más conocido. Además de ser el compartimento de
la célula vegetal en el que tiene lugar la fotosíntesis, alberga importantes rutas biosintéticas, entre
las que se encuentran la síntesis azúcares, aminoácidos, lípidos y ácidos grasos. A ello se le suman
metabolitos secundarios que actúan como compuestos de defensa, vitaminas esenciales y
compuestos polifenólicos como los taninos (1).
Los cloroplastos, al igual que las mitocondrias, poseen su propio material genético, de forma que
coexisten tres genomas en la célula vegetal. Estos dos orgánulos poseen un origen procariota. En
concreto, los ancestros de las mitocondrias son las proteobacterias y de los cloroplastos las
cianobacterias. Estos genomas no son independientes, sino que están estrechamente relacionados:
a lo largo de la evolución se ha establecido una transferencia dinámica de genes entre ellos a
través del genoma nuclear. Algo que apoya esta evidencia es el hecho de que muchas de las
proteínas codificadas por el genoma nuclear son indispensables para la función de las
mitocondrias y de los cloroplastos. Gracias al gran avance que han sufrido las técnicas de
secuenciación en los últimos años, hay evidencias claras de que ambos orgánulos redujeron
drásticamente el tamaño de su genoma por una transferencia masiva de genes hacia el núcleo.
Además, se ha descrito que dicha transferencia se realizó en bloques de genes o clusters, haciendo
que en la actualidad cloroplastos pertenecientes a especies muy alejadas filogenéticamente posean
secuencias similares. Se han propuesto diferentes hipótesis sobre esta transferencia genética,
coincidiendo todas ellas en explicarlo como una mejora evolutiva (2).
Todos estos conocimientos acerca de la evolución del cloroplasto y su interrelación con los otros
dos genomas presentes en la célula no se podrían haber dilucidado sin un avance en paralelo de
las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. El primer genoma plastídico secuenciado
fue el de la planta de tabaco (Nicotiana tabacum) en 1986 (3). Desde entonces, más de 800
genomas plastídicos han sido secuenciados y puestos a disposición de la base de datos de
orgánulos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI). El genoma plastídico
ha aportado grandes contribuciones a los estudios filogenéticos entre distintas especies. De hecho,
las secuenciaciones cloroplastídicas han revelado las variaciones entre distintas especies en
términos de estructura y secuencia. Este hallazgo ha sido de vital importancia para la comprensión
sobre la adaptación climática de cultivos de interés económico, facilitando la hibridación entre
especies cercanas y la conservación de caracteres valiosos. Todo esto contribuye a una mejor
comprensión de la biología y evolución de las plantas, necesaria para poder emplearlas como
herramientas biotecnológicas (4).
En esta revisión se analizará el genoma plastídico (también denominado plastoma), los distintos
métodos de transformación de cloroplastos para producir “plantas transplastómicas” y sus
distintas aplicaciones en el campo de la biotecnología.

1
2.Estructura del genoma plastídico o plastoma
Los genomas cloroplastídicos de las plantas terrestres, por lo general, están altamente conservados
en cuanto a estructura y organización. Están compuestos por una única molécula circular de DNA
con una estructura cuatripartita que incluye dos regiones de genes únicos, grande y pequeña (LSC
y SSC) separados por dos regiones de repeticiones invertidas (IR) que poseen la misma secuencia
en distinta orientación (Fig.1). Contienen entre 120 y 130 genes, y la mayoría de ellos codifican
para proteínas implicadas en el mantenimiento del cloroplasto y proteínas de la fotosíntesis.
Estudios recientes han identificado que las zonas con mayor variabilidad son las secuencias
intergénicas no codificantes (regiones IR), que a menudo contienen importantes secuencias de
regulación. Al contrario que la estructura, los tamaños de los genomas cloroplastídicos no están
conservados, siendo muy variables entre especies. Pueden ir desde 107 kB (Cathaya
argyrophyllla) (5) hasta 218 kB (Pelargonium spp.) (6), y es independiente del tamaño del
genoma nuclear. Hay algunas líneas de plantas que han perdido las secuencias IR o familias
génicas completa, e incluso hay evidencias de la existencia de genomas cloroplastídicos lineales
(4).

Figura 1. Mapa físico del genoma plastídico del alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii. La
flecha indica la dirección de la transcripción de las dos cadenas de DNA. El círculo interior muestra la
estructura cuatripartita del genoma del cloroplasto. Abreviaciones: IR A e IRB, repeticiones invertidas. LSC,
región de genes únicos grande. SSC, región de genes únicos pequeña (7).

2
3.Transformación de cloroplastos, plantas transplastómicas.

La primera transformación del plastoma se logró en el alga verde unicelular Chlamydomonas

reinhardtii (8), con un único cloroplasto que ocupa aproximadamente la mitad del volumen
celular y que contiene unas 80 copias idénticas del genoma plastídico. Sin embargo, la
transformación de cloroplastos en plantas de semillas fue mucho más difícil de desarrollar debido
a que una célula del mesófilo puede contener de 1000 a 2000 copias del genoma plastídico y
aproximadamente 100 cloroplastos. Poco tiempo después se publicó la transformación plastídica
en la planta de tabaco (Nicotiana tabacum) (9). Durante mucho tiempo estas dos especies modelos
eran consideradas como las únicas en las que llevar a cabo transformación plastídica, sin embargo,
a lo largo de los años, el método fue puesto a punto en otras especies como en la patata (Solanum
tuberosum) (10) o la lechuga (Lactuca sativa) (11).
El método más exitoso para la transformación de cloroplastos es la biobalística, que consiste en
el disparo a alta velocidad de micropartículas metálicas recubiertas con el DNA de interés. Al
tratarse de un método físico, provee de un protocolo universal para introducir material genético
en cualquier organismo o tipo celular (4). Otra alternativa es el empleo de protoplastos (células
vegetales desprovistas de pared celular), que pueden ser obtenidos por métodos enzimáticos o
pueden ser mutantes que carecen de pared. Para que el DNA pueda atravesar las tres membranas
(la membrana plasmática y la doble membrana cloroplastídica), es necesario hacer que estas sean
lábiles empleando para ello métodos físicos (como, por ejemplo, la electroporación) o químicos
(como el polietilénglicol, PEG). Sin embargo, la regeneración de la planta completa a partir de
protoplastos es un proceso largo y difícil (12). Por ello, el primer método elegido para la
transformación plastídica es la biobalística debido a su velocidad y a la alta eficiencia de
transformación.
La transformación estable de los cloroplastos requiere de la integración del DNA diana mediante
el uso de vectores de expresión y la eliminación de todas aquellas copias no transformadas del
genoma. La integración del DNA tiene lugar exclusivamente mediante eventos de recombinación
homóloga. Este hecho condiciona el diseño de los vectores usados para la transformación. Estos
han de contener regiones flanqueantes que presenten homología con el sitio de integración del
DNA en el genoma plastídico, además del gen de selección y los elementos de regulación (Fig.2).
(13).

Figura 2. Representación esquemática de la secuencia del vector de transformación y su integración

mediante recombinación homóloga en el genoma plastídico nativo. El vector incluye dos regiones
flanqueantes que facilitan la integración del mismo en el genoma plastídico por recombinación homóloga.
Además, contiene un gen de selección (SMG), un promotor (P), el gen de interés (GOI), la región 5’UTR
(usada para mejorar la unión del ribosoma) y la región 3’UTR (utilizada para mejorar la estabilidad de la
transcripción) (14).

El alto grado de poliploidía que presenta el genoma del cloroplasto (tres o más juegos completos
de cromosomas) implica que la integración del DNA se puede producir en una o en algunas copias
del genoma de la planta. De esta manera, se obtiene una población heteroplásmica, ya que
contiene tanto copias transformadas como copias silvestres. Para generar líneas de plantas

3
transplastómicas homogéneas, son necesarias varias rondas de propagación o subclonación de los
transformantes bajo presión selectiva, consiguiendo finalmente por segregación una población
homoplásmica, en la que todas las copias del genoma plastídico se hayan transformado (Fig.3)
(15).

Figura 3. Transformación plastídica. La integración inicial se da en una única copia del plastoma
poliploide (población heteroplásmica). Repetidas rondas de propagación y selección conducen a un
cloroplasto homoplástico en una de las células, que puede poseer aún cloroplastos sin transformar. Tras ello
se obtendría una población quimérica, en la que todos los cloroplastos de una de las células son
transformados, y finalmente, a una planta homoplástica (15).

Para poder diferenciar las plantas transplastómicas de las no transformadas es necesaria la

búsqueda de métodos de selección. Una de las mayores limitaciones es la disponibilidad de
marcadores seleccionables que actúen únicamente sobre la síntesis de proteínas del cloroplasto,
sin afectar al resto de compartimentos celulares. De hecho, el gen aadA es el único marcador que
ha funcionado con éxito en numerosas especies. Este gen de Escherichia coli codifica para la
enzima 3’’-adeniltransferasa, que inactiva varios antibióticos del tipo aminoglucósidos mediante
modificación covalente. Se suelen utilizar como sustrato los antibióticos espectinomicina y
estreptomicina, dos potentes inhibidores de la traducción del cloroplasto. Posteriormente, en la
mayoría de los casos, es necesario eliminar los genes de selección que confieren resistencia a
antibióticos. Los métodos de eliminación se basan, entre otras, en repeticiones directas y co-
integración transitoria, que explotan los eventos de recombinación y posterior segregación que
tienen lugar en el cloroplasto (15).
En la Figura 4 se muestra un ejemplo práctico basado en un protocolo de transformación de la
planta de patata (Solanum tuberosum), que resume los puntos vistos en este apartado.

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Figura 4. Generación de plantas de patata (Solanum tuberosum) transplastómicas. (a) En primer lugar
se preparan las hojas de patata para la transformación por biobalística. Las hojas cultivadas bajo condiciones
asépticas se disponen sobre una placa de Petri cubriendo toda la superficie. (b) Exposición de los explantos
de hoja resultantes de la transformación a un medio de regeneración que contenga agente de selección, en
este caso, espectomicina. (c) Selección de líneas transplastómicas primarias. Tras varias semanas bajo el
agente selectivo, los explantos se tornan blanquecinos, por inhibición de la síntesis de proteínas
cloroplastídicas. El explanto señalado con la flecha ha sido capaz de regenerarse, por lo que se elige este
clon transplastómico. (d) Nueva ronda de selección para conseguir que el clon seleccionado sea
homoplástico. (e) Ronda de regeneración desde secciones de tallo. (f) Crecimiento de plantas
transplastómicas homoplásticas en condiciones asépticas en medio específico (7).

4.Transformación de cloroplastos en biotecnología de plantas.

El genoma plastídico provee de un atractivo sitio de integración de transgenes, y a pesar de los
retos que supone su transformación, son muchas las ventajas que ofrece.
En primer lugar, mientras que la integración del DNA en el núcleo es un proceso aleatorio, la
transformación plastídica implica la integración dirigida por un proceso de recombinación
homóloga. Esto permite que el transgén se integre en el lugar preciso evitando “efectos de
posición”, como la interferencia con genes endógenos. Además, el genoma plastídico posee una
disminuida frecuencia de eventos de silenciamiento génico o de modificaciones epigenéticas, por
lo que aumenta la estabilidad de la transformación (16).
La acumulación de proteínas expresadas a partir del plastoma puede ser de 10 a 100 veces mayor
que las de las proteínas expresadas a partir del genoma nuclear, y además contabilizando más del
70 % del contenido total de proteínas solubles (TSP) en un extracto de hoja de la planta (17).
Debido a la remanencia del origen procariota del cloroplasto, sus genes están organizados en
operones. Esto permite el apilamiento de varios transgenes en operones sintéticos pudiendo
llevar a cabo ingeniería multigenética en un único evento de transformación (18).

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Por último, los cloroplastos representan un ambiente semicerrado con características específicas,
evitando los efectos de toxicidad de los productos derivados de la expresión del transgén. Además,
al ser orgánulos de herencia materna reduce el riesgo de escape de los transgenes al ecosistema
vía polen (19).
Todas estas ventajas hacen del plastoma una herramienta biotecnológica que está siendo muy
estudiada en los últimos años. Los campos de aplicación más explotados son la generación de
cultivos transplastómicos resistentes tanto a factores bióticos como abióticos, el empleo de los
cloroplastos como biofactorías de producción de compuestos y la ingeniería metabólica para la
generación de productos de alto valor. A continuación, se resumen algunos de los ejemplos más
importantes en estas áreas.
4.1. Cultivos resistentes
El alto nivel de expresión del transgén que se puede obtener a partir de plantas transplastómicas
las convierte en una opción muy atractiva para la creación de cultivos resistentes a determinadas
plagas o a distintas situaciones de estrés, sobre todo en aquellos casos en los que el nivel de
resistencia está directamente relacionado con el nivel de expresión del transgén. Esto ocurre, por
ejemplo, en el caso de las proteínas con acción insecticida de Bacillus thiringiesis (Bt). Son
muchas las líneas de investigación que han producidos cultivos transgénicos Bt mediante
transformación nuclear. De hecho, en USA, el 90 % de los cultivos de maíz comercializados son
de este tipo. Sin embargo, mediante transgénesis nuclear la expresión de múltiples genes requiere
de varios eventos de transformación y generalmente resulta en líneas transgénicas con niveles de
expresión variables. La transformación plastídica puede solventar este problema debido a la
presencia de operones, como se ha comentado anteriormente. Además, también se evitaría la
contaminación de cultivos no transgénicos a través del polen, una de las mayores preocupaciones
de la población acerca de la introducción de cultivos transgénicos en el ecosistema (15).
De cosa B et al. (2001) consiguieron sobreexpresar el operón cry2Aa2 de Bacillus thuringiensis
en plantas de tabaco consiguiendo una acumulación de la toxina del 45.3 % del contenido total
de proteínas solubles de las hojas, el mayor porcentaje reportado. Los ensayos de biotoxicidad
demostraron que los insectos que más daño causaban a determinados cultivos morían tras
consumir las hojas de tabaco transplastómicas (Fig.5) (21).

Figura 5. Bioensayos con distintos insectos causantes de severas enfermedades de cultivos. (A, D, G)
Hojas de tabaco sin transformar; (B, E, H) hojas transformadas con Cry2Aa2 derivado de un único gen; (C,
F, I) Hojas transformadas Cry2Aa2 derivado de un operón. (A-C) Bioensayos con Heliothis virescens
(gusano del brote de tabaco); (D-F) bioensayos con Helicoverpa zea (gusano del algodón); (G-I)
Bioensayos con Spodoptera exigua (gusano americano). Se observa como las hojas transplastómicas
derivadas de un evento multigenético tienen mayor toxicidad (21).

6
Además de los cultivos Bt, hay otros muchos ejemplos de plantas transplastómicas resistentes a
estrés biótico. Por ejemplo, recientemente se han logrado generar plantas resistentes frente a
pulgones, gusanos, bacterias y virus mediante la expresión del gen PTA en el genoma plastídico
(22).
4.2. Ingeniería metabólica
Las plantas sintetizan una amplia gama de metabolitos. Aunque hay algunas las rutas de
biosíntesis que se dan exclusivamente en el citosol, como la síntesis de ácidos grasos, hay otras,
como la vía del isoprenoide, que pueden tener lugar indistintamente en el citosol o en el
cloroplasto utilizando distintos sustratos cebadores de la ruta. Esta redundancia permite la
redirección de las vías del cloroplasto para la producción de nuevos metabolitos con un impacto
mínimo sobre el desarrollo de la planta (23).
Aunque la planta de tabaco sea la primera opción para su empleo en biotecnología por la gran
disponibilidad de protocolos completos de transformación por su condición de organismo modelo,
acumula productos altamente tóxicos como la nicotina. Esto obliga a que cualquier metabolito
producido en la planta de tabaco deba purificarse antes de su uso, aumentando los costes de
producción.
Recientemente se ha empleado la lechuga como alternativa a la planta de tabaco para la
producción de metabolitos, como la astaxantina. La astaxantina es un carotenoide con un alto
valor comercial que se emplea en la industria alimentaria y cosmética debido a su alto poder
antioxidante. La expresión de operón procedente de bacterias marinas en el genoma del
cloroplasto de la lechuga condujo a la acumulación de ésteres de ácidos grasos de astaxantina y
otros carotenoides clave (Fig. 6) (11).

Figura 6. Lechuga WT (izquierda) y lechuga transplastómica (derecha) con coloración rojiza debido a la
síntesis astaxantina y otros carotenoides (derecha) (11).

4.3. Las plantas como biofactorías

La agricultura molecular o “molecular farming” es un área de creciente estudio que tiene como
objetivo aprovechar el gran potencial de las plantas para funcionar como auténticas fábricas de
bajo coste para la producción a gran escala de productos farmacéuticos y enzimas industriales.
El avance de las tecnologías del DNA recombinante condujo al desarrollo de plataformas para la
producción de biofármacos recombinantes, moléculas complejas producidas en organismos
modificados genéticamente utilizados como vehículos de expresión. Los biofármacos reducen la
toxidad y los efectos secundarios con respecto a los fármacos convencionales debido a la alta
selectividad que presentan (24). Por ejemplo, esta es la base de la producción de la insulina para
el tratamiento de la diabetes en la actualidad.

7
Sin embargo, los sistemas de producción actuales de biofármacos son muy caros, siendo
inasequibles para la mayor parte de la población mundial. Las plantas son una fuente alternativa
ideal a los sistemas de fabricación convencionales y a los métodos invasivos de administración
de los compuestos biofarmacéuticos (25). Esto último hace referencia a la posibilidad de
administrar de forma oral los fármacos producidos en plantas.
El sistema de fabricación se basa en la producción de la proteína de interés mediante
transformación plastídica (por la eficiente acumulación de proteínas recombinantes en el
cloroplasto) con un dominio de unión a un trasportador transmucosa. Comúnmente se utiliza la
subunidad b de la toxina del cólera (CBT) que tiene capacidad de unión al gangliósido GM1, un
receptor de las células epiteliales del intestino. Con ello se consigue la translocación de la proteína
recombinante a la submucosa, y de ahí a la circulación sistémica para su distribución hasta los
tejidos diana (Fig.7). Además, la pared celular provee de un eficaz bioencapsulado puesto que
protege al compuesto de la digestión enzimática que pueda sufrir a lo largo del tracto intestinal,
liberándolo en el intestino gracias a la degradación que sufre por la microbiota que habita en él
(25).

Figura 7. Diseño, producción y administración oral de biofármacos recombinantes producidos en

plantas (25).

Boyhan, D., & Daniell, H. (2011) (26) produjeron proinsulina derivada de cloroplastos con ánimo
de reducir los costos y facilitar la administración de insulina para el tratamiento de la diabetes,
enfermedad con gran prevalencia. En su investigación, transformaron cloroplastos de tabaco y de

8
lechuga con la molécula de proinsulina humana fusionada con CBT. Las hojas de tabaco
mostraron una acumulación del 47 % del total de proteínas solubles, mientras que las de lechuga
acumularon un 53 %. La acumulación era muy estable puesto que la acumulación no se reducía
significativamente en hojas necrosadas, lo que facilita el almacenamiento y el procesamiento de
las plantas. A todas estas ventajas ha de sumarse la capacidad de liberar péptido C, presente en la
molécula de proinsulina, ya que mejora la función renal y nerviosa en pacientes diabéticos. La
administración oral de proinsulina bioencapsulada en ratones mostraba un efecto hipoglucémico
equivalente al producido por la insulina comercial procesada (26).

5.Conclusiones
Las investigaciones aquí mostradas son solo parte del gran potencial que tiene la transformación
del cloroplasto y de las ventajas que supone frente a la transformación del núcleo vegetal. A pesar
de los alentadores resultados obtenidos por múltiples líneas de investigación, su extrapolación a
niveles industriales es aún un reto. En parte esto se debe a la necesidad del desarrollo de protocolos
de transformación en nuevas especies, ya que la mayoría de las publicaciones de este campo se
han realizado en la planta de tabaco (Nicotiana tabacum), o en su defecto, en Chlamydomonas
spp. Ambas especies modelo carecen de interés comercial. Además, otra de las limitaciones es el
uso extendido de marcadores de sección basados en antibióticos, ya que son necesarios métodos
de eliminación de los mismos, y dificulta así la puesta en práctica de esta tecnología.

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