UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

VICERRECTORÍA ACADÉMICA
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

GUÍAS PARA EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA CLÍNICA

SEGUNDO PERIODO ACADÉMICO DE 2021 SEXTO NIVEL

DOCENTE ESPERANZA TRUJILLO G.

QUIMICA, MSc. BIOQUÍMICA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

INTRODUCCIÓN

Teniendo en cuenta que las infecciones víricas son consideradas como una de las
principales causas de afección y letalidad en el hombre y en las especies animales, que
son de interés socioeconómico; y sabiendo que el trabajo en el laboratorio es práctica
común de profesional en BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO, ya sea a
nivel clínico o de investigación, se hace necesario que se conozcan y apliquen las
diferentes técnicas para la obtención, identificación y caracterización de virus, además
que se promueva en los estudiantes el deseo y la necesidad de la investigación para su
desarrollo personal y social.

En esta guía de laboratorio se plantean una serie de prácticas que le permitirán al

estudiante familiarizarse con los elementos y equipos de uso común en el laboratorio
de virología, también les permitirá conocer y aplicar técnicas usadas a diario en el
diagnóstico, identificación y caracterización de algunos virus. Las herramientas dadas
en este laboratorio contribuirán con el buen desempeño futuro de los estudiantes en el
área de virología.

Para el adecuado desarrollo de las diferentes prácticas planteadas en esta guía, se

propone la siguiente metodología:

Con el fin de que el estudiante llegue preparado para desarrollar la práctica propuesta
se plantean unas preguntas relacionadas con el tema que deben ser resueltas antes de
dar inicio de la práctica de laboratorio (Pre-laboratorio que se realiza en el cuaderno de
laboratorio). Para evaluar la preparación de los estudiantes 5 minutos después de
iniciar la práctica se realizará un quiz sobre el tema correspondiente.

El docente dará las indicaciones necesarias antes de cada práctica y distribuirá los
diferentes grupos de trabajo (6 estudiantes por grupo) que realizará la práctica y
elaborará el informe final.

Cada estudiante tendrá un cuaderno de laboratorio donde consignará todos los

datos tomados durante el desarrollo de cada práctica y donde realizará un informe
final de cada práctica que debe incluir los siguientes ítems:

PRE-LAB0RATORÍO (PREINFORME)

1
Título de la práctica.
Objetivos
Fundamento teórico: responder las preguntas del Prelaboratorio.
Describir los cuidados, toxicidad y peligrosidad de cada reactivo utilizado
Procedimiento
Bibliografía

Taller FINAL

REQUISITOS PARA EL DESARROLLO DEL LABORATORIO:

1. Protección personal

1.1 Cada estudiante debe tener las medidas de bioseguridad contra el virus SARS
CoV-2. Toma las precauciones adecuadas e infórmate bien para protegerte y cuidar de
quienes te rodean.

a) Para evitar la propagación de la COVID-19

b) Lávate las manos con frecuencia. Usa agua y jabón o un desinfectante de
manos a base de alcohol.
c) Mantén la distancia entre cada uno de ustedes, no pueden reunirse a
charlar en los tiempos muertos de reacción de las pruebas.
d) Mantén una distancia de seguridad con personas que tosan o estornuden.
e) Utiliza mascarilla siempre y con mayor responsabilidad cuando no sea
posible mantener el distanciamiento físico.
f) No te toques los ojos, la nariz ni la boca.
g) Cuando tosas o estornudes, cúbrete la nariz y la boca con el codo flexionado o
con un pañuelo.
h) Si no te encuentras bien, quédate en casa.
i) En caso de que tengas fiebre, tos o dificultad para respirar, busca atención
médica.

1.2 Llama por teléfono antes de acudir a cualquier proveedor de servicios sanitarios
para que te dirijan al centro médico adecuado. De esta forma, te protegerás a ti y
evitarás la propagación de virus y otras infecciones.
1.3 Las mascarillas pueden ayudar a prevenir que las personas que las llevan
propaguen el virus y lo contagien a otras personas. Sin embargo, no protegen frente a
la COVID-19 por sí solas, sino que deben combinarse con el distanciamiento físico y la
higiene de manos. Sigue las recomendaciones de los organismos de salud pública de tu
zona.

2
1.2 Uniforme en el laboratorio: Deben usar bata, gorro, guantes, tapabocas y zapatos
adecuados para el laboratorio (no usar tenis) además deben traer los materiales
necesarios para el desarrollo de la práctica. El estudiante que no traiga los implementos
de laboratorio completos no podrá ingresar a la práctica.

1.3 Gran responsabilidad del estudiante: Debe lavarse las manos después de
manipular materiales y animales infecciosos, así como antes de abandonar las zonas
de trabajo del laboratorio.

1.4 Se prohíbe usar la bata fuera del laboratorio: por ejemplo, en cafeterías, oficinas
bibliotecas, salas para el personal y baños.

2. Procedimientos

2.1 Está estrictamente prohibido pipetear con la boca.

2.2 Los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la

formación de aerosoles y gotículas en el sitio de trabajo.

2.3 Eliminar los materiales de desechos en sus respectivos recipientes.

2.4 Antes de eliminar los materiales que se usaron para manipular los microorganismos
se deben inactivar con hipoclorito de sodio que es un potente oxidante. La exposición al
cloro produce irritación de mucosas y del tracto respiratorio superior manipularlo
cuidadosamente.

2.5 Si hay derrames o accidentes por material infeccioso avisar inmediatamente para
tomar las medidas pertinentes y hacer un registro escrito de lo sucedido.

2.6 Al finalizar la práctica las mesas del laboratorio deben quedar perfectamente
limpias.

3. Evaluación en cada práctica

3.1 En cada práctica on line se realizará un quiz que se iniciará 5 minutos después de la
hora de entrada, este tendrá un tiempo de duración de máximo 5 minutos. Estudiante
que no presente el quiz tendrá una nota de cero y solo se le realizará la evaluación si
presenta excusa médica acorde con el reglamento estudiantil y avalado por las
directivas.

3.2 En cada práctica de laboratorio en el momento de realizar el quiz se revisará el

cuaderno que debe tener el preinforme debidamente desarrollado, se debe colocar
abierto al lado de cada uno de ustedes. Estudiante que no lo presente debe retirarse
de la práctica y tendrá su nota respectiva de cero.

3.3. En la presentación del proyecto es importante ser presentado por los estudiantes
que conforman el grupo. El tema lo escogen ustedes tiene, una duración de tan solo 5
min.

3
EVALUACIÓN

La asignatura teórico-práctica se distribuye para su evaluación cuantitativa en tres

cortes de la siguiente manera:

Primera evaluación parcial 30%

Segunda evaluación parcial 30%
Evaluación final 40%

Para la obtención de los porcentajes mencionados, se toma como referente la

evaluación del desempeño conceptual teórico y la evaluación del desempeño práctico.

Evaluación laboratorio de virología sobre el 45 %.

Primer corte
Quices a partir del preinforme,
Informe o Taller 47 %
Primer parcial 53 % _ Fecha: agosto 9-14
100 %

Segundo corte
Quices a partir del preinforme, talleres e
Informe o Taller 47 %
Segundo parcial 53 % Fecha: septiembre 27-30
100 %

Tercer corte
Presentación de un proyecto 20 %
Quices 5%
Examen final 75 %_
100 %

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Journal of general virology

 Journal of Virology
 Virus Research
 Jpn. J. Infect. Dis.
 Journal of Clinical Microbiology
 Cancer epidemiol Biomarkers Pre
 Principles of Virology (2 Volume Set) by S. Jane Flint, L. W. Enquist and V. R.
Racaniello (Jan 31, 2009)

4
 Virology: Molecular Biology and Pathogenesis by Leonard C. Norkin (Oct 19,
2009)

8.3 Electrónicas

 www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed
 www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/OMIM
 http://www.virology.com
 http://www.virology.net/garryfavwebjournals.html
 www. https://sci-hub.se/

5
23-31Julio

PRÁCTICA 1.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD Y CULTIVO CELULAR PRIMARIO

RESULTADOS DE APRENDIZAJE

 Aplicar las Normas de Bioseguridad en el trabajo en el laboratorio de virología.

 Definir los principales componentes de medios de cultivo necesarios para el
crecimiento de diferentes líneas celulares.
 Aplicar las diferentes condiciones para el mantenimiento de líneas celulares en
un cultivo.
 Describir el protocolo de congelación con el fin de mantener las líneas celulares.
 Describir el protocolo de descongelación con el fin de mantener un cultivo
continuo de líneas celulares.
 Aislar células sanguíneas de diferentes órganos de ratón mediante perfusión
para realizar cultivo celular primario.
 Utilizar la prueba de viabilidad celular como la del método de exclusión de azul
de tripán.

PRE-LABORATORIO
 ¿Cuántos niveles de bioseguridad en laboratorios de microbiología se conocen,
que características tienen y de ejemplos de patógenos que se pueden trabajar en
cada uno de ellos?
 ¿Qué son barreras físicas primarias y secundarias cuando se habla de
bioseguridad en laboratorios de microbiología?
 ¿Cuántas clases de cabinas de seguridad biológica se conocen, qué
características tienen y en que niveles de bioseguridad se deben usar?
 ¿Qué son los filtros HEPA que características tienen y donde se utilizan?
 Mencione las principales normas de bioseguridad necesarias para el trabajo en
el laboratorio de virología.
 ¿Que son medios de cultivo para crecimiento celular y cuales son y qué función
cumplen sus principales componentes?
 ¿Cuáles son los medios de cultivo más utilizados para el crecimiento de líneas
celulares?
 Cuál es la función del Dimetil Sulfóxido y el glicerol en congelación de células.
 Fundamento del método de determinación de viabilidad celular por exclusión de
azul de Tripan.

MATERIALES Y REACTIVOS

Incubadora de CO2 Cabina de flujo laminar.

Centrífuga Pipeteador manual o automático
Tubos de 15 mL Estériles Pipetas de vidrio 10 ml
Puntas Estériles Cajas de Petri autoclavadas
Cajas de cultivo celular de 25 ml Suero Fetal Bovino Inactivado
Medio DMEM o RPMI 100 ML PBS 1X-EDTA 1 mM
Alcohol Stock Celular
Antibiótico-antimicótico 2 Jeringas de 10 ml por mesa
Azul de Tripan Cubreobjetos
6
Toallas de papel Cámara de Neubawer
Bisturí

PROCEDIMIENTO

Aislar células sanguíneas de ratón por perfusión.

 Sacrificar el ratón en cámara de éter.

 Realizar disección del ratón con bisturí, obtener el hígado, bazo, riñones y
corazón (un órgano por grupo de trabajo).
 Colocar cada órgano en una caja de Petri, adicionar 5 mL de PBS1X para lavar
el órgano y eliminar el líquido.
 De aquí en adelante trabajar con mechero para lograr condiciones estériles
 Adicionar a la caja 10ml de PBS1X
 Perfundir cada órgano varias veces con jeringa usando PBS 1X, con el fin de
obtener el mayor número posible de células sanguíneas.
 Tomar una alícuota de células en suspensión y diluirla 1:1 con Azul de Tripan.
 Realizar el montaje en la cámara de Neubawer.
 Contar en el microscopio de Luz los 4 cuadrantes.
 Determinar el número de células presentes en cada órgano.
 Adicionar 1ml de suspensión celular en las cajas de cultivo que tienen 5 ml de
medio DMEN, SFB y antibiótico antimicótico
 Dejar la caja de cultivo en la incubadora a 37°C con 5% de CO2 para la
obtención de un cultivo primario

2-6 agosto
7
 No 2.

CUANTIFICACIÓN VIRAL

OBJETIVOS

 Definir los diferentes métodos de titulación viral

 Explicar el cálculo del título de un stock viral de rotavirus.
 Aplicar técnicas de inmunocitoquímica para la determinación del título viral.

PRE-LABORATORIO

 Expliqué los diferentes métodos que son usados en la determinación del título
viral.
 ¿Qué es inmunocitoquímica, como se realiza y que aplicaciones tiene?
 ¿Cómo se cuantifica el rotavirus por el método de aminoetil carbazol (AEC)?

MATERIALES Y REACTIVOS

Placa de 96 posos con titulación de rotavirus

Microscopio invertido

PROCEDIMIENTO

Evaluar las células infectadas en un microscopio invertido. El título viral se calcula a

partir de la dilución que nos permite contar 100 UFF (Unidades Formadoras de Foco)
una sola vez, desde un extremo del pozo, en línea recta, hasta el otro extremo. Luego
se aplica la siguiente fórmula:

UFF = 20 x 100 x la dilución donde se cuentan los 100 focos de infección x # de

campos.

Esta fórmula utiliza la constante de 20 porque 50 es 1/20 parte de un mL al trabajar en

el pozo 50 µL de medio en que se aplicó el virus. 100 es el número de focos contados.
La dilución es aquélla donde había 100 focos. # es el número de campos que tiene el
pozo al recorrer el lente 20X en el microscopio invertido.

9-13 agosto
8
 PRÁCTICA 3.

INFECCIÓN VIRAL EN CÉLULAS MA 104, Y PRODUCCIÓN DE STOCKS VÍRALES

OBJETIVOS

 Observar e identificar morfológicamente líneas celulares que crecen en

monocapa y en suspensión.
 Definir los protocolos de congelación con el fin de mantener stocks de líneas
celulares.
 Definir los protocolos de descongelación con el fin de mantener un cultivo
continuo de líneas celulares.
 Describir las etapas que se presentan durante una infección viral (adsorción,
penetración, replicación y liberación del virus).
 Utilizar el proceso de inoculación de virus (rotavirus) en cultivos de líneas
celulares.
 Examinar del efecto citopático producido por virus.
 Producir un stock viral de rotavirus.

PRE-LABORATORIO

 Describir las diferencias entre un cultivo celular primario y uno de una línea
celular.
 Describir las diferencias entre las células que crecen en suspensión y las células
que crecen en monocapa (adherentes)
 Definir el MOI y la función que cumple
 Describir cual es la función del EDTA y la tripsina en el cultivo de células
adherentes
 Explicar las etapas que se presentan durante una infección viral (adsorción,
penetración, replicación y liberación de la progenie viral).
 ¿Por qué la tripsina activa el rotavirus para que sea infeccioso?
 Explique la diferencia entre virus lítico y un virus lisogénico.
 Explique el efecto citopático causado por un virus a las células.

MATERIALES Y REACTIVOS

Monocapa de células MA104 en caja de cultivo de 25 mL Cabina de flujo

laminar
Cepa de rotavirus (RRV) Microscopio invertido
Medio de cultivo DMEM o RPMI Vortex
Antibiótico-antimicótico Incubadora de CO2
Tripsina 10 mgr/ml Pipetas estériles 5 y 10 ml
Pipeteador Micropipetas
Puntas azules y amarillas autoclavadas Tubos ependorff
Toallas de papel

PROCEDIMIENTO

Células que crecen en monocapa.

9
  Observar la morfología de monocapa de células MA104 (línea celular epitelial de
riñón de mono verde africano)
 Lavar la monocapa celular con PBS-EDTA, retirar el PBS-EDTA
 Adicionar 500 mL de PBS-EDTA y 1 mL de Tripsina (4X)
 Incubar a 37°C durante 3 minutos.
 Observar en el microscopio invertido como cambia la morfología de las células
una vez se desprenden de la caja de cultivo por el efecto de la tripsina y el
EDTA.
 Golpear suavemente la caja con el objetivo de desprender las células,
pipeteando varias veces para disgregarlas.
 Transferir a tubo de 15 mL.
 Tomar una alícuota de células resuspendidas diluirla 1:1 con Azul de Tripan.
 Realizar el montaje en la cámara de Neubawer.
 Contar en el microscopio de Luz los 4 cuadrantes.
 Determinar el número de células presentes en la muestra.
 Expandir el cultivo celular (subcultivo) en cajas de 25 mL con medio de cultivo
DMEM y suero fetal bovino 10%.

Producción de stock viral

 Activar el rotavirus con tripsina 10 mg/ml (1 µL por ml del stock viral) por 30
minutos a 37°C.
 Retirar el medio de la caja de cultivo que contiene la monocapa de células
MA104, usando pipeta estéril de 5mL.
 Adicionar el rotavirus previamente activado con tripsina, incubar por 1 h a 37°C
en incubadora de CO2.
 Retirar el rotavirus, lavar con medio DMEM para retirar el virus no adherido,
adicionar medio DMEM con antibiótico-antimicótico, incubar por 48 h a 37°C en
incubadora de CO2.
 Observar el efecto citopático causado por el virus de las células infectadas en el
microscopio invertido.
 Congelar las células infectadas por 15 minutos en Nitrógeno líquido, incubar a
37°C por 15 min. Este procedimiento se repite 3 veces, con el fin de lisar las
células y liberar el virus,
 Distribuir en alícuotas de 1 ml y almacenar a -70°C hasta su uso en la
determinación del título viral.

10
.

17-21 AGOST0 PRIMER PARCIAL

Después del parcial se presentará una charla sobre como realizar un proyecto por
la Bacterióloga Nataly Poveda

23-27 agosto
11
 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE COMPONENTES VIRALES

Practica 4 y 6

AISLAMIENTO DE RNA GENÓMICO DE ROTAVIRUS Y SU DETECCION MEDIANTE

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

OBJETIVOS

 Describir los métodos utilizados en el aislamiento del material genético de virus

(RNA, DNA).
 Aplicar el método de extracción de RNA de doble cadena de rotavirus, y
cualificarlo.

PRE-LABORATORIO

 Definir el fundamento del aislamiento de ácidos nucleicos (RNA).

 ¿Qué cuidados se deben tener en el manejo del fenol y cloroformo? ¿Cuál es su
toxicidad?
 Describir el fundamento de electroforesis de ácidos nucleicos en geles de
agarosa.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Cámara de electroforesis (ácidos nucleicos) Pipetas 0.5-10 µL estériles

Micro centrífuga Ependorff 1.5 mL estériles
Vaso de precipitados Puntas estériles
Stock de rotavirus
Kit para la extracción de DNA genómico Fenol equilibrado pH 6.5
Agarosa Cloroformo
PBS 1x Etanol Absoluto
TAE Agua destilada, filtrada y auto
clavada
Micropipetas (20,100 y 1000 uL) Intercalante de ARN, ADN
Patrón de peso molecular para ácidos nucleicos Buffer de carga
Buffer disruptor (ver anexo)

PROCEDIMIENTO

AISLAMIENTO DE RNA DE DOBLE CADENA DE ROTAVIRUS

 Se parte un lisado celular de MA104 infectado con la cepa de rotavirus

RRV (200 µL) en tubos eppendorf de1.5mL.
 Agregar 20 µL de buffer disruptor y agitar en Vortex.
 Agregar 200 µL de fenol saturado pH 6.6 y agitar en vortex.
 Agregar 200 µL de cloroformo y agitar en vortex.
 Centrifugar a 12000 rpm por 8 min.
 Tomar el sobrenadante y pasarlo a otro tubo ependorff de 1.5 mL, medir el
volumen.
12
  Agregar 2.5 volúmenes de etanol absoluto y agitar en vortex.
 Incubar a -20 °C 20 minutos.
 Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos descartar el sobrenadante
 Secar el pellet
 Adicionar 30 µL de agua destilada, filtrada y estéril.
 Hacer una dilución 1:100 del RNA y cualificarlo en espectrofotómetro a
260 nm.
 Al resto de la muestra adicionarle 10 uL de buffer de carga y agitar en
vortex. Guardar a -20°C hasta su uso.

DETECCIÓN DE ARN DE ROTAVIRUS

Fuente de poder Buffer de carga

Bromuro de etidio Puntas amarillas
Micropipetas de 5 a 50 µl Horno microondas
Micropipetas de 100-1000ul Puntas azules
Patrones de peso Molecular de RNA Probeta de 100 ml
Cámara de electroforesis para DNA, dientes, soportes, etc.

PREPARACIÓN DE UN GEL DE AGAROSA AL 1% EN TAE

 Pesar 0,5 g de agarosa y disolverla en 50 ml de TAE calentando.

 Enfriar aproximadamente a 50 OC y adicione sobre la cama y los dientes
de la cámara de electroforesis y deje gelificar.
 Adicione el TAE hasta cubrir el gel y retirar los dientes.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

 Mezclar 10 ul de RNA viral con 2 µl de buffer de carga.

 Servir las nuestras en cada uno de los pozos en el gel y servir los patrones
de peso molecular.
 Conectar la cámara a la fuente de poder a 100 V y correr por 30 min.
 Teñir el gel sumergiéndolo en una cubeta con bromuro de etidio por 10
min.
 Observar la separación de las bandas de RNA genómico de rotavirus en el
visor de UV en el cuarto oscuro.

ANEXO

Buffer Disruptor:
Tris -Base 0.64g NaCI 0.80 g
EDTA 0.56 g B-mercaptoetanol 260 µL
SDS 0.26 g Agua destilada 20 mL

30-31 agosto
1-4 septiembre
13
 PRACTICA No. 5

FUNDAMENTO DE LA EXTRACCIÓN Y DETECCION DEL RNA GENÓMICO DE

VIRUS MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

OBJETIVOS

 Analizar el RNA genómico de rotavirus en geles de agarosa (tinción con

intercalante de ADN).
 Identificar los métodos de detección de material genético viral como la
tinción con bromuro de etidio o un intercalante de ácidos nucleicos.

PRE-LABORATORIO

 Diferenciar el proceso de replicación de un virus de RNA de doble cadena

(rotavirus) y uno de DNA de doble cadena (papilomavirus).
 Fundamento del aislamiento de ácidos nucleicos (RNA).
 ¿Qué cuidados se deben tener en el manejo del fenol y cloroformo? ¿Cuál
es su toxicidad?
 Consultar cuantos segmentos de RNA de doble cadena componen el
genoma de rotavirus y como se separan en un gel de poliacrilamida y en
un gel de agarosa.
 A que se debe la diferencia del corrido electroforético de los diferentes
segmentos del RNA en los geles de agarosa y geles de acrilamida

PROCEDIMIENTO

Los temas se discutirán en clase durante la práctica.

13-18 septiembre
.
14
 PRACTICA No. 7

CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS VIRALES (ROTAVIRUS)

OBJETIVO

 Reafirmar las Normas de Bioseguridad para el trabajo en el laboratorio de

virología.
 Que cuidados se deben tener al trabajar con rotavirus.
 Identificar y analizar proteínas virales provenientes del rotavirus, mediante
técnicas electroforéticas (SDS-PAGE) y técnicas inmunológicas (Western Blot).

PRE-LABORATORIO

 Explique el fundamento de la técnica SDS-PAGE.

 Fundamento de la técnica inmunológica: Western Blot.
 ¿Cuál es la composición proteica del rotavirus, como están distribuidas dichas
proteínas en la partícula viral y cuál es la función de una de ellas?

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Cámara de electroforesis horizontal (SDS-PAGE) Agua Destilada

Fuente de poder Buffer Laemmli
Patrón de peso para proteína Plancha de calentamiento
Micropipetas de 0.5-20 ul Acrilamida
N N Metilen Bis Acrilamida Buffer de Corrido
Persulfato de Amonio Puntas amarillas y azules
Temed Tubos falcón de 15ml
Pipetas de 5-10 ml Puntas amarillas y azules
Vaso de precipitados de 500 ml Azul de Bromofenol

PROCEDIMIENTO

Electroforesis SDS-PAGE

 Realizar un gel de poliacrilamida al 10%

 Preparar las muestras: Añadiendo el buffer Laemmli
 Hervir las muestras durante 5 minutos
 Cargar el gel con las diferentes muestras a trabajar.
 Conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder y corre el gel a
120 mA por 45 minutos.
 Retirar el gel y teñirlo con azul de bromofenol durante 15 minutos
 Lavar el gel con agua destilada
 Observar y analizar las proteínas en el rango en que se encuentren

DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES VIRALES

15
 PRACTICA No. 8 y 9

20-24 septiembre
4-8 octubre

AISLAMIENTO DE ADN DE PAPILOMAVIRUS (VPH) Y SU DETECCION MEDIANTE

TÉCNICAS MOLECULARES (PCR)

AISLAMIENTO DE ADN DE HPV

OBJETIVO

 Describir el fundamento de la PCR, técnica de Biología Molecular.

 Utilizar diferentes métodos de extracción de ADN (manual y kit comercial).
 Desarrollar la técnica de Biología Molecular (PCR) para la detección del virus del
papiloma humano (VPH).

PRE-LABORATORIO

 Explique el fundamento de la PCR y nombre las aplicaciones de la

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
 Describir los fundamentos de los métodos de extracción de ADN.
 Identificar los cuidados que se deben tener al realizar la PCR en el
laboratorio para evitar la contaminación ambiental por aerosoles de los
productos de PCR.
 Investigar cómo se deben eliminar o desechar los productos de PCR y
como evitar la producción los aerosoles.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Cámara de electroforesis (ácidos nucleicos) Visor Ultravioleta

Termociclador Agua Ultrapura
Buffer para PCR 10X TAE 10X
Deoxinucleotidos (dNTPs) Etanol 100%
Primers o cebadores Etanol 75%
Taq DNA polimerasa Agarosa
MgCl2 Centrifuga
Bromuro de etidio Tubos para PCR
Buffer de carga Pipetas
Puntas amarillas y azules autoclavadas Tubos Ependorff de 1.5 ml
Puntas de 1-10 UL Vortex
Micropipetas para 10, 50 y 1000 ul Vaso de precipitados
Plancha de Calentamiento

PROCEDIMIENTO

Muestras obtenidas mediante frotis cervical en mujeres y frotis del surco

balanoprepucial en hombres, se colectarán en 5 mL de PBS 1X, se centrifugaron a
16
3000 rpm durante 10 minutos para obtener un precipitado celular, se descarta el PBS y
las células se resuspenden en 1 mL de buffer Tris-CI 10mM pH 8, de este se toman 100
uL y se llevan a ebullición por 10 minutos, para lisar las células y liberar el DNA y
además eliminar posible contaminación bacteriana presente en la muestra.
Centrifugar a 4500 rpm durante 10 minutos, para retirar restos celulares y se toman 10
uL del sobrenadante para la realización de la PCR.

Hacer la extracción de ADN viral utilizando un kit de purificación tomando 150 ul de la

misma muestra y seguir las instrucciones de este.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Realizar los cálculos de los volúmenes necesarios de cada reactivo para obtener una
mezcla de reacción que contenga las siguientes concentraciones en un volumen final
de 25 uL

[ Inicial] [ Final]

Agua ultra pura Vol para completar

25ul Buffer 5X 1X
MgCl2 25mM 3.5 mM
DNTPs 2mM 0.2 mM
Primer 1 (GP5+) 100uM 0.5uM
Primer 2 (GP6+) 100uM 0.5uM
Taq DNA Polimerasa 5U/uL 1U
Templado (DNA genómico de VPH) 5ul

Secuencia de los Primers:

GP5+ 5'- TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC - 3'

GP6+ 5'- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC - 3'

Condiciones de amplificación que se deben programar en el termociclador:

 Denaturación inicial 94 °C por 4 minutos.

 Denaturación 94 °C por 1 minutos.
 Anillaje o hibridización 40 °C por 2 minutos.
 Extensión o elongación 72 °C por 1 minuto 30 segundos.
 Los pasos 2-4 se repiten por 40 ciclos.
 Extensión final 72 °C por 4 minutos.
 Conservación a 4 °C por el tiempo necesario.

Identificación de los fragmentos de PCR en electroforesis de agarosa:

 Preparar un gel de agarosa al 1.5 % en buffer TAE 1X o TBE 1X

 Preparar la muestra: 5 µL de DNA de la PCR del VPH + 1 uL de buffer carga
 Cargar la mezcla anterior en el pozo y correr el gel con las diferentes muestras y
patrones de peso molecular, (100 mA durante 15 minutos).
 Sumergir el gel en una cubeta con bromuro de etidio por 10 minutos.
 Observar el gel marcado con el Gel Red en el visor de Ultravioleta la banda de
amplificación de VPH (banda de 142 pb correspondiente a un fragmento del gen
que codifica para la proteína de la cápside viral L1 de VPH).

17
 27-30 SEPTIEMBRE SEGUNDO PARCIAL

11-16 octubre

18
 PRÁCTICA 10

Bases teóricas Inmunocromatografía para la detección de VSR, RV y HIV

Objetivo

 Describir el manejo y el fundamento de los kits comerciales de

Inmunocromatografía para la detección rápida de agentes virales

PRELABORATORIO

 Definan el fundamento de la Inmunocromatografía para el virus sincitial

respiratorio (VSR), HIV y para el rotavirus.
 Nombrar las clases de muestras que se usan en Inmunocromatografía.
 Describir los cuidados que se deben tener al manejar muestras biológicas
con virus.

MATERIALES Y EQUIPO

Puntas amarillas Tubos Ependorff

Vortex Lancetas
Alcohol Algodón
Muestras Kits de detención

PROCEDIMIENTO

Los temas se discutirán en clase durante la práctica.

18-22 octubre
1-5 noviembre
19
 PRACTICA No. 11 y 13

DETECCIÓN DE VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO (VSR), ROTAVIRUS Y HIV 1

MEDIANTE INMUNOCROMATOGRAFÍA

Objetivo

 Describir el manejo y el fundamento de los kits comerciales de

inmunocromatografía para la detección rápida de agentes virales

PRELABORATORIO

 Describir el fundamento de la Inmunocromatografía para el VSR, el HIV y

para el rotavirus.
 Identificar que cuidados se deben tener al manejar muestras biológicas
con virus VSR y HIV.

MATERIALES Y EQUIPO

Puntas amarillas Tubos Ependorff

Vortex Lancetas
Alcohol Algodón
Muestras Kits de detención

PRACTICA No. 12

25-10 octubre

PRESENTACION DE PROYECTOS

20