Bognanni
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Tutor:
Prada, Federico, UADE
Co-Tutor:
Nafissi, Julieta, UADE
Colaborador/es:
Torcal, Tomás Agustín, UADE
Fernández, José, UADE
Julio, 2015
CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................... 4
RESUMEN ................................................................................................................................ 5
ABSTRACT .............................................................................................................................. 7
1. INTRODUCCCIÓN ............................................................................................................. 9
1.1 OBJETIVOS .............................................................................................................. 9
1.2 RELEVANCIA DEL PROYECTO.......................................................................... 9
1.3 ESTRUCTURA DE LA TESIS .............................................................................. 11
1.4 ADN POLIMERASA Y TAQ POLIMERASA ..................................................... 11
1.5 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ................................................ 12
2. INTRODUCCIÓN A LOS MATERIALES Y TÉCNICASUTILIZADOS ............... 16
2.1 HUÉSPED ..................................................................................................................... 16
2.2 EL PLÁSMIDO ....................................................................................................... 18
2.3 MEDIO DE CULTIVO ................................................................................................ 19
2.5 MINIPREP .................................................................................................................... 22
2.6 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA ............................................................ 22
3. ANTECEDENTES ............................................................................................................. 24
4. METODOLOGÍA .............................................................................................................. 26
4.1 LUGAR DE TRABAJO: LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR.............. 26
4.2 FINANCIAMIENTO ..................................................................................................... 28
4.3 DESARROLLO PROYECTO FINAL DE INGENIERIA ............................................ 28
4.3.1 ENSAYO DE TRANSFORMACIÓN BACTERIANA.............................................. 29
4.3.2 CRECIMIENTO BACTERIANO ............................................................................... 34
4.3.3 CULTIVOY OBTENCIÓN DE EXTRACTO ENZIMÁTICO .................................. 35
4.3.4 CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA .................................................... 39
4.3.5 ESCALADO ................................................................................................................ 46
4.3.6 ALMACENAMIENTO ............................................................................................... 53
5. APLICACIONES DEL PRODUCTO TERMINADO .................................................... 55
PFI “Marcador molecular” ......................................................................................... 55
PFI “Análisis del efecto de alimentos genéticamente modificados en el modelo de
Drosophila melanogaster” .................................................................................................. 56
6. DISCUSIÓN ........................................................................................................................ 59
6.1ANÁLISIS DE COSTOS BIOTAQ ................................................................................ 62
6.2 FODA ............................................................................................................................. 64
6.2.1 FORTALEZAS ........................................................................................................... 65
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6.2.2 DEBILIDADES........................................................................................................... 66
6.2.3 OPORTUNIDADES ................................................................................................... 66
6.2.4 AMENAZAS ............................................................................................................... 66
7.CONCLUSIÓN .................................................................................................................... 69
8. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 71
9 ANEXO ............................................................................................................................ 73
9. 1ANEXO I: Protocolo Miniprep Casera .......................................................................... 73
9. 2ANEXO II:Protocolo de Restricción .............................................................................. 75
9. 3ANEXO III: Protocolo de crecimiento ........................................................................... 76
9.4ANEXO IV: Protocolo de “Obtención de enzima Taq polimerasa por decantación en
frio” ...................................................................................................................................... 77
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AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a:
Marcela Bortheiry
Ing. José Ignacio Fernández
Técnico Tomas Torcal
Dra. Diana Acosta
Dra. María Verónica López
Lic. Julián Cardozo
Dr. Leandro Martínez Tosar
Fundación Instituto Leloir
Dr. Federico Prada
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RESUMEN
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ABSTRACT
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1. INTRODUCCCIÓN
1.1 OBJETIVOS
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La ADN polimerasa es una enzima que interviene en el proceso de replicación del ADN.
Durante la replicación, un ácido nucleico bicatenario se duplica para formar copias idénticas y
de este modo perpetuar la información genética.Se encarga de la síntesis en el sentido 5’3’
de nuevas cadenas de ADN que son complementarias de los polinucleotidos parentales. Dado
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que no puede iniciar la síntesis de ADN en una molécula totalmente monocatenaria, la enzima
es dependiente de una pequeña secuencia complementaria, llamada cebador, ubicada en el
extremo 3’ la cual le brinda a la enzima la región bicatenaria que necesita para la síntesis de
ADN.
Muchas ADN polimerasas dependiente del ADN molde tienen actividad exonucleasa
3’5’. Esta actividad le permite a la enzima eliminar nucleótidos del extremo 3’ de la cadena
recién sintetizada. Se la considera una actividad de corrección, cuya función es subsanar el
error de apareamiento de bases ocasional que podría ocurrir durante la síntesis de las
cadenas.La actividad exonucleasa 5’3’ es menos frecuente, pero está presente en algunas
polimerasas cuya función en la replicación exige que puedan eliminar por lo menos parte de
un polinucleótidos ya unido a la cadena molde que está copiando la polimerasa. Se conocen
diversas ADN polimerasas, como por ejemplo la ADN polimerasa I, cuya actividad
exonucleasa es 3’5’ y 5’3’. Tiene como función la reparación y replicación del ADN.
Otro ejemplo es el de la ADN polimerasa III, la principal polimerasa en la replicación de E.
coli con actividad exonucleasa 3’5’ (carece de actividad 5’3’).
A diferencia de las ADN polimerasas tradicionales, existe la ADN polimerasa taq
procedente de la especie Themus aquaticus, descubierta por Thomas D. Brock en el año 1967
(Brock, 1998). Esta enzima es muy utilizada por los laboratorios de biología molecular en la
técnica de reacción en cadena de la polimerasa. Su uso es fundamental en la técnica porque es
una enzima termoresistente, es decir, sobrevive a condiciones de altas temperaturas sin sufrir
la desnaturalización ni pérdida de actividad.La actividad polimerasa va acompañada de una
exonucleasa 5’3’ aunque carece de actividad exonucleasa 3’5’ por lo que no es capaz de
corregir los errores producidos durante la elongación.
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Desnaturalización. Etapa en la cual las hebras del ADN molde son separadas,
producto del aumento de la temperatura a 95°C. La separación de las hebras depende
de la ruptura de las uniones puente de hidrógeno entre las bases nitrogenadas. Si la
cadena tiene un alto porcentaje de nucleótidos G o C, el desapareamiento de bases será
más costosa e implicará más tiempo. En el caso de mayor cantidad A o T será menos
costoso y requerirá menor tiempo. Bajo efecto de la desnaturalización, se detienen
todas las reacciones enzimáticas, es decir la extensión del ciclo anterior.
Elongación. Por último actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para
sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial
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necesario para la síntesis del nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72°C,
temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su máximo de actividad,
aumentando exponencialmente la cantidad de fragmentos de ADN amplificados en la
reacción.
Por cada ciclo se duplica la cantidad de ADN sintetizada en el ciclo anterior. (A) Primer ciclo en el
que se ilustran la desnaturalización, Annealing y extensión. En este primer ciclo no se genera el
producto deseado.(B) Sucesión de ciclos demostrando la reacción en forma exponencial. Cada ciclo
duplica la cantidad de ADN sintetizada en el ciclo anterior y además los nuevos fragmentos generados
actúan, a su vez, de molde. Fuente: “Biología Molecular de la Célula” Alberts et al, 2010
Generalmente la reacción de PCR se lleva a cabo en un volumen de 25 ul, que contienen los
siguientes componentes,
Primers (o cebadores), pequeñas secuencias de oligonucleótidos complementarias a
los extremos de la región del ADN que se desea amplificar.
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La especifidad y la estabilidad del híbrido formado entre la hebra molde y los primers
es crucial para el resultado de la reacción de PCR.
La longitud de los oligonucleótidos debe estar entre 15 a 30 nucleótidos. Cuanto
mayor sea su tamaño, mayor es la probabilidad de que se asocien a secuencias no
perfectamente complementarias y conduzcan a la amplificación de productos nos
específicos. Cuanto más corto sea el cebador, más perfecta tiene que ser su
complementariedad con el molde, y más específica será la amplificación, aunque su
unión al molde es más débil y conduce a un rendimiento menor. Por ello, el tamaño
más adecuado de primers es de 20 o 24 nucleótidos. Se debe tener en cuenta, además,
no repetir más de tres o cuatro bases seguidas para evitar uniones incorrectas.
La composición de bases de los primers es importante por el efecto que pueda causar
sobre la estabilidad del híbrido cebador-ADN molde; lo ideal sería 50% de GC. En
caso de que el porcentaje sea menor, pues interesa que el tamaño del cebador sea
mayor para evitar una baja temperatura de fusión.
Templado (secuencia target), el ADN portador de la secuencia a amplificar puede
incorporarse a la reacción en forma monocatenaria o bicatenaria.
Gracias a la alta especifidad de la reacción de PCR, esta secuencia no ha de ser
previamente purificada; a partir de un extracto crudo se puede conseguir fácilmente su
amplificación.
ADN polimerasa taq, enzima que cataliza la síntesis de la nueva hebra de ADN a
partir del ADN molde. A los 72˚C logra su máxima actividad.
Buffer de reacción, aporta sales y mantiene el pH de la mezcla de reacción en un pH
8 a temperatura ambiente. A la temperatura de polimerización el pH cae a 7,2.
dNTPs, nucleótidos que la taq polimerasa iráincorporando alADN durante la síntesis.
MgCl2, cofactor para la taq polimerasa. Su concentración regula la actividad y
especificidad de la enzima. Un exceso de esta sal puede inhibir la reacción.
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2.1 HUÉSPED
Escherichia coli (E. coli) es probablemente el organismo mejor conocido por los
profesionales de las biociencias del mundo.Fue el primer hospedador utilizado en
experimentos de clonaje de ADN a principios de los años 70’s.Desde ese momento y hasta la
actualidad dicho organismo es utilizado como modelo de estudio de genética, genómica y
fisiología bacteriana. Desde hace fines de la década del 90 su genoma es conocido de manera
completa (Blattner et al, 1997).
Dicho organismo es una enterobacteria con forma de bacilo y se la caracteriza como
bacteria Gram-negativa, anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos, no formadora de
esporas y capaz de fermentar glucosa y lactosa. Posee un citoplasma envuelto por una
membrana plasmática y una membrana externa, entre las que se encuentra el espacio
periplásmico que contiene la pared celular de peptidoglicano. Su cromosoma es una molécula
circular de ADN doble cadena con 4,64 Mb de extensión. Muchas cepas de E. coli contienen,
además, varias copias de uno o varios plásmidos (moléculas circulares de ADN doble cadena
de replicación autónoma).
E. coli es un tipo de bacteria que naturalmente se encuentra en el intestino humano y
en general no es patogénico. En el ámbito de un laboratorio de investigación, las bacterias se
las puede hacer crecer sobre un medio de cultivo muy simple que contengan sales, elementos
traza y una fuente de carbono. El crecimiento bacteriano también se puede realizar en un
medio rico, como el medio LB, compuesto por vitaminas y aminoácidos.
El tiempo de duplicaciónde E. coli en condiciones óptimas (medio LB, a 37˚C, con
oxígeno) es alrededor de 20 minutos, teniendo un crecimiento en forma exponencial y cuya
curva de crecimientoestá compuesta por 4 fases, las cuales se identifican como fase latencia,
fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte(Figura 2).
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2.2 EL PLÁSMIDO
Los plásmidos, por definición, son moléculas de ADN doble cadena circular de
replicación autónoma, descriptos por primera vez en 1952 por Joshua Lederberg (Lederberg et
al, 1998). Una característica de su estructura moleculares la de poseer genes que le confieren
resistencia a múltiples antibióticos permitiendo, a los investigadores que las utilizan, la
eficiente selección de bacterias recombinantes en los protocolos de transformación.
En el caso de este proyecto final de ingeniería se ha utilizado para el análisis de la
actividad enzimática de la taq polimerasa el plásmido comercial pTriex-2 (Figura 3),
utilizado generalmente para la expresión de proteínas y cuyo tamaño es de 5457 pb.
Plásmido comercial para la expresión de proteínas, de tamaño 5457 pb. Se lo utilizó como ADN molde
para el análisis de la actividad enzimática de taq polimerasa en PCR. Fuente:
(https://www.addgene.org/)
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Molécula de uso común en investigación. Se usa como análogo no hidrolizable de la lactosa para
inducir la expresión génica.Fuente: http://www.sigmaaldrich.com
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(a) En ausencia del inductor, el represor se une a la región operadora inhibiendo el comienzo de la
transcripción. (b) En presencia de IPTG, el inductor se une a la proteína represora generándole un
cambio conformacional que evita la unión del complejo inductor-represor a la región operadora. Se
activa la transcripción. Fuente: Adaptado de “Recombinant DNA” Watson et al, 1992.
2.4 AMPICILINA
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2.5 MINIPREP
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3. ANTECEDENTES
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Por otro lado, el primer registro histórico de la PCR se ubica en el año 1985. De la
mano de Kary Mullis se inventaba la técnica “Reacción en cadena de la polimerasa” (PCR por
sus siglas en inglés)(Mullis, 1990).
Inicialmente la técnica era revolucionaria, sin embargo, tenía una grave limitación.
Dado que el método original de PCR usaba el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I
sintetizada por E. coli, por cada ciclo transcurrido en la reacción, era necesaria la adición de
una nueva alícuota de la enzima, pues el problema estaba en su desnaturalización a causa de
las altas temperaturas de la reacción. La técnica pudo superar este inconveniente cuando se
comenzó a utilizar la taq polimerasa descubierta por Brock.
Teniendo en cuenta los estudios relevantes del área, el presente proyecto final de
ingeniería tiene como objetivo producir y obtener la enzima taq polimerasa en un extracto
enzimático dentro de los UADE Labs en el marco de un laboratorio auto-sustentable
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4. METODOLOGÍA
(A) Permite observar las pizarras para una mejor organización y discusión de los temas a abordar.
(B)Toma lateral de la mesada de trabajo del laboratorio, donde se realizó el presente proyecto.
Fotografía tomada en los UADE Labs.
Nuestra tarea dentro del mismo fue el desarrollo completo del proyecto final de
ingeniería. Este laboratorio se encuentra equipado apropiadamente para facilitar el manejo y
experimentación con bacterias E. coli. Algunos de los equipos más importantes que se usaron
fueron el flujo laminar horizontal, que permite trabajar bajo condiciones de esterilidad
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(A) Cabina de flujo laminar horizontal. (B) Cuba electroforética. (C) Termocicladora. (D) Sala de
computadora y transiluminador de luz ultravioleta.Fotografías tomadas en los UADE Labs.
Este año se solicitó la incorporación de una nueva heladera para guardado exclusivo de
distintos proyectos finales de investigación, lo cual ha facilitado, en gran medida, la
organización y el orden de las cajas de reactivos de uso frecuente.
Para trabajar dentro de los laboratorios se debe cumplir con un régimen de normas de
seguridad para todo el personal y/o alumnos concurrentes al laboratorio. Entre las normas se
encuentrael uso de vestimenta adecuada, conocimiento de elementos de seguridad como
duchas químicas y lava ojos, matafuegos y mantas ignífugas.
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4.2 FINANCIAMIENTO
Figura 8: Esquema para la producción y obtención del extracto enzimático que contiene
a la enzima taq polimerasa.
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Una de las tareas más laboriosas dentro del PFI fue la puesta a punto del proceso de
enriquecimiento (Tabla 1). Cada una de las variantes realizada en el protocolo (temperatura
de la centrifugación, agregado de inhibidor de proteasas, tiempo de preparación de los buffers
de lisis alcalina) fue realizada para mejorar el rendimiento y calidad de la preparación final.
En total se realizaron 5 extractos durante el corriente año.
Obtención de extractos enzimáticos bajo distintas variaciones del protocolo de decantación en frío.
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Figura 9: FASE 1.
(A) incubadora con termostato para el crecimiento de microorganismos a 37˚C. (B) colonias de
bacterias crecidas en placas con medio agar LB-ampicilina luego del tiempo de incubación.
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Tanda de tubos preparados con crecimiento bacteriano tras 18 horas de incubación en horno a 37˚C.
Fotografía tomada en los UADE Labs.
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BamHI
Calle 0: Marcador 1Kb DNA Ladder (Invitrogen). Calle 1: DNA sin digerir. Calle 2: DNA digerido
con BamHI. Calle 3: DNA digerido con NcoI. Fotografía tomada en los UADE Labs.
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Con este resultado ver que, efectivamente, el tamaño del plásmido que contiene el gen
de taq polimerasa es de 6000 y 7000 pb aproximadamente (Calle 2). Además, se pudo
determinar que la restricción funcionó con la endonucleasa BamHI observándose la forma
linerizada del ADN (Calle 2), mientras que con la endonucleasa NcoI no se obtuvo
digestión(calle 3) observándose una banda de forma similar a la obtenida en la calle 1
(plásmido sin digerir). En estas calles se obtuvo el plásmido superenrrollado.
Por último, para asegurar un stock, las bacterias transformadas se almacenaron en 20%
de glicerol a -80 ˚C (Figura 15).
Ultra freezer donde se congelan las bacterias almacenadas en 20% de glicerol. Fotografía tomada en
UADE Labs.
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(A) Se observa el shaker con agitación (250 RPM) y temperatura constante (37˚ C) ubicado en el piso
9no piso de los UADE Labs. (B) Cultivo crecido luego de 18 horas de incubación. Fotografía tomada
en los UADE Labs.
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Siguiendo este procedimiento se obtendrá un extracto sin purificar (crudo) compuesto por
todas las enzimas de la bacteria incluida la taq polimerasa.
Para la lisis celular se usaron distintos buffers compuestos por diversos agentes
químicos, como por ejemplo lisozima, PMSF, un inhibidor de serina-proteasas que evitan la
degradación de la enzima taq polimerasa. Otro ejemplo es el NP-40, un detergente que rompe
todas las membranas de la célula, incluida la membrana nuclear. Cada uno de ellos fue
preparado en el momento de ser utilizados.
Los buffers preparados fueron identificados como Buffer A, Buffer A1 y Buffer B y
cuya función es, (Figura 19).
Reactivo Función
Solución buffer biológica común que se
utiliza en todo el proceso de extracción de
ADN, como así también utilizada durante la
Tris-Hcl (50 Mm PH 7.9)
lisis celular, la eliminación y la
precipitación de componentes celulares no
deseados para mantener el pH estable.
Dextrosa (50 mM) Es una forma de azúcar.
Agente quelante que puede crear complejos
EDTA (1 mM)
con un metal.
Agua destilada (1000 ml) Utilizada para llevar a volumen final.
Buffer A1: Solución con lisozima. Es la solución isotónica para resuspender las
bacterias y por ende proporcionarles un medio isotónico. Esto es posible porque
mantiene la osmolaridad y pH estables. También es la solución con la cual se daña la
pared celular.
Reactivo Función
Solución buffer biológica común que se
Tris-Hcl (50 Mm PH 7.9) utiliza en todo el proceso de extracción de
ADN, como así también utilizada durante la
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Buffer B: solución que contiene droga PMFS, un inhibidor de proteasas, siendo éstas
últimas, enzimas capaces de hidrolizar proteínas en medios con pH mayor a 7. Con la
presencia de la droga se buscó conservar así la proteína en cuestión.
Reactivo Función
Buffer que aporta capacidad tamponante
Tris-HCl (10 Mm PH 7.9) efectiva en un intervalo de pH entre 7,0 y
9,2.
Agente quelante que puede crear complejos
EDTA (1 mM)
con un metal.
KCl (50 mM) Sal.
Es un inhibidor de proteasas de serina usado
comúnmente en la preparación de lisados
celulares, en los que preserva a
las proteínas celulares de su digestión por
PMSF (1 mM)
proteasas. Se descompone rápidamente en
agua de modo que es preparado en
disoluciones
de alcohol anhidro, isopropanol, o DMSO.
Tensoactivo, también llamados surfactante,
sustancia que influye por medio de la
Tween-20 (0.5 %)
tensión superficial en la superficie de
contacto entre dos fases
NP-40 (0.5%) Detergente.
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De izquierda a derecha se observan los buffers B, Buffer A y Buffer A1, con volúmenes de 30 ml, 100
ml y 30 ml respectivamente. Fotografía tomada en los UADE Labs.
Para comenzar el tratamiento de lisis, se decidió dividir los 50 ml de cultivo líquido
crecido en dos tubos Falcon de 50 ml para trabajar con mayor comodidad. A cada tubo se los
centrifugó a 2200 RPM durante 30 minutos a 10˚C, obteniéndose un botón de células (Figura
20).
(A) se observa la centrífuga refrigerada de UADE Labs. (B)Pellet con bacterias luego de la
centrifugación.
Fotografía tomada en UADE Labs.
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Tras la mezcla de la suspensión celular con los buffers de lisis, se verá la formación de una
Fotografía tomada en UADE Labs.
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Para ello, se utilizó como ADN molde el plásmido comercial pTriex-2 y primers que
amplifican 1000 pb diseñados en los UADE Labs (cortesía del PFI “Marcador molecular” de
Tomás Agustín Torcal).
Reactivo Volumen
Muestra pTriex-2 (dil 1/1000)250 ng/ul 1 ul
Buffer de taq (Invitrogen) 10 X (p/ un
2.5 ul
volumen final de 25 ul)
MgCl2 (std) 50 mM 1.5ul
dNTPs 10 mM 0.5
Primer R 10uM 1ul
Primer F 10 uM 1ul
Taq polimerasa Life (Invitrogen) – en caso
0.2 ul
de control positivo
Taq Polimerasa enriquecida 0.2 ul
Agua 17.8
Volumen final 25 ul
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Temperatura Tiempo
95˚C 30 segundos
60˚C 45 segundos
62˚C 1 minuto
72˚C 10 minutos
4˚C 10 minutos
Número de ciclos 35
Figura 23: Ensayo de la actividad enzimática del primer extracto enzimático (mes enero).
Calle M: Marcador 1Kb DNA Ladder Invitrogen. Calle 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7: amplificación por acción de
taq polimerasa en el ADN molde pTriex-2. Calle C-: control negativo. Calle C+: control positivo con
taq polimerasa Life. Volumen de siembra: 6 ul, compuesto por 5 ul de mezcla de reacción y 1 ul de
buffer carga 6X. Volumen de enzima: 0,2 ul. Fotografía tomada en UADE Labs.
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Figura 24: Ensayo de la actividad enzimática del primer extracto enzimático (mes enero) y
segundo extracto enzimático (mes febrero).
Calle M: Marcador Low mass DNA Ladder Invitrogen. Calle C-: control negativo. Calle C+: control
positivo con taq polimerasa Life. Calle 1 y 2: actividad enzimática perteneciente a extracto enzimático
del mes de enero. Calle 3, 4 y 5: actividad enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del
mes de febrero. Fotografía tomada en UADE Labs.
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Figura 25: Ensayo de la actividad enzimática de los extractos enzimáticos de los meses enero,
febrero y abril.
Calle M: Marcador 1Kb DNA Ladder Invitrogen. Calle 1 y 2: actividad enzimática perteneciente a
extracto enzimático del mes de enero. Calle 3 y 4: actividad enzimática de taq polimerasa proveniente
del extracto del mes de febrero. Calle 5 y 6: Extracto mes abril.
Calle C-: control negativo. Calle C+: control positivo con taq polimerasa Life. Fotografía tomada en
UADE Labs.
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Figura 26: Ensayo de la actividad enzimática de los extractos enzimáticos de los meses enero,
febrero, abril y junio.
Calle M: Marcador 1Kb DNA Ladder Invitrogen. Calle 1: siembra del extracto tratado en ausencia de
PMSF. Calle 2 y 3: actividad enzimática perteneciente a extracto enzimático del mes de enero. Calle 4
y 5: actividad enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del mes de febrero. Calle 6:
Extracto mes abril. Calle 7: control negativo. Calle 8: control positivo con enzima taq polimerasa Life.
A partir de estos últimos ensayos se concluye que los extractos de los meses de enero,
febrero y abril, la actividad enzimática sigue siendo funcional (Figura 25, calles 1 a 6)
habiendo almacenado la preparación a 4 C. Asimismo se confirmó que la presencia de
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4.3.5 ESCALADO
La FASE 5 del proyecto final de ingeniería (Figura 27) fue el escalado o scaling-up
del bioproceso (Figura 28). En dicha fase se hace uso de un biorreactor en condiciones físico-
químicas controladas, para la producción óptima de la proteína recombinante y a gran escala.
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Se ilustra desde la estrategia de clonación y la transformación de las células hasta el almacenado del
producto final. Los pasos 1 al 11 están relacionados con la manipulación genética del hospedador. Los
pasos 12 a 14 tratan del escalado propiamente dicho, partiéndose de un cultivo pequeño hasta lograr
un crecimiento a escala piloto. Los últimos pasos (15 a 17) se basan en los procesos de purificación
del producto y su almacenamiento.
Fuente: Adaptado de “Bioprocess Engineering Principle”.
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Figura 29: Biorreactor con tanque agitado mecánicamente de UADE Labs ubicado en el
Laboratorio de Biotecnología y Microbiología.
Tanque de vidrio donde se cultivan las bacterias. (B) Soporte del reactor con camisa de transferencia
de calor. (C) Hélice de cuatro paletas con motor. (D) Medidor de agitación. (E) Sistema de
calefacción. (F) Regulador de calefacción.
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requeridos en cada etapa. A su vez, se midió el pH y la densidad óptica tanto al inicio como al
final del proceso.
Para comenzar el proceso se realizó un crecimiento bacteriano en placas de cultivo
agar LB-ampicilina, con el fin de obtener una colonia para la posterior propagación del
inóculo en medio líquido. La placa se incubó a 37˚C durante 18 horas.
Luego del crecimiento ON (overnight) se inocularon 200 ml de medio de cultivo LB-
ampicilina. Este medio se convirtió en el starter o punto de partida para el proceso de scaling-
up. Dado que el escalado se realiza en forma gradual, es decir, se parte de un volumen
pequeño de medio de cultivo y se lo escala hacia un volumen mayor (en este caso 1 litro), se
realizó una serie de pasajes de expansión, lo que significa que se tomaron del cultivo starter
alícuotas de cultivo crecido para inocular a cada uno de los medios de cultivo tal como se
ilustra en la Figura 30, incubándolos durante 18 horas en shaker a 37˚ C y midiendo tanto el
pH como la densidad óptica de la solución a 550 nm, siendo ésta la longitud de onda útil para
poder medir la turbidez, pues cuanto menor sea la dispersión de luz, mayor será la longitud de
onda(Tabla 4).
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agregado de un
tapón y parafina
Crecimiento con
limitación de
Biorreactor 1 litro
6 oxígeno y 0,085 7 5,82
LB-ampicilina
agitación
constante.
Mediciones de DO y pH.
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(A) Medio de cultivo starter (200 ml). (B) Medio de cultivo LB-ampicilina (120 ml) inoculado con 12
ml del cultivo starter. (C) Medio de cultivo LB-ampicilina (400 ml) inoculado con 40 ml del cultivo
starter. (D) Medio de cultivo LB-ampicilina (2 ml) inoculado con 200 ul del cultivo starter. (E) Medio
de cultivo LB-ampicilina (7 ml) inoculado con 700 ul del cultivo starter.
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anaerobiosis. En el caso del biorreactor, el crecimiento celular se asemeja al del medio 4 pero
este resultado no fue suficiente para determinar si el escalado fue exitoso para el fin de este
proyecto, es decir, obtener un extracto enzimático que contenga la enzima taq polimerasa
funcional. Para ello, se necesitó confirmar la actividad enzimática mediante una PCR (Figura
31), previamente llevando a cabo una lisis celular con su posterior decantación en frío.
Calle M: Marcador 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen). Calle 1: Control positivo (Invitrogen). Calle 2:
Control negativo. Calle 3: actividad enzimática de taq polimerasa perteneciente al extracto del
biorreactor (mes julio). Calle 4: actividad enzimática perteneciente a extracto enzimático del mes
enero. Calle 5: actividad enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del mes de febrero.
Calle 6: actividad enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del mes abril.
Fotografía tomada en los UADE Labs
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estos resultados muestran que la actividad enzimática proveniente del extracto es funcional. A
partir del escalado de 1 litro, se consiguió un volumen final de extracto enzimático de 56 ml,
los cuales se alicuotaron en tubos Eppendorf, cada uno con 1 ml de crudo.
En el caso de los extractos obtenidos a partir de los cultivos con ausencia de oxígeno o
con poca agitación, no se tuvieron resultados positivos, es decir, no hubo amplificación por
parte de taq polimerasa (Datos no mostrados).
Adicionalmente, y como punto final de la parte experimental del trabajo se volvió a
confirmar que la actividad de las taq polimerasas enriquecidas de los meses enero, febrero y
abril siguen siendo activas.
4.3.6 ALMACENAMIENTO
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Calle M: Marcador 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen). Calle 1: control negativo. Calle 2: control positivo
(Taq polimerasa Invitrogen). Calle 3: actividad enzimática perteneciente a extracto enzimático del mes
enero. Calle 4: actividad enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del mes de febrero.
Calle 5: actividad enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del mes abril. Calle 6:
actividad enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del mes junio. Calle 7: actividad
enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del mes julio. Calle 8: actividad enzimática de
taq polimerasa proveniente del extracto del biorreactor almacenada a 4˚ C. Calle 9: actividad
enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del biorreactor almacenada en glicerol 50% a -
20˚ C en la semana uno. Calle 10: actividad enzimática de taq polimerasa proveniente del extracto del
biorreactor almacenada en glicerol 50% a -20˚C en la semana dos.
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En primer lugar se presenta el resultado de PCR del PFI “Marcador molecular” en vías de
desarrollo por el alumno Tomás Agustín Torcal. En esta PCR se evaluaron diferentes
contraciones de MgCl2 para analizar como afectaba a la taq polimerasa en la etapa de
elongación del ADN (Figura 34).
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Con este ensayo se confirma que la taq polimerasa BIOtaq fue funcional para la generación
de amplicanos desde 50 pb hasta 2000 pb.
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transgénicos). Las muestras evaluadas fueron soja RG (soja resistente a glifosato) y soja
ORG (soja orgánica), hipotéticamente libre de OGM. El control positivo utilizado fue una
muestra de soja con el transgen CAMV confirmado anteriormente (Figura 35)
Figura 35: Aplicación de la enzima taq polimerasa BIOtaq en el PFI “Análisis del efecto de
alimentos genéticamente modificados en el modelo de Drosophila melanogaster”.
Calle 1: Marcador 1Kb DNA Ladder (Invitrogen). Calle 2: Soja RG (volumen ADN 10 ul). Calle 3:
Soja RG (volumen 20 ul). Calle 4: Soja ORG (volumen ADN 15 ul). Calle 5: Soja ORG (volumen
ADN 30 ul). Calle 6: control negativo. Calle 7: control positivo. Calle 8: control positivo con enzima
taq polimerasa BIOtaq, 2 ul.
Fuente: PFI “Análisis del efecto de alimentos genéticamente modificados en el modelo de Drosophila
melanogaster”.
Con este ensayo se puede confirmar que la taq polimerasa BIOtaq fue funcional para
la amplificación del transgen que contiene la soja cuya generación de amplicón se evidencia
en la calle 7.
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En base a los resultados que se obtuvieron en ambos PFI, se puede afirmar que la taq
polimerasa BIOtaq tiene la capacidad de amplificar ADN de distintos tipos de organismos en
forma exitosa.
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6. DISCUSIÓN
Se considera que las condiciones más relevantes para obtener la enzima son,
Crecimiento bacteriano en medio de cultivo liquido LB-ampicilina por 18 horas.
Inducción con IPTG.
Centrifugación refrigerada en 10˚ C y 4˚ C.
Centrifugación a temperatura ambiente.
Preparación de buffers de lisis alcalina preparados en el momento a ser utilizados.
PMSF 0,1 gr estrictamente.
Dado que la ADN polimerasa taq de Thermus aquaticus (cepa YT-1) es la enzima
adecuada y vital para la amplificación in-vitro de fragmentos de ADN mediante la PCR y
además su demanda ha ido creciendo en las aplicaciones de la biología molecular, durante
años y hasta la fecha se han investigado estrategias para obtener la enzima a partir de E. coli
con alto rendimiento en la actividad enzimática.
Pérez et al publicó la metodología de obtención de ADN polimerasa de Thermus
aquaticus en un laboratorio de mediana complejidad, sobre el cual se ha basado el desarrollo
de esta tesis.
Crecimiento de bacterias
Originalmente, en la publicación, se describe el uso del caldo nutritivo Muller Hinton.
En el caso de este proyecto, se trabajó con el medio de cultivo LB, pues se trata de un
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obtuvo un extracto enzimático con taq polimerasa funcional, que fue evaluada únicamente
con la PCR clásica con la que cuenta los UADE Labs.
Escalado
Una de las diferencias que se han encontrado entre el trabajo original y esta tesis fue el
proceso de escalado, con el cual se buscó aumentar la cantidad de bacterias E. coli para armar
un stock de bacterias y por lo tanto un stock de extracto enzimático. Habiendo partido de un
volumen de 200 ml (cultivo starter) se escaló hacia uno de 1 litro, del cual se obtuvo un crudo
de 56 ml. Dentro de este extracto se pudo confirmar la presencia de la enzima taq polimerasa
funcional. A diferencia de esta tesis, en la publicación de Pérez et al se partió de un volumen
de 200 ml, (sin realizar ningún escalado), obteniéndose finalmente un extracto crudo de
aproximadamente 15 ml.
Almacenado
Otra gran diferencia fue la estrategia de almacenamiento. Mientras que en el trabajo de Pérez
et al se almacenó el extracto enzimático en heladera a 4˚ C por un tiempo de seis meses, en el
caso de BIOtaq, la enzima fue almacenada tanto en heladera a 4˚C como en glicerol 50% a -
20˚ C. Se puede confirmar que la enzima continúa activa a más de ocho meses de su
obtención
A la hora de discutir los resultados de este trabajo, resulta importante retomar los
resultados de otros trabajos publicados sobre el tema de estudio.
En el año 2008, Roayaei y colaborador obtuvieron un extracto enzimático proveniente
de bacterias E. coli mediante una lisis celular a la cual le realizaron una semi-purificación por
choque térmico. Se realizaron dos ensayos de PCR, uno de ellos usando el extracto
enzimático crudo y el otro mezclando la enzima con sulfato de amonio y BSA. En el caso del
extracto crudo el resultado indicó que usando 2 ul de enzima purificada se tuvo un
rendimiento idéntico al contrastarlo contra 0,5 ul de enzima comercial. Por otro lado, al
comparar el rendimiento de la enzima tratada con el sulfato de amonio y BSA con la enzima
comercial, solo se necesitaron de 0,5 ul de cada una (Roayei y Galehdari, 2008).En el caso de
BIOtaq, se trató el extracto enzimático con un choque térmico previo a su guardado en
heladera a 4˚ C. Al comparar nuestra enzima contra la comercial (Invitrogen) se pudo
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Costos fijos: incluye a todos aquellos materiales cuya cantidad a utilizar no depende
de la cantidad de enzima a obtener porque independientemente de la cantidad de
crecimiento bacteriano que se genere, la lisis celular que se lleve a cabo para obtener
el extracto enzimático que contiene a taq polimerasa siempre se realizará sobre un
mismo volumen de trabajo (en este caso, 50 ml en tubos falcon).
El costo variable por cada 100 ul (unidad de costeo) se determinó sobre la experiencia de
laboratorio de esta tesis, de acuerdo con el cual, a partir de 1 litro de cultivo, se obtuvieron 56
ml de extracto enzimático, con el objetivo de la comparación con el precio de venta. A su vez,
con 56 ml del crudo que contiene a BIOtaq, se estimó que la cantidad de ensayos es de
280.000 pruebas (Tabla 7). Para ello, se supuso que por cada tubo de reacción en PCR, se
utilizan 0,2 ul de enzima.
6.2 FODA
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INBIO HIGHWAY
GenBiotech
Life - Invitrogen
NEB - BioLabs
6.2.1 FORTALEZAS
Las fortalezas son todos aquellos aspectos internos y positivos del proyecto que permiten la
diferenciación de otros de igual clase.
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6.2.2 DEBILIDADES
Las debilidades son todos aquellos recursos, como energía, habilidades con los que la
Universidad cuenta y que son barreras para la continuidad del proyecto.
6.2.3 OPORTUNIDADES
Las oportunidades son aspectos positivos del entorno que pueden ser identificados y
aprovechados.
6.2.4 AMENAZAS
Las amenazas son situaciones externas de carácter negativo que puede atentar contra el
proyecto. En este caso, sería necesario el diseño de una nueva estrategia
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Nuevos proveedores en CABA con facilidad para importar el producto y volverse una
competencia fuerte.
Por último, se analizó la demanda anual de la enzima taq polimerasa de Life (Invitrogen)
por parte del laboratorio de biología molecular de UADE Labs.
Cada vial del producto comercial tiene 100 µl de ADN taq polimerasa, los cuales contienen 5
U/µl, lo que significa que el producto tiene 500 unidades totales.
Según datos proporcionados por el sector de compras de UADE Labs, por año se
compran aproximadamente 7 viales del producto. El costo de cada una de ellos al año 2015 es
de $884,50 invirtiéndose anualmente en el reactivo $6.191,50.
Adicionalmente, se confirmó por parte del departamento de compras que el consumo
de la enzima crece de manera exponencial a causa de las prácticas de laboratorio para las
diversas materias que utilizan la técnica de PCR, para prácticas libres de laboratorio como así
también para los Proyectos Finales de Ingeniería. Teniendo en cuenta esta información se
podría considerar que con el autoabastecimiento, UADE Labs se independizaría de la
demanda del reactivo a proveedores donde la producción propia implica un ahorro del
99,41% con respecto al costo de adquisición y, de acuerdo con la experiencia descripta, el
ahorro en valores absolutos asciende a $492.390,08 (Tabla 5 y Tabla 6). Estos datos fueron
calculados sobre la base de adquisición anual de 7 viales de la enzima comercial de 100 ul
cada uno. No se puede determinar el nivel de consumo, pues se tiene conocimiento de que el
uso de la enzima crece en forma exponencial debido a los trabajos prácticos de las materias de
la Licenciatura en Biotecnología, las prácticas libres de laboratorio y proyectos finales de
ingeniería.
Si bien las publicaciones analizadas y nuestro trabajo arriban a resultados similares, es
decir, la actividad de la enzima taq polimerasa es funcional tras su producción y obtención,
consideramos que para las necesidades del laboratorio de biología molecular, la metodología
utilizada en este trabajo es suficiente para la obtención de una enzima de buen rendimiento y
larga duración en su vida media (mayor a los seis meses). Consideramos además que se trata
de una metodología de trabajo relativamente rápida para los tiempos de demanda que cada
materia y proyecto requiere, permitiendo un stock permanente del reactivo en el laboratorio.
Cabe destacar que al comienzo del proyecto se propuso la purificación total de la
enzima taq polimerasa y dado que no se conoce información sobre el plásmido de expresión
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7. CONCLUSIÓN
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Por último, es posible concluir que el autoabastecimiento de ADN taq polimerasa es una
realidad dentro de los UADE Labs. Este logro, sin duda permitirá la independencia comercial
en relación a este importante reactivo de biología molecular dando un gran paso a nivel
institucional en la ruta hacia un pronto y prometedor laboratorio autosustentable dentro de
nuestra Universidad.
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8. BIBLIOGRAFÍA
ALBERTS, JHONSON et al. 2002. Molecular Biology of the Cell. Cuarta edición.
Garlands Science. 2002.
BOUZARI, SAEID et al. 1998. Cloning and Expression of Thermus Aquaticus DNA
Polymerase, Using a Thermo-Inducible Expression Vector. Iranian biomedical
journal 2 (2): 79-82. (Abril 1998).
BROCK, THOMAS D. 1997. The Value of Basic Reseach: Discovery of Thermus
Aquaticus and Other Extreme Thermophiles. Genetics society of Americas, 1997.
CHEIN, ALICE et al. 1976. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from the Extreme
Thermophile Thermus Aquaticus. Journal of Bacterology. Vol. 127, N˚ 3 (1976), p:
1550-1557.
GUTIERREZ, JORGE GUILLERMO GOMEZ et al. 2002. Producción y Purificacion
de la Taq DNA Polimerasa a Partir de E. coli Recombinante. Ciencia UANL,
Septiembre 2002. Volumen V. N˚ 003. P: 316-321.
LAWYERT, FRANCES et al. 1989. Isolation, Characterization, and Expression in
Escherichia Coli of the DNA Polymerase Gene from Thermus Aquaticus. The journal
of biological chemistry, vol. 264. N˚ 11. April 1989, p: 6427-6437.
LEHNINGER, ALBERT et al. 2009. Principios de Bioquímica. Quinta Edición.
Omega. 2009.
LEWIN. 2003. Genes VIII. Oxford University Press. 2003.
LODISH, BERK et al. 2005. BiologíaCelular y Molecular.Quinta Edición. Editorial
Panamericana. 2005
MULLIS, KARY B. 1990. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.
Scientific american. April 1990. P:56-65.
PERERA, J et al. 2003. IngenieríaGenética. Volumen I. Preparación, análisis,
manipulación y clonaje de DNA. Tomo A. Editorial Síntesis, 2003
PEREZ, FERNANDO et al. 2006. Obtención de ADN Polimerasa de Thermus
Aquaticus en unLaboratorio de MedianaComplejidad.
Activabioquímicaclínicalatinoamericana, Vol: 40, N˚4, Diciembre 2006 p:1-5.
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9 ANEXO
Solución de lisozima
50 mM glucosa
25 mM Tris-Hcl (pH 8.0) a partir de solución stock 1 M
10 mM EDTA (pH 8.0) a partir de solución stock 0.5 M
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DNA 2ul
Buffer 10X 1ul
ER 0,5 2 horas a 37°C
Agua 6,5ul
Vf: 10 ul
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Para aumentar las condiciones de esterilidad, la toma de biomasa puede realizarse bajo el
flujo horizontal con un ansa al lado.
Nota: Para trabajar bajo condiciones de esterilidad se realiza el proceso bajo flujo laminar
horizontal con un mechero bunsen prendido al lado.
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9.4 ANEXO IV: Protocolo de “Obtención de enzima Taq polimerasa por decantación en
frio”
Día 1:
Sembrar en una placa LB-ampi una muestra de bacterias E. coli transformada con
ansa, en flujo laminar horizontal.
Dejar crecer en horno a 37 ° C durante 18 horas.
Día 2:
Picar con ansa una colonia de la placa de cultivo LB-ampi. Colocarla en 50 ml medio
de cultivo líquido LB. Agregar al medio 50 ul de ampicilina y 0,02 ul (0,0005 M) de
la droga IPTG.
Colocar en horno shaker a 37 ° C por 18 horas.
Transcurrido el tiempo, se deberá observar un medio denso y turbio propio de la
presencia del crecimiento bacteriano.
Día 3:
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C durante una semana para que sedimenten los detritos celulares. Se obtiene un
sobrenadante limpio de aproximadamente 4 ml con el extracto crudo.
Nota: no guardar en el freezer.
Día 7:
Análisis de actividad enzimática por PCR clásica, utilizando 0,2 ul de extracto crudo
para un volumen final de 25 ul.
p-Triex2 1 ul
Buffer 10 X 2,5 ul
MgCl250 mM 1,5 ul
dNTPs 10 mM 0,5 ul
Primer F 10 uM 1 ul
Primer R 10 uM 1 ul
Agua 17,3 ul
Volumen FInal 25 ul
Temperatura Tiempo
95˚ C 30 segundos
60˚ C 45 segundos
62˚ C 1 minuto
72˚ C 10 minutos
4˚ C 10 minutos
Número de ciclos 35
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