EVALUACIÓN DE ANTAGONISTAS IN PLANTA – IN VITRO

1
Nelly Yazmin Agudelo Rozo -1611303; 2Dayron Eliecer Almeyda Pimienta-1611323;
3
Daniela Andrea Vargas Ortega-1611329.

1
[email protected]; [email protected];
3
[email protected]

Universidad Francisco de Paula Santander, Facultad de Ciencias Agrarias y del

Ambiente, Ingeniería Biotecnológica, 04 de Junio del 2019

RESUMEN

El objetivo del presente informe fue evaluar la capacidad antagonista de Trichoderma sp.
frente a hongos fitopatógenos Fusarium sp., para esto se utilizaron metodologías in planta
y en condiciones in vitro, con el fin de evaluar su potencial para ser utilizado en control
biológico. En la metodología in planta se preparo el suelo con una mezcla de 7,5 Kg de
abono y 2,5 Kg de arena, y se agrego a 10 bolsas donde se inocularon 10 semillas de frijol
previamente germinadas, se les agrego el hongo antagonista Trichoderma sp. a 5 bolsas
siendo las de tratamiento y a los 5 restantes agua destilada siendo las de testigo, al día
siguiente se le agrego el hongo fitopatógeno Fusarium sp. a todas las bolsas y se realizó
lectura cada día para observar que tan eficiente es este hongo antagonista. En la
metodología in vitro se realizó la siembra en agar PDA por duplicado, donde en un lado de
la caja se sembró Thichoderma sp. (a) y en el otro lado de la caja se sembró Fusarium sp.
(b), esto se realizo para evaluar que incidencia tiene el hongo antagonista frente al hongo
fitopatógeno.

Palabras claves: Antagonista, fitopatógenos, in planta, in vitro, control biológico,

incidencia.

ABSTRACT
The objective of this report was to evaluate the antagonistic capacity of Trichoderma sp. in
front of phytopathogenic fungi Fusarium sp., for this in plant methodologies and under in
vitro conditions were used, in order to evaluate their potential to be used in biological
control. In the in-plant methodology the soil was prepared with a mixture of 7.5 Kg of
fertilizer and 2.5 Kg of sand, and it was added to 10 bags where 10 seeds of previously
germinated beans were inoculated, they were added the antagonist fungus Trichoderma sp.
to 5 bags being the treatment and the remaining 5 distilled water being the control, the next
day was added the phytopathogenic fungus Fusarium sp. to all the bags and reading was
done every day to see how efficient this antagonistic fungus is. In the in vitro methodology,
sowing was carried out on PDA agar in duplicate, where Thichoderma sp. Was planted on
one side of the box. (a) and on the other side of the box Fusarium sp. (b), this was done to
evaluate the incidence of the antagonistic fungus against the phytopathogenic fungus.

Key words: Antagonist, phytopathogens, in plant, in vitro, biological control, incidence.

INTRODUCCIÓN

En el control químico de Fusarium sp. y otros hongos se emplean fungicidas sistémicos

como los benzimidazoles (benomil, carbendazim, tiabendazol y tiofanato). Las continuas
aplicaciones de estos agroquímicos ocasionan diferentes problemas, como intoxicación en
humanos y animales, problemas de exportaciones de productos por residuos químicos,
daños al medio ambiente, efectos nocivos en microorganismos, resistencia a ingredientes
activos, necesidad de altas dosis y la búsqueda de nuevos agroquímicos para tratar de
contrarrestar a los hongos resistentes (Ochoa et al., 2012).

Debido a esto es necesario el desarrollo de técnicas de control biológico que sean accesibles
para el sector agrícola y a su vez no representen una amenaza a la biodiversidad. El genero
Trichoderma sp. presenta grandes características para ser utilizado como biocontrolador de
Fusarium sp. (Arbito, 2017).

Trichoderma sp. es un hongo que se encuentra frecuentemente sobre tejidos vegetales en

descomposición. Es un organismo dominante en los suelos, debido a su naturaleza agresiva
y su capacidad metabólica para competir con otros microorganismos. Además,
Trichoderma sp. tiene la capacidad de parasitar a otros hongos lo que se conoce como
hiperparasitismo o micoparasitismo. El modo de acción de Trichoderma sp. es complejo e
incluye quimiotaxismo, antibiosis y parasitismo (Elósegui, 2006).

Los síntomas de la enfermedad causada por Fusarium sp. generalmente se observan en

etapas cercanas a la floración; las plantas son raquíticas, con un amarillamiento
blanquecino ascendente, con posterior marchitamiento. En los tejidos internos de las raíces
y de la base del tallo, se observa una pudrición seca de coloración rojiza, causada por las
toxinas producidas por el hongo, ya que el xilema es obstruido causando la muerte de la
planta (Eraso et al., 2014).

El manejo preventivo con el uso del control biológico con Trichoderma sp. es una
alternativa importante para el control del amarillamiento causado por F. oxysporum, ya que
una vez se hayan manifestado los síntomas de esta enfermedad ni siquiera el control
químico es eficiente (González et al., 2005).

MATERIALES Y METODOS

1. Evaluación de antagonismo de Trichoderma sp. In vitro – Potencial inhibitorio

micelial (PIM)

Se realizo pruebas de antagonismo in vitro de Trichoderma sp. frente a Fusarium sp. sobre
agar PDA de acuerdo a la Figura

a=Trichoderma sp.
b=Fusarium sp
Evaluar el potencial inhibitorio:
%PIM: (mb-ma/mb)*100

ma = Micelio del fitopatógeno inhibido por el antagonista

mb = Micelio del fitopatógeno con crecimiento libre

2. Evaluación de Trichoderma sp. In planta - modelo fríjol

- Preparación del suelo. Sevtamizo muy bien 750 g de suelo para cada bolsa, es decir un
total de 7,5Kg y 250 g de arena por bolsa, es decir 2,5 Kg en total. Se mezcló estos
sustratos y luego se repartio este suelo en 10 bolsas (1Kg en cada bolsa). Las 10 bolsas se
empacaron nuevamente en una sola y se llevó al autoclave para la eliminación de
microbiota en general. Tiempo de esterilización: 45 minutos.
-Preparación de la semilla. Se colocó a pregerminar 10 semillas de fríjol de 3 a 5 días antes
de iniciar el proceso de siembra e inoculación de los microorganismos.

- Obtención de la suspensión celular (inóculo). A partir de una caja de Trichoderma sp., se

arrastró todos los conidios y se realizó una suspensión celular en un frasco con 50 mL de
solución salina.

- Preparación de las bolsas de siembra. Después de autoclavar el suelo, se llenó 10 bolsas

de vivero de 1 Kg y sembramos cuidadosamente una semilla de fríjol pregerminada en cada
bolsa. Luego aplicamos 5 mL de la suspensión de Trichoderma sp. Sólo a 5 bolsas y a las
otras 5, se aplicó 5 mL de agua destilada estéril como testigos y se marcó los respectivos
tratamientos.

- Inoculación con el patógeno. Al día siguiente, aplicamos 5 mL de suspensión de

Fusarium sp alrededor de la semilla de fríjol.

-Observe diariamente el comportamiento de las plantas en cada caso y describa los

síntomas que se van desarrollando. Realice lectura periódica para poder evaluar el
comportamiento del fitopatógeno con y sin la presencia del antagonista.

-Se debió observar diariamente por 7 días el comportamiento de las plantas en cada caso y
se describió los síntomas que se iban desarrollando y determinando la curva progresiva de
la enfermedad.

RESULTADOS

In vitro

b a b a
 Fig. 1 y 2: Evaluación Antagónica de Trichoderma sp contra Fusarium sp., In Vitro.
a= Trichoderma sp; b= Fusarium sp
CAJA 1

Ma = 1cm

Mb = 1,5cm mb−ma
%PMI= ∗100 %
mb

1,5 cm−1 cm
%PMI= ∗100 %
1,5 cm

%PMI = 33,33%

CAJA 2

Ma = 1cm

Mb = 1,2cm

1,2cm−1cm
%PMI= ∗100 %
1,2cm

%PMI = 16,67%

In vivo

TESTIGO

Fig. 3 y 4: Incidencia de Fusarium sp sobre las plántula de frijol (Testigos)

 Calculo del área bajo la curva de progreso de la enfermedad para cuantificar el progreso de
la Enfermedad (AUDPC)

Día inicial de la lectura: 15 de mayo del 2019

Día final de la lectura: 27 de mayo del 2019
Intervalo de Promedio Intervalo de tiempo * Promedio de
Muestra Día Incidencia Tiempo incidencia Incidencia
T0 1 0      
T1 3 2 1 2
T2 6 3 3 2,5 7,5
T3 8 4 2 3,5 7

AUDPC 16,5

Incidencia vs Día
4.5
4
3.5
3 # De plantas que
Incidencia

2.5
2 crecieron: 4/5
1.5
1
0.5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Dias

TRATAMIENTO
 Fig. 5 y 6: Incidencia de Fusarium sp sobre las plántula de frijol, con el tratamiento de
Trichoderma sp (Tratamiento)

Calculo del área bajo la curva de progreso de la enfermedad para cuantificar el progreso de
la Enfermedad (AUDPC)

Día inicial de la lectura: 15 de mayo del 2019

Día final de la lectura: 27 de mayo del 2019
Intervalo de Promedio Intervalo de tiempo * Promedio
Muestra Día Incidencia Tiempo incidencia de Incidencia
T0 1 0      
T1 3 1 2 0,5 1
T2 6 3 3 2 6

AUDPC 7

Incidencia vs Día
3.5
3
2.5
Incidencia

2
1.5
# De plantas que
1
0.5 crecieron: 3/5
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Días

% De eficiencia del Tratamiento

a= Valor de AUDPC en la Incidencia con Fusarium sp.

a−b
%E= ∗100 %
a
b= Valor de AUDPC en el Tratamiento con Trichoderma sp.

16,5−7
%E= ∗100 %
16,5

%E = 57,58%

DISCUSIONES

Al hacer la comparación a los 3 días, del radio del crecimiento antagonista, con el radio de
crecimiento patógeno de cada Caja de Petri, se determinó la competencia por nutrientes y
espacio, donde se encontró, que las cepas de Trichoderma sp se desarrollaron a una
velocidad superior a las de Fusarium sp. El antagonista tuvo un crecimiento muy
desarrollado, mientras que el patógeno mostró un crecimiento limitado en ambas cajas con
un 33,33% y un 16,67% de inhibición de crecimiento

La inhibición del crecimiento se observó en ambas cajas al tercer día aun cuando el
antagonista se encontraba distante del patógeno, posiblemente a través de antibiosis,
mecanismo característico para estas especies de biocontroladores. La forma en que
Trichoderma sp probablemente inhibe el crecimiento radial, aun estando a distancia del
patógeno, esta mediada por diversos mecanismos, destacándose la producción de
compuestos inhibitorios al medio; antibiosis por producción de metabolitos volátiles y no
volátiles entre los cuales se encuentran, pirones, isocianatos, pépticos, y recocinas (Howell,
2003); además, la producción de enzimas extracelulares difundibles tales como peptinasas,
cutinasas, glucanasas, y quitinasas e inactivación de las misma hacia el patógeno, tal como
lo sugieren Durán et al. (2003).

En el caso In Vivo, se logró observar el mismo efecto de Trichoderma sp sobre Fusarium

sp en plántulas de frijol, identificando los síntomas que causa dicho patógeno a la planta,
como marchitez en las hojas, bajo crecimiento y desarrollo, etc. Se observaron también
síntomas causados por insectos, en este caso se pudo decir que eran síntomas de minadores
de las hojas, ya que formaban caminos de color blanco en las hojas.
De las 5 plantas que se sembraron con tratamiento, 3 presentaron síntomas de la
enfermedad (mínimos) pero no murieron, y 2 murieron debido a la presencia del patógeno.
De esto se puede concluir que la eficiencia de dicho tratamiento no fue la mejor ya que se
obtuvo un 57,57% de eficiencia.

BIBLIOGRAFIA

- Arbito, M. (2017). Evaluación in vitro de la capacidad antagonista de Trichoderma

sp. frente a Fusarium sp. Trabajo de titulación para optar el título de Ingeniero en
Biotecnología de los Recursos Naturales. Universidad Politécnica Salesiana.
Cuenca, Ecuador.
- Durán, E., F. Robles, J. Martínez y M. Brito. 2003. Trichoderma Un hongo
combatiente de patógenos. Revista Técnico Ambiental Teorema Ambiental 42: 23-
26.
- Elósegui O. 2006. Métodos artesanales de producción de bioplaguicidas a partir de
hongos entomopatógenos y antagonistas. Instituto de Investigaciones de Sanidad
Vegetal. La Habana.
- Eraso, C.; Rodríguez, J.; Gonzales; C. & Betancourth, C. (2014). Evaluación de
cepas de Trichoderma spp. para el manejo del amarillamiento de arveja causado por
Fusarium oxysporum. Corpoica Cienc. Tecnol. Agropecu. 237-249.
- González JC, Maruri JM, González A. 2005. Evaluación de diferentes
concentraciones de Trichoderma spp. contra Fusarium oxysporum agente causal de
la pudrición de plántulas en papaya (Carica papaya L.) en Tuxpan, Veracruz,
México. Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad
Veracruzana. Revista UDO Agrícola 45-47.
- Howell, C.R. 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological
control of plant diseases: The history and evolution of current concepts. Plant
Disease 87(1): 4-10.
- Ochoa, Y.; Cerna, E.; Landeros, J.; Hernández, S. & Delgado, J. (2012). Evaluación
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control de tres especies de Fusarium sp. Phyton (Buenos Aires), 69-73.