Práctica #5.
Práctica #5.
Práctica #5.
EXPERIMENTO 5
ENZIMA CATALASA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. FACTORES QUE LA AFECTAN.
DETERMINACIÓN DE LA CONSTANTE DE
MICHAELIS-MENTEN. EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.
REQUISITOS
Repasar la deducción de
OBJETIVOS
la fórmula de
Michaelis-Menten, sus Describir algunas
premisas y aplicación. características de las enzimas.
Balance de ecuaciones Determinar la actividad
y titulación enzimática de la catalasa, su
KM y el efecto de inhibidores
sobre la actividad enzimática.
1. FUNDAMENTOS
Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica. Esto significa que son proteínas
cuya función es acelerar las reacciones bioquímicas. Aunque se trata de proteínas muchas requieren,
para ser activas, un componente no proteico conocido como coenzima o grupo prostético, según se
encuentre débil o firmemente asociado a la matriz proteica. La estructura de este componente no
proteico va a variar desde un ion (Ca ++, Mg++, Mn++, y otros) hasta moléculas complejas como
NAD+, NADP+ y FAD (coenzimas). En estos casos la actividad enzimática va a depender de la
presencia simultánea de una porción proteica (apoenzima) y una porción no proteica (cofactor) y el
conjunto activo apoenzima más coenzima, se conoce como holoenzima.
La actividad enzimática se estudia en el equilibrio, donde no hay cambio neto en la cantidad de
sustrato o de producto. En los sistemas biológicos, las enzimas abaten la energía de activación y
permiten que se produzcan reacciones, que de otro modo, no ocurrirían a velocidades mesurables.
Las enzimas no se consumen en el proceso y las reacciones catalizadas no alteran la naturaleza de la
reacción, solo disminuyen la energía de activación. (Figura 1).
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Figura 1. Diagrama de energía para reacciones con G positiva y negativa comparando una
reacción catalizada contra una no catalizada.
Una consecuencia del hecho de que las reacciones bioquímicas sean catalizadas por enzimas es la
especificidad de éstas hacia el substrato: una enzima cataliza la transformación de un solo tipo de
molécula o de unos tipos diferentes de moléculas estructuralmente muy relacionadas, la especificidad
representa una ventaja para la célula.
Las enzimas dependiendo de las reacciones que catalizan, se han clasificado por la comisión
internacional de enzimas (E.C) en cuatro dígitos que anteceden al nombre recomendado para la
enzima, este nombre está compuesto por uno corto unido al nombre de la reacción que cataliza, los
dígitos son: el primero se refiere a la clase y van del 1 al 6, representan la reacción general
catalizada, el segundo la sub-clase, el tercero la sub-subclase y el cuarto designa a cada enzima
especifica. En la tabla a continuación se muestra la clasificación solamente del primer dígito:
Como proteínas que son, las enzimas son moléculas de uso delicado por ser fácilmente
desnaturalizables. Debido a esto, deben manipularse bajo condiciones que no permitan la
desnaturalización puesto que ésta conduce a la inactivación. Entre las condiciones que se deben
controlar durante la manipulación de las enzimas, cabe destacar:
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1.1.1. La temperatura: La estructura terciaria de una proteína es muy sensible a los cambios
de la temperatura ya que, como sabemos, se mantiene gracias a fuerzas no covalentes altamente
sensibles al calor. Esto hace que la actividad enzimática muestre una dependencia de la temperatura
como la representamos en la figura 2.
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Aumento de la temperatura (grados centígrados)
1.1.2. El pH: Debido a que los cambios de pH modifican las concentraciones de los iones
H+ y OH- de la solución, lo que afecta las interacciones electrostáticas intra e intermoleculares (las
interacciones entre las moléculas de proteínas), modificándose así también la estructura
tridimensional y la actividad de la proteína. La gráfica que se obtiene cuando se estudia la actividad
enzimática en función del pH se parece a la obtenida en el parágrafo anterior como se puede notar en
la siguiente figura 3.
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Aumento del pH
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1.1.3. La fuerza iónica: Como la fuerza iónica está relacionada con la concentración de los
diferentes iones de una solución y éstos pueden influir sobre la estabilidad y la actividad de una
proteína debe mantenerse un control sobre este parámetro.
1.1.4. La agitación: las soluciones de proteínas tienen baja tensión superficial, lo cual
determina que cuando estas soluciones se agitan violentamente, se forma espuma. La formación de
espuma es un factor que indica la desnaturalización.
Cuando en el laboratorio se desea estudiar la actividad de una enzima particular, se comienza por
controlar algunos parámetros que van a determinar la reproducibilidad de los ensayos. Entre estos
parámetros se pueden destacar:
1.2.2. Tiempo de incubación: Para determinar una actividad enzimática es necesario fijar un
intervalo de tiempo conveniente durante el cual se consuma una cantidad medible de substrato. Debe
siempre garantizarse que haya un exceso de sustrato. Para determinar el tiempo de incubación, se
mezclan los reactantes en varios recipientes y se detiene la reacción a diferentes tiempos.
Para estudiar la reacción, se puede elegir cualquier lapso comprendido dentro de la barra a y se debe
desechar el lapso representado por b, el tiempo debe ser tal que se pueda hacer una determinación
confiable de la actividad.
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12
Actividad enzimática U/L
10
8
6
4
2
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentración de la enzima ug
Se debe elegir una cantidad de enzima que permita una determinación confiable de la actividad.
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Por lo general, se considera saturante y se emplea rutinariamente una concentración de sustrato [s] =
10 KM. Diga el estudiante a qué fracción de Vmax corresponde la actividad enzimática cuando [s] = 10
KM .
Esta determinación se realiza empleando una cantidad fija de enzima e incubando durante un mismo
lapso de tiempo pero con diferentes concentraciones de sustrato.
Al hacer esto hay que tomar ciertas precauciones prácticas, entre ellas, se deben cuidar que a las
concentraciones inferiores no se agote el sustrato en el lapso de tiempo fijado con la cantidad de
enzima usada. Para evitar esto hay varias alternativas, aquí las mencionaremos y el estudiante deberá
averiguar cómo se justifican:
1.2.6. pH de incubación: Se procede igual que para determinar la temperatura óptima pero
sólo se varía el pH de la mezcla de reacción; la gráfica que se obtiene es la mostrada en la Figura
3.
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1. Si la velocidad inicial de la reacción se gráfica como función de las concentraciones del sustrato
se puede determinar la velocidad máxima y también la concentración del sustrato a la semivelocidad
máxima de reacción (KM ).
1 KM + [S]
Se obtiene ---- = ---------------------
V V max. [S]
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1 KM [S]
------- = --------------------- + -------------------
V V. max. [S] V. max. [S]
1 1 KM 1
--- = ---------------- + ----------------- ------
V V. max. V. max. [S]
De este modo es posible obtener gráficamente los valores de V max. (en la intersección de 1/v) y
calcular el valor de KM .
Algunas sustancias actúan sobre las enzimas o coenzimas que intervienen en una reacción enzimática
afectando la Vmax. de reacción y/o la afinidad de la enzima por el sustrato. El uso de estas sustancias
inhibidoras ha permitido conocer la naturaleza de grupos funcionales del centro activo, la
especificidad del sustrato, posibles mecanismos de reacción enzimáticos y la participación de
algunos grupos funcionales en el mantenimiento de la conformación de la enzima específica para su
actividad biológica.
Irreversible: el inhibidor reacciona con la enzima, destruye uno ó más grupos funcionales de
la enzima y no puede eliminarse dicho inhibidor por diálisis. En exceso de inhibidor su acción
aumenta con el tiempo ya que la formación del complejo EI es irreversible.
Inhibición competitiva: La enzima puede enlazar en su centro activo una sustancia estructuralmente
relacionada a su verdadero sustrato previniéndose de esta manera la unión al sustrato; el S y el I
compiten por alcanzar el centro activo de la enzima; esta inhibición se revierte por exceso de
sustrato. El valor de la KM cambia pero no Vmax. alcanzada en la reacción sin inhibidor.
Inhibición acompetitiva: esta inhibición se caracteriza porque el inhibidor se une solamente con el
complejo enzima-sustrato. No existe unión del inhibidor con la enzima si previamente una molécula
de sustrato no se ha unido al sitio activo de la enzima.
1.3.3 Métodos para determinar el efecto de inhibidores: Las figuras a continuación (6, 7
y 8), muestran el efecto de los diferentes tipos de inhibición por los métodos de Michaelis-Menten y
Lineaweaver-Burk.
Figura 6 Inhibidor competitivo (Km alterada y la Vmax es igual). Por los métodos de Michaelis-
Menten y Lineaweaver-Burk
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Figura 7 Inhibidor no competitivo (Km inalterada y Vmax menor en ausencia de inhibidor). Por
los métodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk
Figura 8 Inhibidor irreversible acompetitivo (Km y Vmax menor en ausencia de inhibidor). Por
los métodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk
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3. PROCEDIMIENTO:
A un litro de agua destilada enfriada en hielo agregue 1 mL de sangre obtenida por venipuntura y
mezcle volteando suavemente el recipiente dos veces. Esta solución se mantiene siempre en hielo.
Puede usarse 1 mL de homogeneizado de hígado o riñón de res o ratas.
Una vez obtenida la mezcla de reacción, es decir, el sustrato peróxido de hidrogeno (H 2O2), la
enzima catalasa presente en el homogeneizado de hígado y el ácido sulfúrico (H 2SO4) 2N, se
detectará la actividad enzimática de la catalasa titulando el peróxido de hidrogeno presente
(remanente) en cada matraz con permanganato de potasio (KMnO4-) 0,1N. El H2SO4 cede los
protones necesarios para que se lleve a cabo la reacción.
Catalasa
MnO4- + H2O2 + H+ O2 + Mn++ + H2O
El estudiante debe balancear la ecuación y analizarla ya que a partir de ella se realizarán los cálculos
que se van a necesitar durante la práctica. Igualmente el alumno deberá repasar lo aprendido en
química inorgánica sobre titulación.
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Siga el esquema de trabajo mostrado a continuación y comience enumerando los matraces del 1 al
10:
Esperar 1 min
Matraz N° H2O2 (mL) H2O (mL) H2SO4 2N (mL) Enzima (mL) H2SO4 2N (mL)
3.3.1. Matraces impares (1, 3, 5, 7 y 9) y para cada matraz aplique el siguiente procedimiento:
el color que observa una vez añadido el KMnO 4- sobre la solución permanezca 30 segundos. Anote el
volumen gastado de KMnO4-
3.3.2. Matraces pares (2, 4, 6, 8 y 10) y para cada matraz aplique el siguiente procedimiento:
c. Mezcle y titule con la solución de permanganato como lo realizó con los matraces impares
Realice una gráfica en la que represente el volumen gastado de permanganato (el número de moles
de H2O2 descompuestos) en función del volumen de enzima empleado. Las dos representaciones
(matraces pares e impares) deben realizarse en la misma gráfica, cuya finalidad no solo será hallar la
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concentración optima de enzima sino también determinar cómo influye sobre la actividad enzimática
la adición de protones (acido sulfúrico) antes y después de la enzima. En base a esa gráfica el grupo
seleccionará el volumen de enzima que empleará en las experiencias siguientes.
de agua que debe agregar serán los que resulten de restar 8,5 menos el volumen optimo de enzima
seleccionado en el ensayo anterior
d. Incorpore al matraz N° 1 X mL de enzima e inmediatamente (tiempo 0) adicione 3 mL de
ácido sulfúrico
e. Repita el procedimiento para cada matraz pero añada el ácido sulfúrico después de
transcurrido el tiempo prescrito en la tabla
f. Titule el H2O2 remanente en cada matraz y haga una gráfica que represente el volumen
incubación y en base a esta gráfica elija el tiempo de incubación que empleará en las experiencias
sucesivas.
4. AUTO-EVALUACION
b. pH óptimo
c. Constante de Michaelis (KM) y velocidad máxima (Vmax)
d. Efecto de la azida de sodio sobre la actividad enzimática.
6. Calcule cómo se preparan 250 ml de una solución de H2SO4 2N a partir de una botella que tiene
las siguientes especificaciones: d =1.84 g/ml y pureza 97%.
INFORME (CATALASA)
Apellidos Nombres
Grupo de prácticas N° del mesón
Fecha N° del estudiante
Calificaciones
Entrada Desarrollo Informe Definitiva
1. Diseñe una tabla en esta hoja para presentar sus resultados.
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Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la práctica, sin anexar hojas.