Manual Microbiología General
Manual Microbiología General
Manual Microbiología General
FACULTAD DE QUÍMICA
MANUAL DE LABORATORIO
MICROBIOLOGÍA GENERAL
Elaboró:
0
Índice
Págs.
Presentación 2
Introducción 3
Objetivos Generales 4
Reglamento de laboratorio 5
Práctica No. 1: Microscopia 6
Practica No. 2: Esterilización y desinfección 15
Práctica No. 3: Preparación de medios de cultivo 23
Práctica No. 4: Aislamiento de Microorganismos en cultivo puro 28
Práctica No. 5: Tinciones diferenciales 35
Práctica No. 6: Morfología macroscópica y microscópica de hongos 50
Práctica No. 7: Observación microscópica de preparaciones
teñidas de protozoarios 57
Práctica No. 8: Morfología macroscópica y microscópica de algas 63
Práctica No. 9: Metabolismo bacteriano 70
Forma de evaluación 82
Anexos 83
Referencias bibliográficas 85
Imágenes pictográficas:
Descripción de la práctica
Conclusiones y sugerencias
Cuestionario
Actividad de síntesis
1
Referencias bibliográficas
2
Presentación
El presente manual esta diseñado para los alumnos que cursan los Programas
Educativos de Químico Farmacéutico Biólogo y Químico en Alimentos, el documento
integra información suficiente para desarrollar las competencias básicas en
Microbiología.
El diseño y contenido del Manual permite a los alumnos, integrar los conocimientos en
teoría y llevarlos a realizar un trabajo en el laboratorio en donde el proceso enseñanza
aprendizaje es integral.
Las actividades que se llevan a cabo son experimentales, iniciando con el uso y manejo
del microscopio hasta metabolismo microbiano, es importante recalcar que este
documento se elaboró de manera didáctica, de tal manera de que las prácticas se
lleven a cabo con claridad y sobre todo con una secuencia lógica entre la teoría y la
práctica.
En este manual se plantean nueve prácticas que integran los conocimientos adquiridos
en teoría considerando que los alumnos desarrollen competencias entre las que se
incluyen el manejo de instrumentos, equipo y procesos metodológicos para comprender
y utilizar a los microorganismos en beneficio del hombre.
3
Introducción
En la naturaleza existe una diversidad de seres vivos constituidos por una o varias células
denominadas microorganismo debido a que la gran mayoría de ellos no son visibles a simple
vista.
Los microorganismos, en especial las bacterias y los hongos, son los principales degradadores
de la materia orgánica, participan en diferentes procesos biotecnológicos, tales como
fermentación alcohólica, producción de alimentos, fabricación de productos lácteos, síntesis de
sustancias importantes en la medicina (insulina, antibióticos, hormonas, estrógenos). Los
microorganismos también son transmisores de enfermedades como lepra, tuberculosis, etc.
En los medios acuáticos algunas bacterias conjuntamente con las algas son las responsables
de la producción de oxígeno y del almacenamiento de la energía en los alimentos.
La microbiología, estudia por lo tanto a las bacterias, hongos, virus, algas y protozoos, todos
ellos fundamentales en la organización de la vida sobre la tierra.
La microbiología, es considerada:
4
Objetivos generales:
5
Reglamento de laboratorio
6
Práctica No. 1
Microscopia
Introducción:
Un microscopio puede definirse como un instrumento óptico formado por una o varias
lentes cuyo propósito es amplificar y resolver la imagen de objetos pequeños. Existen
dos tipos de microscopios:
Simple: Es una sola lente biconvexa con la cual se permite observar multitud de
objetos microscópicos.
7
El tubo: Tiene forma cilíndrica y está ennegrecido internamente para evitar las
molestias que ocasionan los reflejos de la luz. En su extremidad superior se
colocan los oculares.
El revólver: Es una pieza giratoria provista de orificios en los cuales se enroscan
los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se
colocan en posición de trabajo, la cual se nota por el ruido de un piñón que lo fija.
La columna: Llamada también asa o brazo, es una pieza colocada en la parte
posterior del aparato. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo
inferior se adapta al pie.
La platina: Es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u
objeto que se va a observar. Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que
permite el paso de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija,
en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir,
mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.
Carro: Es un dispositivo colocado sobre la platina que permite deslizar la
preparación con movimiento ortogonal de adelante hacia atrás y de derecha a
izquierda.
El tornillo macrométrico: Girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del
microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a una cremallera. Estos
movimientos largos permiten el enfoque rápido de la preparación.
El tornillo micrométrico: Mediante el movimiento casi imperceptible que produce
al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nítido de la
preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm que
se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos.
1. Los oculares: Los oculares están constituidos generalmente por dos lentes,
dispuestas sobre un tubo corto. Los oculares generalmente más utilizados son los
de: 8X, 10X, 12.5X, 15X. La X se utiliza para expresar en forma abreviada los
aumentos.
2. Los objetivos: Los objetivos producen aumento de las imágenes de los objetos
y organismos y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los
objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de
inmersión.
Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre
ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el
aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. El número de
objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos
de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 6X, 10X, 20X, 45X y
60X.
El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes.
Para observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite
de cedro entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre en
contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se
distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo
inferior.
8
Los objetivos se disponen en una pieza giratoria denominada revólver.
El espejo: Tiene dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en
todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación
artificial, y la plana, para iluminación natural (luz solar). Modernamente se
prescinde del espejo en la fabricación de microscopios, ya que éstos traen
incorporada una lámpara colocada en el eje del microscopio.
Condensador: El condensador está formado por un sistema de lentes, cuya
finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación. El
condensador se halla debajo de la platina. El condensador puede deslizarse sobre
un sistema de cremallera mediante un tornillo que determina su movimiento
ascendente o descendente.
Diafragma: Generalmente, el condensador está provisto de un diafragma-iris, que
regula su abertura y controla la calidad de luz que debe pasar a través del
condensador.
9
Candida albicans Contraste de fases, X 400
La muestra se tiñe con una sustancia fluorescente que absorbe la energía de las ondas
cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas más largas (verde). Se
utiliza en inmunofluorescencia, técnica en la cual, una sustancia fluorescente se une a
un anticuerpo específico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se
une al microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar.
Esta técnica se usa en clínica.
10
Sustancias amiloides en Riñón
Leptospira spp.
11
Con el objetivo se enfoca la imagen, que es ampliada por la lente de proyección. Para
variar los aumentos en el microscopio electrónico basta variar la distancia focal de la
lente proyectora.
Como los electrones no impresionan la retina del ojo humano, debe recogerse la
imagen del microscopio electrónico en una pantalla fluorescente, la cual posee una
superficie impregnada con fósforo o sulfuro de cinc. La imagen obtenida en esta
pantalla puede fotografiarse
Cuidados especiales.
El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que
pudieran dañarlo. Mientras no esté en uso debe guardarse en un estuche o
gabinete, o bien cubrirlo con una bolsa plástica o campana de vidrio.
12
Las partes mecánicas deben limpiarse con un paño suave; en algunos casos, éste
se puede humedecer con xilol para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de
cedro, parafina, etc. Que hayan caído sobre las citadas partes.
La limpieza de las partes ópticas requiere precauciones especiales. Para ello debe
emplearse papel "limpiante" que se expiden en las casas distribuidoras de material
de laboratorio. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador
con los dedos; las huellas digitales perjudican la visibilidad, y cuando se secan
resulta trabajoso eliminarlas.
Para una buena limpieza de las lentes puede humedecerse el papel "limpiante" con
éter y luego pasarlo por la superficie cuantas veces sea necesario. El aceite de cedro
que queda sobre la lente frontal del objetivo de inmersión debe quitarse
inmediatamente después de finalizada la observación. Para ello se puede pasar el
papel "limpia lentes" impregnado con una gota de xilol.
Material:
Descripción de la práctica:
13
7. Dando un semigiro con el revólver coloque una gota de aceite de inmersión sobre
la preparación. Enseguida gira el revólver hasta que el objetivo 100X quede en su
lugar.
8. Incremente la iluminación abriendo el diafragma o elevando el condensador, al
mismo tiempo enfoque con el tornillo micrométrico.
9. Dibuje los esquemas de las observaciones en su manual de la práctica
detallando las características de cada uno de los microorganismos observados.
Evaluación de la práctica:
Examen escrito
Reporte de la práctica
Habilidades durante el desarrollo de la práctica
Conclusiones y sugerencias:
14
Cuestionario:
2. ¿Qué significan las cuatro inscripciones que tiene cada uno de los objetivos?
Actividades de síntesis:
El alumno elaborará un resumen de los conceptos relacionado con práctica así como el
fundamento de la Microscopía.
Referencias bibliográficas:
15
Práctica No. 2
Esterilización y desinfección
Introducción:
Métodos de Esterilización:
1. Agentes Físicos
Calor Seco
Calor Húmedo.
La esterilización con calor húmedo (vapor de agua) es mucho más rápida y eficaz que
el calor seco debido a que las moléculas de agua desnaturalizan las proteínas de forma
irreversible mediante rotura de las uniones H entre los grupos peptídicos a
temperaturas relativamente bajas.
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a. Autoclave: horno a presión, consiste en una cámara en la que el aire puede ser
sustituido por vapor de agua sometida a presión. Se opera a 121º C y 1 atm. de
presión durante 20 minutos. De esta forma se consigue destruir todas las formas
vegetativas y esporas. Se utiliza para esterilizar todo material resistente a esa
temperatura y es muy empleada para la esterilización de medios de cultivos
17
Formol o formaldehído.
Glutaraldehído.
Se emplea sumergiendo el material limpio en una solución al 2%, se usa sobre todo en
la esterilización de instrumentos ópticos y los utilizados en terapia respiratoria.
Desinfectantes y antisépticos.
1. Compuestos inorgánicos.
2. Compuestos orgánicos.
18
b. Fenoles: Actúan precipitando proteínas. El hexaclorofeno y el fenol no se
emplean por su toxicidad. Otros derivados fenólicos son los cresoles, los que
unidos a jabones originan compuestos estables.
c. Clorohexidina: Es un derivado fenólico que actúa alterando la permeabilidad de
la membrana celular bacteriana. Tiene inactivación rápida y es bien tolerado por la
piel. Se emplea mucho en hospitales en el lavado de la superficie cutánea en
forma de solución (acuosa o alcohólica) o asociada a detergentes no iónicos.
d. Detergentes: anionicos. Actúan desorganizando las membranas citoplasmáticas.
Tienen escaso poder bacteriostático. Se pueden mejorar combinándolos con
desinfectantes u otras sustancias tensoactivas como laurilsulfato.
e. Detergentes cationicos: Tienen acción antiséptica, se inactivan en contacto con
jabón, algodón y materia orgánica. Son poco usados.
f. Glicoles: Propilenglicol y Etilenglicol, se aplican por medio de unos aparatos
llamados glicosatos o en forma de aerosoles para desinfección ambiental.
Material:
Descripción de la práctica:
2 tubos 20 minutos
2 tubos 40 minutos
2 tubos 60 minutos
19
6. Rotule una serie de cuatro tubos de la siguiente forma: 0, 20, 40, y 60 min. con
caldo nutritivo no estéril, y otra serie con caldo nutritivo estéril.
7. Adicionar una serie de tubos un volumen de 3.0 ml de caldo nutritivo sin
esterilizar e incubar a 37oC durante 24 – 48 hrs.
8. Adicionar a la otra serie de tubos un volumen de 3.0 ml de caldo nutritivo
estéril e incubar a 37oC durante 24 – 48 Hrs.
1. Solicite dos tubos de ensayo que contengan cada uno,1 ml. de suspensión
de Escherichia coli.
2. Junto a la zona de esterilidad del mechero, vierta el contenido de uno de los
tubos en el fondo de una caja de petri estéril; añada 15 ml de medio agar
nutritivo fundido y enfriar a 45 ° C.
3. Mezclar la suspensión de bacterias con el agar, efectuando delicadamente
movimientos de rotación de la caja petri sobre la mesa de trabajo.
4. Deje reposar la caja para que solidifique al agar.
5. Una vez que el agar ha solidificado, invierta la caja y sobre el fondo, con un
marcador identifique como control de esterilización.
6. El segundo tubo con suspensión de E. coli se pondrá a esterilizar en
autoclave 15 lb por 15 min.
7. Después del tiempo de esterilización el tubo se someterá a los pasos del 1
al 5, solo que la caja se marcará como problema de esterilización.
Desinfección:
1. Marque dos cajas petri, que contenga agar nutritivo, de las siguientes
maneras:
20
Control de desinfección.
Problema de desinfección
Evaluación de la práctica:
Examen escrito
Reporte de la práctica
Habilidades durante el desarrollo de la práctica
Calor seco
Tiempo de esterilización
Calor húmedo
Desinfección
21
Conclusiones y sugerencias:
Cuestionario:
Nombre dos agentes físicos y dos químicos que reúnan el concepto de ser
esterilizantes y explique su mecanismo de acción
Actividades de síntesis:
22
Referencias bibliográficas:
23
Práctica No. 3
Introducción.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión
de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.
Por su estado:
a. Medios líquidos
b. Medios sólidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido
acídico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa
a una concentración del 1,5%.
c. Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%.
Por su composición:
24
Por su función
25
Material:
Agar nutritivo
Agar dextrosa
Agar eosina azul de metileno
Agar Salmonella- Shigella
Benzal al 10%
Cloruro de sodio al 0.85%.
Descripción de la práctica:
Evaluación:
Descripción de la práctica:
26
Análisis y discusión de resultados:
Conclusiones y sugerencias:
Cuestionario:
Actividad de síntesis:
27
Referencias bibliográficas:
28
Práctica No. 4
Introducción:
Un cultivo puro o axénico es aquel formado por células provenientes de una sola inicial
y por tanto perteneciente a la misma especie y cepa. Es una situación artificial ya que
en la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas y
heterogéneas. Es un artificio obligado para estudiar cada especie y cepa de
microorganismo en particular.
29
Técnica de vertido en placa.
30
Técnica de enriquecimiento del cultivo: consiste en diseñar condiciones de cultivo
que favorezcan específicamente al microorganismo que queremos aislar y que se
encuentra en pequeñas cantidades.
Morfología colonial
Tamaño: mm
Cromogénesis: color del pigmento
Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, huso
Elevación: lisa, elevada, convexa, pulvinada, abonetada
Borde: entero, ondulado, lobado, recortado, filamentoso, rizado.
Superficie: lisa o rugosa.
Luz reflejada: brillante, mate.
Luz transmitida: opaca, translucida o transparente
Consistencia: suave (mucoide o friable) o dura.
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c. En medios sólidos, agar (siembra por picadura)
d. En gelatina
Material:
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Medios de cultivo y reactivos:
Muestras biológicas:
Tierra, suelo
Agua limpia de pozo
Agua sucia de estanque
Agua sucia de canal
Leche
Procedimiento de la práctica:
Aislamiento de bacterias.
a) De las 2 últimas diluciones transferir 1ml a una caja petri estéril (realizar
por duplicado)
b) Agregar agar nutritivo y mezclar lentamente por rotación
c) Dejar melificar e incubar a 37° C/ 24 hrs.
3. Aislamiento de hongos.
33
d) Dejar gelificar e incubar a 28° C/48 – 72 hrs.
Evaluación:
Conclusiones y sugerencias
34
Cuestionario:
2. ¿Cual es la razón del por qué se aíslan los microorganismos en cultivo puro?
3. ¿Qué precauciones debe tomar al momento de realizar las diluciones para evitar
errores?
Actividad de síntesis:
Referencias bibliográficas:
35
Práctica No. 5
Tinciones diferenciales
Introducción:
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver
con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y
el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización
de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células
o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente,
aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y
alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células
que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador,
y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el
encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan
mayores que lo que es realmente, de manera que las medidas de las células que han
sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia
son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el
cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente
(aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales
como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo
Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este
grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para
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revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudán.
Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con
otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se
denomina mordente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina
con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el
colorante.
Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en
ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero
que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales
estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para
tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es
una estructura realmente existente.
Preparación de un frote
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se
va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez
que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede
ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para
transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del
portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina
previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy
pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada
de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción
apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde
puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar
37
al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de
Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme.
Tinción Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la
misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
Tinción Diferencial
Tinción Gram.
La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así
como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que
confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula Gram positiva es gruesa y
consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido
teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram positiva es
peptidoglicano. La pared de la célula Gram negativa, por otro lado, contiene una capa
mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana
exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20%
de la pared de la célula Gram negativa es peptidoglicano.
Las paredes de las bacterias Gram positivas contienen menos aminoácidos que las
Gram negativas; el contenido graso es mucho más elevado en las Gram negativas que
en las gram positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de
la reacción al gram.
38
Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa
39
Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción
Gram:
Cocos
Bacilos
Empalizadas, Bacilos
Forma de vara: Dos bacilos juntos: Cadenas de bacilos:
lado con lado o en
se llaman Bacilos Diplobacilos Estreptobacilos
figuras en X, V o Y
40
Tinción Gram:
Cocos Gram-positivos
Micrococcus sp
Bacilos Gram-positivos
Actinomycetes y Nocardia
41
Bacterias Gram-negativas
Cocos Gram-negativos
Bacilos Gram-negativos
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos de alto
peso molecular (ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la
tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las
micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como
Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La
coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante
atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
Tinción de esporas
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Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen
en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes,
temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora
por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa
se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora
germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura
durante años. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para
el hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés.
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas
aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua,
y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.
Tinción de cápsula.
43
Las características de producir cápsulas, es una propiedad hereditaria del organismo,
pero estas estructuras no son componentes celulares absolutamente esenciales, ya
que cepas mutantes sin cápsula, son capaces de crecer en cultivo puro.
Material:
Soluciones:
Descripción de la práctica:
44
Método de Gram
1. Siguiendo las indicaciones del profesor, coloca una gota de agua destilada
en el porta objetos
2. Toma con el asa de platino los diferentes cultivos y suspenderlos en la gota
de agua extendiéndolos sobre una superficie de 1.5 a 2.0 cm.
3. Dejar secar el aire los diferentes frotes
4. Fijar los frotes al calor, pasando los portaobjetos tres veces sobre la flama del
mechero Fisher, por la cara contraria de aquella en que se encuentra el frote.
Tenga cuidado de no calentar en exceso.
5. Coloca la preparación sobre el puente de tinción y cubrir el frote con
solución colorante de cristal violeta
6. Dejar actuar el colorante por 1 minuto
7. Lavar con agua destilada y dejar escurrir los frotes
8. Cubrir con solución de lugol y dejar actuar por 1 minuto
9. Lavar con agua destilada y dejar escurrir bien los frotis
10. dejarlo con etanol - acetona únicamente 0 segundos
11. Lavar rápidamente y suavemente con agua destilada y escurrir bien la
preparación
12. Cubrir con solución colorante de safranina y dejar actuar por 1minuto
13. Lavar rápidamente y suavemente con agua destilada y escurrir bien los
frotes
14. Dejar secar al aire y observar al microscopio
15. Registrar los resultados obtenidos con ilustraciones
Gram - positivos
Cocos
En racimos: forma típica
Staphylococcus sp.
Ejemplo: Staphylococcus aureus
Gram - negativos
45
Cocos
Bacilos
1. Preparar un frote en el centro del porta objetos de una cada una de las mezclas
siguientes:
Mycobacterium phlei
46
1. En un portaobjetos limpios coloque una gota de rojo de congo
2. Utilizando esta gota realice un frote con el cultivo de Klebsiella penumoniae y
dejar secar al aire
3. Sin fijar el frote cúbralo con una gota de mordente para cápsula y déjelo actuar
por 1 minuto
4. Con precaución lavar el frote con agua destilada
5. Escurra el agua y deje secar al aire.
6. Observar al microscopio y registrar sus resultados con ilustraciones
Evaluación:
Tinción de Gram
Tinción de Cápsula
Tinción de Esporas
Conclusiones y sugerencias:
48
Cuestionario:
Actividad de síntesis:
49
Explique como interaccionan los colorantes y los componentes estructurales de
los microorganismos
Cuales son los componentes estructurales de los microorganismos susceptibles
de interaccionar con los colorantes
Referencias bibliográficas:
50
Practica No. 6
Introducción:
Un hongo es un organismo eucariota, portador de esporas, con una nutrición absortiva
y carente de clorofila; se reproducen asexualmente, sexualmente, o de ambas
maneras; y normalmente posee hifas filamentosas rodeadas de paredes celulares, que
habitualmente contiene quitina.
La clasificación de los hongos se basa principalmente en la anatomía de estos
microbios, especialmente en el aspecto de las hifas, micelios y la naturaleza de las
esporas reproductoras que forman.
Las hifas son células en forma de hilos relativamente rugosos de un grosor de unas 4μ
que forman un micelio.
51
Continuo (cenocitico): Hifas no tabicadas permiten que el citoplasma multicelular
fluya sin interrupción a lo largo del filamento y por lo tanto se dice que es micelio
cenocitico, es decir, el protoplasma es compartido por todo el moho.
La parte del micelio que penetra en el medio para la absorción de alimento se llama
micelio vegetativo. La parte de desarrollo que se proyecta desde la superficie al aire es
el micelio aéreo, esta masa característica da a los mohos su aspecto velloso.
En los Zygomycetes la punta de cada hifa fecunda, se alarga dentro de una cabeza
peculiar llamada columela. A su alrededor se desarrolla un saco redondo, el
esporangio, dentro del cual se forman las esporas.
Esporas. Cualquier estructura simple redondeada, que cuando se separa del hongo
progenitor, es capaz de germinar y reproducir el organismo completo.
Todos los organismos se reproducen por esporas. En los mohos mas desarrollados, las
esporas reproductoras se forman asexualmente en gran número sobre hifas fecundas,
característicamente muy diferenciadas. En otros hongos se reproducen las esporas
directamente de la parte que se desarrolla (vegetativa) del hongo, sin ninguna
estructura reproductora especial. Todos los hongos a excepción de los hongos
imperfectos, pueden formar esporas sexuales de alguna clase.
52
Clamidosporas: parte inclinada y redondeada de una hifa, redondeada por una pared
gruesa y resistente. Es una parte enquistada y permanente del hongo, capaz de resistir
ambientes desfavorables.
53
Conidios: formadas en el exterior de una membrana limitante, que nace de hifas
especializadas (conidioforos), o que surgen directamente del micelio vegetativo. Se
liberan de las hifas por abstricción en el punto de unión.
54
Geotrichum candidum Levaduras
Morfología macroscópica:
Placa con una colonia de Penicillium sp. Colonias de levaduras en placa de Petri
Material:
Microscopio
Asa micológica
Mechero Bunsen
Portaobjetos
Cubreobjetos
Gradilla
Aguja de disección
Colorante de contraste
Azul algodón lactofenol
55
Descripción de la práctica:
Preparación en fresco:
Evaluación de la práctica:
Conclusiones y sugerencias
56
Cuestionario:
1. Explique la diferencia que hay entre una coloración simple y una preparación en
fresco.
Actividades de síntesis:
Referencias bibliográficas:
57
Práctica No. 7
Introducción:
Mastigóforos o flagelados: Están provistos de uno o varios flagelos que les permiten
moverse, se reproducen por división longitudinal, viven libremente y otros son parásitos
que producen enfermedades, algunas muy graves, especialmente las tricomoniasis, la
enfermedad del sueño, la enfermedad de Chagas, la leptomoniasis, etc.
58
Sarcodinos o rizópodos: Se caracterizan por tener prolongaciones de materia
citoplasmática. Unos, como los Ameboideas no tienen membrana rígida; otros, los
foraminíferos, radiolarios y heliozoos poseen un esqueleto silíceo o calcáreo y sus
seudópodos son radiantes de infinidad de formas y dibujos.
Este tipo de reproducción cíclica origina algunas enfermedades graves, como las
fiebres terciarias o paludismo. Ocasionada por el Plasmodium.
59
Ejemplos de protozoarios:
Flagelados:
Sarcodinos:
Esporozoos:
60
Ciliados:
Material:
Descripción de la práctica:
Evaluación de la práctica:
61
Conclusiones y sugerencias
CUESTIONARIO:
62
Actividades de síntesis:
Referencias bibliográficas:
1. Becker, W. M. Reece, J. B. and Poenie, M. F. 1996. The World of the Cell. 3th ed.
Rewood City. California. Benjamín Cummings.
2. Beveridge, T. J. 1989. The structure of Bacteria. In Bacteria in Nature, Vol. 3. J. S.
Poindexter and E. R. Leadbetter editors. New York: Plenim. Pp. 1 – 65.
3. Dix, N. J. and Webster, J. W. 1995. Fangal Ecology. Englewood Cliffts, N. J.
Prentice – Hall.
4. Fenchel, T. 1987. Ecology of Protozoa. New Cork. Springer – Verlag.
5. Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. 1999. “Microbiología“. 4ª ed. Edit.
McGraw-Hill-Interamericana. España,. Pp. 729-733.
Imágenes:
63
Practica No. 8
Introducción:
Las algas son eucariotas que carecen de un sistema vascular bien desarrollado y de
estructuras reproductoras complejas, pero que poseen clorofila y otros pigmentos para
realizar una fotosíntesis productora de oxígeno.
Plactónicas; suspendidas
Ancladas
Bentónicas; viviendo en el fondo
Neustónicar, viviendo en la interfase entre el agua y la atmósfera.
Algunas crecen sobre rocas, madera o árboles húmedos, o sobre la tierra húmeda.
La célula de alga eucariota está rodeada de una pared celular fina y rígida. Algunas
algas poseen una matriz externa situada por fuera de la pared celular, que suele ser
flexible y gelatinosa, similar a las cápsulas de las bacterias.
El núcleo posee una membrana nuclear típica con poros; en el interior del núcleo se
encuentra un nucléolo, cromatina y cariolinfa.
64
Los cloroplastos poseen sacos limitados por membranas llamados tilacoides que
realizan las características de la fase luminosa de la fotosíntesis. Estos orgánulos están
incluidos en el estroma, donde tienen lugar las reacciones de la fase oscura de fijación
del dióxido de carbono. En los cloroplastos puede haber una zona proteinácea densa,
el pirenoide, relacionado con la síntesis y almacenamiento de almidón.
Nutrición
Las algas pueden ser autrótofas o heterótrofas. La mayoría son fotoautótrofas; solo
requieren luz y CO2 como fuentes principales de energía y de carbono. Las algas
quimioheterotrofas requieren compuestos orgánicos externos como fuentes de carbono
y de energía.
El cuerpo vegetativo de las algas se denomina talo. Varía desde la relativa simplicidad
de una sola célula a la complejidad más llamativa de las formas
multicelulares, como son los quelpos gigantes. Las algas unicelulares pueden
ser tan pequeñas como las bacterias, mientras que el quelpo puede llegar a
alcanzar una longitud superior a 75 m.
Unicelulares
Coloniales
Filamentosas
Membranosas y en forma de hojas
Tubulares
Reproducción
65
Sexual. Se forman huevos en el interior de las células vegetativas relativamente poco
modificadas llamadas oogamias, que funcionan como estructuras femeninas. Los
espermios se forman en estructuras reproductoras masculinas denominadas anteridios.
En la reproducción sexual los gametos se fusionan para formar un zigoto diploide.
Clasificación
De acuerdo con los sistemas de cinco reinos de Whittaker, las algas pertenecen a siete
divisiones repartidas en dos reinos diferentes. Esta clasificación se basa en
propiedades de la célula, no del organismo.
66
Euglenophyta Euglena viridi
Pyrrhophyta Charophyta
Ceratium Chara
Chlorophyta Phaeophyta
Hydrodictyon Fucus
Rhodophyta Phaeophyta
Porphyra
Material:
67
Cultivos de algas Lápices de colores
Descripción de la práctica:
Preparación en fresco.
Evaluación de la práctica:
Conclusiones y sugerencias:
68
Cuestionario:
Actividades de síntesis:
69
Referencias bibliográficas:
1. Becker, W. M. Reece, J. B. and Poenie, M. F. 1996. The World of the Cell. 3th ed.
Rewood City. California. Benjamín Cummings.
2. Dix, N. J. and Webster, J. W. 1995. Fangal Ecology. Englewood Cliffts, N. J.
Prentice – Hall.
3. Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. 1999. “Microbiología“. 4ª ed. Edit.
McGraw-Hill-Interamericana. España,. Pp. 729-733.
Imágenes:
70
Practica No. 9
Metabolismo bacteriano
Introducción:
La enzima que efectúa la hidrólisis de almidón se llama amilasa; estas dos enzimas son
del tipo extracelular, ya que se secretan a través de la pared celular para que degraden
sustancias complejas en unidades que puedan penetrar a la célula con facilidad.
71
Urea amoniaco bióxido de carbono
Prueba Aplicación en el
Descripción
bioquímica laboratorio
Fermentación Durante el crecimiento fermentativo La fermentación de azucares
de hidratos de con azucares o alcoholes de específicos se emplea para
carbono azucares se produce ácido y/o gas. diferenciar bacterias entéricas
así como otros géneros o
especies.
Hidrólisis de Detecta la presencia de caseinasa, Se emplea para cultivar y
caseína una enzima capaz de hidrolizar la diferenciar actinomicetos
proteína láctea caseína. Las aerobios basándose en la
bacterias que utilizan caseína utilización de caseína. Por
aparecen como colonias rodeadas ejemplo, Streptomyces
de una zona transparente. utiliza caseína y Nocardia
no.
Licuefacción Detecta si una bacteria produce o no Se emplea en la
de gelatina proteasas que hidrolizan la gelatina identificación de
y causan licuefacción de un medio Clostridium, Serratia,
sólido de gelatina. Pseudomonas y
Flavobacterium.
Sulfuro de Detecta la formación de sulfuro de Importante en la
hidrógeno hidrógeno a partir del aminoácido identificación de
cisteína por la desulfurasa de Edwardsiella, Proteasa y
cisteína. Salmonella.
72
El “Indol” detecta la producción de
Se emplea para diferenciar
indol a partir del aminoácido
Escherichia (RM+, VP-,
triptofano. El “Rojo de metilo” es un
IMViC (indol; indol+) de Enterobacter
indicador de pH para determinar si la
rojo de metilo; (RM-, VP+, indol-) y Klesiella
bacteria ha producido ácido. “VP
Voges- pseudoniae (RM-, VP+,
(Voges-Proskauer)” detecta la
Proskauer, indol-); también se emplea
producción de acetoína. La prueba
citrato) para caracterizar a los
del “citrato” determina si la bacteria
miembros del género
puede emplear citrato sodico como
Bacillus.
fuente exclusiva de carbono.
Detecta la presencia de lipasa, que
Reducción de Se emplea en la
escinde lípidos en ácidos grasos
nitratos diferenciación de clostridios.
libres y glicerol.
Se emplea para identificar
Hidrólisis del Detecta la presencia de la enzima hidrolizadores típicos del
almidón amilasa, que hidroliza el almidón. almidón como especies de
Bacillus.
Útil para diferenciar Proteus,
Providencia rettgeri y
Detecta la enzima que desdobla la
Ureasa Klebsiella pneumoniae (+)
urea en NH2 y CO2.
de Salmonella, Shigella y
Escherichia (-)
Hidrólisis de proteínas:
73
Reacciones bioquímicas de aminoácidos:
SIM
MIO
Medio LIA. La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD-(+), que la
transforman en cadaverina; esto produce un viraje al color violeta del indicador púrpura
de bromocresol. La formación de H 2S produce coloración negra por el sulfuro de hierro
producido.
74
Urea. El medio urea contiene un indicador de pH que vira a color rosa fuerte cuando la
reacción es positiva.
Fermentación de carbohidratos:
RM - VP (Rojo de metilo – Voges - Proskauer)
75
Respiración:
Nitrato negativo
Nitrato positivo
76
Antes de Zn Después de Zn
Material:
Material biológico:
77
Descripción de la práctica:
a) Dividir el área de siembra de las cajas petri que contienen Czapeck almidón y
Czapeck celulosa.
b) Sembrar en cada sección los diferentes microorganismos.
c) Incubar a 37° C durante 24 horas.
d) Observar la producción y acción de las enzimas extracelulares, en las placas de
Czapeck almidón usando unas gotas de lugol.
a) Dividir el área de siembra de las cajas petri que contienen agar leche descremada
y agar caseína en 8 secciones.
b) Sembrar en cada sección los diferentes microorganismos.
c) Incubar a 37° C durante 24 horas.
d) Observar la producción de la enzima proteasa agregando a las placas de agar
caseína unas gotas de cloruro mercúrico. Por diferencia de opacidad observar la
hidrólisis de caseína en las placas de agar leche descremada.
e) Por picadura inocular los tubos que contienen agar gelatina con los cultivos
señalados. Incubar a 37° C durante 24 horas y posteriormente refrigerarlos 2
horas para observar la licuefacción de la gelatina.
a) Sembrar por picadura en los tubos rotulados con SIM, los cultivos de los
microorganismos señalados.
b) Incubar a 37° C durante 24 horas. Posteriormente verter a los tubos unas gotas de
reactivo de Kovac´s, observando la formación de un anillo rojo lo cual indica la
presencia de Indol. La producción de H 2S se detecta por la aparición de un color o
un precipitado negro en el medio de cultivo.
SIM (+)
(15)
78
2. Producción de putrecina y CO2 en el medio MIO:
Sembrar por picadura en los tubos rotulados con MIO, los cultivos de los
microorganismos señalados.
Incubar a 37° C durante 24 horas.
Observar la producción de putrecina por un vire de color del indicador púrpura de
bromocresol a morado intenso. Y la producción de CO 2 por medio de burbujas en el
medio.
Sembrar por picadura en los tubos rotulados con LIA, los cultivos de los
microorganismos señalados.
Incubar a 37° C durante 24 horas.
La biosíntesis de cadaverina se observa por medio del cambio de color del indicador
púrpura de bromocresol y el CO2 por la aparición de burbujas en el medio.
(16)
a) Inocular cada una de las cepas bacterianas en cada uno de los tubos de rojo de
fenol y caldo glucosado o de RM-VP.
b) Incubar a 37° C durante 24 horas.
c) Observar la producción de acetil metil carbinol (prueba de Voges Proskauer) en
los tubos de caldo glucosado, así como el pH final de los cultivos mediante el
reactivo de rojo de metilo.
d) Observar la producción de ácido en los tubos de rojo de fenol por el vire del
indicador de rojo a amarillo.
(17)
79
V. Respiración.
a) Inocular los tubos de caldo de nitratos con los cultivos microbianos indicados.
b) Incubar a 37° C durante 24 horas.
c) Adicionar a los cultivos dos gotas de solución de ácido sulfanílico y dos gotas de
alfa naftil amina y observar la producción de un color rojo, lo cual indica una
prueba positiva para la reducción de nitratos a nitritos.
(18)
Tubo
1 2 3 4 5 6
Caldo nutritivo 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0
Suspensión de E. coli - 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
Sol. Azul de metileno 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Aceite mineral estéril 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Evaluación de la práctica:
80
Análisis y discusión de resultados:
Conclusiones y sugerencias:
81
Cuestionario:
Actividades de síntesis:
Referencias bibliográficas:
Imágenes:
82
Forma de evaluación
La evaluación del curso práctico será del 20 % y el curso teórico de 80 %, este será
promediado siempre y cuando ambas sean aprobatorias.
El 20 % de laboratorio comprende:
a) Exámenes parciales 10 %
b) Exámenes relámpagos 6%
c) Diario o bitácora de laboratorio 4%
83
Anexos:
84
Agar Papa Dextrosa con desarrollo de Penicillium roqueforti
85
Referencias Bibliográficas:
86
24. Marsik, F. J. and Denys, G. A. 1995. Sterilization, decontamination, and
disinfection. Procedures for the Microbiology Laboratory. In Manual of Clinical
Microbiology. 6th Ed. P. R. Murray editors. Washington, D. C. American Society for
Microbiology. Pp. 86 – 98.
25. Murray, R. K. Granner, D. K. y Rodwell, V. W. 2007. Harper. Bioquímica Ilustrada.
17ª ed. Ed. Manual Moderno.
26. Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. 1999. “Microbiología“. 4ª ed. Edit.
McGraw-Hill-Interamericana. España,. Pp. 729-733.
27. Rawlins, D. J. 1992. Light Microscopy, Philadelphia: Coronel Books.
28. Scherrer, R. 1984. Gram´s Staining reaction, Gram Types and Cell Walls of
bacteria. Trends Biochems Sci. 92: 242 – 245.
Imágenes:
87