Laboratorio de Microbiología

Práctica 1 Microscopía
Introducción
Esta práctica resalta la importancia de conocer las partes del microscopio y el uso
adecuado, así como su cuidado y mantenimiento, debido a que estos instrumentos
son herramientas fundamentales en un laboratorio, pues nos permiten observar
una gran cantidad de muestras y con ello realizar un estudio detallado de
ejemplares imperceptibles para el ojo humano. 
Resultados y observaciones

Figura 1 E. coli sin teñir. Una bacteria Gram negativa, 100X

La muestra de la figura 1 es una bacteria Gram negativa sin tinción, vista con el
objetivo 100X del microscopio, por ello se adicionó aceite de inmersión que
provoca un aumento en la calidad de la imagen, pues reduce la refracción de la
luz, sin embargo, la manipulación incorrecta del condensador ocasiona poca
calidad en la visualización de la muestra.
Como se observa cada imagen tiene tres grados de luz distintos, la primera
imagen ubicada a la izquierda contiene poca luz lo cual provoca que el fondo se
vea gris y con ello no logra una buena definición de la fotografía. La imagen de la
muestra que se encuentra en el centro es una fotografía buena, que define el
contorno de las bacterias y la luz promueve un excelente contraste. Finalmente, la
imagen ubicada a la derecha contiene demasiada luz, dando como resultado una
fotografía con nula apreciación de E. Coli.
Figura 2 E. coli tinción sólo con cristal violeta, vista a 100X.

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La muestra de la figura 2 es una bacteria Gram negativa vista con el objetivo
100X del microscopio, ahora con tinción de cristal violeta, por ello la coloración de
la muestra es morado-azul. Se utilizó esta tinción simple para describir y definir la
estructura morfológica de la bacteria.
Nuevamente se puede observar como el empleo incorrecto del condensador
puede producir una calidad muy baja en las fotografías de las muestras y con ello
omitir partes importantes de la misma. Únicamente se observa de forma correcta
la muestra de la fotografía ubicada en el lado derecho, ya que se aprecian dos
bacilos, uno Gram positivo y uno Gram negativo que se pueden ver con la correcta
luz que logre contrastar la imagen.

Figura 3 E. coli tinción sólo con tinción Gram vista a 100X

La muestra de la figura 3 es una bacteria Gram negativa vista con el objetivo 100X
del microscopio, con tinción Gram para un solo microorganismo. Esta tinción
permite identificar si son positivas o negativas, mostrando una muestra con color
morado o bien rosado-rojo.
En la primera fotografía de la izquierda, se observan homogéneas en cuanto a
color, cuando se oscurece la muestra con ayuda del condensador, puede no solo
haber un único color en la imagen lo cual produce incertidumbre del tipo de
muestra que se tiene, por los colores distintos que se aprecian. Finalmente, con la
iluminación adecuada se ve claramente que toda la muestra está conformada por
bacterias las Gram negativas, reafirma la presencia de E. coli.

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Figura 4 Muestras de agua de laguna, vista a 40X

Se observa en la figura 4 una muestra de agua de laguna con el objetivo 40X, con
este se observa una imagen detallada de un alga multiflagelada, y la presencia de
tardígrados u osos de agua por su apariencia y movimiento especial. Esta
fotografía muestra principalmente que la calidad del agua está en función a los
microorganismos, que indican sin duda contaminación.

Figura 5 Muestras de agua de laguna, vista a 40X

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Se observa en la figura 5 una muestra de agua de charco (imagen de la
izquierda), con el objetivo 40X, la imagen es detallada y se aprecian algas
flageladas y una gran cantidad paramecios, organismos eucariontes unicelulares
ciliadas. En el frotis se encuentran en movimiento constante, sin embargo, la
fotografía tiene una buena calidad de imagen, ya que se usa el contraste de la luz
correctamente. La fotografía ubicada a la derecha es un alga filamentosa, esta
muestra contiene un contraste de fase adecuado, lo cual permite observar
detalladamente la pared celular y los cloroplastos, incluso el colapso de una célula
ubicada justo en el centro.
En la figura 6 se observan tres fotografías. La primera ubicada hacía la derecha,
es una muestra de S. Cerevisiae teñida con azul de algodón, con el objetivo a
40X, esta muestra la importancia de una correcta fotografía, pues no está
enfocada adecuadamente y se puede observar la sombra del celular. Sin
embargo, se considera un muy buen frotis, por la distribución de la muestra y la
tinción única de la levadura.
La imagen del centro es una muestra de levaduras presentes en un cultivo de
referencia, con tinción de azul de algodón, para observar la estructura definida, se
percibe que varias células se encuentran en división celular.
La fotografía de la izquierda es una muestra de Aspergillus nidulans teñida de
igual forma con azul de algodón, este es un hongo, se aprecia perfectamente las
estructuras principales esperadas en un frotis de este tipo, esporas, el micelio
(filamentos) y espumas.

Figura 6 Tinción de hongos por azul de algodón.

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Figura 7 Muestra de K. pneumoniaeteñida en fresco con tinta china, vista a 100X

En la figura 7 se observan tres fotografías de muestras de tinción negativa con

tinta China, de K. Pneumoniae. Este ejemplar muestra claramente la importancia
de generar un buen frotis, así como cuidar la iluminación.
Esta bacteria produce un exopolisacarido, así que para observar detalladamente
se genera un medio de contraste para observar correctamente el bacilo y la
cápsula como es el caso de la imagen ubicada a la izquierda. Los detalles que se
deben cuidar es la cantidad de muestra, ya que si se genera un frotis saturado de
muestra no se logrará apreciar y distinguir las estructuras, de igual forma la poca
iluminación provoca más trabajo para la ubicación concreta del microorganismo.
Cuestionario
1) Reportar mediante esquemas o fotografías las preparaciones observadas con
los diferentes objetivos.
No se tuvo la oportunidad de observar muestras, sin embargo, se han discutido
varias muestras propuestas por el profesor (resultados y observaciones).

2) Explique el funcionamiento de las partes de un microscopio de campo brillante

o campo claro.

Sistema óptico
Oculares. Este es el elemento óptico que proporciona la segunda etapa de
ampliación de la imagen. Está formado por un cilindro que se une
perfectamente con el tubo, permitiendo así que lleguen los rayos de luz junto a
la imagen ampliada del objetivo.
Este consta de una lente superior llamado lente ocular y una lente inferior
llamada lente colector. Poseen lentes convergentes que amplían la imagen
virtual creada por el objetivo. También posee un diafragma y dependiendo

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de donde se ubique tendrá un nombre. El que se ubican entre ambas lentes se
denomina ocular de Huygens, y si se ubica después de las dos lentes se llama
ocular de Ramsden. En general, el aumento aportado por el ocular es inferior al
del objetivo. El aumento de este oscila entre 5X, 10X, 15X o 20X, dependiendo
del microscopio.
A través de los oculares el operador observará la imagen. Algunos modelos
traen un anillo en el ocular izquierdo que es movible y permite el ajuste de la
imagen denominado anillo de Dioptrías. En función del número de oculares se
puede distinguir entre microscopios monoculares, binoculares e incluso
trinoculares. La combinación de objetivo y ocular determina el aumento total
del microscopio.

Objetivos. Conjunto de lentes que se encuentran más cerca de la muestra y

son los encargados de aumentar la imagen real que proviene de la muestra. La
imagen es transmitida hacia el ocular ampliada e invertida. Generalmente un
microscopio contiene de 3 a 4 objetivos. Nombrados de menor a mayor
aumento son: lupa, 10X, 40X y 100X. Este último se le conoce como objetivo
de inmersión debido a que necesita unas gotas de aceite (entre 1 y 2) para
poder ser utilizado, mientras que al resto se les conoce como objetivos secos.
Al girar el revólver (pieza mecánica) se puede pasar de un objetivo a otro,
comenzando siempre por el de menor aumento. El aumento del objetivo junto
con su apertura numérica suele estar escrito en su parte lateral.

Prisma óptico. Algunos microscopios incluyen prismas en su interior para

corregir la dirección de la luz. Esto es imprescindible en el caso de los
microscopios binoculares, donde un prisma divide el haz de luz proveniente del
objetivo para dirigirlo hacia dos oculares distintos.

Sistema de iluminación
Lámpara, foco o fuente de luz. Esta fuente de iluminación que es utilizada
para los microscopios ópticos es halógena y generalmente son de 12 V,
aunque existen más potentes. Está se encuentra ubicada en la parte inferior
del microscopio, emitiendo la luz de abajo hacia arriba dirigido hacia la
muestra.
En algunos casos el haz de luz es primero dirigido hacia un espejo que a su
vez lo desvía hacia la muestra. La posición del foco en el microscopio depende
de si se trata de un microscopio de luz transmitida o de luz reflejada.

Condensador. Elemento que consta de una lente convergente, encargado de

concentrar los rayos de luz provenientes del foco a la muestra. Su ubicación
varía de acuerdo con el modelo del microscopio. En general, los rayos de

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luz provenientes del foco son divergentes. El condensador consiste en un
seguido de lentes que cambian la dirección de estos rayos de modo que pasen
a ser paralelos o incluso convergentes
Este se puede regular mediante un tornillo y dependiendo de la cantidad de luz
que se requiere concentrar, se puede subir o bajar.

Diafragma. Se ubica por encima de la fuente de iluminación y por debajo del

condensador. Actúa como un regulador del paso de luz. Si se requiere de
mucha iluminación se abre y si se necesita poca iluminación se cierra. De esta
manera se controla cuánta luz pasará por el condensador. El punto óptimo
depende del tipo de muestra observada y de su transparencia.

Transformador. Este permite que la lámpara del microscopio sea alimentada

con una fuente de poder. El transformador regula el voltaje que le llegará a la
lámpara.

Sistema mecánico
Tubo. Pieza en forma de un cilindro hueco de color negro por donde viajan los
haces de luz hasta llegar al ocular que a su vez conecta con los objetivos. Es
un elemento esencial para mantener una correcta alineación entre los
elementos ópticos

Revólver. Pieza con forma circular que soporta a los objetivos, los cuales
están sujetos por una rosca y a la vez permite rotar los objetivos. Cuando estos
se rotan, se puede escuchar y sentir un pequeño clic, el cual indica que el
objetivo está posicionado de manera correcta (siempre se tiene que escuchar
este clic para posteriormente hacer las observaciones). Se mueve de derecha
a izquierda y de izquierda a derecha. Habitualmente permite escoger entre tres
o cuatro objetivos distintos.

Tornillo macrométrico. Permite acercar o alejar el objetivo de la muestra con

desplazamientos profundos (de forma rápida) de la platina de forma vertical,
pudiendo subirla o bajarla. Se utiliza para obtener un primer enfoque que es
ajustado posteriormente mediante el tornillo micrométrico (se utiliza con el
objetivo de 10x para poder encontrar la muestra a observar). En algunos
modelos de microscopios lo que se mueve es el tubo y no la platina.

Tornillo micrométrico. Permite el desplazamiento extremadamente fino de la

platina (de una forma muy lenta). El movimiento es casi imperceptible y puede
ser hacia arriba o hacia abajo. Es necesario para ajustar el enfoque definitivo
de la muestra ya cuando esta no requiera de un movimiento tan brusco,

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como en el caso del cambio de los objetivos de 10x a 40x y a 100x para su
ajuste óptico.

Platina. Parte donde se coloca la muestra que será observada. Contiene un

orificio estratégicamente ubicado para permitir el paso de luz a través de la
muestra y el sistema de lentes. Generalmente hay dos pinzas unidas a la
platina que permiten mantener la muestra en posición fija. Esta puede ser
desplazada en algunos modelos mediante los tornillos macrométricos y
micrométricos.

Carro. Pieza que permite que se pueda recorrer toda la preparación. Es

sumamente importante, ya que la mayoría de los análisis requieren la
observación de al menos 100 campos. Permite moverse de izquierda a
derecha y viceversa, y de adelante hacia atrás y viceversa.

Pinzas sujetadoras. Se encuentran en la platina, como función tiene el sujetar

la muestra (portaobjeto) para que este no se esté desplazando y poder tener
un mejor manejo a la hora de la observación.

Brazo o asa. Constituye el esqueleto del microscopio, principalmente conecta

la superficie donde se coloca la muestra con el ocular por donde ésta se puede
observar. Tanto las lentes del objetivo como del ocular se encuentran también
conectadas al brazo también es la parte que une al tubo y a la base. El brazo
es por donde se debe agarrar correctamente el microscopio cuando se
requiera trasladarlo de un lugar a otro.

Base o pie. Se ubica en la parte inferior del microscopio, otorgándole así la

estabilidad para que así el microscopio repose en un lugar sin riesgo de que
llegue a caerse. La forma varía de acuerdo con el modelo y marca del
microscopio. Puede tener forma redondeada, ovalada o cuadrada. Es habitual
que incluya algunos topes de goma para evitar que el microscopio se deslice
sobre la superficie donde se encuentra.

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Figura 8 Partes del microscopio.

3) ¿Cuáles son las diferencias más evidentes de los microorganismos observados

en esta práctica?
Las diferencias radican en su morfología y tamaño, no es lo mismo observar la
bacteria de E. coli, la cual tiene forma definida de bacilo y las muestras de
levadura con una forma más redondeada, incluso siendo parte del mismo
reino, la muestra cambia radicalmente en cuanto a composición, por ejemplo,
Aspergillus. nidulans tiene estructuras filamentosas que le generan
características propias. Otra de las diferencias entre los microorganismos, muy
probablemente indirecta, es la elección del tipo de tinción que se usa para
favorecer la muestra de distintas formas, tales como examinar detalladamente,
definir y contrastar.

4) Indique el tipo de microscopio que se requiere para observar:

 La pared celular de un hongo: microscopio de campo claro.
 La pared celular de una bacteria: microscopio de campo claro.
 Poder visualizar un ribosoma: microscopio electrónico de transmisión.
 La reacción de un antígeno con un anticuerpo en la superficie o en el
interior de una célula: microscopia de fluorescencia, debido a que el
límite de resolución de un microscopio de fluorescencia puede estar
muy por debajo de un microscopio óptico convencional, lo que
permite contemplar con precisión las estructuras de una célula o los
procesos de células vivas.
 La identificación de componentes celulares usando anticuerpos con dos o
más moléculas fluorescentes y poder analizar compartimientos internos:
Microscopia de fluorescencia y de contraste de fases.

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 La estructura de una cápside viral: Microscopia electrónica, microscopia
con focal.
 El nucleoide bacteriano: microscopia óptica de campo oscuro,
microscopia de fluorescencia.
 Preparaciones en fresco de bacterias: microscopia óptica de campo
claro.
 Endoesporas bacterianas: microscopia de campo claro con objetivo de
inmersión.

5) En una observación al microscopio de campo brillante, se determinó que las

medidas de un microorganismo eran de 0.5 µm de diámetro y 2.4 µm de largo,
al observarlo con el objetivo de inmersión ¿Cómo considera usted que se llegó
a esta conclusión? Explique brevemente el método para determinar el tamaño
de un microorganismo visto al microscopio.
Se llegó a esta conclusión gracias al apoyo del micrómetro de la platina y el
micrómetro del ocular, ya que logran medir las dimensiones de dicho
microorganismo.
El método para determinar el tamaño es el siguiente:
1) Primeramente, se tiene que alinear la regla de medición de los micrómetros
tanto del ocular como el de la platina, observando una superposición de las
dos en alguna parte de la “regla”, que logran que coincidan las líneas de
ambos.
2) Posteriormente, se hacen los cálculos de calibración para determinar las
divisiones del micrómetro del ocular respecto al de la platina.
3) Una vez hecho esto y teniendo ese dato se observa la muestra, con una
técnica apropiada.
4) Al detectar el microorganismo, se mide con el micrómetro ocular y se hacen
los cálculos para obtener sus dimensiones, multiplicar este número de
divisiones por el factor de calibración recién obtenido.

Video sobre Microscopía de Fluorescencia

1. ¿Para qué se usa este tipo de microscopía?

Diferentes experimentos son utilizados
por microscopía fluorescente e
involucra diferentes tipos de fluoruros,
uno de ellos es la fotografía de
proteínas que son marcadas por
anticuerpos que están conectadas o
bien conjugadas con compuestos

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Figura 9 Aplicaciones de la microscopia de fluorescencia.

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fluorescentes. Microscopia de partículas fluorescentes que es una tecnología
que utiliza ensamblado macromolecular marcado con fluorescencia, para
estudiar el movimiento y cinética de rotación (en el caso del citoesqueleto).
Recuperación fluorescente después del fotoblanqueado o FRAP por sus siglas
en inglés, donde se realiza al fotoblanquear intencionalmente una pequeña
región de una muestra para poder monitorear el ritmo de difusión de moléculas
marcadas con fluorescencia de vuelta a la región fotoblanqueada.
2. ¿Cuáles son los pasos críticos de esta microscopía?
Cuando la luz abandona la lampara de
arco, es dirigida a través de un filtro
excitador que selecciona la longitud de
onda de la excitación. Esta luz es
reflejada hacia la muestra, por un espejo
especial llamado espejo dicroico, el cual
es diseñado para reflejar luz, solamente
en la longitud de onda de la excitación.
La luz reflejada pasa a través del
objetivo, donde es enfocada sobre el
espécimen fluorescente. Las emisiones
desde el espécimen son pasadas de
vuelta a través del objetivo, donde el
aumento de la imagen ocurre y a través Figura 10 Pasos críticos de la microscopía de fluorescencia.
del espejo dicroico. Esta luz es filtrada
por el filtro de barrera, que selecciona por la longitud de onda y filtra la luz
contaminante desde la lampara de arco y otras fuentes que son reflectadas de
los componentes del microscopio. Finalmente, la emisión fluorescente filtrada,
se envía al detector, donde la imagen puede ser digitalizada o es transmitida al
ocular para visualización óptica.
3. ¿Qué parte del microscopio de fluorescencia es más peligrosa y por qué?

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La instalación en el microscopio fluorescente de la
lámpara de arco de mercurio o xenón, ya que la luz
emitida es de 10 a 100 veces más brillante que la
mayoría de las lámparas incandescentes y da luz en
una amplia gama de longitudes de onda, desde el
ultravioleta hasta el infrarrojo; esta fuente de luz de
Figura 11 Mirar directamente alto poder es la parte más peligrosa, ya que mirar
a una luz sin filtro puede directamente a una luz sin filtro puede dañar
dañar seriamente las retinas.
seriamente las retinas, y el mal manejo de las
bombillas puede provocar que exploten.

Figura 12 Extremar cuidados en instalación de

Figura 13 Lámpara de arco de mercurio o
lámpara de arco de mercurio o xenón.
xenón.

4. ¿Qué es el fotoblanqueo?
Cuando una muestra con el fluoroforo es expuesta de manera prolongada a la
fuente de luz de manera que genera una destrucción fotoquímica del fluoroforo,
produciendo una menor cantidad de fluorescencia.
Ejercicio de calibración del micrómetro ocular
5. Si cada espacio más pequeño del micrómetro de la platina mide
0.01 mm (10 µm).
a) Calcula cuanto mide cada espacio del ocular.
b) Calcula el tamaño aproximado de los siguientes
microorganismos de acuerdo con la calibración que hiciste.

x=espacio del micrómetro de la platina

y=espacio del micrómetro delocular
Figura 14 Calibración del
1 espacio del ocular=( x / y ) ( 0.01 mm )
micrómetro del ocular.
1 espacio del ocular=( 20/5 ) ( 0.01mm )=0.04 mm=40 μm

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 Nota: Para calcular correctamente los espacios del ocular en amiba,
eritrocito levadura, y bacteria se realizó una relación entre el lugar que
ocupa en la platina y el área del ocular, de la siguiente forma:
Si estos microorganismos están en el espacio de 20 líneas correspondiente
a la platina hay 5 espacios de ocular, entonces:
( Espacio de C / microorganismo)(5)
Espacio en el ocular( X)=
20
( 10 ) ( 5 )
 Amiba. Espacio en el ocular ( X )= =2.5
20

(3) (5)
 Eritrocito. Espacio en el ocular ( X )= =0.75
20

(3) (5)
 Levadura. Espacio en el ocular ( X )= =0.75
20

 Bacteria.

Figura 15 Tamaños de los microorganismos.

(2) ( 5)
Espacio en el ocular ( X )= =0.5
20
Microorganism Cálculo Tamaño
o
Fibroblasto (10)(40 μm) 400 μm
Amiba (2.5)(40 μm) 100 μm
Eritrocito (0.75)(40 μm) 30 μm
Levadura (0.75)(40 μm) 30 μm
Bacteria (0.5)( 40 μm) 20 μm

Conclusiones

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El conocer perfectamente el funcionamiento, manipulación de herramientas y
técnicas primordiales en un laboratorio es sin duda de gran relevancia para la
formación de cualquier persona que se dedique a la ciencia.
La preparación de un buen frotis es toda una técnica que se perfecciona con la
práctica. En tal proceso podemos resaltar tres puntos fundamentales al realizar
cualquier tipo de frotis, agregar poca muestra en el portaobjetos, evitar fijar
demasiado y utilizar una cantidad apropiada de colorante para la tinción de las
muestras. A partir de esto, hay varias herramientas que permiten un
aprovechamiento eficiente del microscopio como son un buen enfoque e
iluminación, sin embargo, para dominar estas es necesario conocer toda la
estructura y función de cada parte que lo conforma. Estas herramientas, sin duda
perfeccionan los análisis de muestras como bacterias, hongos y protozoarios, al
proporcionar nitidez, contraste y brillo adecuado para visualizar morfología,
estructura y tamaño; este último requiere el conocimiento de calibración del
micrómetro ocular, que es indispensable para conocer a fondo la escala de
comparación de los microorganismos que estudiamos.

Referencias
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funciones. Lifeder. https://www.lifeder.com/microscopio-campo-claro/
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%20una%20preparaci%C3%B3n,continuaci%C3%B3n%20cubrirla%20con
%20un%20cubreobjetos.

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Práctica 1 Microscopía
 JoVE Science Education Library. (s. f.). General Laboratory. Techniques
Introduction to Fluorescence Microscopy. JoVE Science. https://www-jove-
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