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    Bioquimica I Ciclo Krebs Practica

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    Yuliana Mosquera
    1) El documento describe un experimento para medir la oxidación mitocondrial del succinato en trozos de corazón de res mediante la cuantificación espectrofotométrica del ferrocianuro utilizado como aceptor artificial de electrones. 2) Se preparan tres tubos con diferentes sustratos y se mide la absorbancia a 420nm para calcular los micromoles de ferrocianuro utilizados y los que quedan después de la reacción. 3) Se espera que el tubo sin succinato conserve más ferrocianuro, el tubo con succinato utilice más

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    Bioquimica I Ciclo Krebs Practica

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    1) El documento describe un experimento para medir la oxidación mitocondrial del succinato en trozos de corazón de res mediante la cuantificación espectrofotométrica del ferrocianuro utilizado como aceptor artificial de electrones. 2) Se preparan tres tubos con diferentes sustratos y se mide la absorbancia a 420nm para calcular los micromoles de ferrocianuro utilizados y los que quedan después de la reacción. 3) Se espera que el tubo sin succinato conserve más ferrocianuro, el tubo con succinato utilice más

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    Bioquimica I ciclo krebs practica

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    1) El documento describe un experimento para medir la oxidación mitocondrial del succinato en trozos de corazón de res mediante la cuantificación espectrofotométrica del ferrocianuro utilizado como aceptor artificial de electrones. 2) Se preparan tres tubos con diferentes sustratos y se mide la absorbancia a 420nm para calcular los micromoles de ferrocianuro utilizados y los que quedan después de la reacción. 3) Se espera que el tubo sin succinato conserve más ferrocianuro, el tubo con succinato utilice más

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    1) El documento describe un experimento para medir la oxidación mitocondrial del succinato en trozos de corazón de res mediante la cuantificación espectrofotométrica del ferrocianuro utilizado como aceptor artificial de electrones. 2) Se preparan tres tubos con diferentes sustratos y se mide la absorbancia a 420nm para calcular los micromoles de ferrocianuro utilizados y los que quedan después de la reacción. 3) Se espera que el tubo sin succinato conserve más ferrocianuro, el tubo con succinato utilice más

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    Bioquimica I

    Instructor : M.C. Miguel Ángel Díaz Alday

    OXIDACION MITOCONDRIAL DEL SUCCINATO (ciclo krebs y fosforilacion


    oxidativa)

    OBJETIVO

    El alumno demostrara la oxidación mitocondrial del succinato, utilizando un


    aceptor artificial de electrones, la cantidad del cual será determinada por
    espectrofotometría.

    INFORMACION GENERAL

    Los animales superiores son heterótrofos, es decir, no pueden sintetizar su propia


    energía (como lo hacen las plantas en la fotosíntesis), sino que deben ingerir esa
    energía en los alimentos que consumen, y posteriormente extraer parte de la
    misma mediante una compleja serie de reacciones bioquímicas.

    La principal fuente de energía para los animales y el hombre son los


    carbohidratos, el metabolismo energético de estos compuestos incluye reacciones
    como la glucólisis, ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Dependiendo de si las
    condiciones microambientales son aerobias (con presencia de oxigeno), o
    anaerobias (en ausencia de oxigeno), las reacciones proseguirán por una vía, o
    bien, se detendrán a cierto nivel.

    La mitocondria, es un pequeño organelo celular en donde se llevan a cabo las


    reacciones que requieren la presencia de oxigeno. En la mitocondria se hallan
    numerosas enzimas que hacen posible la oxidación de los metabolitos del ciclo de
    Krebs.

    La oxidación puede implicar: ganancia de oxigeno, perdida de hidrogeno, o mas


    específicamente, perdida de electrones.

    La producción de energía por parte de la mitocondria, implica el transporte de


    electrones a lo largo de una cadena de reacciones y de varias maneras, una de
    ellas, es la colorimétrica, usando un aceptor artificial de electrones, el cual cambia
    de color cuando capta dichos electrones.
    Para medirá con exactitud el grado en el cual se produce el cambio de color, se
    usara un aparato muy común en el laboratorio de bioquímica, el
    espectrofotómetro.

    Sin entrar en muchos detalles, este aparato nos mide la cantidad de luz que
    atraviesa un medio coloreado (transmitancia), o bien, nos puede medir la cantidad
    de luz que es retenida o absorbida por ese medio coloreado (absorbancia).

    A mayor cantidad de substancias coloreadas tenga una muestra, mayor cantidad


    de luz será capaz de absorber, pero ello también dependerá del espesor de la
    cubeta (los tubos de cuarzo donde se colocan las muestras dentro del aparato).

    Para el caso de la práctica, se usará como aceptor artificial de electrones al


    ferrocianuro (se usará ferrocianuro de potasio).

    Esta substancia es de color amarillo, y a medida que va aceptando electrones, va


    haciéndose cada vez más pálida. A mayor cantidad de electrones aceptados, más
    pálida se vulva la solución, esta disminución de color se puede mediar con gran
    exactitud usando el espectrofotómetro.

    MATERIALES REACTIVOS

    4 tubos de ensayo 120 x 10mm Buffer de fosfatos pH 7.4 0.1M

    1 gradilla Succinato en buffer 0.01M

    3 pipetas de 1ml Malonato en buffer 0.01M

    2 pipetas de 0.1ml Cianuro de potasio

    2 vasos p.p. 250ml1 baño Maria Ferrocianuro de potasio 0.01M

    1 termómetro Ácido tricloroacético al 10%

    1 mortero y mano1 trozo de gasa

    1 centrifuga con tubos MATERIAL BIOLÓGICO


    1 espectrofotómetro con cubetas Trozo de corazón de res (fresco).

    1 licuadora

    hielo picado

    DESARROLLO DEL EXPERIMENTO.

    1. Pese 10 gramos de corazón de res fresco (puede ser de otra especie).

    2. Pique finamente el trozo de corazón, añada 190ml de buffer de fosfatos bien


    frío.

    3. Coloque en un vaso licuador y licue por 1 minuto.

    4. Filtre a través de gasa fina y recoja el filtrado en un vaso de precipitados.

    5. Coloque en baño Maria de hielo el vaso de precipitados que contiene el filtrado


    (homogenizado).

    6. Numere 3 tubos de ensayo y proceda como muestra el esquema:

    Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

    Buffer de fosfatos 3ml 2ml 1.9ml

    Succinato en buffer 1ml 1ml

    Malonato en buffer 0.1ml

    _______________________________________________________________
    ____

    Homogenizado del
    paso No 5 1ml 1ml 1ml

    NOTA: Checar que esté bien mezclado.

    _______________________________________________________________
    ____Cianuro de potasio 1 gota 1 gota 1 gota

    7. Colocar los tubos en un baño Maria a 37°Cpor 5 minutos.

    8. Añadir a cada tubo 1ml de ferrocianuro de potasio. Mezcle bien, anotar el tiempo
    al que se hizo la adición.

    9. Diez minutos después agregue a cada tubo 5ml de ácido tricloroacético. Mezcle
    bien.

    10. Centrifugue cada tubo por 5 minutos a 2,000 r.p.m.

    11. Obtenga el sobrenadante de cada tubo y tome la lectura de la absorbancia en


    el espectrofotómetro, a una longitud de onda de 420nm. NOTA: UTILICE
    AGUA DESTILADA COMO BLANCO PARA CALIBRAR EL APARATO.

    12. Calcule el numero de micromoles de ferrocianuro que quedan en cada tubo,


    para ello considere lo siguiente:
    3
    a) La Extinción molar (E) del ión ferrocianuro es de 1 X 10 litros mol-1 cm -1
    a
    420nm.

    b) El volumen total en cada tubo, luego de la adición del ácido tricloroacético es


    de 10ml.c) La longitud del rayo de luz que atraviesa la cubeta es de 1-1.2 cm.
    (Consulte a su instructor para el caso de las cubetas que usted está usando)

    FORMULA A EMPLEAR PARA LOS CALCULOS

    C = A_

    EB

    C = Concentración
    A = Abosorbancia medida en el espectrofotómetro

    E = Exticnción molar (1 X 10 3 mol -1 cm-1)

    B = Espesor de la cubeta (cms)

    Micromoles de Fe (CN) 3 Micromoles de Fe


    (CN) 3

    Al final de la reacción usados por el sistema

    Tubo 1

    Tubo 2

    Tubo 3

    12. Resultados esperados

    Tubo 1. ------ No contiene el substrato (succinato), solo el buffer, de aquí que no


    exista oxidación, por lo tanto es el tubo que conserva más cantidad de
    ferrocianuro sin aceptar electrones (y sin cambiar de color).

    Tubo 2. ------ La presencia del substrato (succinato), en este tubo, permite que
    dicho succinato se oxide, proceso que implica un transporte de electrones,
    los cuales soncaptados por el ferrocianuro, el cual se va decolorando a medida
    que ello ocurre. Este tubo debe dar el valor mas alto de micromoles de
    ferrocianuro empleados por el sistema enzimático y el menos numero de
    micromoles de ferrocianuro que quedan después de terminada la reacción.

    Tubo 3. ------ La presencia del malonato que contiene este tubo, actúa como un inhibidor de
    tipo competitivo para la succinato deshidrogenasa (la enzima que cataliza la remoción de
    hidrogeno del succinato). Por lo tanto, el succinato al no oxidarse, se mantiene. Este tubo
    debe dar, en base a lo señalado, un valor de micromoles de ferrocianuro que quedan
    después de la prueba, mayor al del tubo No 2.

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