EXTRACCIÓN Y ESTABILIDAD DE LA AZADIRACTINA A EN EXTRACTOS

DE NEEM (Azadirachta indica) OBTENIDOS CON ENZIMAS Y DISOLVENTES

EXTRACTION AND STABILITY OF AZADIRACHTIN A IN NEEM (Azadirachta indica)

EXTRACTS OBTAINED WITH ENZYMES AND SOLVENTS

Arfaxad Aguilar-Acosta, Argel Flores-Primo*, David I. Martínez-Herrera, Violeta T. Pardío-Sedas, Karla M. López-Hernández,
Sóstenes R. Rodríguez-Dehaibes, Elissa Chávez-Hernández

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana. Miguel A. de Queve-

do S/N, 91710, Veracruz, Veracruz, México. ([email protected]).

RESUMEN ABSTRACT

La semilla del neem (Azadirachta indica) contiene triterpenoides Neem seed (Azadirachta indica) contains triterpenoids with
con actividad acaricida y repelente a plagas del sector agropecua- acaricidal and pest repellent activity in the agricultural sector.
rio. La concentración de los compuestos en el aceite de neem The concentration of the compounds in neem oil depends on the
depende del método de extracción. La hipótesis fue que el uso method of extraction. The hypothesis in this study was that the
de enzimas y disolventes aumenta la liberación de azadiractina A use of enzymes and solvents increases the release of Azadirachtin
(AzaA) de la semilla del neem, y su concentración permanece es- A (AzaA) from the neem seed, and its concentration remains
table en los extractos durante su almacenamiento a temperaturas stable in the extracts during storage at different temperatures.
diferentes. El objetivo fue determinar el efecto de la maceración The objective was to determine the effect of hexane maceration of
con hexano de extractos de neem preparados con Crystalzyme® neem extracts prepared with Crystalzyme® PLMX, Crystalzyme®
PLMX, Crystalzyme® Cran, Crystalzyme® 100XL, y Cellulase Cran, Crystalzyme® 100XL, and Cellulase 17600L on the
17600L sobre la extracción de (AzaA) y su estabilidad en almace- extraction of azadirachtin A (AzaA) and its storage stability.
namiento. El diseño experimental fue completamente al azar con The experimental design was completely randomized with three
tres repeticiones. La unidad experimental fue la semilla del neem repetitions. The experimental unit was the neem seed collected
recolectada de una plantación en Jamapa, Veracruz, México. La from a plantation in Jamapa, Veracruz, Mexico. The loss rate
constante de velocidad de pérdida (k) de AzaA en almacenamien- constant (k) of AzaA in storage was determined by a first order
to se determinó mediante una ecuación de primer orden. Los equation. Data were analyzed with ANDEVA and the Tukey
datos se analizaron con ANDEVA y la prueba de comparación mean comparison test (p£0.05). The highest concentration
de medias de Tukey (p≤0.05). La concentración mayor de AzaA of AzaA (2.73 g L-1) was obtained with CPLMX in hydrolysis
(2.73 g L-1) se obtuvo con CPLMX en la hidrólisis y 24 h de and 24 h of maceration with hexane, with a greater proportion
maceración con hexano, con mayor proporción de la fracción of the aqueous fraction (2.67 g L-1) than the hexane fraction
acuosa (2.67 g L-1) que la fracción hexánica (0.06 g L-1). Las con- (0.06 g L-1). The concentrations of AzaA extracted with the
centraciones de AzaA extraídas con el uso de enzimas y hexano use of enzymes and hexane were similar to those obtained by
fueron similares a las obtenidas por ultrasonido, prensado mecá- ultrasound, mechanical pressing and methanolic extrusion. The
nico y extrusión metanólica. La pérdida de AzaA en los extractos loss of AzaA in the enzyme extracts increased with the increase
enzimáticos aumentó con el incremento de la temperatura de al- in storage temperature, since it was not detected in the enzyme
macenamiento, ya que no se detectó en los extractos enzimáticos extracts after 7 and 28 d of storage at 50 and 30 °C, respectively.
después de 7 y 28 d de almacenamiento a 50 y 30 °C, respectiva- The concentration of AzaA (20%) remained constant 28 d after
mente. La concentración de AzaA (20%) se mantuvo constante storage at 5 °C and showed the lowest k among the enzyme
28 d después de almacenamiento a 5 °C y presentó la k menor extracts.
entre los extractos enzimáticos.
Key words: neem, Azadirachta indica, storage, enzyme extracts,
hexane, azadirachtin A.
* Autor para correspondencia v Author for correspondence.
Recibido: junio, 2018. Aprobado: octubre, 2018.
Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 54: 89-100. 2020.

89
AGROCIENCIA, 1 de enero - 15 de febrero, 2020

Palabras clave: neem, Azadirachta indica, almacenamiento, ex- INTRODUCTION

tractos enzimáticos, hexano, azadiractina A.

P
lant oils are among the most commonly used
INTRODUCCIÓN substances for the biological control of pests in
the livestock and agricultural sector (Zoubiri

L
os aceites de plantas están entre las sustancias and Baaliouamer, 2014). In Mexico, the neem tree
más empleadas para el control biológico de (Azadirachta indica) is used for the natural control of
plagas en el sector pecuario y agrícola (Zoubiri pest species due to its triterpenoid content, among
y Baaliouamer, 2014). En México, el árbol de neem which azadirachtin (Aza) stands out (Giglioti et al.,
(Azadirachta indica) se usa para el control natural de 2011).
especies plagas por su contenido de triterpenoides, Aza and its natural analogs are the most biologically
entre los cuales destaca la azadiractina (Aza) (Morgan active in the neem seed, and the A (AzaA) isomer is
2009; Giglioti et al., 2011). Aza y sus análogos natu- the most abundant (Soni et al. 2012). Neem is one
rales son los más activos biológicamente en la semilla of the most studied biopesticides for its toxic effects
del neem, y el isómero A (AzaA) es el más abundante on pests, which provides a potential alternative as
(Soni et al. 2012). El neem es uno de los bioplagui- a substitute for synthetic pesticides used to control
cidas más estudiados por sus efectos tóxicos para las pest arthropods (Denardi et al., 2011; Giglioti et al.,
plagas, constituye una alternativa potencial como 2011).
sustituto de plaguicidas sintéticos utilizados para el The application of AzaA in insects inhibits the
control de artrópodos plaga (Denardi et al., 2011; hormones 20-hydroxyecdysona and juvenile, affects
Giglioti et al., 2011). their capacity for oviposition in the mature stage and
La aplicación de AzaA en insectos inhibe las hor- hatching in the larval state, and blocks the synthesis
monas 20-hydroxyecdysona y a los juveniles, afecta of chitin, which prevents insects from making the
su capacidad de ovoposición en etapa madura y de necessary molts for the next stage of development
eclosión en el estado larvario, y bloquea la síntesis de (Giglioti et al., 2011). The cotyledon (seed) has the
quitina, con lo cual impide a los insectos realizar las highest concentration of AzaA with 83% compared
mudas necesarias para la siguiente etapa de desarrollo to other parts of the fruit such as the endosperm,
(Giglioti et al, 2011). El cotiledón (semilla) presenta seminal cover or body of the fruit (Ramos et al.,
la mayor concentración de AzaA con 83% en com- 2004) and in other parts of the tree such as bark,
paración con otras partes del fruto como el endosper- leaf, root and stem (Fernandes et al., 2019). AzaA is
mo, cubierta seminal o cuerpo del fruto (Ramos et considered a benchmark for the insecticidal activity
al., 2004) y en otras regiones del árbol como corteza, of products derived from neem oil.
hoja, raíz y tallo (Morgan, 2009). La AzaA se con- The methodologies proposed to obtain the oil
sidera un referente de la actividad insecticida de los allow maintaining its properties and improving
productos derivados del aceite del neem. the extraction performance of AzaA (Azmir et al.,
Metodologías propuestas para la obtención del 2013). Extraction methods include maceration, cold
aceite permiten mantener sus propiedades y mejorar extrusion with mechanical press and percolation,
el rendimiento en la extracción de AzaA (Azmir et al., with the use of water and various organic solvents
2013). Los métodos de extracción incluyen macera- (Esparza-Díaz et al., 2010; et al., 2011), as well as
ción, extrusión en frío con prensa mecánica y per- hot pressurized solvents, equipment of supercritical
colación, con el uso de agua y distintos disolventes extraction, and ultrasound (Jadeja et al., 2011;
orgánicos (Esparza-Díaz et al., 2010; Boursier et al., Ismadji et al., 2012; De Paula et al., 2016).
2011), así como disolventes calientes presurizados, Factors such as seed management, light exposure,
equipo de extracción supercrítica y ultrasonido (Ja- storage, drying, and extraction method affect the
deja et al., 2011; Ismadji et al., 2012; De Paula et al., concentration of AzaA (Gahukar, 2014). Esparza-
2016). Díaz et al. (2010) mentioned that the concentration
Factores como el manejo de la semilla, la exposi- of AzaA decreases in neem extracts stored at 30 °C;
ción a la luz, el almacenamiento, el secado y el mé- although Jadeja et al. (2011) stated that AzaA is stable
todo de extracción afectan la concentración de AzaA up to temperatures of 50 °C.

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(Gahukar, 2014). Esparza-Díaz et al. (2010) mencio- The cell wall of the seed is another factor that
naron que la concentración de AzaA disminuye en conditions the extraction of active neem terpenoids
los extractos de neem almacenados a 30 °C; aunque (Jadeja et al., 2011). Pardío et al. (2018) mentioned
Jadeja et al. (2011) afirmaron que la AzaA es estable that cellulases or preparations with multiple
hasta temperaturas de 50 °C. enzymatic activity (cellulases, hemicellulases and
La pared celular de la semilla es otro factor que pectinases) increase the extraction of metabolites of
condiciona la extracción de los terpenoides activos interest from plant sources due to their ability to
del neem (Jadeja et al., 2011). Pardío et al. (2018) hydrolyze cell wall structures.
mencionaron que las celulasas o preparados con ac- Hypothesis in our study was that the use of
tividad enzimática múltiple (celulasas, hemicelulasas enzymes with organic solvents, such as hexane,
y pectinasas) aumentan la extracción de metabolitos increases the release of AzaA from the neem seed, and
de interés desde fuentes vegetales por su capacidad de its concentration remains stable in the extracts during
hidrolizar las estructuras de la pared celular. storage at different temperatures. The objective was
La hipótesis de este estudio fue que el uso de en- to determine the effect of hexane maceration of neem
zimas con disolventes orgánicos, como el hexano, au- extracts prepared with the use of enzymatic mixtures
menta la liberación de AzaA de la semilla del neem, y on the storage stability of the extracted AzaA.
su concentración permanece estable en los extractos
durante su almacenamiento a diferentes temperatu- MATERIALS AND METHODS
ras. El objetivo fue determinar el efecto de la mace-
ración con hexano de extractos de neem preparados Neem seeds were extracted from fruits with 110 d of post-
con el uso de mezclas enzimáticas sobre la estabilidad flowering development obtained from trees with 15 years of age
en almacenamiento de la AzaA extraida. located in the El Naranjal ranch, in the municipality of Jamapa,
Veracruz (18 ° 59’ 40.2” N; 96° 15’ 11.5” W) at an altitude of 57
MATERIALES Y MÉTODOS m, luvisol soil, warm-dry-regular climate, average temperature of
25 °C, and an average annual rainfall of 1108 mm.
Las semillas de neem se extrajeron de frutos con 110 d de de- Enzymatic preparations Crystalzyme® PLMX (CPLMX)
sarrollo post-floración obtenidos de árboles con 15 años de edad [pectinases (EC 3.2.1.15), cellulases (EC 3.2.1.4), hemicellulase
ubicados en el rancho El Naranjal en el municipio de Jamapa, Ve- (not reported), arabinase (EC 3.2.1.99)]; Crystalzyme® Cran
racruz (18° 59’ 40.2” N; 96° 15’ 11.5” O) a una altitud de 57 m, (CCran) [pectinase (E.C.3.2.1.15)]; Crystalzyme® 100XL
suelo tipo luvisol, clima cálido-seco-regular, temperatura prome- (C100XL) [pectinase (EC 3.2.1.15), arabinase (EC 3.2.1.99)];
dio de 25 °C y una precipitación pluvial media anual de 1108 mm. Cellulase 17600L (CEL) [endo-b-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4),
Los preparados enzimáticos Crystalzyme® PLMX (CPL- exo-b-1,4-glucanase (E.C.3.2.1.91), b-1,4-glucosidase (EC
MX) [pectinasas (EC 3.2.1.15), cellulasas (EC 3.2.1.4), hemi- 3.2.1.21 )] were obtained from Valley Research, Inc. (South
cellulasa (no reportada), arabinasa (EC 3.2.1.99)]; Crystalzyme® Bend, Indiana, USA). Enzymatic activity units were determined
Cran (CCran) [pectinasa (E.C.3.2.1.15)]; Crystalzyme® 100XL using the filter paper unit technique (UPF mL-1) proposed by
(C100XL) [pectinasa (EC 3.2.1.15), arabinasa (EC 3.2.1.99)]; Eveleigh et al. (2009).
Cellulase 17600L (CEL) [endo-b-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4),
exo-b-1,4-glucanasa (E.C.3.2.1.91), b-1,4-glucosidasa (EC Enzyme-assisted neem extraction and
3.2.1.21)] se obtuvieron en Valley Research, Inc. (South Bend, maceration with hexane
Indiana, EUA). Las unidades de actividad enzimática se determi-
naron mediante la técnica de unidades de papel filtro (UPF mL-1) The seeds were stored for 24 h in freezing at -20 °C before
propuesta por Eveleigh et al. (2009). use. The moisture content in the seeds was 67.8%. Four extracts
of neem were made; one with each enzyme preparation.
Extracción de neem asistida por enzimas y Fresh seeds (35.4 g) were homogenized with phosphate
maceración con hexano buffer at pH 5.0 to undergo hydrolysis with CCran and pH 4.5
for CPLMX, C100XL and CEL in a 1:10 ratio (dry base seed:
Las semillas se almacenaron por 24 h en congelación a -20 °C phosphate buffer). Then 4.76, 6.96, 5.3 and 5.60 UPF g-1 seed
antes de usarlas. El contenido de humedad en las semillas fue de (dry base) were added for CCran, CPLMX, C100XL and CEL,
67.8%. Cuatro extractos de neem se elaboraron; uno con cada respectively. The reaction was carried out for 18 h, 45 °C with
preparado enzimático. CPLMX and at 50 °C with the other extracts.

AGUILAR-ACOSTA et al. 91
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Semillas frescas (35.4 g) se homogenizaron con amortigua- At the end of the hydrolysis, hexane was added in a 1:1 ratio
dor fosfato a pH 5.0 para someterlas a hidrólisis con CCran y pH (v:v), 10 mL of sample were taken at 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48
4.5 para CPLMX, C100XL y CEL en una relación 1:10 (semi- and 72 h. The samples were centrifuged at 3500 g for 30 min;
lla base seca: amortiguador fosfato). Luego se adicionaron 4.76, the solids were separated from the hexane and aqueous fractions,
6.96, 5.3 y 5.60 UPF g-1 de semilla (base seca) para CCran, and from the latter the AzaA concentrations were analyzed with
CPLMX, C100XL y CEL, respectivamente. La reacción se rea- an HPLC model 1525, Waters brand (Milford, Massachusetts,
lizó durante 18 h, 45 °C con CPLMX y a 50 °C con los otros USA). The oil fraction was stored in refrigeration for further
extractos. analysis.
Al finalizar la hidrólisis se adicionó hexano en una relación
1:1 (v:v), se tomaron 10 mL de muestra a las 0, 2, 4, 6, 8, 10, Determination of acaricidal components
12, 24, 48 y 72 h. Las muestras se centrifugaron a 3500 g por 30
min, se separaron los sólidos de las fracciones hexánicas y acuo- Analysis of the acaricidal components was performed by
sas, y de esta última se analizaron las concentraciones de AzaA using HPLC (Kaushik, 2002) and the equipment included
por un equipo HPLC modelo 1525 marca Waters (Milford, binary pumps (Waters 1525) and a photodiode detector (Waters
Massachusetts, EUA). La fracción oleosa se almacenó en refrige- 2996). The analytical separation was performed on a 4 mm
ración para su posterior análisis. NovaPak C18 column (3.9 x 150 mm). The extracted samples
were centrifuged and diluted 1:1 in acetonitrile (HPLC) and
Determinación de componentes acaricidas filtered through 0.22 mm acrodisks (Millipore), and 20 mL were
injected. The flow rate was set at 1 mL min-1, acetonitrile mobile
El análisis de los componentes acaricidas se realizó por HPLC phase: water (40:60), AzaA retention time was 3.1 min, and the
(Kaushik, 2002) y el equipo incluyó bombas binarias (Waters samples were read at 217 nm.
1525) y un detector de fotodiodos (Waters 2996). La separación
analítica se realizó en una Columna NovaPak C18 de 4 mm (3.9 Extract storage
x 150 mm). Las muestras extraídas se centrifugaron y diluyeron
1:1 en acetonitrilo (HPLC) y se filtraron a través de acrodiscos The effect of storage temperature on the stability of AzaA
de 0.22 mm (Millipore) y se inyectaron 20 mL. La velocidad de was determined by the preparation of two enzymatic extracts of
flujo se estableció en 1 mL min-1, la fase móvil acetonitrilo: agua neem, for each enzyme preparation (CCran, CPLMX, C100XL
(40:60), el tiempo de retención de AzaA fue de 3.1 min y las and CEL) in flasks with screw cap, without maceration with
muestras se leyeron a 217 nm. hexane and stored without light at 5, 30 and 50 °C.
The temperatures of 30 (Esparza-Díaz et al., 2010) and 50 °C
Almacenamiento de los extractos (Jadeja et al., 2011) were recorded as optimal for the extraction of
AzaA and coincided with the temperatures used in our study for
El efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la esta- the phase of enzymatic hydrolysis and maceration with hexane.
bilidad de la AzaA se determinó mediante la elaboración de dos The 5 °C was used as a reference for cooling temperatures. On
extractos enzimáticos de neem, para cada preparado enzimático days 0, 7, 14, 21 and 28, 1 mL of sample was taken and the
(CCran, CPLMX, C100XL y CEL) en matraces con tapón de concentration of AzaA was quantified using HPLC. The stability
rosca, sin maceración con hexano y se almacenaron sin luz a 5, of AzaA was evaluated for 28 d since the average life of AzaA in
30 y 50 °C. organic and aqueous solvents is 24 d at pH 7.0 and 20 °C (Jarvis
Las temperaturas de 30 (Esparza-Díaz et al., 2010) y 50 °C et al., 1998).
(Jadeja et al., 2011) se han registrado como óptimas para la ex-
tracción de AzaA, y coinciden con las temperaturas usadas en Design and statistical analysis
nuestro estudio para la fase de hidrólisis enzimática y maceración
con hexano. Los 5 °C se usaron como referencia de temperaturas The experimental design was completely randomized
de refrigeración. En los días 0, 7, 14, 21 y 28 se tomó 1 mL de with three replications for the five treatments evaluated: four
muestra y se cuantificó la concentración de AzaA por HPLC. enzymatic (CPLMX, CEL, CCran, and C100XL), and an
La estabilidad de la AzaA se evaluó durante 28 d, ya que la vida enzyme-free treatment.
media de la AzaA en solventes orgánicos y acuosos es de 24 d a The statistical differences in the results of the release kinetics
pH 7.0 y 20 °C (Jarvis et al., 1998). of AzaA during maceration with hexane and the loss rate constant

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Diseño y análisis estadístico (k) of AzaA in storage were analyzed by ANDEVA and Tukey
means separation tests (p£0.05).
El diseño experimental fue completamente al azar con tres For the quantification of the AzaA loss constant during
repeticiones para los cinco tratamientos evaluados: cuatro enzi- storage, the first order equation was used:
máticos (CPLMX, CEL, CCran y C100XL) y un tratamiento
sin enzima. Yi = Y0 (1-ekt)
Las diferencias estadísticas de los resultados de la cinética de
liberación de AzaA durante la maceración con hexano y la cons- where Yi is the concentration of AzaA in g L-1 extract; Y0 is the
tante de velocidad de pérdida (k) de AzaA en el almacenamiento initial concentration of AzaA, and k is the loss rate constant of
se analizaron por ANDEVA y pruebas de separación de medias AzaA in time (t).
de Tukey (p£0.05).
Para la cuantificación de la constante de pérdida de AzaA du- RESULTS AND DISCUSSION
rante el almacenamiento se utilizó la ecuación de primer orden:
The optimal conditions of each enzyme
Yi = Y0 (1-ekt) preparation were established based on the hydrolysis
of the cellulosic structures of the neem seed. For
donde Yi es la concentración de AzaA en g L-1 de extracto; Y0 es enzymatic hydrolysis, fresh neem seeds were used with
la concentración inicial de AzaA, y k es la constante de velocidad 24 h of storage at –20 °C, to reduce the factors that
de pérdida de AzaA en el tiempo (t). could condition the loss of acaricidal components
before the extraction process.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN The reaction was carried out for 18 h under
optimal conditions of each of the enzyme preparations
Las condiciones óptimas de cada preparado en- CPLMX (pH 4.5 and 45 °C), C100XL (pH 4.5 and
zimático se establecieron en función de la hidrólisis 50 °C) CCran (pH 5.0 and 50 °C), and CEL (pH
de las estructuras celulósicas de la semilla de neem. 4.5 and 50 °C), and subsequently hexane was added
Para la hidrólisis enzimática se usó semilla de neem in a 1:1 ratio (v:v). The samples were kept at room
fresca con 24 h de almacenamiento a –20 °C, para temperature (30 °C) during maceration.
disminuir los factores que pudieran condicionar la
pérdida de componentes acaricidas antes del proceso Kinetics of the effect of maceration
de extracción. with hexane on the AzaA release
La reacción se realizó por 18 h en las condiciones
óptimas de cada uno de los preparados enzimáticos The neem extract obtained with CPLMX showed
CPLMX (pH 4.5 y 45 °C), C100XL (pH 4.5 y 50 °C) the maximum concentration of AzaA (p£0.05)
CCran (pH 5.0 y 50 °C) y CEL (pH 4.5 y 50 °C), 2.67 g L-1 in the aqueous fraction at 24 h of
y posteriormente se adicionó hexano en proporción maceration with hexane (Figure 1). The amount of
1:1 (v:v). Las muestras se mantuvieron a temperatura AzaA extracted was higher than that reported in other
ambiente (30 °C) durante la maceración. studies in which simple extrusion and Soxhlet with
hexane were used as extraction methods, and was
Cinética del efecto de la maceración con similar to that obtained with methanolic extrusion,
hexano sobre la liberación de AzaA mechanical pressing and ultrasound (Esparza-Díaz et
al., 2010; González-Gómez et al., 2012; De Paula et
El extracto de neem obtenido con CPLMX pre- al., 2016).
sentó la concentración máxima de AzaA (p£0.05) No statistically significant differences (p>0.05)
2.67 g L-1 en la fracción acuosa a las 24 h de mace- were found in the concentration of AzaA obtained
ración con hexano (Figura 1). La cantidad de AzaA at 24 and 72 h of maceration with hexane,
extraída fue superior a la referida en otros estudios therefore 24 h is the ideal time to obtain the highest
en los que se utilizó extrusión simple y Soxhlet con concentration of AzaA.
hexano como métodos de extracción, y fue similar The release of AzaA in the extract with CEL
a la obtenida con extrusión metanólica, prensado showed a negative trend during the first 8 h of

AGUILAR-ACOSTA et al. 93
AGROCIENCIA, 1 de enero - 15 de febrero, 2020

3.5 maceration since the concentration of AzaA with

3.0 2.67
respect to the initial one decreased by 48%, while at
the end of the maceration there was a concentration
2.5 2.33
2.20 of AzaA not statistically different (p>0.05) from that
Aza A g L1

2.0
obtained at time 0 (Figure 2).
1.67 1.45
1.33
Esparza-Díaz et al. (2010) mentioned that
1.5 1.29 1.20 temperatures above 30 °C cause the loss of AzaA
1.0 during storage. According to Boursier et al. (2011),
AzaA is a thermolabile and photosensitive molecule
0.5
that can degrade over time. This phenomenon
0 could explain the decrease in the concentration of
0 4 6 8 12 24 48 72
Tiempo (h) AzaA during maceration with hexane at 30 °C, and
the variability in its concentration throughout the
Figura 1. Cinética del efecto de la maceración con hexano del kinetics.
extracto de neem obtenido con CPLMX sobre la li- The concentrations of AzaA during the maceration
beración de AzaA. of the neem extracts obtained with C100XL and
Figure 1. Kinetics of the effect of hexane maceration of the
CCran did not show significant differences for the
neem extract obtained with CPLMX on the release
of AzaA. times evaluated (Figure 3 and 4).
The concentration of AzaA was quantified in
the hexane fraction at 24 h of maceration by the
HPLC technique (Figure 5). The extracts obtained
mecánico y ultrasonido (Esparza-Díaz et al., 2010;
with CCran had the highest concentration of AzaA
González-Gómez et al., 2012; De Paula et al., 2016).
in the hexane fraction with 0.54 g L-1. These results
No se encontraron diferencias estadísticamente
indicate that the highest proportion of AzaA occurs
significativas (p>0.05) en la concentración de AzaA
in the aqueous fraction.
obtenida a las 24 y 72 h de maceración con hexano,
The AzaA concentrations obtained with the
por lo tanto 24 h es el tiempo ideal para obtener la
two fractions were 2.73, 1.82, 1.37, and 1.26 for
concentración mayor de AzaA.
CPLMX, C100XL, CCran, and CEL, respectively.
La liberación de AzaA en el extracto con CEL pre-
sentó una tendencia negativa durante las primeras 8
h de maceración, ya que disminuyó 48% la concen-
tración de AzaA respecto a la inicial, mientras que
al final de la maceración se tuvo una concentración 3.5
de AzaA sin diferencias (p>0.05) estadísticas con la 3.0
obtenida en el tiempo 0 (Figura 2). 2.5
Esparza-Díaz et al. (2010) mencionaron que las
Aza A g L1

1.61
temperaturas superiores a 30 °C provocan la pérdida 2.0
1.65
de AzaA durante el almacenamiento. Según Boursier 1.5 1.36
1.23 1.22
et al. (2011), la AzaA es una molécula termolábil y 1.02
1.0 0.85 0.85
fotosensible que puede degradarse en el tiempo. Este
fenómeno podría explicar la disminución en la con- 0.5
centración de AzaA durante la maceración con hexa-
0
no a 30 °C y la variabilidad en su concentración en 0 4 6 8 12 24 48 72
toda la cinética. Tiempo (h)
Las concentraciones de AzaA durante la macera-
ción de los extractos de neem obtenidos con C100XL Figura 2. Cinética del efecto de la maceración con hexano del
extracto de neem obtenido con CEL sobre la libera-
y CCran no presentaron diferencias significativas
ción de AzaA.
para los tiempos evaluados (Figuras 3 y 4). Figure 2. Kinetics of the effect of hexane maceration of the
La concentración de AzaA se cuantificó en la frac- neem extract obtained with CEL on the release of
ción hexánica a 24 h de maceración por la técnica AzaA.

94 VOLUMEN 54, NÚMERO 1

EXTRACCIÓN Y ESTABILIDAD DE LA AZADIRACTINA A EN EXTRACTOS DE NEEM (Azadirachta indica) OBTENIDOS CON ENZIMAS Y DISOLVENTES

3.5 3.5
3.0 3.0

2.5 1.77 2.5

1.93 2.19
Aza A g L1

Aza A g L1
1.75 1.91 1.57
2.0 1.73 1.71 2.0
1.5 1.5
0.69 0.83 0.68
1.0 1.0 0.74 0.69 0.44
0.58 0.59
0.5 0.5
0 0
0 4 6 8 12 24 48 72 0 4 6 8 12 24 48 72
Tiempo (h) Tiempo (h)

Figura 3. Cinética del efecto de la maceración con hexano del Figura 4. Cinética del efecto de la maceración con hexano del
extracto de neem obtenido con C-100XL sobre la extracto de neem obtenido con CCran sobre la libe-
liberación de AzaA. ración de AzaA.
Figure 3. Kinetics of the effect of hexane maceration of the Figure 4. Kinetics of the effect of hexane maceration of the
neem extract obtained with C-100XL on the release neem extract obtained with CCran on the release
of AzaA. of AzaA.

de HPLC (Figura 5). Los extractos obtenidos con The control treatment without enzymes was
CCran presentaron la mayor concentración de AzaA evaluated after 24 h of maceration with hexane and
en la fracción hexánica con 0.54 g L-1. Estos resulta- the concentration of AzaA was 0.18 and 0.06 g L-1 in
dos indican que la mayor proporción de AzaA se pre- the aqueous and hexane fraction, respectively. This
senta en la fracción acuosa. Las concentraciones de confirms that the use of the enzyme preparations of
AzaA obtenidas con las dos fracciones fueron 2.73, this study increased the extraction of AzaA from the
1.82, 1.37 y 1.26 para CPLMX, C100XL, CCran, y neem seed compared to the enzyme-free treatment.
CEL, respectivamente. The combination of pectinases, cellulases,
El tratamiento testigo sin enzimas se evaluó des- hemicellulases and arabinases activities present in
pués de 24 h de maceración con hexano y la con- the CPLMX enzyme preparation promoted a greater
centración de AzaA fue de 0.18 y 0.06 g L-1 en la release of AzaA and increased its concentration in the
fracción acuosa y hexánica, respectivamente. Esto extract.
confirma que el uso de los preparados enzimáticos de
este estudio aumentó la extracción de AzaA a partir
de la semilla del neem en comparación con el trata-
miento sin enzimas. 1.0
La combinación de actividades de pectinasas,
celulasas, hemicelulasas y arabinasas presentes en el 0.8
preparado enzimático CPLMX promovió una libera- 0.54
Aza A g L1

ción mayor de la AzaA, y aumentó su concentración 0.6

en el extracto.
0.4
Estabilidad de la AzaA en almacenamiento
0.2
0.06 0.06 0.05 0.05
Para determinar el efecto de la temperatura de al-
0
macenamiento sobre la degradación de AzaA se ela- Control CPLMX C100XL CCran CEL
boraron ocho extractos de neem, dos para cada enzi-
ma, sin maceración con hexano. La concentración de Figura 5. Concentración de AzaA en la fracción hexánica.
AzaA no se detectó después de 7 d de almacenamiento Figure 5. Concentration of AzaA in the hexane fraction.

AGUILAR-ACOSTA et al. 95
AGROCIENCIA, 1 de enero - 15 de febrero, 2020

a 50 °C en los extractos elaborados con CPLMX, Stability of the AzaA in storage

C100XL y CEL. El extracto con CCran mantuvo
2.28% de la concentración de AzaA. En ninguno de In order to determine the effect of storage
los extractos se pudo identificar la AzaA a partir del temperature on the degradation of AzaA, eight neem
día 14 de almacenamiento (Figura 6). extracts were made, two for each enzyme, without
Para establecer las diferencias en la pérdida de maceration with hexane. The concentration of AzaA
AzaA en el almacenamiento se usó la fórmula em- was not detected after 7 d of storage at 50 °C in
pírica de primer orden (Ecuación 1) para calcular la extracts made with CPLMX, C100XL, and CEL.
constante de velocidad de pérdida de AzaA (k). No CCran extract kept 2.28% AzaA concentration.
hubo diferencias significativas en k para los extractos None of the extracts presented AzaA from day 14 of
elaborados con CPLMX, C100XL, CCran, y CEL storage (Figure 6).
almacenados a 50 °C, cuyos valores fueron 1.299 (± In order to establish the differences in the loss of
0.556), 1.593 (± 1.349), 0.922 (± 0.017) y 1.555 (± AzaA in storage, we used the first-order empirical
0.086) g AzaA L-1 d-1, respectivamente. formula (Equation 1) to calculate the AzaA loss rate
Los extractos de neem elaborados con CEL y constant (k). There were no significant differences in
C100XL almacenados a 30 °C mantuvieron el 18 y k for extracts made with CPLMX, C100XL, CCran,
22% de la concentración inicial de AzaA después de and CEL stored at 50 °C, whose values were 1.299 (±
21 d de almacenamiento, pero no se pudo detectar 0.556), 1.593 (± 1.349), 0.922 (± 0.017), and 1.555
este triterpenoide a partir al día 28 de almacena- (± 0.086) g AzaA L-1 d-1, respectively.
miento. Los valores de k de los extractos con CEL y Neem extracts made with CEL and C100XL
C100XL fueron 0.071 (± 0.004) y 0.049 (± 0.011) g stored at 30 °C maintained 18 and 22% of the initial
AzaA L-1 día-1, los cuales fueron significativamente concentration of AzaA after 21 d of storage, but this
diferentes (p£0.05) a los extractos elaborados con triterpenoid could not be detected from day 28 of
CPLMX y CCran, con 0.248 (± 0.076) y 0.210 (± storage. The k values of the extracts with CEL and
0.007) g AzaA L-1 día-1. C100XL were 0.071 (± 0.004) and 0.049 (± 0.011)
No se detectaron diferencias significativas en la g AzaA L-1 day-1, which were significantly different
concentración residual de AzaA (p<0.05) para los (p£0.05) to the extracts made with CPLMX and

100
Crystalzyme PML-MX
90
Crystalzyme 100XL
80 Crystalzyme Cran
Cellulase 17600L
k (Aza A g L1 día1)

70 Crystalzyme PML-MX ajustada

60 Crystalzyme 100XL ajustada
Crystalzyme Cran ajustada
50 Cellulase 17600L ajustada
40
30
20
10
0
0 7 14 21 28
Tiempo (días)

Figura 6. Cinética de pérdida de AzaA en extractos de neem almacenados a 50 °C.

Figure 6. Kinetics of AzaA loss in neem extracts stored at 50 °C.

96 VOLUMEN 54, NÚMERO 1

EXTRACCIÓN Y ESTABILIDAD DE LA AZADIRACTINA A EN EXTRACTOS DE NEEM (Azadirachta indica) OBTENIDOS CON ENZIMAS Y DISOLVENTES

100
CPLMX
90 C100XL
80 CCran
CEL
k (Aza A g L1 día1)

70 CPLMX ajustada
C100XL ajustada
60
CCran ajustada
50 CEL ajustada

40
30
20
10
0
0 7 14 21 28
Tiempo (días)

Figura 7. Cinética de pérdida de AzaA en extractos de neem almacenados a 30 °C.

Figure 7. Kinetics of AzaA loss in neem extracts stored at 30 °C.

cuatro extractos almacenados a 5 °C, a pesar de que CCran, 0.248 (± 0.076) and 0.210 (± 0.007) g AzaA
los valores de k disminuyeron en los extractos enzi- L-1 day-1.
máticos: 0.089 (± 0.021), 0.072 (± 0.016), 0.091 (± No significant differences were detected in the
0.006) y 0.047 (± 0.002) g AzaA L-1 d-1 para los residual concentration of AzaA (p<0.05) for the
extractos obtenidos con CPLMX, C100XL, CCran y four extracts stored at 5 °C, although the values of
CEL, respectivamente. k decreased in the enzyme extracts: 0.089 (± 0.021),
El almacenamiento a 5 °C fue el más adecuado 0.072 (± 0.016 ), 0.091 (± 0.006), and 0.047 (±
en nuestro estudio (Figura 8). Gahukar (2014) men- 0.002) g AzaA L-1 d-1 for extracts obtained with
cionó que el rendimiento en la obtención del aceite CPLMX, C100XL, CCran, and CEL, respectively.
de neem y su efectividad acaricida disminuyen en Storage at 5 °C was the most appropriate in our
función de las condiciones de almacenamiento de study (Figure 8). Gahukar (2014) mentioned that
la semilla por influencia de tiempo, humedad rela- the yield in obtaining neem oil and its acaricidal
tiva y temperatura de almacenamiento. Tofel et al. effectiveness decreased depending on the storage
(2016) señalaron que existe una tendencia marcada conditions of the seed due to the influence of time,
de la AzaA a degradarse con el tiempo al aplicarla en relative humidity and storage temperature. Tofel et al.
granos de maíz, ya que la efectividad insecticida del (2016) pointed out that there is a marked tendency
aceite de neem disminuye en el tiempo de manera of AzaA to degrade over time when applied to corn
similar a la degradación de AzaA. kernels since the insecticidal effectiveness of neem
Nuestro estudio confirma que el aumento de la oil decreases over time similar to the degradation of
temperatura de almacenamiento favorece la pérdida AzaA.
o degradación de AzaA en los extractos. Esta infor- Our study confirms that the increase in storage
mación coincide con lo mencionado por Esparza- temperature favors the loss or degradation of AzaA
Díaz et al. (2010), que temperaturas superiores a 30 in the extracts. This information coincides with what
°C promueven la degradación de AzaA, y por lo tanto Esparza-Díaz et al. (2010) said about temperatures
la disminución de su actividad insecticida. above 30 °C: they promote the degradation of AzaA,
Los resultados de estabilidad de AzaA podrían in- and therefore the decrease of its insecticidal activity.
dicar un posible efecto sinérgico entre la temperatura The AzaA stability results could indicate a
de 45 °C empleada en la hidrólisis de la semilla con possible synergistic effect between the temperature

AGUILAR-ACOSTA et al. 97
AGROCIENCIA, 1 de enero - 15 de febrero, 2020

100
CPLMX
90 C100XL
80 CCran
CEL
k (Aza A g L1 día1)

70 CPLMX ajustada
C100XL ajustada
60
CCran ajustada
50 CEL ajustada

40
30
20
10
0
0 7 14 21 28
Tiempo (días)

Figura 8. Cinética de pérdida de AzaA en extractos de neem almacenados a 5 °C.

Figure 8. Kinetics of AzaA loss in neem extracts stored at 5 °C.

CPLMX y su actividad enzimática, para que se obtu- of 45 °C used in the hydrolysis of the seed with
viera la mayor concentración de AzaA, a diferencia de CPLMX and its enzymatic activity to obtain the
las actividades enzimáticas y los 50 °C empleados con highest concentration of AzaA, unlike the enzymatic
C100XL, CCran y CEL. activities and 50 °C used with C100XL, CCran, and
El extracto enzimático elaborado con CEL man- CEL.
tuvo el porcentaje mayor de AzaA en el almacena- The enzyme extract made with CEL maintained
miento a 5 °C con 77.12, 63.04, 40.58 y 13.19% de the highest percentage of AzaA in storage at 5 °C
la concentración inicial, al día 7, 14, 21 y 28, respec- with 77.12, 63.04, 40.58, and 13.19% of the initial
tivamente. Esta temperatura resultó más adecuada concentration, at day 7, 14, 21 and 28, respectively.
para el almacenamiento de los extractos enzimáticos This temperature was more suitable for the storage of
de neem, bajo las condiciones ensayadas. the neem enzymatic extracts, under the conditions
La quiralidad y los enlaces de hidrógenos internos tested.
de la molécula de AzaA le confieren sensibilidad a la The chirality and internal hydrogen bonds of
luz y temperatura, así como estabilidad en condicio- the AzaA molecule make it sensitive to light and
nes ligeramente ácidas en comparación con las alcali- temperature, as well as stable under slightly acidic
nas (Fernandes et al., 2019). Ello puede significar que conditions compared to alkaline ones (Fernandes et
la pérdida de AzaA en el almacenamiento se debió a al., 2019). This could mean that the loss of AzaA in
un efecto combinado del pH de los extractos con la storage was due to a combined effect of the pH of the
temperatura de almacenamiento. extracts with the storage temperature.
El uso de hexano en la maceración de los ex- The use of hexane in the maceration of neem
tractos enzimáticos de neem aumentó la extracción enzymatic extracts increased the extraction of AzaA ~
de AzaA ~ 3 %. El rendimiento bajo de AzaA en la 3%. The low yield of AzaA in the oil fraction and its
fracción oleosa y la proporción mayor (~ 97 %) de greater proportion (~ 97%) in the aqueous fraction
AzaA presente en la fracción acuosa, permite concluir allow us to conclude that maceration with hexane was
que la maceración con hexano no proporcionó una no advantage to justify its use in the preparation of
ventaja que justifique su uso en la elaboración de ex- neem extracts. Although hexane is an organic solvent
tractos de neem. Aunque el hexano es un disolvente widely used in the extraction of edible oils, current
orgánico utilizado ampliamente en la extracción de trends are aimed at the development of organic

98 VOLUMEN 54, NÚMERO 1

EXTRACCIÓN Y ESTABILIDAD DE LA AZADIRACTINA A EN EXTRACTOS DE NEEM (Azadirachta indica) OBTENIDOS CON ENZIMAS Y DISOLVENTES

aceites comestibles, las tendencias actuales se dirigen agriculture and avoid the use of chemical fertilizers
al desarrollo de la agricultura orgánica y a evitar el uso and pesticides (FAO, 2018).
de fertilizantes y plaguicidas químicos (FAO, 2018).
CONCLUSIONS
CONCLUSIONES
Extraction with enzymes and hexane allowed
La extracción con enzimas y hexano permitió ob- to obtain neem extracts with concentrations of
tener extractos de neem con concentraciones de Aza- Azadirachtin A (AzaA) similar to those reported
ridactina A (AzaA) similares a las documentadas por by other authors by using ultrasound, mechanical
otros autores al usar ultrasonido, prensado mecánico pressing and methanolic extrusion.
y extrusión metanólica. The degradation rate of AzaA triterpene increased
La velocidad de degradación del triterpeno AzaA with the increase in the storage temperature of neem
aumentó con el incremento de la temperatura de al- extracts. The cooling temperature maintained the
macenamiento de los extractos de neem. La tempe- highest proportion of Azadirachtin A during 28 d of
ratura de refrigeración mantuvo la proporción mayor storage.
de Azaridactina A durante 28 d de almacenamiento.
—End of the English version—
AGRADECIMIENTOS
pppvPPP
A la Dirección General de Educación Superior Universitaria
(DGESU/SEP) con el proyecto PRODEP con numero de oficio
DSA/103.5/14/7147, por el financiamiento de la investigación.
sobre agricultura orgánica. http://www.fao.org/organicag/
oa-faq/es/ (Consulta: septiembre 2018).
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AGUILAR-ACOSTA et al. 99
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