Boletín Boletín OEPP / EPPO ( 2018) 48 ( 1), 64–77 ISSN 0250-8052. DOI: 10.1111 / epp.

12453

Organización Europea y Mediterránea de Protección de las Plantas

Organización Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes PM 7/89 (2)

Diagnóstico
Diagnóstico

PM 7/89 (2) Glicinas heterodera

Alcance específico Aprobación y enmienda específicas

Esta Norma describe un protocolo de diagnóstico para Aprobado en 2008 - 09.

Glicinas heterodera. 1 Revisión aprobada en 2017 - 11.
Esta Norma debe utilizarse junto con PM 7 /
76 Uso de protocolos de diagnóstico EPPO.

Los términos utilizados son los del Glosario pictórico de términos morfológicos
en nematología de la EPPO. 2

(Niblack et al., 2002). Puede encontrar más información en la hoja de datos de la

1. Introducción
EPPO en H. glicinas ( EPPO / CABI, 1997).
Glicinas heterodera o 'nematodo del quiste de la soja' es de gran importancia Un diagrama de flujo que describe el procedimiento de diagnóstico para

económica en Glycine max L. 'soja'. H. glicinas se presenta en la Fig.1.

Glicinas heterodera ocurre en la mayoría de los países del mundo donde se
produce la soja. Tiene una amplia distribución en países con grandes
2. Identidad
superficies cultivadas con soja: Estados Unidos, Brasil, Argentina, República
de Corea, Irán, Canadá y Rusia. También se ha informado de Colombia, Nombre: Glicinas heterodera Ichinohe, 1952
Indonesia, Corea del Norte, Bolivia, India, Italia, Irán, Paraguay y Tailandia Sinónimos: ninguna

(Baldwin y Mundo-Ocampo, 1991; Manachini, 2000; Riggs, 2004). Glicinas Posición taxonómica: Nematoda: Tylenchina 3 Heteroderidae
heterodera ocurre en el 93,5% de los Código EPPO: HETDGL
Categorización fitosanitaria: EPPO A2 Lista no. 167
zona donde G. max L. se cultiva. Glicinas heterodera tiene un
amplia gama de hospedadores, particularmente dentro de las Leguminosae, y
3. Detección
se ha detectado en cultivos como Glicina, Vicia,
Trifolium, Phaseolus, Lespedeza y Pisum. Sin embargo, maldita sea
3.1 Síntomas
La edad de importancia económica se observa principalmente en la soja.
También es capaz de atacar varios cultivos no leguminosos, incluidos algunos Los síntomas de H. glicinas no son específicos. Los síntomas generales son, por
ornamentales como Geranio y ejemplo, parches de crecimiento deficiente en un cultivo de soja. A veces, las plantas
Papaver, pero también muchas malezas de al menos 23 familias (Moore, 1984). en estos parches muestran amarillamiento, marchitamiento o pérdida de hojas con una
Poblaciones de campo de H. glicinas exhiben diversidad en su capacidad para producción reducida de semillas. Por lo general, existe una línea divisoria marcada
desarrollarse en resistentes G. max L. cultivares. Por lo tanto, varias pruebas de entre las áreas del campo afectadas y no afectadas. En las áreas afectadas, las filas
carrera para H. glicinas Se han propuesto poblaciones (Golden et al., 1970 y Riggs tardan en cerrarse y pueden permanecer así durante toda la temporada. El daño más
severo suele estar en el centro del área afectada. Las áreas dañadas se encuentran

et al., 1981). Como estas pruebas demostraron no siempre ser confiables para la frecuentemente cerca de la entrada del campo donde la maquinaria se mueve hacia el
caracterización de razas, un esquema de clasificación revisado para genéticamente campo, o en áreas donde el viento o el agua deposita tierra de otro campo. La
diversos H. glicinas Se propuso poblaciones reducción en el rendimiento de semillas suele ser la primera señal de que

1 El uso de nombres de productos químicos, equipos o kits comerciales en estas Normas EPPO no

implica la aprobación de los mismos con exclusión de otros que también puedan ser adecuados.
3 Desarrollos recientes que combinan una clasificación basada en datos morfológicos y
2 http://www.eppo.int/QUARANTINE/diag_activities/EPPO_TD_1056_ Glossary.pdf análisis moleculares se refieren a 'Tylenchomorpha' (De Ley & Blaxter, 2004)

64 ª 2018 OEPP / EPPO, Boletín Boletín OEPP / EPPO 48, 64–77

 PM 7/89 (2) Glicinas heterodera sesenta y cinco

Suelo Raíces

No
quistes, juveniles y machos de segunda etapa

si
si

Morfología
Pruebas moleculares
Etapas con típico
Las pruebas de PCR se pueden realizar en: Incierto
No
los Heterodera
los Heterodera et al.,
yo grupo
2000 PCR-ITS-RFLP, Apéndice 1)
b) Quistes, juveniles o huevos de segundo estadio
si

Apéndice 2).
c) Quistes o mezclas de quistes (según
Incierto
Morfológico
3). No

H. glicinas

si

H. glicinas
H. glicinas no
Figura 1 Procedimiento de diagnóstico para H. glicinas.

[La figura de color se puede ver en

wileyonlinelibrary.com]

hay una infestación. Por lo general, la combinación de crecimiento reducido y

4. Identi fi cación
coloración amarillenta se denomina 'enfermedad de la enana amarilla' para la soja
infestada con H. glicinas. La infestación de raíces aumenta el número de raíces La identificación se basa en quistes y juveniles de segunda etapa. La
laterales y reduce el número de presencia de machos permite distinguir entre
Rhizobium nódulos y fijación de nitrógeno. Las hembras jóvenes y los quistes aparecen de H. glicinas y Heterodera lespedezae. Heterodera
color blanco, amarillo o marrón, aproximadamente del tamaño de la cabeza de un alfiler glicinas puede ser difícil de distinguir de otras especies en el schachtii grupo
apenas visible a simple vista en la superficie de la raíz. Pueden confundirse con la soja. Rhizobium utilizando características morfológicas y morfométricas. En caso de dudas con la

nódulos. identificación morfológica, se pueden utilizar pruebas moleculares. Las pruebas

moleculares se pueden utilizar directamente en quistes o juveniles (aún puede
ser necesaria la identificación morfológica a nivel de género; ver sección 4.2).
3.2 Muestreo

En el documento PM 9/5 (1) Heterodera se proporciona orientación sobre el muestreo.

glicinas: procedimientos de control o fi cial.

4.1 Morfología
3.3 Extracción
Para la identificación morfológica, se recomienda examinar bajo un microscopio
Para identificar H. glicinas deben obtenerse todas las etapas. Los métodos de óptico las muestras montadas en fi xativo en portaobjetos de microscopio. Se
extracción del suelo se presentan en PM recomienda la microscopía de fase de interferencia para la observación de
7/119 Extracción de nematodos. juveniles.

ª 2018 OEPP / EPPO, Boletín Boletín OEPP / EPPO 48, 64–77

66 Diagnóstico

Graney y Miller (1982) Brzeski (1998) Kirjanova et

Baldwin y Mundo-Ocampo (1991) produjeron una clave útil para la identi fi

Hirschmann y Triantaphyllou (1979) Gerber y

cación de géneros que forman quistes y que no los forman dentro de la

Mulvey y Anderson (1974); Wouts y Sturhan

subfamilia Heteroderinae. Hasta ahora se han descrito seis géneros

Graney y Miller (1982); Burrows y Stone

Hirschmann y Triantaphyllou (1979)

formadores de quistes y estos pueden identificarse con claves de Wouts y

Wouts y Sturhan (1977) Wouts et

Baldwin (1998) que incluyen tanto quiste como juveniles. Esta clave también

al. ( 2001) Vovlas et al. ( 1985)

es útil a nivel de especie dentro del género. Heterodera ( ver Apéndice 1).

Duggan y Brennan (1966)

Maas (1982)
Glicinas heterodera es miembro de la schachtii grupo,

Referencias

al. ( 1976)
(1985)

(1977)
que incluye más de 10 especies. Personajes del
schachtii- grupo se dan a continuación en la sección 'Quistes'. Algunos miembros
importantes de este grupo se enumeran en la Tabla 1, que también proporciona las
características de diagnóstico más importantes de sus caracteres juveniles de
segunda etapa.

Parte hialina de la longitud de la cola ( l metro)

En la figura 2 se presentan dibujos de machos, hembras, quiste y juvenil de
segunda etapa.

Características morfológicas de H. glycines

21,0 - 33,0 (27,0)

28,0 - 39,0 (33,3)

32,0 - 50,0 (39,0)
31,0 - 42,0 (36,0)
33,2 - 44,7 (40,3)
20,4 - 37,8 (26,3)
22.0 - 33,0 (28,5)
36,9 - 44,6 (40,4)
20,0 - 32,0 (26,0)
25,8 - 30,2 (28,2)
Se deben determinar las características tanto de los quistes como de los juveniles de

33 - 41 (37,5)
segunda etapa y la presencia de machos en la muestra para una identificación
confiable. Estas etapas están normalmente presentes en muestras de suelo

Tabla 1. Varios caracteres de diagnóstico para la diferenciación del juvenil de segunda etapa de Glicinas heterodera de algunas especies estrechamente relacionadas del schachtii- grupo
infestadas; Los juveniles de segunda etapa se pueden obtener directamente de
quistes viables.
En el caso de quistes, se debe examinar el cono vulvar y observar la forma de la

Longitud de la cola ( l metro)

fenestra, el ancho de la vulva y la presencia de un puente inferior y bullas. Para la longitud

40,0 - 61,0 (47,0)

49,0 - 60,0 (55,0)

65,0 - 84,0 (71,0)
53,0 - 72,0 (60,0)
60,5 - 75,1 (68,1)
45,7 - 60,7 (53,5)

58,4 - 76,9 (65,9)

38,0 - 60,0 (47,0)
46,5 - 56 (51,9)
del estilete de los juveniles de segunda etapa, se debe determinar la forma del botón del

41 - 60 (52,0)

56 - 70 (65,3)
estilete y la cola y la longitud de la cola hialina y la longitud del cuerpo.

Hembras sedentarias

Las hembras sedentarias son de color blanco a amarillo pálido, con el cuerpo hinchado,

en forma de limón y con el cuello saliente. El cuerpo suele estar cubierto de crestas
Cóncavo anteriormente

Cóncavo anteriormente

Cóncavo anteriormente

Cóncavo anteriormente

Cóncavo anteriormente

Cóncavo anteriormente

Cóncavo anteriormente

Cóncavo anteriormente
Profundamente cóncava

Profundamente cóncava
Ligeramente cóncava

reticuladas. La matriz gelatinosa o el saco de huevos están presentes y contienen hasta

Perillas de estilete

200 huevos. La capa subcristalina prominente. El estilete es delgado con protuberancias

que se proyectan hacia atrás (inclinadas). En las hembras jóvenes, los ovarios están

emparejados y enrollados, casi llenan todo el cuerpo y se abren posteriormente a través

de la vulva. La vulva y el ano están presentes en una proyección terminal en forma de

cono. La vulva, una hendidura transversal, está rodeada por áreas en forma de media
Longitud del estilete ( l metro)

luna de paredes delgadas, las llamadas semifenestras. La pared del cuerpo de la mujer
22.0 - 26,0 (24,0)

24,0 - 26,0 (25,0)

27,0 - 30,0 (28,6)

25,9 - 28,2 (27,1)
23,4 - 25,8 (24,3)
24,0 - 26,0 (25,0)
26,6 - 33,8 (31,3)
23,0 - 29,0 (26,0)
24,1 - 26,9 (25,7)
26,5 - 29,0 (28,0)

madura, de color amarillo pálido, cambia al morir a un quiste marrón de pared dura.
29,5 - 33 (31,0)

Quistes
Longitud del cuerpo ( l metro)

Los quistes tienen forma de limón con un cuello y un cono que sobresalen. Los
quistes varían en longitud de 340 a 920 l my en ancho de 320 a 610 l metro. La
375 - 540 (470)

400 - 480 (457)

550 - 660 (595)
440 - 585 (525)
495 - 620 (553)
401 - 531 (481)
420 - 510 (460)
430 - 661 (549)
390 - 550 (450)
437 - 492 (469)
494 - 535 (517)

superficie de la cutícula tiene un patrón en zigzag de crestas. La región vulvar

suele estar intacta en los quistes jóvenes; en los ejemplares más antiguos, la
cutícula de pared delgada del cono se pierde dejando una fenestra abierta
atravesada por el puente vulvar y dividiendo la fenestra en dos
semifenestradas (tipo ambifenestrado) (Fig. 3). El puente vulvar lleva la
hendidura vulvar. La hendidura vulvar es más ancha que el ancho fenestral,
H. sonchophila
H. medicaginis
H. galeopsidis
H. lespedezae

respectivamente 50 (45 - 60) l my 40 (32 - 50) l metro. Las bullas son prominentes
H. schachtii
H. glicinas

H. daverti

y alargadas,
H. betae
H. ciceri

H. trifolii
Especies

H. rosii

ª 2018 OEPP / EPPO, Boletín Boletín OEPP / EPPO 48, 64–77

 PM 7/89 (2) Glicinas heterodera 67

Figura 2 Glicinas heterodera. ( A, B, F - H) Juvenil de segunda

etapa: A, cuerpo; B, parte anterior; F, región de la cabeza; G,

estiletes; H, colas. (C) Parte anterior masculina. (D) Cabeza

masculina. (E) Cola. (I) Vista frontal del cono de quiste. (J)

Desarrollo femenino. (UNA - H, J según Hirschmann, 1956; Yo

después de ohshima et al., 1981).

esparcidos justo debajo del puente. El puente inferior bien desarrollado (Fig. (alrededor de 4 l metro). Las espículas son robustas, curvadas ventralmente y 34 (33 - 37) l longitud

4). mínima.

Machos Juveniles de segunda etapa

Los machos suelen estar presentes, con una morfología típica del género (Fig. 2). El Los juveniles de la segunda etapa son vermiformes, anulados y ahusados en ambos

campo lateral tiene cuatro incisiones. La cabeza está compensada con 4 - 5 anillas. El extremos. La longitud del cuerpo varía de 375 a 540 l m, y la cabeza está compensada

estilete es robusto y 27 (25,5 - 28,5) l m de longitud, con protuberancias que con 3 - 4 anillas. El campo lateral tiene cuatro incisiones. El estilete es robusto y de 24

sobresalen anteriormente. La glándula faríngea dorsal se abre cerca de la base del (22 - 26) l m de longitud, con protuberancias cóncavas anteriormente. La cola

estilete gradualmente

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68 Diagnóstico

detección de pequeñas diferencias únicas en las secuencias de rDNA del

espaciador transcrito interno (ITS) de H. glicinas.
Subbotin desarrolló una prueba de polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción (RFLP) por PCR-ITS et al. ( 2000) y probado con varios H. glicinas poblaciones
por
Zheng et al. ( 2000) y Tanha Maafi et al. ( 2003). Esta prueba solo se puede
realizar en individuos identificados como pertenecientes al género Heterodera. Identi
fi cación confiable de los juveniles de segunda etapa de H. glicinas en

También se pueden obtener muestras mezcladas con otros quistes y

Fig. 3 Patrones fenestrales de la región quística terminal de Heteroderinae. (A) Región nematodos que habitan en el suelo utilizando PCR con un cebador específico
vulvar ambifenestrada; región anal no fenestrada. (B) Región vulvar bifenestrada; región de la especie (Subbotin et al., 2001; UNED et al., 2008). El protocolo
anal no fenestrada. (C) Circunfenestrar la región vulvar; región anal no fenestrada. (D) PCR-ITS-RFLP es más informativo pero es más caro y consume más tiempo.
Circunfenestrate la región vulvar con fenestra anal separada. (Según Baldwin & Ye (2012) desarrolló un método de PCR en tiempo real dúplex para una
Mundo-Ocampo, 1991.)
identificación rápida, sensible, específica de la especie y precisa de

H. glicinas solos o en poblaciones mixtas con otros nematodos del quiste.

se estrecha hacia un término finamente redondeado, 47 (40 - 61) l m de largo con una
ClearDetections © También han desarrollado una prueba de PCR en tiempo real
cola hialina parte de 27 (21 - 33) l m de largo. Varios caracteres de diagnóstico para la
para la detección e identificación de
diferenciación de la segunda etapa juvenil de H. glicinas de algunas especies
H. glicinas.
estrechamente relacionadas del schachtii grupo se presentan en la Tabla 1.
Las siguientes pruebas se describen en este protocolo:

• PCR-ITS-RFLP (subbotina et al. 2000); ver Apéndice 2

• PCR dúplex en tiempo real (Ye, 2012); ver Apéndice 3
4.2 Métodos moleculares
• prueba de PCR en tiempo real ClearDetections ©; ver Apéndice 4.
4.2.1 Pruebas de PCR Dado que las características de rendimiento de las diferentes pruebas varían (en

Se han desarrollado varias pruebas basadas en PCR para la identi fi cación de H. particular con respecto a su especificidad), la elección de la prueba debe hacerse de

glicinas. Todas estas pruebas se basan en acuerdo con las circunstancias de uso.

Figura 4 Diagrama que muestra las estructuras de la región del

cono terminal de Heterodera schachtii

quiste grupal. (Según Baldwin y MundoOcampo,

1991.)

ª 2018 OEPP / EPPO, Boletín Boletín OEPP / EPPO 48, 64–77

 PM 7/89 (2) Glicinas heterodera 69

Otra prueba de PCR en tiempo real (Li et al., 2014) ha sido

10. Revisión del protocolo
desarrollado para estimar el número de H. glicinas a partir de muestras de ADN
metagenómico aisladas directamente de suelo de campo en producción agronómica. Existe un proceso de revisión anual para identificar la necesidad de revisar los protocolos
Sin embargo, se necesita una mayor validación en diferentes tipos de suelo y, en de diagnóstico. Los protocolos identificados que necesitan revisión están marcados como
consecuencia, no se describe en su totalidad. tales en el sitio web de la EPPO.

Cuando las erratas y las correcciones estén en prensa, también se marcarán en el

sitio web.
4.2.2 código de barras de ADN

En el Apéndice 5 de PM 7/129 se describe un protocolo para códigos de barras

Agradecimientos
de ADN basado en COI, ADNr 18S y ADNr 28S.
El código de barras de ADN como herramienta de identificación para una serie de plagas Este protocolo fue redactado originalmente por: G. Karssen, Organización

reglamentadas: nematodos de código de barras de ADN ( EPPO, 2016) Nacional de Protección Vegetal, Laboratorio Nacional de Referencia,

y se puede utilizar; sin embargo, los datos de validación no están disponibles para H. Wageningen (NL); S. Subbotin, Plant Pest Diagnostic Center, Departamento

glicinas. Las secuencias están disponibles en Q-bank (http: // de Alimentación y Agricultura de California, 3294 Meadowview Road,

www.q-bank.eu/Nematodes/). Sacramento, CA 95832 (EE. UU.) Y G. Anthoine, LNPV-Unite de Nematologie,

Domaine de la Motte au Viconte BP 35327 Le Rheu (FR ). La revisión ha sido
preparada por LA Pylypenko, Academia Nacional de Ciencias Agrarias, 37
5. Material de referencia Vasylkivska Str., Kiev-22, 03022 (UA).

Profesor Dr. Gerrit Karssen, Organización Nacional de Protección Fitosanitaria,

Nacional Referencia Laboratorio, correos

Box 9102, 6700 HC Wageningen (NL).

Las secuencias están disponibles en Q-bank (http://www.q-bank.eu/Nematodes/).
Referencias

Amiri S, Subbotin SA y Moens M (2003) Morfometría comparativa

y estudios RAPD de Heterodera schachtii y H. betae poblaciones.
6. Presentación de informes y documentación Revista rusa de nematología 11, 91 - 99.
Baldwin JG y Mundo-Ocampo M (1991) Heteroderinae, quiste y no
La EPPO proporciona orientación sobre informes y documentación.
nematodos formadores de quistes. En: Manual de Nematología Agrícola ( Ed. Nickle WR),
Estándar PM 7/77 (1) Documentación y reporte de un diagnóstico. págs.275 - 362. Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY (Estados Unidos).

Brzeski MW (1998) Nematodos de Tylenchina en Polonia y templados

Europa. Muzeum i Instytut Zoologii PAN, Waszawa (PL). 396 p. Burrows PR y Stone
7. Criterios de desempeño AR (1985) Glicinas heterodera. CIH
Descripciones de nematodos fitoparásitos. Conjunto 8, No. 118. CIP, St. Albans (Reino Unido).
Cuando se dispone de criterios de rendimiento, estos se proporcionan con la
descripción de la prueba. Los datos de validación también están disponibles en De Ley P & Blaxter M (2004) Un nuevo sistema para Nematoda:
la Base de datos de EPPO sobre experiencia en diagnóstico (http://dc.eppo.int), combinando caracteres morfológicos con árboles moleculares y traduciendo clados en
y se recomienda que se consulte esta base de datos, ya que puede haber rangos y taxones. En: Monografías y perspectivas de nematología ( Ed. Cook R & Hunt

información adicional disponible allí (por ejemplo, información más detallada DT), págs.633 - 653. EJ Brill, Leiden (NL).

sobre la informes de validación, etc.).

Duggan JJ y Brennan PA (1966) Heterodera rosii ( Heteroderidae), un
nuevas especies de nematodos formadores de quistes del muelle rizado. Revista irlandesa de

investigación agrícola 5, 113 - 120.

8. Más información EPPO (2016) PM 7/129 El código de barras de ADN como herramienta de identificación para

número de plagas reglamentadas. Boletín EPPO 46, 501 - 537.

Se puede obtener más información sobre este organismo de: Profesor Dr. EPPO / CABI (1997) Hojas de datos sobre plagas cuarentenarias: Heterodera

Gerrit Karssen, Organización Nacional de Protección Vegetal, glicinas. En: Plagas cuarentenarias para Europa, Segunda edición (Ed. Smith IM et al. ), págs. 607 - 611.

CAB International, Wallingford, Reino Unido.

Nacional Referencia Laboratorio, correos
Gerber K & Maas PWTh (1982) Una redescripción de Heterodera
Box 9102, 6700 HC Wageningen (NL); Profesor Dr. Sergei Subbotin, Centro de
medicaginis Kirjanova. Nematologica 28, 94 - 100.
Diagnóstico de Plagas de Plantas, Departamento de Alimentación y Agricultura de
Golden AM, Epps JM, Riggs RD, Duclos LA, Fox JA y Bernard RL
California, 3294 Meadowview Road, Sacramento, CA 95832 (EE. UU.). (1970) Terminología e identidad de formas infraespecíficas del nematodo del quiste de la
soja ( Glicinas heterodera). Reportero de enfermedades vegetales 54, 544 - 546.

Graney LSO y Miller LI (1982) Estudios morfológicos comparativos de

9. Comentarios sobre este protocolo de diagnóstico Heterodera schachtii y H. glicinas. En Libro: Nematología en la Región Sur de Estados
Unidos. Boletín 276 de la Serie Cooperativa del Sur, pág. 96 - 107.
Si tiene algún comentario sobre este Protocolo de diagnóstico, o cualquiera de las
pruebas incluidas, o si puede proporcionar datos de validación adicionales para las Hirschmann H (1956) Estudios morfológicos comparativos sobre el
pruebas incluidas en este protocolo que desea compartir, comuníquese con nematodo del quiste de la soja, Glicinas heterodera y el quiste del trébol
[email protected].

ª 2018 OEPP / EPPO, Boletín Boletín OEPP / EPPO 48, 64–77

70 Diagnóstico

nematodo H. trifolii ( Nematoda: Heteroderidae). Actas Wouts WM & Sturhan D (1977) La identidad de Heterodera trifolii
Sociedad Helmintológica Washington 23, 140 - 151. Goffart, 1932, y la descripción de H. daverti norte. sp. (Nematoda: Tylenchida. Nematológica
Hirschmann H & Triantaphyllou AC (1979) Comparación morfológica (1978) 24, 121 - 128.
de miembros de la Heterodera trifolii complejo de especies. Nematologica Ye W (2012) Desarrollo de PCR en tiempo de máxima audiencia en tiempo real para especies

25, 458 - 481. identificación del nematodo del quiste de la soja ( Glicinas heterodera
Ichinohe, 1952) en Carolina del Norte. Revista de nematología 44,
Ichinohe M (1952) Sobre el nematodo de la soja, Glicinas heterodera norte. sp. de Japon. Oyo-Dobutsugaku-Zasshi
17, 1 - 2: 1 - 4. 284 - 290.
Joyce SA, Reid A, Driver F & Curran J (1994) Aplicación de Zheng J, Subbotin SA, Waeyenberge L y Moens M (2000) Molecular
métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la identificación de caracterización del chino Glicinas heterodera y H. avenae
nematodos entomopatógenos. En: Genética de complejos entomopatógenos poblaciones basadas en RFLP y secuencias de regiones de rDNA-ITS.
nematodos-bacteria. Actas del simposio y taller ( Eds. Burnell AM, Ehlers RU y Masson Revista rusa de nematología 8, 109 - 113.
JP), págs.178 - 187.
Colegio de S. Patrick, Maynooth, Co., Kildrare, Irlanda. CE DG XII, Luxemburgo.
Apéndice 1
Kirjanova ES, Krall EL & Krall H (1976) El quiste de cardo
Clave para la identificación de géneros de Heteroderinae que forman quistes y que
nematodo Heterodera sonchophila n.sp. (Nematoda: Heteroderidae) de Estonia. Eesti
no lo hacen (adaptado por Karssen, según Baldwin y Mundo-Ocampo, 1991).
NSV Teaduste Akademia Toimetised, Biologilini Seeria 25, 305 - 315.

Li Y, Lawrence GW, Lu S, Balbalian C & Klink VP (2014)

1. Subecuatorial vulvar 2
Ensayos cuantitativos de campo Heterodera glicinas de muestras de ADN
Terminal de vulva 3
metagenómico aisladas directamente del suelo en producción agronómica. Más uno, 9, e89887.
2. Reniforme femenino Verutus
Manachini B (2000) Primer informe de Glicinas heterodera Ichinohe en
Hembra no reniforme Meloidodera
3. Quiste ausente 4
soja en Italia. Bolletino di Zoologia Agraria e di Bachicoltura, Serie II 32, 261 - 267.
Quiste presente 12
4. Vulva - distancia anal 15 - 35 l m Vulval - distancia 5
Moore WF (1984) Nematodo del quiste de la soja. Mississippi Coop. Ext.
anal> 35 l m El lóbulo de la glándula 9
Servicio, Estados Unidos.
5. faríngea de J2 casi llena el diámetro de 6
Mulvey RH y Anderson RV (1974) Heterodera trifolii. CIH Descripciones de nematodos
parásitos de plantas, conjunto 4, no. 46, 4 p.
cavidad corporal
Niblack TL, Arelli PR, Noel GR, Opperman CH, Orf JH, Schmitt DP
Lóbulo de la glándula faríngea de J2 Atalodera
et al. ( 2002) Un esquema de clasificación revisado para poblaciones genéticamente diversas
angosto, aproximadamente
de Glicinas heterodera. Revista de nematología 34, 279 -
un tercio del diámetro del cuerpo
288.
6. Hembra con redondeado Hylonema
Ohshima Y, Momota Y & Shimizu K (1981) Información adicional sobre
término
algunas características morfológicas de Glicinas heterorodera
Hembra con patrón de cutícula de cono 7
Ichinohe, 1952. Revista japonesa de nematología 10, 52 - 53.
7. distinto de hembra estriado en la mitad Rizonema
Ou S, Peng D, Liu X, Li Y & Moens M (2008) Identi fi cación de
del cuerpo
Glicinas heterodera utilizando PCR con cebadores de región amplificada caracterizada por
Patrón de cutícula no 8
secuencia (SCAR). Nematología 10, 397 - 403.
estriado en la mitad del cuerpo
Riggs RD (2004) Historia y distribución. En: Biología y gestión
8. Patrón de cutícula de zig-zag Sarisodera
del nematodo del quiste de la soja ( Eds. Schmitt DP, Wrather JA et al.), 262 págs. Schmitts &
femenino
Associates de Marceline, Marceline, MO (EE. UU.).
Patrón de cutícula con Ekphymatodera
Riggs RD, Hamblen ML & Rakes L (1981) Variación de infraespecies en
superficie rugosa y
reacciones a los huéspedes en las poblaciones. Revista de nematología 13, 171 -
surcos longitudinales
179.
9. Cutícula femenina con 10
Subbotin SA, Peng D & Moens M (2001) Un método rápido para la
estrías prominentes en
identi fi cación del nematodo del quiste de la soja Glicinas heterodera
medio cuerpo
utilizando PCR dúplex. Nematología 3, 365 - 371.
Cutícula femenina sin 11
Subbotin SA, Waeyenberge L & Moens M (2000) Identificación de quiste
estrías prominentes en
formando nematodos del género Heterodera ( Nematoda: Heteroderidae) basado en el ADN
medio cuerpo
ribosómico-RFLP. Nematología 2, 153 - 164.
10. Hembra madura Bellodera
Tanha Maa fi Z, Subbotin SA y Moens M (2003) Identi fi cación molecular
en forma de limón vulva
de nematodos formadores de quistes (Heteroderidae) de Irán y una filogenia basada en
cono prominente
secuencias de ITS-rDNA. Nematología 5, 99 - 111.
Hembra madura casi Cryphodera
Vovlas N, Greco N y Di Vito M (1985) Heterodera ciceri sp. norte.
esférico; poco o
(Nematoda: Heteroderidae) en Cicer arientinun L. del norte de Siria. Nematologica
sin cono vulvar
Mediterranea 13, 239 - 252.
11. Hembra madura casi Atalodera andinus
Wouts WM & Baldwin JG (1998) Taxonomía e identificación. En los
esférico; poco o
Nematodos del quiste ( Ed. Sharma SB), págs.83 - 122. Kluwer Academic Publishers,
sin prominencia terminal
Dordrecht (NL).
Camelodera
Wouts WM, Rumpenhorst HJ y Sturhan D (2001) Heterodera betae
sp. n., el nematodo del quiste de la remolacha amarilla (Nematoda: Heteroderidae).

Revista rusa de nematología 9, 33 - 42.

(continuado)

ª 2018 OEPP / EPPO, Boletín Boletín OEPP / EPPO 48, 64–77

 PM 7/89 (2) Glicinas heterodera 71

Hembra madura con Puente bajo corto (80 - 130 l m) y

terminal distinta generalmente pesado (15 - 30
prominencia l m de ancho)

12. Quiste sin fenestración Afenestrata 10. Puente vulval alrededor de 15 l m de ancho H. limonii
de la región vulvar fenestra> 50 l Puente Vulval de 4 m de
Quiste con fenestración 13 ancho - 5 l m de ancho fenestra <50 l estilete 11
de la región vulvar J2 de 24 m de ancho l m estilete J2 de unos
13. Quiste con fenestración Punctodera 11. 26 l mo más J2 <430 l m de largo H. tadshikistanica
de la región anal 12
Quiste sin fenestración 14 12. H. mediterranea
de la región anal J2> 430 l m de largo 13
14. Quiste con dos semifenestras en Heterodera 13. Ancho fenestral alrededor de 30 l metro; Parte de cola hialina H. ciceri
región vulvar J2> 30 l m de largo Ancho fenestral alrededor de 40 l metro; J2

Quiste con una fenestra en la 15 cola hialina parte <30 l m de largo J2 alrededor de 500 l mo H. sonchophila
región vulvar más; estilete alrededor de 28 l mo más J2 <500 l metro; estilete

15. Cono terminal prominente Cactodera 14. <28 l m estilete J2 de largo <30 l m de largo machos sin estilete 15
a ligeramente reducido J2> 30 l m de largo los machos presentan una longitud corporal

Cono terminal ausente, dieciséis promedio de J2 alrededor de 600 l m Longitud corporal 17

término redondeado 15. promedio J2 alrededor de 550 l m Machos ausentes H. trifolii
dieciséis. Quiste cutícula en zig-zag Globodera dieciséis

Quiste cutícula estriada Dolichodera dieciséis. H. betae

H. rosii
17. H. lespedezae
Hombres presentes 18
Clave para la identi fi cación de algunas especies del Heterodera schachtii- grupo 18. Puente bajo débil, <15 l m de ancho Puente bajo H. medicaginis
(adaptado por Karssen, según Wouts & Baldwin (1998). pesado,> 15 l estilete J2 de ancho <24 m l m 19
19. estilete J2 de largo> 24 l m de largo H. glicinas
H. daverti
1. Puente doble de forma consistente H. oxiana
Presente en el cono vulvar Puente

inferior en el cono vulvar único o 2

ausente
Apéndice 2 - Prueba PCR-ITS-RFLP (Subbotin
2. Longitud promedio de la hendidura vulvar de un 3
et al., 2000).
quiste joven> 30 l metro

Longitud media de la hendidura vulvar de un H. avenae- grupo

quiste joven <30 l m Quiste ampollado; Debajo

3. del puente 4 1. Información General

generalmente bien desarrollado
1.1 Esta prueba desarrollada por Subbotin et al. ( 2000) se utiliza para la
Ablación de quiste; debajo del puente generalmente H. goettingiana grupo
ausente o disperso
identi fi cación de Glicinas heterodera.
4. Quiste esférico, con corta 5 La prueba solo se puede utilizar en nematodos morfológicamente identi fi cados

protuberancia posterior como Heterodera spp., ya que los cebadores no son específicos de un género.
Quiste en forma de limón, con protuberancia 6
posterior de corta a larga J2 alrededor de 400 l m
1.2 Quistes completos o juveniles de segunda etapa identi fi cados como
5. de largo estilete H. zeae
Heterodera spp. son la fuente de ácido nucleico.
< 25 l m de largo
1.3 La prueba está diseñada para la región del espaciador transcrito
J2 alrededor de 500 l m de largo estilete H. salixophila
> 25 l m de largo interno (ITS) de las secuencias de ADNr de
6. Bullas anales en forma de molar Bullas anales H. schachtii Heterodera spp. produciendo un amplicón de aproximadamente
sin forma de molar Profundidad debajo del 7 1030 pb (Zheng et al., 2000) a 1060 pb (Subbotin et al., 2000) para H.
7. puente 22 - 30 l m, longitud 50 - 80 l metro 8 glicinas.
1.4 Oligonucleótidos: cebadores universales específicos de ITS descritos
Profundidad bajo puente 30 - 86 l m, longitud 70 - 9
por Joyce et al. ( 1994): cebador delantero TW81 (5 0- GTT TCC GTA
160 l metro

8. Bullae pequeñas; longitud fenestral 45 - 68 l metro H. fi ci

GGT GAA CCT GC-3 0)
y cebador inverso AB28 (5 0- ATA TGC TTA AGT TCA GCG GGT-3 0).
Bullas grandes; longitud fenestral 23 - 45 l metro H. cajani

1,5 Taq ADN polimerasa 5 U / l L (Qiagen) utilizado para

9. Puente bajo largo (100 - 150 l m) y delgado (5 - 20 10
Amplificación por PCR y enzimas Alu YO, Ava YO,
l metro)
Bsh 1236I ( Bst UI), Bsu RI ( Hae III), Director de Finanzas YO, Mva YO, Rsa I para la restricción
14
de amplicones.

(continuado)

ª 2018 OEPP / EPPO, Boletín Boletín OEPP / EPPO 48, 64–77

72 Diagnóstico

1.6 La amplificación se realiza en un termociclador (por ejemplo, Gene-E,

New Brunswick Scienti fi c, WezmbeekOppem, Bélgica).
Volumen

Trabajando por reacción Final

Reactivo concentración ( l L) concentración

2. Métodos Grado molecular N/A 12,8 N/A

agua*
2.1 Extracción y purificación de ácidos nucleicos
Enzima restrictiva 10 9 2.0 19
2.1.1 Se transfieren de uno a cuatro quistes a 10 l L de tampón (Promega)
agua bidestilada en un tubo Eppendorf y triturada con un Restricción 10 U l L - 1 0,2 2U
micro-homogeneizador. Ocho microlitros de tampón de lisis de enzima (s) ( Alu yo †)

nematodos (KCl 125 mM; Tris HCl 25 mM, pH = 8,3; 3,75 mM Total parcial 15
Producto de PCR (purificado) 5
Total 20
MgCl 2; DTT 2,5 mM; 1,125% de Tween 20;
0,025% de gelatina) y 2 l L proteinasa K *
Se debe utilizar preferiblemente agua de grado molecular, o prepararla purificada (desionizada o

(600 l g mL - 1) se agregan. Los tubos se incuban a 65 ° C (1 h) y destilada), estéril (esterilizada en autoclave o al 0,45%). l m filtrada) y agua libre de nucleasas.

95 ° C (10 min) consecutivamente.

† El mismo protocolo para cada enzima de restricción individual: Alu YO, Ava YO,

Bsh 1236I ( Bst UI), Bsu RI ( Hae III), Director de Finanzas YO, Mva YO, Rsa YO.
2.1.2 No se requiere limpieza de ADN.
2.1.3 El ADN extraído debe utilizarse inmediatamente o almacenarse a
2.3.2 Tiempo / temperatura de incubación para la digestión: 2 ha 37ºC ° C
aproximadamente - 20 ° C por períodos más largos.

2.2 Reacción en cadena de la polimerasa

2.2.1 Mezcla maestra 3. Información procesal esencial

3.1 Controles

Volumen por
Para obtener un resultado de prueba confiable, se deben incluir los siguientes

Trabajando reacción Final controles (externos) para cada serie de extracción de ácido nucleico y
Reactivo concentración ( l L) concentración amplificación del organismo diana y el ácido nucleico diana, respectivamente:

Grado molecular 54,84

agua* • Control de aislamiento negativo (NIC) para monitorear la contaminación durante
Tampón de PCR (Qiagen) 10 9 Tampón de PCR 10 19
la extracción de ácido nucleico: extracción de ácido nucleico y posterior
conteniendo
amplificación, preferiblemente de una muestra de matriz no infectada o, si no
MgCl 15 mM 2
está disponible, tampón de extracción limpio.
dNTP (Qiagen) 10 mM cada uno 2 200 l M cada uno

5 9 Q-solución 59 20 19
(Qiagen) • Control de amplificación negativo (NAC) para descartar falsos positivos por
Imprimación directa 100 l METRO 1,5 1,5 l METRO contaminación durante la preparación de la mezcla de reacción:
( TW81) amplificación de agua de grado molecular que se utiliza para preparar la
Imprimación inversa 100 l METRO 1,5 1,5 l METRO
mezcla de reacción.
( AB28)
• Control positivo de amplificación (PAC) para monitorizar la e fi ciencia de
Taq ADN polimerasa 5 U l L-1 0,16 0,8 U
la amplificación: amplificación del ácido nucleico del organismo diana.
(Qiagen)
Total parcial 90 Esto puede incluir ácido nucleico extraído del organismo diana o un
Extracto de ADN genómico 10 control sintético (por ejemplo, producto de PCR clonado).
Total 100

*
• Como la prueba implica el uso de cebadores universales que
Se debe utilizar preferiblemente agua de grado molecular, o prepararla purificada (desionizada o
amplificarán la región 18S en todos los casos para muestras eucariotas,
destilada), estéril (esterilizada en autoclave o al 0,45%). l m filtrada) y agua libre de nucleasas.
se controlará la calidad del ADN extraído de cada muestra individual.

2.2.2 Parámetros de ciclos de PCR 3.2 Interpretación de resultados:

4 min en 94 ° C, 35 ciclos de 1 min a 94 ° C, 1,5 min a 55 ° C, 2 min a 72 ° C, Para asignar los resultados de una prueba basada en PCR, se deben

alargamiento final 10 min a 72 ° C. seguir los siguientes criterios:

2.3 Restricción del amplicón de PCR Verificación de los controles

2.3.1 Mezcla de reacción • NAC no debe producir amplicones.

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 Tabla 2. Tamaños aproximados de fragmentos de restricción de regiones de ITS-rDNA para nematodos formadores de quistes

Especies Alu yo Ava yo Bsh 1236I Bsu Rhode Island Director de Finanzas yo Mva yo Rsa yo

H. avenae ( escribe un) 1060 1060 880, (500, 380), 140 420, 360, 180, 50 750, 160, 110 400, 330, 290 1040
H. avenae ( tipo B) 560, 500 1060 880, 140 420, 360, 180, 50 750, 160, 110 400, 330, 290 720, 320

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H. arenaria 1060 1060 880, 140 420, 360, 180, 50 750, 160, 110 400, 330, 290 1040
H. fi lipjevi 560, 500 1060 880, 140 435, 370, 180, 50 750, 160, 110 400, 330, 290 720, 320
H. aucklandica 560, 500 1060 880, 140 420, 360, 180, 50 750, 200, 110 400, 330, 290 720, 320
H. iri 560, 500 1060 540, 340, 140 420, 360, 180, 50 410, 340, 160, 110 420, 330, 290 720, 320
H. latipons 420, 350, 180 1060 880, 160 530, 510 750, 110 420, 330, 290 900, 160
H. hordecalis 880, 180 1060 700, 180, 140 530, 435, 50 750, 160, 110 440, 330, 290 1040
H. schachtii 350, 280, 180, 170 560, 370, 130 520, 380, 140 530, 300, 210 430, 320, 150, 110 1010, 840, 760, 630, 220, 150, 80 830, 460, 380, 230
H. trifolii ( 390), 350, 280, 180, 170 560, 370, 130 520, 380, 140 530, 300, 210 430, 320, 150, 110 760, 220, 80 830, 600, 230
H. medicaginis 350, 280, 180, 170 560, 370, 130 520, 380, 140 530, 300, 210 430, 320, 150, 110 760, 220, 80 830, 230
H. ciceri 390, 350, 280, 180, 170 560, 370, 130 500, 380, 140 530, 300, 210 750, 430, 320, 150, 110 760, 220, 80 830, 600, 230
H. salixoplila 560, 500 930, 130 530 450, 435, 80 200, 160, 150 400, 330, 290 770, 290 [1060]
H. oryzicola 330, 295, 200, 150 1010 320, 270, 200, 130 360, 210, 80 470, 330, 150, 60 470, 300, 210 870, 90
H. glicinas 350, 280, 180, 170 560, 510 520, 380, 140 530, 300, 210 430, 320, 150, 110 760, 220, 80 830, 230
H. cajani 360, 200, 180, 140, 100 560, 510 470, 380, 140 530, 310, 120 320, 270, 160, 150 760, 300 1060
H. humuli 460, 250, 180, 170 930, 130 880, 140 450, 110, 50 600, 160, 150 760, 300 760, 260
H. ripae 630, 250, 180 930, 130 880, 140 450, 110, 50 250, 180, 170, 160, 150 760, 300 760, 260
H. fi ci 780, 180, 100 930, 130 880, 140 560, 450, 50 600, 160, 150 690, 200, 80 560, 480
H. litoralis 880, 180 930, 130 670, 390 610, 450 350, 310, 250, 150 560, 310, 290, 240 800, 260
H. carotae 530, 250, 230 1060 830, 140, 70 530, 330, 170 480, 270, ( 220), 170, 110 760, 300 600, 330, 130
H. cruciferae 530, 250, 230 1060 830, 140, 70 530, 330, 170 480, 270, 170, 110 760,300 600, 330, 130
Heterodera sp. 450, 400, 240 1060 900, 160 360, 250, 180, 150, 90 410, 160, 110, 80 800,260 1060
H. cyperi 410, 360, 200, 160 1100 710, 240, 150 450, 250, 200,100, 50 480, 330, 130, 100 780, 320 950, 150
H. goettingiana 350, 250, 230 1060 830, 230 530, 330, 170 280, 270, 190, 110 760, 300 480, 210, 130, 120
H. urticae 530, 250, 230 1060 830,120 530, 330,170 480, 270, 170, 110 760,300 600, ( 460), 330, 130

Números en cursiva, fragmentos adicionales; (), fragmentos de restricción adicionales para algunas poblaciones; [], restricción solo para algunas poblaciones.
PM 7/89 (2) Glicinas heterodera
73
74 Diagnóstico

Figura 5 Perfiles RFLP para los nematodos del quiste después de la restricción de los productos de PCR por la enzima Ava I. Los carriles son los siguientes: M, escalera de ADN de 100 pb, Promega; U, producto de PCR

sin restricciones; 1 y 2, Heterodera avenae; 3, H. arenaria; 4 H. fi lipjevi; 5 H. aucklandica; 6, H. ustinovi; 7, H. latipons;

8, H. hordecalis; 9, H. schachtii; 10, H. trifolii; 11, H. medicaginis; 12, H. ciceri; 13, H. salixophila; 14, H. oryzicola; 15, H. glicinas; dieciséis,
H. cajani; 17, H. humuli; 18, H. ripae; 19, H. fi ci; 20, H. litoralis; 22, H. cruciferae; 23, Heterodera sp. desde Cynodon dactylon; 24, H. cyperi; 25,
H. goettingiana; 26, H. urticae; 27, Meloidodera alni. ( Después de Subbotin et al., 2000.)

• PIC, PAC debe producir amplicones de 1030 - 1060 pb. H. ciceri, H. medicaginis ( Figura 4) (Subbotin et al., 2000;
• Todas las muestras deben producir un amplicón. Amiri et al., 2003) y una especie no descrita del
Cuando se cumplen estas condiciones schachtii grupo (Tanha Maafi et al., 2003). Ninguna de las otras enzimas
• Una prueba se considerará positiva si los amplicones de 1030 - Se probadas permitió una discriminación confiable de
producen 1060 pb. H. glicinas con tal Ava Yo haplotipo de H. trifolii,
• Una prueba se considerará negativa si no produce una banda o una H. ciceri o H. medicaginis. La enzima de restricción Mav yo
banda de diferente tamaño. se puede utilizar para la separación de H. schachtii de otras especies del schachtii
• Las pruebas deben repetirse si se obtienen resultados contradictorios o grupo, incluido H. glicinas ( Subbotin
poco claros. et al., 2000; Amiri et al., 2003).

Identi fi cación de especies

4. Criterios de desempeño disponibles
Patrones RFLP para H. glicinas y otra Heterodera Las poblaciones de especies se
dan en la Tabla 2. 4.1 No se dispone de datos sobre sensibilidad analítica.
Los perfiles RFLP más específicos para H. glicinas son generados por la 4.2 Datos específicos analíticos
enzima de restricción Ava I. Porque el genoma de H. glicinas contiene varios La especificidad analítica de la prueba se evaluó contra
haplotipos de ITS-rDNA y su proporción puede variar entre poblaciones e H. avenae ( escribe un; una población), H. avenae ( tipo B; una población), H.
individuos; esta enzima puede generar varios perfiles de RFLP. arenaria ( una población), H. fi lipjevi
(una población), H. aucklandica ( una población), H. iri
Patrón I: dos fragmentos de restricción de aproximadamente 550 y 480 pb (dos poblaciones), H. latipons (uno población),
de longitud (Fig. 5). Este patrón se observa en las poblaciones H. hordecalis ( dos poblaciones), H. schachtii ( tres poblaciones), H. trifolii ( dos
estadounidenses de H. glicinas. Esta enzima también produce un perfil RFLP poblaciones), H. medicaginis ( una población), H. ciceri ( una población), H.
similar para H. cajani. Varias otras enzimas, por ejemplo Rsa Yo, puedo usar salixophila ( dos poblaciones), H. oryzicola ( una población), H. glicinas
para distinguir
H. glicinas desde H. cajani. Rsa No digiero el producto de PCR de H. cajani, mientras (una población), H. cajani ( una población), H. humuli
que genera dos o tres fragmentos después de la digestión del producto de (una población), H. riparia ( dos poblaciones), H. litoralis
PCR de H. glicinas (uno población), H. carotae (dos poblaciones),
(Subbotin et al., 2000; Tanha Maa fi et al., 2003). H. cruciferae ( una población), Heterodera sp. (una población), H. cyperi ( una
Patrón II: cuatro fragmentos de restricción de aproximadamente población), H. goettingiana ( dos poblaciones), H. urticae ( dos poblaciones) y Meloidodera
550, 480, 370 y 110 pb de longitud (Zheng et al., 2000). Este perfil RFLP es alni ( dos poblaciones). Enzimas Alu YO, Ava YO, Director de Finanzas YO, Hpa II,
único para H. glicinas y se encuentra en poblaciones chinas.
Mva YO, Rsa yo y Scr FI separó las especies estrechamente relacionadas y
Patrón III: tres fragmentos de restricción de aproximadamente morfológicamente poco distinguidas de las
550, 370 y 110 pb de longitud. Este per fi l se observa para una población iraní H. schachtii s. str. grupo H. schachtii, H. glicinas,
(Tanha Maa fi et al., 2003) y algunos H. trifolii, H. medicaginis y H. ciceri) de cada uno
H. glicinas quistes de China (Zheng et al., 2000). También se encuentran y todas las demás especies (después de Subbotin et al., 2000).

perfiles RFLP similares para H. schachtii, H. trifolii,

ª 2018 OEPP / EPPO, Boletín Boletín OEPP / EPPO 48, 64–77

 PM 7/89 (2) Glicinas heterodera 75

Especificidad analítica de la prueba usando solo la enzima de restricción Ava 1.8 Sistema de PCR en tiempo real: sistema Cepheid SmartCycler II (Sunnyvale,
Fui evaluado en Anses, Laboratoire de la Sante des Vegetaux - Unite de CA, EE. UU.).
Nematologie (Le Rheu, FR) para H. glicinas ( una población), H. betae / 1.9 Software para análisis / configuración de datos: Software SmartCycler.
trifolii ( una población), H. humuli ( dos poblaciones),

H. cajani ( una población), H. schachtii ( tres poblaciones), H. avenae ( cinco

2. Métodos
poblaciones), H. ciceri ( una población), H. fi lipjevi ( una población), H.
latipons ( una población), H. sacchari ( una población), G.pallida 2.1 Extracción y purificación de ácidos nucleicos
2.1.1 Se colocan de uno a diez quistes, juveniles de segunda etapa o huevos

(una población), G.rostochiensis ( una población), en un portaobjetos de microscopio, se aplastan con la punta de una

G.tabacum ( una población), M.hapla una población). pipeta bajo microscopía óptica y se recogen en 50 l L de tampón AE

Como reacciones cruzadas con H. betae / trifolii, H. schachtii (Tris-HCl 10 mM,

y H. ciceri ( todos pertenecientes al grupo Schachtii que también incluye H. EDTA 0,5 mM; pH 9,0) en un microtubo de 0,5 ml.
glicinas) se detectaron especificidad analítica que resultó no ser suficiente
(más detalles en: http://dc.eppo.int/validationlist.php?action=filter&taxo 2.1.2 No se requiere limpieza de ADN.
nomic = Nematoda & organism = H & validationprocess = & me 2.1.3 El ADN extraído debe utilizarse inmediatamente o almacenarse a
aproximadamente - 20 ° C por períodos más largos.
thod =).
4.3 No se dispone de datos sobre repetibilidad 2.2 Reacción en cadena de la polimerasa

4.4 No se dispone de datos sobre reproducibilidad 2.2.1 Mezcla maestra para PCR simplex en tiempo real:

Apéndice 3 - RCP en tiempo real dúplex (Ye, 2012). Volumen

por
Trabajando reacción final
1. Información General Reactivo concentración ( l L) concentración

1.1 Esta prueba se utiliza para la identificación de Heterodera Agua de grado molecular * 6.5
glicinas. Cepheid Omni Mix HS Una cuenta de PCR 10.0 N/A

1.2 Protocolo desarrollado por Ye (2012). Master Mix (Takara se reconstituye

Bio Inc. Otsu, Shiga, JP) con 30.0 l L de
1.3 Se extrae ADN de quistes, juveniles de segunda etapa y huevos.
grado molecular
agua
1.4 La región objetivo es la secuencia genómica marcadora de la región
Imprimación directa ( SCNrtF) 2 l METRO 2.5 0,2 l METRO
amplificada caracterizada por secuencia del nematodo del quiste de la Imprimación inversa ( SCNrtR) 2 l METRO 2.5 0,2 l METRO

soja (SCN) (Ou et al., 2008). Sonda 1 ( SCNrtP) 2 l METRO 2.5 0,2 l METRO

1.5 cebadores / sonda específicos de SCN: cebador directo SCNrtF 5 0- AAA Total parcial 24

TTC CAG GCC GCT ATC TC-3 0 y ADN 1

Total 25
cebador inverso SCNrtR 5 0- CGT GGA CTG AAC TGG ACA AAG-3 0
( longitud esperada del fragmento = 83 pb). La sonda de doble * Se debe utilizar preferiblemente agua de grado molecular, o prepararla purificada (desionizada o
apagado es SCNrtP: 6.5 0 / destilada), estéril (esterilizada en autoclave o 0.45 l m filtrada) y agua libre de nucleasas.

56 - FAM / TGGGCTGGG / ZEN / TGCTTCTAGAACT

TTT / 3IABkFQ / 3 0 ( temperatura de fusión: 60,5 ° C).
Oligonucleótidos universales para un control endógeno de nematodos 2.2.2 Parámetros de los ciclos de PCR en tiempo real

para detectar la presencia del gen de ADNr 18S: cebador directo Ne18Sf Desnaturalización a 95 ° C durante 2 min, seguido de 50 ciclos de desnaturalización

5 0- ATT GAC GGA AGG GCA CCA C-3 0; cebador inverso Ne18Sr 5 0- GAA inicial de la plantilla a 95 ° C durante 10 s, fase de recocido y extensión a 62 ° C

CGG CCA TGC durante 45 s.

ACC AC-3 0; Investigacion Ne18Sp 5 0 / 5-TET /

TGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGG / 3IABkFQ / 3 0
3. Información procesal esencial
(temperatura de fusión: 61,6 ° C).
1.6 La mezcla maestra Cepheid OmniMix HS (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, JP) se 3.1 Controles
utiliza para la amplificación por PCR en tiempo real. La mezcla maestra se Para obtener un resultado de prueba confiable, se deben incluir los
compone de perlas de reactivo que se reconstituyen en agua. siguientes controles (externos) para cada serie de aislamiento de ácido
nucleico y amplificación del organismo diana y el ácido nucleico diana,
1.7 Se utiliza agua de grado molecular para preparar mezclas de reacción; respectivamente:
esto debe ser puri fi cado (desionizado o destilado), estéril • Control de aislamiento negativo (NIC) para monitorizar la contaminación durante la

(autoclavado o 0,45 l m- filtrado) y libre de nucleasas. extracción de ácido nucleico: tampón de extracción limpio.

ª 2018 OEPP / EPPO, Boletín Boletín OEPP / EPPO 48, 64–77

76 Diagnóstico

• Control de amplificación negativo (NAC) para descartar falsos positivos lo mismo con las muestras que comprenden un solo quiste o hasta diez quistes. Se
por contaminación durante la preparación de la mezcla de reacción: obtuvieron resultados similares para un solo juvenil de segunda etapa o un solo
amplificación del agua de grado molecular que se utiliza para preparar la huevo, pero el valor de Ct es más alto que el de una muestra de quiste.
mezcla de reacción.
• Control positivo de amplificación (PAC) para monitorizar la e fi ciencia de La PCR en tiempo real dúplex no tuvo éxito en todas las muestras. Solo el
la amplificación: amplificación del ácido nucleico del organismo diana. colorante TET puede detectarse para la presencia del gen del ADN que codifica
Esto puede incluir ácido nucleico extraído del organismo diana, ADN el ARN ribosómico (rADN) del nematodo 18S, pero no el colorante FAM para la
amplificado de genoma completo o un control sintético (por ejemplo, presencia del fragmento de ADN SCAR en SCN. Sin embargo, todas estas
producto de PCR clonado). pruebas tuvieron éxito cuando las reacciones se realizaron por separado (Ye,

• Opcionalmente, se puede usar un control de aislamiento positivo (PIC) 2012).

para asegurar que se aísle un ácido nucleico en cantidad y calidad 4.3 No se dispone de datos sobre repetibilidad
suficientes: extracción de ácido nucleico y posterior amplificación del 4.4 No se dispone de datos sobre reproducibilidad
organismo diana. 4.5 Información adicional
3.2 Interpretación de resultados Esta prueba fue evaluada en Anses, Laboratoire de la Sante des Vegetaux - Unite
Verificación de los controles de Nematologie (Le Rheu, FR). Se observó una reacción cruzada con H.
• Las curvas de amplificación PIC (si se utilizan) y PAC deben ser goettingiana; sin embargo, esta fue una reacción tardía (con un valor Ct ≥ 30).
exponenciales.
• NIC y NAC no deben proporcionar amplificación. Para obtener más detalles, consulte: http://dc.eppo.int/validationlist.php? action =

Cuando se cumplen estas condiciones filter & taxonomic = Nematoda & organism = H & vali

• Una prueba se considerará positiva si produce una curva de dationprocess = & método =).
amplificación exponencial.
• Una prueba se considerará negativa si no produce una curva de
Apéndice 4 - Prueba de diagnóstico por PCR en tiempo real para la
amplificación o si produce una curva que no es exponencial.
identi fi cación y detección de
H. glicinas, basado en el mDNA de COI
• Las pruebas deben repetirse si se obtienen resultados contradictorios o
poco claros.
En las condiciones descritas en este artículo, los resultados de todas las
1. Información General
pruebas de PCR en tiempo real son 100% específicos y precisos para la
detección de SCN con un ciclo de umbral FAM (valor Ct) de 25 - 42. Dado que 1.1 Alcance de la prueba: identificación de un solo H. glicinas

un valor de corte de Ct depende del equipo, el material y la química, debe quistes mediante PCR en tiempo real y detección de H. glicinas

verificarse en cada laboratorio al implementar la prueba. nematodos en fondos de ADN complejos (mezclas de quistes) mediante PCR

en tiempo real.

1.2 Esta prueba está disponible como un kit de PCR en tiempo real con todo
incluido (ClearDetections, NL; www.cleardetec tions.com)
4. Criterios de desempeño disponibles

La determinación de la sensibilidad analítica y la especificidad analítica se 1.3 Esta prueba se dirige al gen del ADN mitocondrial COI.

realizó en un sistema Cepheid SmartCycler II (Sunnyvale, CA, EE. UU.). 1.4 El amplicón tiene más de 400 pb de longitud.

1.5 No se describen secuencias de oligonucleótidos.

4.1 Datos de sensibilidad analítica 1.6 Esta prueba se desarrolló en un sistema de PCR en tiempo real CFX

La sensibilidad analítica es de un solo huevo, un solo juvenil de segunda etapa, una (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.).

dilución de 10 veces de un solo juvenil de segunda etapa y una dilución de 20 veces de

un solo quiste (Ye, 2012).

2. Métodos
Tanto la dilución de 10 veces de un solo juvenil de SCN de segunda etapa como la

dilución de 20 veces de un quiste de SCN único arrojaron resultados confiables similares a 2.1 Extracción de ácidos nucleicos

las muestras no diluidas con poca variación en el valor de Ct. Esta prueba de PCR en tiempo real se puede combinar con cualquier método de extracción de

ADN de nematodos que entregue el ADN diana.

4.2 Datos específicos analíticos 2.2 PCR en tiempo real

La especificidad analítica de los conjuntos de cebadores / sondas de SCN se probó Todos los componentes necesarios de la prueba de PCR en tiempo real están incluidos en el

contra otros nematodos formadores de quistes ( H. fi ci, kit de PCR en tiempo real:

H. schachtii, H. trifolii, Cactodera weissi, Globodera tabacum, Meloidodera fl • Conjunto de cebadores de PCR en tiempo real (específico de especie, directo y inverso)

oridensis) así como contra no-

nematodos formadores de quistes, incluidos Ditylenchus dipsaci, • Mezcla de PCR liofilizada con tinte fluorescente de unión al ADN

Meloidogyne incognita y Xiphinema chambersi. Una mezcla-

tura de diez muestras sin SCN dieron negativo, pero positivo cuando se • Control de amplificación positivo (PAC)

añadió SCN en la muestra. Esta prueba funciona el • Tampón de resuspensión (libre de DNasa / RNasa)

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 PM 7/89 (2) Glicinas heterodera 77

• Protocolo de banco. • NIC y NAC no deben proporcionar amplificación.

Cuando se cumplen estas condiciones:

2.2.1 Condiciones de ciclo de PCR: • Una prueba se considerará positiva si produce una curva de
3 min a 95 ° C, 35 ciclos de 10 sa 95 ° C, 1 min a 63 ° C, 30 sa 72 ° C, 0,2 - 0,5 ° C amplificación exponencial.
pasos a 72 ° C? 95 ° C. • Una prueba se considerará negativa si no produce una curva de
amplificación exponencial.
• Se realiza un análisis de la curva de fusión y se obtiene
3. Información procesal esencial
T METRO valor es igual al T METRO valor del PAC.
3.1 Controles • Las pruebas deben repetirse si hay alguna contradicción o
Para obtener un resultado de prueba confiable, se deben incluir los se obtienen resultados poco claros.

siguientes controles para cada serie de extracción de ácido nucleico y • El kit de diagnóstico de PCR en tiempo real ClearDetections General
amplificación del organismo diana y el ácido nucleico diana, Nematode se puede utilizar en caso de duda sobre la presencia de ADN de
respectivamente: nematodo en una muestra de ADN (verifique posibles falsos negativos).
• Control de aislamiento negativo (NIC) para monitorizar la contaminación
durante la extracción de ácido nucleico: extracción de ácido nucleico y
posterior amplificación, preferiblemente tampón de extracción limpio.
4. Criterios de desempeño disponibles

• Control de amplificación negativo (NAC) para descartar falsos positivos por Esta prueba de PCR en tiempo real está validada de acuerdo con PM 7/98.

contaminación durante la preparación de la mezcla de reacción: 4.1 Sensibilidad analítica: <1 huevo de quiste único.
amplificación de agua de grado molecular. 4.2 Especificidad analítica: 100%.
• Control de amplificación positivo (PAC, incluido en el kit) para monitorizar Número de cepas / poblaciones de organismos objetivo analizados: seis H.
la e fi ciencia de la amplificación: amplificación del ácido nucleico del glicinas cepas probadas in vitro.
organismo diana. Esto puede incluir ácido nucleico extraído del organismo Número de organismos no objetivo analizados: 11 especies de nematodos del quiste no

diana o un control sintético (por ejemplo, producto de PCR clonado). objetivo analizadas en silico más 15 especies de nematodos del quiste no objetivo

probadas in vitro.

3.2 Interpretación de los resultados Para asignar los resultados de las pruebas 4.3 Especificidad diagnóstica: 100%.
basadas en PCR, se deben seguir los criterios siguientes. 4.4 Reproducibilidad: 100%.
4.5 Repetibilidad: 100%.
Verificación de los controles 4.6 Robustez: 100%.
• Las curvas de amplificación de PAC deben ser exponenciales.

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