2021 Tecnicas Biotecnologia Reproductiva
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2021 Tecnicas Biotecnologia Reproductiva
EMBRIONES BOVINOS
Asesores
2021
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Resumen
2
Abstract
Ovum Pick Up, allows us to implement genetic improvement through the production
of embryos, facilitating profitability in the country's livestock environment, so there
are two important techniques that are, the production of embryos in vivo with MOET
technology and the production of in vitro embryos with OPU technology.
Superovulation is the increase in the physiological number of ovulations typical of
the species, caused by the administration of gonadotropins, in order to obtain several
offspring naturally in a short time, from a genetically superior female. Transvaginal
follicular aspiration is a technique by which immature oocytes are collected from the
follicles in the ovaries of a live cow by ultrasound-guided aspiration through the
vaginal wall. Within the bovine reproduction program, it is necessary to know in depth
each hormone used for superovulation in females and to have experience when it
comes to extracting fertile oocytes and ovules.
3
Introducción
4
reclutamiento de los ovocitos disponibles en el ovario de la hembra para realizar la
fecundación (7).
5
Marco conceptual
Dinámica folicular
Fuente: (40)
6
Técnica MOET
Los tratamientos a base de hormonas para producir una ovulación múltiple (OM),
junto a la transferencia de embriones (TE), hacen posible utilizar intensivamente a
las hembras superiores genéticamente. Este conjunto de tecnologías se denomina
de manera internacional, como MOET (ovulación múltiple y transferencia de
embriones) (8). Se compone de varios procesos como la superovulación,
inseminación artificial a tiempo fijo (IATF), cultivo in vivo de embriones, recuperación
de embriones, y la transferencia de embriones (8). Para esta técnica, es necesario
contar con una hembra donante, preferiblemente de alto valor genético, esto con el
fin de producir embriones de alta calidad para el productor, quien busca aumentar
el número de animales puros en su hato, agilizar el desarrollo genético con animales
superiores de doble aporte, tanto materno como paterno (8).
7
para estimular el ovario, puesto que las dosis de administración influye de forma
significativa en los resultados. La superestimulación ovárica afecta a la calidad de
los embriones recogidos, pero, por otro lado, mejora la capacidad del ovocito para
completar su maduración, y aumenta los porcentajes de desarrollo hasta blastocisto
(13). Esta biotecnología se basa en el proceso de inseminación de una hembra, con
un toro de alto valor genético, estos embriones van a ser recogidos mediante un
lavado uterino el cual se realiza el día 7 después del protocolo hormonal, estos
embriones que se recogen, pasan por un proceso de conservación a bajas
temperaturas y deben ser transferidos en el menor tiempo posible a la hembra
receptora (14).
Para escoger una óptima receptora es importante que sea un animal con una
excelente habilidad materna, por lo general se utilizan híbridos con habilidad
materna en donde se implantará el embrión, se llevará a cabo toda la gestación,
hasta culminar en el parto (15). Se realizan 2 o 3 Inseminaciones Artificiales (IA) por
protocolo, al requerirse la IATF con dosis de diferentes toros, convirtiéndose en un
proceso de resultados impredecibles o al implementar semen sexado (para producir
crías de sexo conocido), el porcentaje de embriones viables recuperados por lavado
(MOET), disminuye debido a su menor fertilidad con semen sexado relación al
semen no sexado y al menor número de espermatozoides/pajilla, de forma que el
número de pajillas de semen utilizadas aumenta (17)(18).
Protocolos de Súperovulación
Los protocolos usados en las hembras bovinas se inician en el diestro entre el día
8 o 14 del ciclo (28), y se caracterizan por tener tres tipos diferentes de
gonadotropinas para inducir superovulación como son las gonadotropinas de
extractos de pituitaria de animales domésticos, la (FSH), la gonadotropina coriónica
equina (eCG) y gonadotropina menopaúsica humana (hMG). La PGF2 se ha
utilizado para inducir luteólisis en los regímenes super-ovulatorios para permitir una
buena sincronización del inicio del celo y de la ovulación (19)
8
Tabla 1. Programa de superovulación después de un celo natural
Fuente: (7)
Tabla 2. Superovulación con FSH
9
Tabla 3. Protocolo de superovulación con progestágenos
Día Hora/Dosis
0 Colocación del dispositivo intravaginal + BE+ P4
7 hrs FSHp
4
19 h FSHp
7 h FSHp
5
19 h FSHp
7 h FSHp + 1 Dosis de PF2
6
19 h FSHp + 1 Dosis de PF2
7 h FSHp - retiro del dispositivo
7
19 h FSHp
8 GnRH o LH, presentación del celo e IA
9 Inseminación Artificial (IA)
15 Colecta de embriones
Fuente: (7)
Recuperación embrionaria
Este proceso se realiza preferiblemente acompañado de anestesia epidural para
evitar daños y lesiones para el operario o el animal además de tener una zona de
trabajo limpia y con materiales estériles que se componen de los siguientes
implementos.
Catéter de 52 cm
Fiador de 60cm.
Una llave de tres vías, con un extremo adaptado al catéter de recolección y los
otros dos conectados a canales de entrada y salida del líquido de recolección.
Una jeringa de 10mL y otra de 60mL.
Filtro de recogida de embriones.
Dilatador cervical.
Líquido de recogida.
10
Gelatina sin espermicida, especial para la recogida de embriones.
Condiciones Sanitarias
Es necesaria una revisión veterinaria general y ginecológica para comprobar que
las hembras son idóneas en su función como donante. Solo se permiten animales
sanos, ya que se tiene la premisa que hembras sanas generan embriones sanos.
(19).
Hay algunos índices que se pueden tener en cuenta para la selección de la hembra
desde el punto de vista sanitario, por ejemplo, que la hembra provenga de un rebaño
fértil y con buen manejo ya sea de alimentación y mantenimiento, además de estar
libre de Tuberculosis, Brucelosis, Paratuberculosis, BVD e IBR en el caso de
mostrar resultado positivo respecto a BVD/IBR, deberá ser negativo a la presencia
de partículas virales. También en su historial de partos no deberá contar con
distocias, por otra parte, esta hembra tendrá puerperios normales, con periodos
entre partos e índice de inseminación por preñez bajos, además, que muestren celo
11
por tarde, 4 semanas post-parto, con celos posteriores regulares. Se deben
descartar hembras con baja condición corporal (mínimo 3, en escala de 1-5),
diarrea, cojeras, con estado ginecológico anormal luego de un puerperio
problemático. Se pueden tratar aquellas donantes que por alguna carencia haya
presentado problemas reproductivos, antes de su descarte (19).
12
Técnica Aspiración Folicular (OPU)
La aspiración folicular guiada por ultrasonografía para la recuperación repetida de
ovocitos de hembras donantes vivas fue desarrollado a finales de la década de 1980
esta técnica se ha convertido en una de la predominante para la recolección de
ovocitos de ganado vivo (19). Se ha determinado mediante un estudio que el
número total anual de colecciones de OPU en los Estados Unidos creció de 2,000
colecciones en 2000 a 32,000 colecciones en 2015 (20). Esta técnica permite
producir embriones a partir de ovocitos, los cuales son fecundados en un laboratorio
de alta genética, estos se cultivan in vitro, durante un periodo de 7 días, a partir de
este momento, se realiza una selección de los embriones viables para transferirse
a las hembras receptoras o de ser necesario, pasar a un periodo de conservación a
través de la congelación (21).
Mediante el desarrollo del sistema de punción que se realiza vía transvaginal guiado
por ultrasonografía, se permite de manera innovadora que la obtención de ovocitos
sea en hembras donantes vivas, debido a que anteriormente solo se realizaba en
hembras donantes muertas, después de su fecundación, se procede a transferir los
embriones a las hembras receptoras. Para realizar este procedimiento se necesita
un equipo de ultrasonido, una bomba de aspiración y un sistema guía de aguja
hipodérmica desechable calibre 18, que va conectado a el tubo colector, este debe
contar con una presión entre 50-85 mm Hg y una temperatura de 38°C. Para la
seguridad del operario y hacer más efectivo el procedimiento, se recomienda hacer
una previa sedación de la hembra. Lo más utilizado para esto es Democedan
(clorhidrato de detomidina) vía endovenosa (posología de 1mg/100kg peso vivo), y
la xilacina (22).
13
mantengan vivos, igualmente, estos ovocitos recolectados deben estar en un medio
de Tyrode's Albúmina Lactato Piruvato (TALP) (22), que es enriquecido con suero
de ternero fetal al 2%, penicilina 100UI/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml y heparina
5UI/ml; lo adecuado es que se deben perforar los folículos mayores a 3 mm de
diámetro durante cada sesión OPU (23).
14
Fertilización y Producción de Embriones in vitro
Los ovocitos recuperados son sometidos al tratamiento propuesto por Pontes et al.
(25) El material que se aspira, se filtran a través de un filtro EmCon con solución
salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado con suero fetal bovino (SFB) al
5%. Antes de la maduración in vitro (MIV), los complejos del cúmulo del oocito
(COC) se lavan tres veces con TCM-199 HEPES suplementado con SFB al 10% y
sulfato de gentamicina 50 g y una vez en bicarbonato TCM-199,suplementado con
SFB al 10%, 5 g de hormona luteinizante (LH), 0.5 g hormona folículo estimulante
(FSH - Folltropin), 1 g de estradiol (17β estradiol), 2.2 g de piruvato, 50 g de
gentamicina/ml de medio. Después de la maduración, los COC se lavan tres veces
en el medio de pre-fertilización de TCM-199 suplementado con HEPES 25 mM y
albúmina sérica bovina (BSA) al 0.3% y una vez en medio de fertilización TALP
suplementado con 10 g/ml de heparina y 160 µl de solución PHE. Se realiza la FIV.
El semen se separa en Percoll 90 al 45% y se centrifuga (200 g) durante 30 min,
antes de ajustarse para obtener una concentración final de 100x103
espermatozoides viables por gota. La FIV se lleva a cabo durante 18 horas a 39 ºC
en una atmósfera de CO2 al 5% en aire (26).
Después de la FIV, los oocitos y los COC se transfieren a gotas de 100 µl de medio
de cultivo para embriones (CIV), un fluido sintético modificado del oviducto, SOFaa
BSA, conteniendo 8 mg/ml de BSA libre de ácido graso y glutamina 1 mM.
Permanecen en este medio entre 5 y 8 días. Este paso se realiza bajo condiciones
de misma temperatura y ambiente gaseoso. La osmolaridad se mantiene en 270 -
280 mOsmol y el pH es de 7, el medio de cultivo se renueva para cada micropozo
después de 3 y 5 días, y después de 6 días es llevado a la granja para transferir los
embriones a las vacas receptoras (27). Los embriones se clasificaron de acuerdo
con los criterios IETS. Solo se consideran embriones de grado I o II para transferir
(embriones de mórula y blastocistos de 6 y 7.5 días de desarrollo). La calidad
embrionaria, el número de células embrionarias de la masa celular interna y
trofoectodermo, incidencia de apoptosis, capacidad de eclosión, anormalidades
15
cromosómicas y expresión de genes específicos, han sido aceptados extensamente
como determinantes de la calidad embrionaria (28).
16
Conclusiones
17
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19
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