PRACTICA N°1

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE COAGULACIÓN

Instrucciones generales en la realización de las pruebas de coagulación

1. Personal entrenado
Se debe seleccionar entre el personal de laboratorio, a una persona para que se encargue de
realizar las pruebas de coagulación o mejor aún, a un equipo, dependiendo del tipo de
laboratorio, el cual debe tener un entrenamiento especial.

2. Equipos
a. Baño de María. Los baños de maría deben estar provistos de termostatos que mantengan una
temperatura de 37 °C ±0,5. Deben ser controlados cuidadosamente: vigilar la temperatura
antes de comenzar a realiza las pruebas, ya que las variaciones afectan notablemente los
resultados. Vigilar también el nivel del agua, el cual debe llegar casi al borde del baño. El agua
debe ser destilada para que esté libre de sales calcáreas.
b. Centrífugas.
c. Neveras. Ciertos plasmas y reactivos necesitan ser guardados en nevera a temperaturas de
4°C.
d. Congelador. Sirve para el almacenamiento prolongado de plasmas. Algunos plasmas requieren
de temperaturas de -20°C para su conservación. Algunos factores como F VIII requieren por lo
menos de -70 °C.
e. Fuente de luz. Una fuente de luz es indispensable para una buena observación en la formación
de los coágulos; pero no debe proporcionar temperaturas altas, por lo que se utiliza un lámpara
de luz de Neón, que es luz fría.
f. Cronómetros. La mayoría de las pruebas de coagulación se basan en medir el tiempo que
tarda en formarse un coágulo de fibrina in vitro; a veces este tiempo es muy corto, sólo en
segundos, por lo que es necesario disponer de cronómetros.

3. Material
a. Agujas. Solo se deben utilizar agujas descartables, n° 20 y de 1 pulgada de longitud; agujas
de menor diámetro pueden producir la hemolisis de los glóbulos rojos y por ende,
contaminación de la muestra con sustancias tromboplásticas. Agujas más largas de 1
pulgada, proporcionan mayor superficie de activación.
b. Inyectadoras. Se recomienda el uso de inyectadoras plásticas descartables. No se
recomienda el uso da vacutainer ya que la sangre entra con mucha presión, lo que puede
causar, por una parte hemólisis de los glóbulos rojos y liberación de sustancias con activación
troboplástica y por otro lado, la activación de los factores de contacto.
c. Tubos. Para la recolección de la sangre se deben utilizar tubos plásticos descartables,
preferiblemente provistos de tapa; estos mismos se utilizan para conservar los plasmas.Para
medir el tiempo de coagulación, se utilizan tubos 10 75 mm. Es indispensable que el
diámetro sea uniforme, a fin de obtener resultados reproducibles. Otros tubos para colocar
reactivos tales como cloruro de calcio, tromboplastina, cefalina, pueden ser de vidrio, bien
sea de 12 75 mm o de 100 13mm, pero destinados sólo a pruebas de coagulación.
d. Pipetas. En la mayoría de las pruebas se emplean las llamadas pipetas automáticas con las
ventajas adicionales de que sus puntas son plásticas (no contactables) y descartables.
e. Bandejas con hielo. Como las muestras de plasmas y otros reactivos, hay que mantenerlos en
baño de hielo durante la realización de la prueba, se necesita disponer de bandejas con
 capacidad suficiente para introducir en ellas las gradillas que van a sostener los tubos con los
reactivos.

Cuidado y lavado del material de vidrio

El lavado se hace con agua y detergentes proteolíticos especiales como el 7x, Alconox, Buell-
Cleaner. El enjuague final se practica con agua corriente, varias veces hasta que se elimine todo
resto de detergente; el enjuague final se realiza con agua destilada.
En cuanto el tratamiento del material de vidrio con mezcla sulfocrómica, se debe pasar por ella con
cierta frecuencia e incluso; dejarlo sumergido durante toda la noche; luego lavarlo muy bien con agua
de chorro y agua destilada. Se ha comprobado que el material tratado con solución sulfocrómica,
inactiva la cefalina.

4. Reactivos
Los reactivos deben ser de preparación reciente y de buena procedencia. La mayoría de los
reactivos se conservan en nevera a 4ºc, algunos requieren congelación a -20 °C o -70 °C. Para
evitar descongelaciones repetidas es aconsejable repartirlos en pequeñas alícuotas y después de
utilizarlas, descartar el resto; esto evita la contaminación y pérdida de actividad. Si aparece
turbidez o precipitados, deben descartarse.

a. Soluciones anticoagulantes. Los anticoagulantes empleados en la mayoría de las pruebas de

coagulación se fundamentan en la precipitación de los iones calcio. Los más empleados son
los de Citrato de sodio 3,8% y Oxalato de sodio 0,1 M.
 Citrato de sodio 3,8%. Preserva mejor los factores de la coagulación, tales como el FV y el FBI
y, además, la neutralización del calcio es más rápida. Se emplea en proporción de 1 volumen
de anticoagulante por 9 de sangre. La solución se conserva a 4 °C; descartarla si hay
presencia de hongos; bacterias o precipitados.
 Oxalato de sodio 0,1 M. preserva menos los factores lábiles de la coagulación. Se emplea
cuando se va a obtener plasma envejecido. (plasma desprovisto de FV) cuando se va adsorber
plasma Sulfato de Bario. Se utiliza en proporción de 1 volumen de anticoagulante por 9
volúmenes de sangre.
 EDTA. Se utiliza en la proporción de 1 mg de sal por cada ml de sangre (1 mg/ml). Se emplea
para tomar muestra para el contaje directo de plaquetas. No puede utilizarse en casi ninguna
prueba de coagulación; ya que el EDTA es un quelante del calcio y algunos factores de
coagulación pierden su actividad cuando el calcio no está presente. Impide la agregación
plaquetaria y tampoco sirve para evaluar el tamaño de las plaquetas, pues aumenta su
tamaño.
 Oxalato de Amonio 1%. Se utiliza como liquido de dilución para el contaje de las plaquetas por
método directo. Además de ser un anticoagulante, hemoliza los glóbulos rojos, lo que facilita
el contaje de las plaquetas.
 Cloruro de calcio. Se utiliza en concentración 0,025 M y se obtiene a partir de la solución de
CaCl2 1M.

b. Tromboplastinas. Las tromboplastinas son extractos tisulares salinos. La extracción se hace

con solución salina y se obtiene actividad coagulante completa. Se obtiene, placenta, pulmón;
de diferentes especies: hombre, conejo, caballo y por técnicas variadas.
La tromboplastina parcial (cefalina) también son extractos tisulares pero a diferencia de las
tromboplastinas, la extracción se hace con cloroformo; de este modo se obtiene solo la
fracción lipídica del principio activo coagulante. Se utiliza como sustituto de los fosfolipídos
plaquetarios. Pueden venir combinadas con sustancias activadoras por contacto (caolín, celite
y ácido elágico) y se llaman tromboplastinas parciales activadas.
 c. Plasmas
 Normal
 Plasma absorbido. Plasma desprovisto de algunos factores de la coagulación, debido a la
absorción con sales. Las mas utilizadas son el sulfato de bario y el hidróxido de aluminio, que
absorben los factores vitamina K dependientes: F II, F VII, F IX Y FX.
 Plasma envejecido. Carece del factor V.

d. Sueros
 Normal
 Suero absorbido. Es un suero desprovisto de los factores K dependientes, mediante la
absorción con sulfato de bario o con hidróxido de aluminio. Contiene los factores XI y XII.
 Suero envejecido. Contiene los factores XII, XI, X, IX y VII.

e. Plasma pobre en plaquetas. 3500 rpm/ 10 minutos.

f. Plasma rico en plaquetas. 800-900 rpm/ 10 minuto

5. Metodología
a. Extracción sanguínea
Se recomienda inyectadoras plásticas descartables y las agujas n 20 descartables. La
sangre debe extraerse con un mínimo de estasis venoso, por lo tanto el torniquete se debe
utilizar en menor tiempo posible. La punción debe ser limpia, es decir sin hacer movimientos
de exploración. Al verter la sangre en el tubo con anticoagulante hay que mezclar muy bien y
rápidamente. Debe centrifugarse inmediatamente a 3500 rpm durante 10 minutos. Separar el
plasma y trasvasarlo a envases plásticos y conservar a 4 C.
Las pruebas de coagulación deben realizarse dentro de las 3 horas de extraída la
muestra si el anticoagulante empleado es citrato de sodio y dentro de 90 minutos en caso de
oxalato de sodio.

b. Uso de controles y de la mezcla control paciente.

Ninguna prueba de coagulación debe realizarse sin el uso de controles. Estas mesclas
(pool) de por lo menos 3 plasmas normales, procedentes de sangre extraída al mismo tiempo
y tratadas en idénticas condiciones a la del paciente. También pueden emplearse controles
comerciales.
En casos especiales, los controles deben ser una mezcla de plasmas de 6 personas
normales.
Al realizar las pruebas de coagulación es indispensable introducir una mezcla de
plasma control + plasma paciente (CP) preparada volumen a volumen. Esta mezcla permite
diferenciar si el tiempo de coagulación alargado de una prueba obedece a deficiencia de algún
factor o la presencia de inhibidores.

c. Duplicados
Tanto las muestras del control, como las del paciente y las mesclas C/P deben ser
realizadas por duplicados y el promedio de estos duplicados es utilizado para deducir los cálculos.
Tiempo de coagulación Diferencia aceptada entre duplicados
< 20 s 1s
20- 60 s 2s
60- 100 s 3s
> 100 s 5s
d. Orden balanceado
Las muestras: control, paciente y mezcla C/P deben ser procesadas por duplicado y en
orden balanceado. Esto quiere decir que no debe trabajarse con las dos muestras control y
luego las dos del paciente; si no que ambas deben ser procesadas conjuntamente durante la
realización de las pruebas.
Al realizar las pruebas en orden balanceado se evitan errores subjetivos en la
apreciación de la formación de los coágulos, cuando se realizan por duplicados.

e. Movimiento del tubo

Se refiere al modo y frecuencia con que debe moverse el tubo donde se formará el
coágulo. El movimiento adecuado debe describir un ángulo de 90 y se repite con una
frecuencia no mayor de una vez por segundo.

f. Punto final de la prueba.

Hay que establecer que se toma como punto final de la prueba: Si la aparición de las
primeras mallas de fibrina o la formación de un coágulo sólido, pues el intervalo entre uno y
otro puede extenderse a varios segundos. El criterio que adopte tiene que mantenerse tanto
en el control como en paciente y en la mezcla control/paciente.

Pruebas de detención de trastornos de la hemostasia. Pruebas de selección.

Las pruebas de coagulación pueden ser pruebas generales, las que constituyen la gran
mayoría; estas pruebas involucran la participación de varios factores. Ejemplo: El tiempo de
tromboplastina parcial (TTP), que evalúa los factores del sistema intrínseco de la coagulación.

Otras pruebas son semiespecíficas, como es el caso del tiempo de trombina, que evalúa solo
una determinada etapa de la coagulación: la transformación del fibrinógeno en fibrina.
PRUEBAS GENERALES EN ESTUDIO DE COAGULACION
Prueba Modo de Valores Alteración
reportar normales
min (método) 3-7 min (método  Defectos plaquetarios:
Mielke) Cuantitativos y cualitativos.
Tiempo de sangría  Enfermedad de von
Willebrand.
 Afibrinogenemia.
 Heparina.
 Presencia de PDF.

170- 440 109/ l  Trombocitopenias

Contaje de n 9
10 / l  Trombocitosis
plaquetas (Brecher-
(método) Cronkite)

 Deficiencia de FI:
Afibrinogenemia,
Hipofibrinogenemia,
Disfibrinogenemia
 Tiempo de C (seg)  FVIII: Hemofilia A,
Tromboplastina P (seg) Diferencia P-C: Enfermedad de von
Parcial activada P-C (seg) hasta ± 6 seg Willebrand.
(TTPa) VN diferencia  FIX: Hemofilia b.
 FII, V, X, XI, XII;
Inhibidores del sistema
intrínseco.
Tiempo de  Deficiencia de F II, V, VI, X.
Protrombina (TP) C(seg)  Deficiencia de FI:
P(seg) Afibrinogenemia,
R: 0,8-1,2 Hipofibrinogenemia,
Disfibrinogenemia
 Anticoagulantes del
sistema extrínseco

VN Razón
Tiempo de C (seg) Diferencia P-C:  Afibrinogenemia
Trombina P (seg) hasta ± 2seg  Hipofibrinogenemia.
P-C (seg)  Disfibrinogenemia.
VN diferencia  Heparina.
 Presencia de PDF
Determinación del Normal o Normal:
F XIII anormal Persistencia del  Deficiencia del F XII
coagulo a 24
horas.

PRACTICA N°2

TIEMPO DE SANGRIA

El tiempo de sangría mide el tiempo que tarda en detenerse el sangramiento de una

pequeña herida realizada en la piel, bajo condiciones estandarizadas. Es la expresión misma
de la hemostasia primaria, ya que el sangramiento de detiene porque las plaquetas se
adhieren en la membrana basal y al colágeno que han quedado expuestos por la herida, luego
sufren agregación lo que da como resultado la formación del tapón hemostático. El tiempo es
influenciado también por la calidad de los pequeños vasos y por un factor plasmático el factor
VIII: vW, así como también por el fibrinógeno.
Se han descrito varios métodos y la selección de la técnica varia en los diferentes
laboratorios. Los métodos más confiables son, por supuesto, lo mas cuidadosamente
estandarizados y controlados. Como las técnicas utilizadas son diferente, es difícil interpretar
los datos obtenidos entre varios laboratorios y los valores normales oscilan un amplio rango;
por ello debe reportarse el método empleado y los valores normales.
Varios métodos han sido utilizados para valorar el tiempo de sangría, entre estos:
método de Duke, método de Luy, método de Mielke (basal) y más recientemente el Mielke
modificado o Simplate II.

Método Mielke modificado o Simplate II.

 El Simplate II es un aparato en forma de cajita, la parte inferior es convexa y en la
superior tiene un dispositivo conectado a un resorte para disparar dos hojillas de 5 mm de
longitud.
Para realizar el tiempo de sangría, el aparato se presiona firmemente contra la piel,
previamente desinfectada: su borde convexo permite ejercer presión sin causar molestia.
Luego se dispara el dispositivo de la parte superior que liberará de modo automático y
simultaneo las dos hojillas, obteniéndose dos incisiones idénticas 5 mm de longitud 1 mm
de profundidad. Los valores del tiempo de sangría son de 2 a 9 minutos con una media de 5,5
minutos.
Este dispositivo ofrece varias ventajas:
1. Es descartable, lo que previene de infecciones.
2. Proporciona dos heridas simultáneamente; esto simplifica el procedimiento y disminuye el
tiempo de la prueba.
3. Es menos doloroso y menos traumático; esto lo hace más recomendable para los niños, ya
que las hojillas vienen escondidas.
4. Requiere poca experiencia.
5. Las hojillas salen automáticamente.

Los resultados de un tiempo de sangría dependen de una gran cantidad de variables que en
algunos casos pueden no revelar el verdadero diagnóstico de una enfermedad hemorrágica. Estos
son:
1. El grosor y vascularidad de la piel.
2. La temperatura.
3. La longitud y profundidad de la incisión.
4. La determinación del punto final del sangramiento.
5. La diferencia entre incisiones.
6. El hematocrito del paciente.

Tiempos más cortos que los reales, pueden obedecer a:

a. Pinchazo poco profundo, lo cual se evita con las técnicas estandarizadas.
b. Masajes fuertes en la zona donde se efectuara la prueba, pues pueden romperse tejidos y
glóbulos rojos, liberándose tromboplastina tisular y ADP, que influyen en la agregación
plaquetaria.
c. Bajas temperaturas que producen vasoconstricción.

Otras veces, los errores pueden conducir a tiempos falsamente largos:

a. Cortar vasitos de mayor calibre.
b. Separar el coágulo que se va formando, al tocar los bordes de la herida con el papel filtro.

PRACTICA N°3

CONTAJE DE PLAQUETAS

En la vida post-fetal, la mayor parte de las plaquetas son producidas en la médula ósea o a
partir de los megacariocitos maduros. Esto involucra procesos de endocitosis, invaginación de la
membrana plasmática del megacariocito, la eventual fusión de membranas citoplasmáticas y la
producción de 2 000 a 3 000 plaquetas del citoplasma de cada megacariocito, las cuales son
liberadas por un mecanismo casi explosivo. La vida media plaquetaria oscila entre 9 a 12 días.

En sangre periférica las plaquetas son heterogéneas con respecto a su tamaño, densidad y
características tintoriales.
 En frotis de sangre periférica coloreadas con coloración Romanowsky las plaquetas, que
tienen forma discoide, aparecen redondas, ovales o en forma de bastones. Se han descrito dos
porciones: una central, constituida por una serie de gránulos azurófilos que están concentrados en
esa zona dando el aspecto de un núcleo (cromómero) y una porción periférica que se observa
hialina, ligeramente azul (hialómero). Cuando la observación se hace en azul brillante de cresil, en
las que hay una fijación instantánea, no se observa esa división clara entre esas dos zonas.

Las plaquetas maduras miden de 2 a 4 µm de diámetro, tienen un volumen promedio de 8 µm 3

y un espesor de aproximadamente de 1 µm.
La ultraestructura de las plaquetas está en estrecha relación con su fisiología. Al microscopio
electrónico se le observa: la zona periférica integrada por una capa exterior (CE) o glicocálix y una
membrana; los sistemas membranosos internos (sistema canalicular abierto (SCA) y sistema tubular
denso (STD)); el citoesqueleto y unidades contráctiles (microtúbulos (Mts) y microfilamentos (Mfs));
organelos (cuerpos densos, gránulos α, lisosomas, peroxisomas y mitocondrias).

Las plaquetas tienen un papel muy importante en la hemostasia entre la cuales están:
formación del trombo plaquetario, contribuyen al mantenimiento de la integridad de la pared vascular,
intervienen en la coagulación principalmente por la disponibilidad del FP-3, actúan en la retracción
del coágulo. Además de su papel en la hemostasia, las plaquetas participan en mecanismos de
defensa, incluyendo respuestas inflamatorias e inmunológicas, y mediante la remoción de partículas
tales como bacterias y además sirven de transporte.

Gran número de técnicas han sido propuestas para realizar el contaje de plaquetas, todas son
pocas satisfactorias ya que debido a su pequeñez, fragilidad, a la tendencia que tienen de adherirse
entre sí a las superficies y a la facilidad que tienen de ser confundida con restos eritrocitos, con
leucocitos desintegrados o con partículas extrañas, hacen que los resultados sean muy disímiles con
las diversas técnicas. Sin embargo hoy en día se disponen de automatizadores que realizan contajes
con exactitud y precisión.

Método utilizado como líquido de dilución: Oxalato de Amonio al 1 %.

PRINCIPIO:
Al mezclar la sangre con un diluyente apropiado (oxalato de amonio al 1 %) se produce lisis
de los glóbulos rojos, lo que permite contar las plaquetas con un microscopio (preferentemente
contraste de fase) y su concentración se obtiene sobre la base del volumen utilizado y la dilución
empleada.
MUESTRA: Sangre venosa con EDTA, o sangre obtenida por punción periférica.
MATERIALES:
 Cámara de Neubauer
 Pipeta de Thoma ( para contaje de GR)
 Agitador mecánico
 Microscopio

REACTIVO:
Solución de oxalato de amonio al 1 %
Oxalato de amonio……………..1 %
Agua destilada…………………..100 ml
Nota: Almacenar refrigerada, filtrar antes de usar.
PROCEDIMIENTO:
1. Aspire sangre con una pipeta para glóbulos rojos hasta la marca 1.
2. Aspire líquido de dilución con el fin de obtener una dilución 1:100.
3. Agitar la pipeta, preferiblemente en agitador mecánico, durante 3 minutos aproximadamente.
4. Descarte las primeras 4 gotas de cada pipeta.
5. Rápidamente llene los retículos de la cámara con la pipeta.
6. Deje sedimentar las plaquetas durante 15 minutos, colocando el hematímetro en cámara
húmeda (placa de petri con papel de filtro humedecido) para evitar la evaporación del líquido.
7. Observar al microscopio con el objetivo de 40X.

Las plaquetas se cuentan en todo el cuadrado central de cada retículo. Estas aparecen como
partículas altamente refráctiles.
CÁLCULOS:
Contaje de plaquetas= Nº de plaquetas contadas x FT

FT= FD x FV
100 = 100
FD =
1
FV= 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm= 0,004 mm3;
pero contamos en 50 cuadrados, el volumen es:
0,004 mm3 x 50= 0,2 mm3
Este volumen se corrige a 1 mm3 dividiendo 1 entre el volumen del cuadrado central:
1/ 0,2 mm3= 5 FV= 5 mm3
FT= 100 x 5 mm3= 500 mm3
MÉTODO DE BRECHER-CRONKITE UTILIZANDO UNOPETTE:
EL Unopette es un dispositivo, fabricado por los laboratorios BectonDikinson, de material
plástico no contactable, que consta de:
 Un capilar calibrado y diseñado de modo de tomar automáticamente la cantidad necesaria de
sangre, viene protegido por una cápsula.
 Un reservorio que contiene el líquido de dilución que es una solución estéril de oxalato de
amonio al 1%.
VENTAJAS DEL UNOPETTE:
 El material es plástico no contactable, evitando así que las plaquetas se adhieran a superficies
activantes. Además, es descartable.
 La pipeta se enrasa automáticamente y esto evita errores de cálculos.
  La solución de oxalato de amonio es estéril, lo que suprime uno de los más grandes errores
en el contaje de plaquetas debido a la contaminación de los líquidos, y que trae como
consecuencia confusión de las partículas con bacteria, hongos, etc.

PROCEDIMIENTO:
 Perforar bien el diafragma del reservorio, utilizando la cápsula protectora del capilar.

 Tomar la muestra de sangre con la pipeta capilar la cual se llenará automáticamente. Limpiar
el exceso exterior teniendo cuidado de no tocar la sangre ya enrasada. Tapar la parte superior
de la pipeta con el dedo índice.

 Presionar suavemente el reservorio, teniendo cuidado de no botar el líquido e introducir la

pipeta con la sangre, manteniéndola tapada con el índice. Este paso debe hacerse con
cuidado a fin de evitar la pérdida de sangre.

 Liberar la presión del reservorio y quitar el dedo de la abertura superior de la pipeta, la sangre
será absorbida por el líquido del recipiente.

 Apretar suavemente el reservorio de 2 a 3 veces a fin de enjuagar la pipeta, teniendo cuidado

de que el líquido no salga fuera del envase.
 Manteniendo el dedo índice sobre la abertura superior de la pipeta, invertir el reservorio con
cuidado varias veces.

 Dejar en reposo por 10 minutos para que se hemolicen los glóbulos rojos.

 Mezclar nuevamente por inversión. Colocar la pipeta capilar hacia fuera, en forma de gotero.

 Invertir el reservorio y oprimiéndolo suavemente descartar 3 ó 4 gotas, a fin de enjuagar el

capilar.

 Cargar la cámara de Neubauer en ambos retículos y dejar en cámara húmeda durante 10 a 15

minutos para que las células sedimenten.

 Con el objetivo de 40X enfoque el cuadrado central de cada retículo y proceda a contar las
plaquetas contenidas en los 4 cuadrados de las esquinas y en el cuadrado central.

CÁLCULOS:
Contaje de plaquetas= Nº de plaquetas contadas x FT
FT= FD x FV

1, 98
FD = = 100
0, 02
FV= 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm= 0,004 mm3;
pero contamos en 5 cuadrados, el volumen es:
0,004 mm3 x 10= 0,04 mm3
Este volumen se corrige a 1 mm3 dividiendo 1 entre el volumen del cuadrado central:
1/0,04 mm3= 25 FV= 25 mm3

FT= 100 x 25 mm3= 2500 mm3

RANGO DE REFERENCIA: 140 – 400 x 109/l

PRACTICA N°4

TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)

TIEMPO DE QUICK

Este examen evalúa la vía extrínseca de la coagulación (mide los factores V, VII, X, II). Al
agregar tromboplastina tisular y calcio a una muestra de plasma, se produce la activación de los
factores de la coagulación, generación de trombina y formación de un coagulo de fibrina.
En ella se obvia la activación de los factores de la vía intrínseca para activar al factor X.
Además, como el principio activo de los extractos titulares es un complejo lipoprotéico, los
fosfolípidos del reactivo actúan como sustitutos de los fosfolípidos plaquetarios, y por lo tanto la
prueba no requiere de la acción de las plaquetas.
Selección de la tromboplastina:
Las tromboplastinas son extractos titulares cuyo principio activo es un complejo lipoprotéico.
Tienen diferente fuentes de origen: pueden proceder de órganos tales como el cerebro,
placenta pulmón, así como también de diferentes especies: humanas, de conejo, etc. Además
existen diversos métodos para su extracción y conservación: algunas son extraídas mediante
solución salina fisiológica, otras por acetona, unas vienen líquidas y traen formol como preservativos;
otras son liofilizadas
FUNDAMENTO
La prueba se basa en el tiempo que tarda el plasma al recalcificarlo en presencia de un
exceso de tromboplastina tisular.
MATERIALES Y METODOS:
 Baño de María 37ºC
 Centrífuga
 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico o vidriosiliconizado
 Reactivo de tromboplastina
 Agua destilada
  Plasma del paciente (citratado)
 Plasma control

PROCEDIMIENTO:
1. Agregar a un tubo 0,1 ml de plasma citratado, incubamos por 1 min en Baño de María a 37 ºC.
2. Adicionar 0,2 ml de reactivo de tromboplastina-calcio (liofilizado) previamente incubado a 37
ºC por 2 a 3 min, y activarel cronómetro.
3. Mezclar por 8 seg, sacar e inclinar cada seg el tubo en ángulo de 90º.
4. Al observarse la formación del coágulo detener el cronómetro.
5. Ensayar el mismo procedimiento con el plasma control y realizar la prueba por duplicado.

VALORES DE REFERENCIA (CN) = 11-14 seg

INFORME E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
Se recomienda informar los resultados del paciente en Razón del TP (paciente y control
normal); esta es la forma aceptada universalmente.
TP (pac.) seg
Razón=
T P (cn) seg
VALORES DE REFERENCIA= 0,8-1,2
Ejemplo:
Paciente= 12,9 seg
Control= 12,0 seg
Razón= 12,9 seg = 1,08
12,0seg
Nota:
El TP puede estar prolongado por deficiencia de uno o varios factores del sistema extrínseco
de la coagulación, generalmente cuando los F V, VII o II están por debajo del 10 % de lo normal, o
cuando los niveles de fibrinógeno son inferiores a 100 mg/dl. Estos factores no influyen del mismo
modo en los resultados de la prueba; esta es más sensible a la deficiencia del F VII y luego a las del
F X, V y II, en ese mismo orden.
El tiempo de Quick es la prueba más utilizada para el control de la terapia anticoagulante con
drogas cumarínicas, aunque no evalúe al F IX que es también deprimido en esos casos.
SISTEMA INR (Razón Internacional Normalizada):
El INR está diseñado para el monitoreo del tratamiento anticoagulante oral, por lo tanto, los
resultados de todos los tiempos de protrombina deberían informarse en segundos, en Razón del TP
y el INR, ya que los laboratorios no siempre conocen el propósito de un determinado TP.
El INR se utiliza en:
 Terapias anticoagulantes con cumarinas (Warfarina, Dicumarol), se ajusta de acuerdo al valor
del TP; el TP debe resultar de 1,5 a 2 veces por encima del control normal.
 Prevención del embolismo sistémico en pacientes con prótesis valvulares, fibrilación auricular
y en la prevención de ACV post-infarto.

INR o RIN= TP (pac.) segISI

TP (cn) seg

ISI (Indice de Sensibilidad Internacional)

APLICACIONES:
 Prueba pre-operatoria
 Prueba de entrada.

RECOMENDACIONES:
 Realizar el control con una mezcla de plasma normal.

 La prueba debe realizarse lo más rápido posible una vez obtenida la muestra. En caso
contrario, separar el plasma y congelarlo a 4ºC por más de 2 horas, tiempo máximo permitido
para realizar la prueba y obtener resultados aceptables.

 La prueba debe realizarse siempre por duplicado, comenzando por el control y en orden
balanceado.

 Cuando se trata de controlar pacientes con terapia anticoagulante se debe utilizar siempre el
mismo tipo de tromboplastina con el objeto de definir el límite de sensibilidad, reproducibilidad.

PRACTICA N°5

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTP A, PTTA)

TIEMPO DE CEFALINA

El tiempo de tromboplastina parcial es la prueba de selección para medir el sistema intrínseco

de la coagulación. Se basa en medir el tiempo de coagulación de un plasma al recalcificarlo en
presencia de un sustituto plaquetario: la tromboplastina parcial. Esta se obtiene de los extractos
tisulares de órganos ricos en tromboplastina, como el cerebro. El principio activo es un complejo
lipoprotéico con propiedades coagulantes, las cuales por extracción de ciertos solventes de las
grasas como el cloroformo, se extrae solo la fracción lipídica y por eso se llama tromboplastina
parcial; ella va a realizar en la prueba el mismo papel de la FP-3; es decir actúa como sustituto
plaquetario.
En este examen, un activador como el kaolín, ácido elágico u otro, inicia la vía intrínseca de la
coagulación, al activar los factores de contacto. En presencia de calcio y fl (tromboplastina parcial),
estos factores inician una cascada de reacciones enzimáticas que culminan en la generación de
trombina y formación de un coagulo de fibrina. Mide los factores XII, XI, IX, VIII de la coagulación.
FUNDAMENTO:
La prueba consiste en medir el tiempo que tarda en coagular un plasma al recalcificarlo en
presencia de tromboplastina parcial (cefalina): sustituto plaquetario y una sustancia activadora que
proporciona una máxima superficie de contacto, obteniéndose resultados más reproducibles.
MATERIALES Y REACTIVOS:
 Baño de María 37ºC
 Centrífuga
 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico o vidriosiliconizado
 Reactivo de tromboplastina parcial más activador (kaolín, celita, ácido elágico, etc.)
 Cloruro de calcio (CaCl2)0,025 M
 Plasma del paciente. Plasma pobre en plaquetas (Ppp)
 Plasma control

PROCEDIMIENTO:
1. Extraer la muestra de sangre nitratada.
2. Centrifugar a 3 500 rpm durante 10 min (Ppp).
3. Precalentar a 37ºC el CaCl2 durante 5 min.
4. Agregar en un tubo 0,1 ml de plasma del paciente, e incubar durante 1 a 2 min, en baño de
María a 37ºC.
5. Adicionar 0,1 ml de reactivo de tromboplastia parcial o cefalina, incubar 2 a 3 min.
6. Agregar 0,1 ml CaCl2 (previamente incubado) y activar el cronómetro.
7. Incubar mezclando por 20 seg, sacar e inclinar el tubo cada seg.
8. Detener el cronómetro en el momento en que se observe la aparición de las primeras mallas
de fibrina.
9. Ensayar el mismo procedimiento con el plasma control y realizar la prueba por duplicado.

VALORES DE REFERENCIA (CN)= 25 – 35 seg

INFORME E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: Se recomienda informar los resultados
del PTT del paciente en segundos y la diferencia entre el control y el paciente.
Diferencia= PTT (pac.) – PTT (cn)
VALORES DE REFERENCIA= ± 6 seg (P-C)
Ejemplo:
Paciente= 29,3 seg
Control= 30,0seg
Diferencia= 29,3seg – 30,0 seg = -0,7 seg
Nota: Si no hay formación de un coágulo al cabo de 180 seg se detiene el cronómetro y el resultado
se informa como >180 seg (igual que para el PT).
El tiempo de cefalina, como también suele llamarse, es muy sensible a la deficiencia de los
factores XII, XI, IX, VIII.
 También se prolonga ante la presencia de un inhibidor: anticoagulante circulante (Heparina).
APLICACIONES:
 Prueba pre-operatoria
 Prueba de entrada
 Prueba control de terapia anticoagulante (Heparina).
RECOMENDACIONES:
Asegurarse de tener todo el material necesario a mano antes de comenzar la prueba.
La prueba debe realizarse lo más rápido posible una vez obtenida la muestra. En caso
contrario, separar el plasma y congelarlo a 4ºC por no más de 2 horas, tiempo máximo permitido
para realizar la prueba y obtener resultados aceptables.
La prueba debe realizarse siempre por duplicado, comenzando por el control y en orden
balanceado, es decir, control-paciente, paciente-control.

PRACTICA N°6

TIEMPO DE TROMBINA (TT)

FUNDAMENTO:
La prueba se basa en medir el tiempo requerido para que una solución estándar de Trombina
transforme en fibrina, el fibrinógeno presente en el plasma.
Es una medida de la tasa de transformación del fibrinógeno en un gel insoluble: la fibrina. A su
vez esta transformación depende de la calidad y cantidad de fibrinógeno presente, ya que como en
la reacción se agrega la trombina preformada, se obvian todas las fases anteriores a la formación de
ella.
La reacción también es afectada por la presencia de inhibidores tales como la heparina y los
productos de degradación del fibrinógeno y/o de la fibrina (PDF), ya que ellos interfieren en la acción
de la trombina sobre el fibrinógeno.
La trombina puede ser bovina o humana. Debe diluirse de forma tal que un plasma normal de
un tiempo de coagulación entre 18 y 22 segundos.
Las soluciones de trombina deben hacerse en material plástico, pues la trombina se absorbe
al vidrio y se inactiva. Todo material que se utilice en la prueba debe colocarse, lavarse y guardarse
aparte, pues puede contaminar el resto del material.
MATERIALES Y REACTIVOS:
 Baño de María 37ºC
 Centrífuga
 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico o vidriosiliconizado
 Reactivo de Trombina ajustada 18-22 seg
 Buffer salino
 Plasma paciente (citratado)
 Plasma control
PROCEDIMIENTO:
1. Agregar a un tubo 0,2 ml de plasma citratado, incubamos por 1 min en baño de María a 37ºC.
2. Adicionar 0,2 ml de reactivo de Trombina, y se activa el cronómetro.
3. mezclar por 8 seg, sacar e inclinar cada seg el tubo, en un ángulo de 90º.
4. Al observar la formación del coagulo, detener el cronómetro.
5. Ensayar el mismo procedimiento con el plasma control y realizar la prueba por duplicado.

INFORME E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: Se reportan los resultados en función de

la diferencia entre el paciente y el control normal.
TT= TT (pac) seg – TT (cn)seg
VALORES DE REFERENCIA= ± 2 seg
Nota:El Tiempo de Trombina prolongado es compatible con una hipofibrinogenemia congénita o
adquirida, un estado fibrinolítico o presencia de un fibrinógeno anormal. También se observa
alargado en presencia de antitrombinas (heparina) y PDF; en hiperbilirrubineas, hipoalbuminemias y
hemólisis inespecíficas.

PRACTICA N°7

MEZCLAS CORRECTIVAS

Al realizar las pruebas coagulación, es indispensable introducir una mezcla de plasma control
más plasma paciente (C/P) preparado volumen a volumen (v/v). Esta mezcla permite diferenciar si el
tiempo de coagulación de una prueba obedece a la deficiencia de algún factor o a la presencia de
inhibidores. Así si el plasma del paciente de un tiempo de coagulación alargado, y en la mezcla C/P
el tiempo de coagulación es normal se deduce que en el plasma del paciente hay deficiencia de
algún factor de la coagulación, que fue suministrado por el plasma normal. Si por el contrario, la
mezcla C/P continua dando tiempo de coagulación alargado se piensa que se debe a la presencia de
inhibidores de la coagulación en el plasma del paciente.
Las mezclas correctivas deben prepararse en tubos plásticos.
MATERIALES Y REACTIVOS:
 Baño de María 37ºC
 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico
 Plasma del paciente.
 Plasma control
 Reactivos (tromboplastina o tromboplastina parcial + activador). El reactivo a utilizar va a
depender del tiempo de coagulación que resulte alargado.

PROCEDIMENTO:
Las mezclas correctivas se realizan en pacientes con tiempo de coagulación alargados.
1. Se realiza la mezcla de plasma paciente + plasma control v/v, es decir, se toman 50µl de
plasma + 50 µl de plasma control.
 2. Dependiendo del tiempo que haya resultado alargado se aplica la metodología anteriormente
mencionada.
3. Si se corrige induce a pensar que la alteración inicial se debe a la deficiencia o ausencia de
alguno de los factores de que participan en la cascada de la coagulación.
4. Si por el contrario en la mezcla C/P no hay corrección, indica la presencia de inhibidores.

Nota:
Se habla de corrección cuando la mezcla C/P, da un valor que cae dentro de los rangos
referenciales o muy cerca de ellos.

PRACTICA N°8

DETERMINACIÓN DEL FACTOR XIII

La acción de la trombina sobre el fibrinógeno conduce a la formación de la fibrina soluble. Este

proceso involucra la formación de enlaces de hidrógeno entre los monómeros de fibrina; los enlaces
de hidrógeno son débiles y, como consecuencia, la fibrina es mecánicamente frágil y se disocia
fácilmente en los monómeros que la constituyen, cuando se pone in vitro, en presencia de
inhibidores de enlace de hidrógeno como es la solución de urea 5M o de ácido monocloroacético a
1%.
El F XIII, una vez que es activado por la trombina transforma la fibrina soluble en fibrina
insoluble en presencia de calcio, mediante la formación de enlaces covalentes entre los monómeros
de fibrina.
La fibrina insoluble proporciona una armazón fuerte y estable que asegura una hemostasia
permanente. In vitro esta fibrina insoluble no se disuelve cuando se coloca en solución de urea 5M.
FUNDAMENTO:
La prueba se basa en coagular un plasma citratado por adición de cloruro de calcio (0,025M) y
observar su comportamiento frente a una solución de Urea 5M.
MATERIALES Y REACTIVOS:
 Baño de María 37ºC
 Centrífuga
 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico o vidriosiliconizado
 SoluciónUrea 5M
 Cloruro de calcio (CaCl2) 0,025 M
 Plasma del paciente.
 Plasma control

PROCEDIMIENTO:
1. Agregar a un tubo 0,3 ml de plasma.
2. Adicionar 0,3 ml de CaCl2 0, 025M.
3. Incubar a 37ºC durante 20-30 min.
4. Agregar 3 ml de Urea 5M, despegando el coagulo de las paredes.
5. dejar durante 24 horas a temperatura ambiente, observar a intervalos.
Si el coagulo permanece, no se solubiliza, significa presencia de factor XIII.
INFORME E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
Si hay disolución del coagulo, total o parcial, significa que hay deficiencia del factor XIII.
En el control normal debe permanecer el coágulo intacto.
Reporte: Determinación del factor XIII:
Persistencia a las 24 horas (normal).
Ausente a las 24 horas (anormal).
DEFICIENCIA DEL FACTOR XIII:
 Asociado a sangramiento tardío, después de traumas y operaciones.
 Fisiológicamente: disminuye en recién nacidos y durante el embarazo.

APLICACIONES: Pre-operatorio y Prueba de entrada

Nota: El método es relativamente insensible: sólo detecta deficiencias muy severas (0,02 unidades
por ml o menos). Sin embargo, como se ha reportado en pacientes con niveles de 0,02 a 0,03
unidades por ml, no tiene defectos hemostáticos significativos, la prueba resulta adecuada como
selección para los desórdenes que son clínicamente importantes.