“Año de la lucha contra la corrupción y la

impunidad"

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO

RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

“Factores que afectan la actividad de α-amilasa:

tiempo, [S], [E], pH, temperatura”

CURSO:
BIOQUÍMICA (P)

ALUMNA:
ÁLVAREZ CASTRO CRISTHA FERNANDA

2019
 EL pH (POTENCIAL DE HIDRÓGENO)

El pH es una medida de la acidez o alcalinidad de una solución. En 1909, el químico danés

Sorensen definió el potencial hidrógeno (pH) como el logaritmo negativo de la concentración
molar (más exactamente de la actividad molar) de los iones hidrógeno.

pH es el logaritmo de la concentración de iones H+, con el signo cambiado:

Análogamente, se define pOH como el logaritmo de la concentración de iones OH-, con el

signo cambiado:

Se puede establecer la siguiente relación entre el pH y el pOH. Partiendo de la expresión

del producto iónico del agua (Kw):

tomando logaritmos:

y cambiando de signos se obtiene que:

o, lo que es lo mismo,
INDICADORES DE pH

Un indicador de pH es una sustancia que permite medir el pH de un medio. Habitualmente,

se utiliza como indicador sustancias químicas que cambia su color al cambiar el pH de la
disolución. El cambio de color se debe a un cambio estructural inducido por la protonación o
desprotonación de la especie. Los indicadores ácido-base tienen un intervalo de viraje de
unas dos unidades de pH, en la que cambian la disolución en la que se encuentran de un
color a otro, o de una disolución incolora, a una coloreada.
Entre algunos de ellos tenemos las siguientes:
 ECUACIÓN DE HENDERSON-HASSELBALCH

Considera la ionización de un ácido débil HA que tiene algún valor de pKa. Es conveniente
poder relacionar el pH de una disolución de un ácido débil con su pKa y con el grado de
ionización. La reacción sería:

HA H+ + A-

La constante de disociación del ácido (Ka) para esta reacción, vendría dada por la ecuación:

Esta ecuación se puede reorganizar para despejar la concentración de iones hidrógeno

porque, recuerda, queremos una ecuación que relacione el pH de la disolución con el pKa
y con el grado de ionización del ácido débil. La forma en la que queda la ecuación es:

Por definición, log (1/ [H+]) = pH y log (1/Ka) = pKa, así que, aplicando logaritmos a la
ecuación anterior, obtenemos:

Esta es la ecuación de Henderson-Hasselbalch que se utiliza a menudo para realizar los

cálculos que requiere la preparación de disoluciones tampón en el laboratorio, o para otras
aplicaciones. Permite calcular el pKa a partir de pH y la relación molar entre dador y aceptor
de protones.

Es una expresión utilizada en química para calcular el pH de una disolución reguladora, o

tampón, a partir del pKa o el pKb (obtenidos de la constante de disociación del ácido o de
la constante de disociación de la base) y de las concentraciones de equilibrio del ácido o base
y de sus correspondientes base o ácido conjugado, respectivamente.
 Reactivo de Fehling
El reactivo de Fehling, también conocido como Licor
de Fehling, es una disolución descubierta por el
químico alemán Hermann von Fehling. Se utiliza como
reactivo para la determinación de azúcares reductores.
Sirve para demostrar la presencia de glusosa, así como para
detectar derivados de ésta tales como la sacarosa o la
fructosa. El licor de Fehling consiste en dos soluciones
acuosas:
 Sulfato de cobre cristalizado, 35 g y agua destilad hasta
1.000 mL.
 Sal de Seignette o Tartrato mixto de potasio y sodio 150 g,
solución de hidróxido de sodio al 40 %, 3 g y agua hasta
1.000 mL.
Ambas se guardan separadas hasta el momento de su
uso, para evitar la precipitación del hidróxido de cobre.
El ensayo con el licor de Fehling se fundamenta en el
poder reductor del grupo carbonilo de los aldehídos. Éste se
oxida a ácido y reduce la sal de cobre en medio alcalino a óxido de cobre, formando un
precipitado de color rojo.

pHMETRO

Un pHmetro o medidor de pH es un instrumento científico que mide la actividad del ion

hidrógeno en soluciones acuosas, indicando su grado de acidez o alcalinidad expresada como
pH. El medidor de pH mide la diferencia de potencial eléctrico entre un electrodo de pH y un
electrodo de referencia. Esta diferencia de potencial eléctrico se relaciona con la acidez o el
pH de la solución. El medidor de pH se utiliza en muchas aplicaciones que van desde la
experimentación de laboratorio hasta control de calidad.

Las soluciones buffer o amortiguadoras son capaces de mantener su pH en valores

aproximadamente constantes, aun cuando se agreguen pequeñas cantidades de ácido o
base, o se diluya la solución.

Una disolución buffer o amortiguadora se caracteriza por contener simultáneamente una

especie débil y su par conjugado:

 un ácido débil y la sal de su par conjugado

HA + H2O A– + H3O+

 una base débil y la sal de su par conjugado

B + H2O BH+ + OH–

La disolución buffer debe contener una concentración relativamente grande de cada uno de los
integrantes del par conjugado, de modo que:

 la especie ácida del sistema buffer pueda reaccionar con los iones OH– que se le añadan
 la especie básica del sistema buffer pueda reaccionar con la cantidad de iones H+ que se añadan.
Un tampón, buffer, disolución amortiguadora o disolución reguladora es una mezcla en
concentraciones relativamente elevadas de un ácido y su base conjugada, es decir, sales
hidrolíticamente activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolución
frente a la adición de cantidades relativamente pequeñas de ácidos o bases fuertes. Este hecho
es de vital importancia en diversos contextos en donde es necesario mantener el pH en un
umbral estrecho, por ejemplo, con un leve cambio en la concentración de hidrogeniones en la
célula se puede producir un paro en la actividad de las enzimas.

Se puede entender esta propiedad como consecuencia del efecto ion común y las diferentes
constantes de acidez o basicidad: una pequeña cantidad de ácido o base desplaza levemente el
equilibrio ácido-base débil, lo cual tiene una consecuencia menor sobre el pH.1

Cada sistema buffer tiene su propio rango efectivo de pH, el cual dependerá de la constante de
equilibrio del ácido o base empleado. Son importantes en el laboratorio y en la industria, y
también en la química de la vida. Tampones típicos son el par amoníaco-catión amonio, ácido
acético-anión acetato, anión carbonato-anión bicarbonato, ácido cítrico-anión citrato o alguno
de los pares en la disociación del ácido fosfórico.

Mecanismo de actuación de las soluciones tampón

Para poder entender con claridad el mecanismo que utiliza el organismo para evitar cambios
significativos de pH, pondremos un ejemplo de actuación del tampón de más importancia en el
organismo, el equilibrio de ácido carbónico (H2CO3) y bicarbonato (HCO3-), presente en el
líquido intracelular y en la sangre.

Como producto del metabolismo se produce CO2 que al reaccionar con las moléculas de agua
produce ácido carbónico, un compuesto inestable que se disocia parcialmente y pasa a ser
bicarbonato según el siguiente equilibrio:

CO2 + H2O H2CO3 HCO3- + H+

Entonces, el bicarbonato resultante se combina con los cationes libres presentes en la célula,
como el sodio, formando así bicarbonato sódico (NaHCO3), que actuará como tampón ácido.
Supongamos que entra en la célula un ácido fuerte, por ejemplo, ácido clorhídrico (HCl):

HCl + NaHCO3 → NaCl + CO2 + H2O

Como se puede ver en la anterior reacción, el efecto ácido clorhídrico queda neutralizado por el
bicarbonato de sodio y resultan como productos sustancias que no provocan cambios en el pH
celular y lo mantienen en su valor normal, que es 7,4.

Cálculo del pH de disoluciones tampón

Frecuentemente se utiliza la ecuación de Henderson-Hasselbalch para el cálculo del pH en

soluciones reguladoras. Sin embargo, debe aclararse que esta ecuación no es aplicable en todos
los casos, ya que para su deducción se realiza una serie de suposiciones. Esta ecuación suele
proporcionar resultados incorrectos cuando las concentraciones del ácido y su base conjugada
(o de la base y su ácido conjugado) son bajas. Para el cálculo del pH, se debe saber el pKa del
ácido y la relación entre la concentración de sal y ácido, como se observa a continuación
Recordemos que el pKa de un ácido débil se obtiene a partir de su constante de acidez (Ka) y es
específico para cada ácido.

Supongamos que disponemos de una determinada cantidad de un ácido débil, por ejemplo,
ácido láctico de concentración 10 mM. Sabemos, que la concentración de su sal conjugada, el
lactato, es de 2 mM y que el pKa ácido del ácido láctico és 3,86. Por tanto, podemos calcular el
pH del ácido láctico en una solución acuosa sin ningún tipo de sistema tamponador con la
ecuación de Henderson-Hasselbalch:

CH3-CHOH-COOH CH3-CHOH-COO- + H+

pH = 3,86 + log (2 mM/ 10mM) = 3,86 - 0,7 = 3,16

Por tanto, el pH de una solución acuosa de ácido láctico de concentración 10 mM, sin la
intervención de ningún tampón es 3,16. Es decir que si esto se produjese en el líquido
intracelular y no existieran las soluciones amortiguadoras su pH estándar de 7,4 bajaría
bruscamente hasta 3,16. Sin embargo, esto no ocurre en nuestro organismo gracias a los
tampones químicos.

Si reflexionamos sobre la ecuación de Henderson-Hasselbalch se deduce que el pH del sistema

amortiguador depende de la proporción relativa entre sal y ácido, y no de sus concentraciones
absolutas. Es decir que si vamos añadiendo agua al sistema variarán las concentraciones
absolutas de cada sustancia, pero no su cociente de concentraciones. No obstante, si la dilución
es muy grande, el equilibrio del ácido y su sal conjugada se desplaza hacia los productos y, por
tanto, aumenta la sal y disminuye el ácido, entonces el cociente sal/ácido aumenta muy
significativamente.

Supongamos ahora que añadimos una solución amortiguadora de bicarbonato de potasio

(KHCO3) y una cantidad grande de agua a la anterior solución de ácido láctico anterior de 10
mM, suficiente para que se rompa el equilibrio de concentraciones del ácido y su sal conjugada.
En consecuencia, la concentración de ácido láctico disminuye a 0,1 mM y la concentración de
lactato de potasio aumenta a 200 mM. Calculemos el pH de la nueva solución:

CH3-CHOH-COOH + KHCO3 → CH3-CHOH-COOK + CO2 + H2O

pH = 3,86 + log (200 mM/ 0,1 mM) = 3,86 + 3,3 = 7,16

Es decir que partiendo de una solución de ácido láctico inicial de concentración 10 mM y pH =

3,16 (ácido) ésta ha acabado transformándose en una solución de ácido láctico de concentración
0,1 mM y pH = 7,16 (neutro) gracias a la intervención de un tampón químico, en este caso, el
bicarbonato de potasio. Así es como el organismo consigue mantener su pH alrededor de 7,4, a
pesar de que entren sustancias ácidas o básicas en el cuerpo.

ROJO DE FENOL
es un compuesto orgánico usado en laboratorio como indicador de pH, también se le conoce
como Fenolsulfonftaleina, Sulfental, Sulfonftal o PSP.
Se presenta en polvo o en cristales de color rojo, inodoro, se descompone a temperatura
de ebullición, su temperatura de fusión es de 285 °C. Tiene baja solubilidad en agua, soluble en
disoluciones de hidróxidos alcalinos y ligeramente soluble en acetona y alcohol etilico. En los
medios de cultivo se utiliza como indicador de pH. A pH inferiores a 6,8, el cultivo vira a
amarillo, a pH superiores a 8 el cultivo se torna de color violeta, los pH entre 6,8 y 8 dan
tonalidades graduales de color naranja.
Su formula química es (C19H14O5S) con una masa molecular de 354.39u.m.a. .
 Un posible mecanismo para la catálisis de amilasa
(Recibido el 28 de noviembre de 1961, y en forma revisada el 8 de febrero de 1968)

Se presentan argumentos que indican que la catálisis de grupo funcional por sí sola no puede
explicar la notable eficiencia de las amilasas. Sobre la base de la termodinámica de activación y
el análisis de rayos X de la lisozima, se sugiere una distorsión del anillo como un posible
mecanismo de interacción adicional. Para explicar la tasa excepcional de catálisis de amilasa,
se propone un mecanismo de reacción que involucra una combinación de catálisis ácida
general por imidaxol, distorsión de anillo y solvatación electrostática o catálisis de base general
o formación de enlace covalente con un grupo carboxilo. La estereoquímica global de la
reacción está controlada en última instancia por el enfoque dirigido por enzimas del disolvente
al centro de reacción. El mecanismo es consistente con los datos orgánicos enzimáticos y
físicos relacionados con la hidrólisis de glucósidos.
1. Introducción
Hace varios años se demostró que /? - la amilasa invierte cuantitativamente la cotiguración
cuando se hidroliza la amilosa (Thoma y Koshland, 1960a). Estudios recientes con a-amilasa
revelaron que la enzima produjo una retención cuantitativa de la configuración (Thoma, datos
no publicados; Wakim, 1965). La diferencia observada en la estereoquímica del producto
provocó la especulación de que las dos enzimas actúan a través de mecanismos de reacción
fundamentalmente diferentes (Koshland, 1953). Sin embargo, la diferencia de configuración de
los productos también es consistente con un mecanismo de reacción común si las enzimas
varían la dirección de aproximación de una molécula de agua al centro de reacción. Queremos
proponer un mecanismo consistente con la última sugerencia que esté de acuerdo con los
datos físicos orgánicos y enzimáticos de la hidrólisis del acetal. En ausencia de evidencia
contradictoria, un mecanismo común, de acuerdo con el principio de Occam, debería tener la
máxima prioridad. De hecho, existe un precedente para esta recomendación derivado del
trabajo sobre el curso estereoquímico de la sustitución electrofílica catalizada por enzimas de
átomos de carbono saturados (Belleau y Burba, 1960; Englard y Listowsky, 1963; Lienhard y
Rose, 1964a, b; Mandeles , Koppelman & Hanke, 1954; Rose, 1958, 1962; Sprecher, Berger &
Sprinson, 1964). Aunque algunos de los electrofílicos las sustituciones proceden por retención
y algunas por inversión de la configuración, se ha propuesto que el curso estérico de la
reacción resulta de una diferencia en la protonación del intermedio unido a la enzima en lugar
de una diferencia en la estereoquímica de la división del enlace carbono-carbono (Rose, 1958,
1962).
No existen modelos realmente satisfactorios para la catálisis de amilasa, pero Fife (1965) y
Capon (1963) han especulado sobre un papel potencial para un ion carboxilato en la reacción.
Piszkiewicz y Briuce (1967) han discutido la posibilidad de acetamida intermolecular y catálisis
de grupos hidroxilo en la hidrólisis de glucósidos. El grupo a & amide proporciona asistencia
ancimérica para que la posibilidad de catálisis por un enlace amida merezca una seria
consideración.
En este artículo sugerimos que la catálisis de grupo funcional es insuficiente para explicar la
eficiencia excepcional de las amilasas. Se propone que la distorsión del anillo es el factor
adicional requerido para reducir la barrera de activación y que se requiere una combinación de
estos factores para explicar la eficiencia de la amilasa. La hidrólisis de acetales con
sustituyentes alifáticos es ampliamente aceptada para proceder a través de un mecanismo
específico de Al catalizado con iones de hidronio (Bunnett, 1961; Bunton, Lewis, Llewellyn y
Vernon, 1955; Koskikallio y Whalley, 1959; Overend, Rees 8 ~ Sequeira, 1962; Schaleger y Long,
1963; Timell, 1964; Wenthe y Cordes, 1965) excluyendo el solvente como un nucleófilo
participante. Por el contrario, la mayoría de las carbohidrasas exhiben un pH óptimo típico en
forma de campana y, por lo tanto, seguramente no promueven un mecanismo A-1 catalizado
por ácido específico.
2. Grupos funcionales
Para el propósito de la discusión a continuación, no es tan importante establecer la identidad
precisa de los grupos catalíticos como identificarlos con un carácter general de ácido y
nucleófilo. La asignación tentativa para los aminoácidos catalíticos de la a-amilasa porcina es
un anión carboxilato y un catión imidazolio (Wakim, 1965). Estos mismos residuos en sus
estados cargados (Thoma y Koshland, 196Ob; Koshland, Yankeelov y Thoma, 1962) también se
han propuesto como residuos catalíticos en / 3-amilasa y otras carbohidrasas (ver Tabla 1). Las
asignaciones de grupos funcionales para la a-amilasa porcina y la batata / \ beta - amilasa se
han realizado a partir de estudios de la variación de V ,,,, y K ,,, con pH y reactivos que
modifican selectivamente varias cadenas laterales. Sin embargo, la identidad de los grupos
funcionales no se establece con rigor. Un sitio catalítico neutro es cinéticamente indistinguible
de la forma zwitteriónica ya que las formas enzimáticas están relacionadas por transferencia
intramolecular de protones.
Cuando IpK, -pK, I> 2 o 3, la concentración de enzima con un sitio activo sin carga es Kb / Ka
veces menor que la concentración de enzima con un sitio activo en el zwitter- forma iónica Por
lo tanto, el coeficiente catalítico efectivo debe ser Kb / Ka, multiplicado por el coeficiente
medido si la forma no cargada es la especie activa. Multiplicando las constantes de la tasa
hidrolítica de amilasa α y β (francés, 1957) por Kb / Ka, suponiendo que la amilasa α es
dimérica (Loyter y Schramm, 1962) y la amilasa β es tetramérica (Thoma, Wakim y Stewart,
1963 ), proporciona coeficientes catalíticos de las formas no cargadas de aproximadamente 8 x
105 y 2 x lo6 seg-I, respectivamente. Estas constantes de velocidad calculadas son tres órdenes
de magnitud mayores que el valor máximo de aproximadamente 103 seg-1, observado para
otras enzimas hidrolíticas (Eigen y Hammes, 1963) y para reacciones catalizadas por ácido base
ácido general. Aceptar este valor como un límite razonable para la transferencia de protones
durante la acción de la amilasa lleva a la conclusión de que la especie de ion híbrido es la
forma activa.
3. Mecanismo tentativo
En esta sección revisaremos brevemente el estado actual de la catálisis de acetal, desarrollar
un mecanismo que invoque distorsión enzimática y funcional catálisis grupal y demostrar que
esta propuesta es consistente con el actual dato experimentales.
La hidrólisis de acetales y cetales ha sido interpretada casi universalmente en términos de la
hipótesis de Zucker-Hammett (Zucker & Hammett, 1939, Hammett, 1940). Según esta
hipótesis, la hidrólisis es esencialmente desprovisto de participación nucleófila con el solvente
y continúa a través de un estado de transición completamente de carácter SNI. Esta
simplificación excesiva tiene sido atacado de manera convincente por Bunnett (1961) y Long &
Paul (1957).
Recientemente, evidencia de asistencia nucleofílica intramolecular por azufre (Speck,
Rynbrandt y Kochevar, 1965) y por oxígeno (Capon y Thacker, 1965, 1967) en la solvolisis de
acetales ha sido descubierto.
Los resultados de Capon y Thacker son particularmente pertinentes porque revelan que el
grupo C4OH (un análogo de H20 en la reacción enzimática) ejerce un efecto profundo sobre la
velocidad de ciclación catalizada de los dimetilglicósidos.
Estas observaciones recientes y la producción de grandes cantidades de B-metil glucosa
durante la metanólisis de tribencilalilosa (BeMiller y Allen, 1967) son una fuerte evidencia de
un estado de transición que posee propiedades sustanciales de SN2.
La evidencia de la participación nucleófila en la hidrólisis de al menos algunos glucósidos está
respaldada por el análisis de Bunnett (1961) y por la relación "isocinética" observada para la
escisión catalizada por ácido de glucofuranosidos y glucopiranosidos (ver Figs. 1 y 2) . Antes de
discutir la relevancia de estos datos, debe mencionarse que Exner (1964, 1965) recomienda
que las correlaciones entre AH * y TAS 'deben revisarse con precaución porque puede surgir
una relación aparente debido a la forma en que se calculan AH * y AS *. Leffler (1966) ha
sugerido formas de distinguir mecanismos de interacción reales o relaciones lineales de los
aparentes. Se alcanza cierta congruencia de que una relación es real cuando la variación de AH
* y TAS * es significativamente mayor que el error introducido por sus cálculos, una
circunstancia que rara vez se encuentra (Exner, 1964).
Para evitar relaciones espurias entre AH * y TAS *, Exner (1964, 1965) sugirió trazar las
variables realmente independientes, los logaritmos de las constantes de velocidad a dos
temperaturas, una contra la otra (Fig. 1) y luego mapear la línea resultante en AH * versus TAS
'o una parcela relacionada. Fue solo cuando el rango de AH * y TAS” era bastante grande y del
orden de 10 kcal. que Exner (1964) encontró acuerdo entre los métodos alternativos de
mapeo. Dado que la variación de TAS * y AH * es significativamente mayor que sus errores y
cubre un rango de aproximadamente 10-15 kcal., La correlación lineal en la Fig. 2 es
probablemente un efecto real. Esta área de investigación definitivamente merece una mayor
exploración. Tradicionalmente, se ha interpretado que una relación lineal entre AH * y TAS *
para una serie de compuestos relacionados estructuralmente como los observados en la Fig. 2
significa que existe un mecanismo de interacción único para todos los compuestos (Leffler,
1955). Dado que las reacciones representadas en la Fig. 2 están catalizadas por ácido, el
enorme rango en la alteración de la estructura que acompaña a AS * (c. 30-40 eu)
probablemente refleja un cambio de un mecanismo Al a A-2 si la relación entre AH * y AS 'es
real. El cambio mecanicista implicaría un cambio gradual en el grado de participación solvente
en el estado de transición (Bunnett, 1961). En otras palabras, cuando la alteración del acetal
cíclico disminuye AH *, la formación de enlaces (al disolvente o enzima) se vuelve más
sincrónica con la ruptura del enlace. La imagen emergente, entonces, de la hidrólisis del acetal
del trabajo en varios laboratorios.
(Banks et al., 1961; Capon & Thacker, 1967; Overend, Rees & Sequeira, 1962; Speck et al.,
1965) es que el estado de transición puede variar de SN1 a SN2, en carácter durante la
solvolisis. Con toda probabilidad, incluso aquellos estados de transición que poseen un
carácter SN2 implican una participación significativa de los orbitales sp3 solitarios del oxígeno
del anillo (Lemieux y Hayami, 1965) y algunos caracteres de iones de oxicarbonio. Si esto es
cierto, entonces los factores que influyen en las tasas específicas catalizadas por ácidos de los
glucósidos pueden extrapolarse con precaución a la reacción enzimática.
Capon y Thacker (1967) han sugerido una explicación alternativa de las entropías negativas de
activación para la hidrólisis de furanosido. Su postulado prevé una rápida protonación del
oxígeno del acetal acompañado de la apertura del anillo para producir un ion oxicarbonio que
luego se descompone en un paso determinante de la velocidad por reacción con solvente. Esta
vía de reacción alternativa todavía se clasificaría como un mecanismo A-2 porque implica una
reacción bimolecular que controla la velocidad entre el disolvente y el ion oxicarbonio. Sobre
la base de los datos experimentales acumulados, entonces, el grado variable de participación
de nucleófilos parece depender principalmente de la estructura de los sustratos y
secundariamente de las condiciones de reacción. Aunque las razones de este cambio no se
entienden completamente, se ha reconocido que los anillos de cinco miembros son a menudo
más susceptibles al ataque nucleofílico que los anillos de seis miembros. Eliel (1956) ha
sugerido que la liberación de la tensión torsional
en el estado de transición del anillo de cinco miembros puede jugar un papel importante. En
este momento, es suficiente señalar que una recomendación de participación nucleófila en
catálisis enzimática o no enzimática de acetales y cetales no debe recibirse con gran sospecha.
Habiendo presentado una visión actual de la hidrólisis del acetal, ahora deseamos demostrar
que la catálisis del grupo funcional es insuficiente para explicar la velocidad de la acción de la
amilasa y luego sugerir un mecanismo para la reacción catalizada por enzimas.
La impresionante eficiencia de las enzimas a menudo se ha explicado en términos de un
proceso de reacción concertada. Este postulado asume implícitamente que aumentar el
número de grupos funcionales que participan en la reacción reduce AH * pero que la enzima
no tiene que sacrificar la entropía requerida para organizar los grupos porque están
posicionados rígidamente en la enzima (Koshland, 1962). La enzima funciona entonces como
una trampa o sumidero de entropía (Westheimer, 1962) y su eficiencia será proporcional a la
entropía requerida para superar la pérdida de grados de libertad de traslación y rotación
durante la alineación de sustratos y catálisis en la reacción catalizada no enzimática. Es
evidente por la magnitud de las funciones de partición traslacional y rotacional (Schaleger y
Long, 1963) que el fracaso de la enzima para entregar la entropía de la organización puede
conducir a grandes ganancias en las velocidades de reacción. Porque
De las complicaciones inherentes a las soluciones acuosas, estas funciones de partición no
pueden determinarse con la suficiente precisión como para permitir una estimación razonable
de un cambio en la velocidad de reacción. Sin embargo, Koshland (1962) ha propuesto un
enfoque alternativo para estimar el efecto de la entropía de la organización en las tasas de
reacción. Para cada grupo catalítico, asigna un factor de 55 (la concentración molar de agua)
para la pérdida de libertad de traducción y un factor de
diez por pérdida de libertad de rotación que acompaña la alineación del sustrato y
catalizador para formar un complejo que puede proceder directamente a lo largo de la
reacción coordinada al estado de transición. Esto puede ser una subestimación porque no
tiene en cuenta ninguna reducción de la libertad de rotación sobre el punto de contacto del
sustrato y el catalizador que puede ser necesario sacrificar en el estado de transición.
Suponiendo un factor de 10 para la pérdida de esta libertad de rotación, el posicionamiento
rígido de cada grupo catalítico en la enzima podría acelerar la reacción en un factor de 5500
(55 x 10 x IO).

Si la alineación adecuada de los grupos es la única función de una enzima, entonces la

constante de velocidad de primer orden para las amilasas que emplean dos grupos debe ser 3
x IO7 (es decir, 55002) más grande que la constante de velocidad de pseudo primer orden no
enzimática. Debido a que la hidrólisis de glucósidos normalmente está catalizada
específicamente por ácido, el coeficiente de velocidad de la reacción catalizada por carboxil-
imidazol concertada requerida para la comparación no se ha medido. Sin embargo, es
razonable suponer que este coeficiente de velocidad de pseudo-1 & orden (a una
concentración de catalizador 1 M) es menor que el coeficiente de la reacción catalizada por
ácido específica. La constante de velocidad de hidrólisis de maltosa de pseudo-primer orden es
16.8 x 10e6 set-l a 60 ° C y tiene un AH 'de activación de 31.0 kcal./mole (Hassid & Ballou,
1957) para que el coeficiente de velocidad sea 25 ° C se calcula que es 1.5 x lo- * set- '. Si este
valor se acepta como el límite superior para la característica constante de velocidad de pseudo
primer orden de la hidrólisis de glucósidos catalizada por un grupo carboxilo e imidazolio, el
coeficiente de velocidad enzimática máxima se calcula en 1.5 x lo- 'x (5500) 2 - '= 4.5 x 10-l set-
l, un número aproximadamente lo5 veces menor que los coeficientes catalíticos observados de
CI- y / amilasa. Desde las pendientes de las líneas en la Fig. 2, la hidrólisis de glucósidos no es
particularmente sensible a los efectos de entropía, por lo que estos cálculos pueden incluso
exagerar demasiado la importancia de los efectos de orientación y proximidad. Claramente,
debe buscarse otra fuente importante de catálisis.
Una distorsión del anillo inducida por enzimas del sustrato hacia la configuración de media
silla, el estado de transición postulado en la hidrólisis de glicopiranosido, es una posibilidad
probable. Esta distorsión reduce AH * y podría muy bien ser el factor responsable de aumentar
la susceptibilidad de un glucósido normalmente inerte a la catálisis nucleofílica por el grupo
carboxilo o el agua. La afectación nucleofílica puede tomar la forma de formación de enlace
covalente o de solvatación electrostática y estabilización del ion oxicarbonio en desarrollo. Es
digno de mención que la pendiente de la Fig. 2 es de aproximadamente 2 (línea completa),
suponiendo que todos los puntos corresponden a un único conjunto de reacción o
aproximadamente 6 (líneas discontinuas) si se supone que los metilfuranosidos y
metilpiranosidos comprenden conjuntos de reacción separados. Por lo tanto, reducir AH *
puede compensar en gran medida la entropía sacrificada al aumentar el orden del estado de
transición. El valor exacto de esta pendiente, /? (Fig. 2), sigue siendo algo incierto porque las
líneas punteadas mapeadas de la Fig. 1 para metilglicofuranosidos y metilglicopiranosidos
tienen pendientes de aproximadamente 6. Sin embargo, un valor preciso de la pendiente no es
una preocupación importante para nuestros propósitos, sino el hecho de que el efecto de
entalpía parece dominar, el efecto de entropía es sustancial
importancia. Por lo tanto, el efecto neto de la distorsión podría ser un cambio a un estado de
transición de tipo SN, acompañado de una mejora de la tasa debido en gran medida a una
disminución de AH *. En otras palabras, la asistencia del grupo funcional normalmente ineficaz
en la catálisis no enzimática puede ser de gran ayuda si la enzima fuerza bien al sustrato a lo
largo de la reacción coordinada al tensarlo. La cooperación mutua entre la catálisis del grupo
funcional y la distorsión del sustrato puede ser una característica común de las reacciones
enzimáticas. La combinación de estas características en una sola molécula bien puede requerir
que un
biocatalizador ser macromolecular. En la discusión anterior, la rigidez absoluta) de la proteína
no está implícita; una distorsión mutua entre enzima y sustrato puede describir con mayor
precisión el sistema real (Jencks, 1966).
La notable sensibilidad de la hidrólisis de glucósidos al tamaño y la forma del anillo descritos
anteriormente se ilustra por el hecho de que el metil cr-D-fructofuranosido se hidroliza lo5
veces más rápido que el metil a-D-glucopiranosido (Heidt & Purves. 1938, 1944). Otros
factores (Shafizadeh, 1958) pueden estar en juego aquí, pero el tamaño y la forma del anillo
son probablemente los factores de control. Además de presentar
La distorsión de los ángulos de enlace y la tensión torsional en el aplanamiento de la molécula
cíclica del anillo reduce el ángulo diédrico entre un par no compartido de electrones sp3 del
oxígeno del anillo y el enlace C, - 0, que se romperá, ya que las reacciones de eliminación
proceden más rápidamente cuando el anión de partida es coplanar a un hidrógeno (par de
electrones) (Cistrol, 1949; Depuy, Morris. Smith & Smart, 1965), se puede argumentar que este
par de electrones sp3 solitarios en oxígeno en un piranosido distorsionado son muy favorables
orientado para ayudar al desarrollo de un ion oxicarbonio (ver Fig. 3). Sin embargo, el alcance
de esta participación no parece haber sido evaluado cuidadosamente.

Los estudios cristalográficos de rayos X de un complejo inhibidor de la lisozima brindan apoyo

para la razonabilidad del postulado de distorsión (Phillips, 1966; Blake y otros, 1965). Los
patrones de difracción de un complejo enzimático inhibidor sugieren fuertemente que el
sustrato se encuentra en una grieta en la proteína y que se requiere una distorsión sustancial
del anillo que experimenta hidrólisis para acomodar el sustrato en la hendidura. Dos grupos
carboxilo se ubican a horcajadas sobre el centro reactivo, uno presumiblemente actuando
como un catalizador ácido general y el otro como un anión involucrado en la formación de
pares de iones o acciones relacionadas (Phillips, 1966). Loverin y Linn (1967) han informado
recientemente de un sistema modelo fascinante que parece demostrar la catálisis por
distorsión. La reacción implica una aceleración dependiente de proteínas de una isomerización
en tranvía cis - + de colorantes azoicos. Se observó una mejora de las tasas de isomerización de
hasta dos órdenes de magnitud. Jencks (1966) ha publicado recientemente una revisión que
discute los efectos de los cambios de deformación y deformación en la catálisis enzimática.
Varios laboratorios han presentado otra evidencia relacionada con la catálisis de acetal. Las
siguientes observaciones parecen más pertinentes a los mecanismos propuestos. (i) La
hidrólisis de glucósidos con sustituyentes alifáticos normalmente está catalizada
específicamente por ácido (Banks et al., 1961; Overend, Rees y Sequeira, 1962) e impermeable
a la base (Dryselius, Lindberg y Theander, 1958). Sin embargo, se han observado algunas
excepciones cuando la aglicona es un buen grupo saliente, cuando el glucósido es un
furanosido, cuando están presentes grupos vecinos adecuados o cuando se emplean
disolventes adecuados.
Por lo tanto, en condiciones adecuadas, los glucósidos pueden estar sujetos a un ataque
nucleofílico (Ballou, 1954; Rhind-Tutt y Vernon, 1960; Capon, 1963; Capon, Collins, Levy y
Overend, 1964; Capon y Thacker, 1965; Lemieux y Hayami , 1965; Speck et al., 1965). (ii) La
amilasa muestra evidencia de electro-
Recientemente se ha descubierto la catálisis filo-nucleófila (ver Tabla 1) y la catálisis ácida
general de acetales (Capon, 1963; Capon y Thacker, 1965).
(iii) La hidrólisis catalizada por ácido de fenilglicósidos sustituidos es una característica
denominado por un coeficiente de Hammett p negativo (Hammett, 1940) mientras que la
hidrólisis catalizada por bases y enzimas se caracteriza por un coeficiente de Hammett p
positivo (Nath y Rydon, 1954; Matsubara, 1961).
(iv) En ácido, la proporción, kH20 / kD20, para glucósidos es aproximadamente O-3-O-5
(Overend et al., 1962; Wiberg,
1955) mientras que para la amilasa a y fi la relación, kH20 / kD20, es aproximadamente la
misma, 1.25, dentro del error experimental (Koshland et al., 1962; Wakim, 1965).
(v) Los datos de isótopos de oxígeno requieren que tanto a como a-amilasa rompan el enlace
C, -0 (Halpern y Liebowitz, 1959; Mayer y Larner, 1959).
rgumentos y datos presentados anteriormente, es razonable
proponer, entonces, que varios factores que actúan en concierto pueden explicar la notable
eficiencia de las amilasas. Tras la formación del complejo enzima-sustrato, el anillo puede
distorsionarse hacia el estado de transición que reduce significativamente AH * sin una pérdida
compensatoria de AS *. El anillo deformado se vuelve más susceptible al ataque nucleofílico y
aprovecha la asistencia del grupo funcional que normalmente no está disponible para
reacciones catalizadas por ácido. La energía libre desfavorable requerida para la organización
de grupos catalíticos y sustrato en la reacción no enzimática se vence por su posición
relativamente rígida en la enzima. El imidazol, que actúa como un ácido general, dona un
protón al oxígeno acíclico mientras que el anión carboxilato sirve como un dispositivo lógico
para estabilizar el ion oxicarbonio en desarrollo (Lemieux y Hayami, 1965). El campo del anión
y el blindaje electrostático resultante podría mejorarse enormemente mediante la eliminación
de una porción de la vaina de solvatación. La ruptura de la capa de disolvente alrededor del
anión podría lograrse durante la unión del sustrato. Si el agua ataca después de la salida de la
aglicona, una variación menor en la estructura de las dos enzimas podría cambiar la dirección
de aproximación del agua y explicar la retención o inversión de la configuración (ver Fig. 3).
También es factible una formación síncrona de un enlace Ci-0 al agua con la ruptura del enlace
Cl-O del sustrato. La inspección de la Fig. 3 revela que un ataque frontal por el agua para un
glucósido en la conformación C, es bastante difícil debido al hacinamiento estérico excesivo.
Una distorsión en la conformación de la media silla alivia enormemente esta congestión, lo
que hace que un mecanismo de ataque frontal sea un candidato importante para la
consideración.
Un ion oxicarbonio libre de la enzima puede excluirse como un intermedio de reacción porque
no podría tener en cuenta la inversión cuantitativa y la retención de la conhguración. Cuando
se ha investigado la estereoquímica de los productos amilolíticos, siempre se encontró
retención cuantitativa o inversión de la configuración (Thoma y Koshland, 1960a; Hamauzu,
Hiromi y Ono,
1965; Ono, Hiromi y Hamauzu, 1965).
La hipótesis presentada aquí equivale a una modificación y elaboración de propuestas
anteriores (Koshland, Yankeelov y Thoma, 1962; Mayer y Larner, 1959; francés, 1957; Fischer y
Stein, 1960) para la catálisis de amilasa. La solvatación electrostática del estado de transición
por el anión carboxilato o la formación de enlaces covalentes probablemente explica el
coeficiente de reacción positivo de Hammett observado para la reacción mediada por enzimas.
Este hecho también podría explicarse por la participación nucleófila del disolvente en el estado
de transición.
La aceptación de la similitud en los mecanismos de acción de la amilasa a y β requiere que el
efecto isotópico de deuterio de Vmax y la termodinámica de la activación sean los mismos. Se
observa que a 25 ° C dentro del error experimental, la relación Vmax (H20) / Vmax (D2O) es
1.25 para ambas enzimas (Koshland et al., 1962; Wakim, 1965). Flashner y Lukton (1967)
informan una relación de 1.50 + 0.03 para a-amilasa a 30 ° C. Este efecto isotópico
probablemente no refleja los cambios de pK, pero las alteraciones conformacionales no se han
excluido como factor contribuyente (Flashner y Lukton, 1967). La constancia de esta relación
no necesariamente es compatible, pero es consistente con una transferencia de protones
determinante de la velocidad (Swain, Kuhn y Schowen, 1965; Bell, 1959) pero inconsistente
con una transferencia de protones pre-equilibrio que precede al paso de determinación de la
velocidad. Como se muestra en la Fig. 2, AH ”y AS * para la catálisis con CI y fi amilasa son casi
idénticos, un hecho consistente con un mecanismo de reacción común. Si la catálisis de la β-
amilasa se iniciara por un desplazamiento nucleofílico posterior con un grupo carboxilo
seguido de un ataque posterior por agua, los parámetros termodinámicos de activación
probablemente diferirían significativamente (Sullivan, 1967). El mecanismo enzimático que
proponemos, entonces, parece ser completamente consistente con los datos físicos, orgánicos
y enzimáticos disponibles. Debe considerarse solo como un mecanismo tentativo que
requerirá modificación o revisión a medida que se disponga de información adicional de
investigaciones tanto enzimáticas como no enzimáticas. Esta investigación fue apoyada en
parte por subvenciones GM 08500 y AM 14289 del Servicio de Salud Pública de los EE. UU. Y en
parte por una subvención de la Fundación de Investigación de Corn Industries.