Unidad I

Técnicas de Separación de
Biomoléculas
(Purificación de Proteínas)

Dr. Raúl E. Cian

[email protected]
Facultad de Ingeniería - UNER
CONICET – UNL
 1. Proteasas
ENZIMAS 2. Lipasas
3. Amilasas

PROTEÍNAS RECOMBINANTES: 1. Gelatina

1. Insulina
2. Aislados de soja
2. Somatostatina
3. Citoquinas

USOS: FARMACOLÓGICOS, ALIMENTARIOS, INVESTIGACIÓN, ETC.

- Caracterizar la actividad biológica de la proteína

- Para estudiar la estructura

No hay un único protocolo estándar que pueda aplicarse

para la purificación de proteínas
 PURIFICACIÓN
“Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es
lograr la concentración diferencial de la proteína o
molécula de interés”
 El método de purificación debe diseñarse desde un
principio teniendo en cuenta la cantidad de proteína que
se requiere y pureza de la misma

USO ESCALA PUREZA Rendimiento

Investigación Reducida Elevada Bajo
Terapéuticos Elevada Máxima Elevado
Alimentario Elevada Baja Elevado
 DIVERSIDAD DE PROTOCOLOS …

•Origen de la proteína
 procariota vs. eucariota
 animal vs. vegetal
 tejido vs. cultivo celular
 ubicación de la proteína en el sistema biológico

•Destino o finalidad de la proteína

 La determinación de su estructura, secuencia de AA,
valor nutricional.
 La determinación de su actividad biológica
(enzimática, reguladora, estructural, etc.)
 La obtención de enzimas, anticuerpos, etc.
 INFORMACIÓN DE LA PROTEÍNA A PURIFICAR….
1. Características Morfológicas y Estructurales
• Tamaño
• Forma
• Monomérica vs. Multimérica
2. Propiedades Físico-Químicas
• pI
• Polaridad/Hidrofobicidad
• Solubilidad
• Rango de estabilidad: pH, T ºC, solventes orgánicos,
sales, etc.)
3. Función Biológica
• Actividad Enzimática vs. Estructura
• Presencia de grupos funcionales o dominios
• Requerimiento de co-factores
CONDICIONES GENERALES A EVALUAR ANTES DE DISEÑAR EL
PROCESO DE PURIFICACIÓN

Calidad: Porcentaje de pureza del producto de acuerdo a

los objetivos:

• Secuenciación, cristalización, etc.  Inv. Básica

• Ensayo de actividad enzimática, fármacos, alimentarios,
etc.  Industrial

Cantidad: técnicas de alta capacidad y de baja capacidad

• Preparativas
• Analíticas

Costos
 GUÍA BÁSICA PARA LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

1. Definir los objetivos de la purificación:

Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos.
2. Seleccionar la muestra biológica de inicio:
Dependerá de la localización de la proteína tanto en tejidos como
en compartimentos extracelulares o intracelulares
3. Desarrollar una técnica de análisis para la determinación
rápida de la pureza, actividad o contenido total de proteína:
Un método frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la
separación de la proteína mediante electroforesis

4. Minimizar la manipulación de la muestra:

Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de
perder la actividad de la proteína o reducir el rendimiento
 5. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes:
Ej.: proteasas, metales pesados, etc.

6. Reducir el uso de aditivos:

El uso de muchos y diversos aditivos como sales y
amortiguadores en cada paso, puede llevar a la pérdida de la
actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificación.
Seleccionar y usar sólo lo necesario.

7. Usar una técnica diferente en cada paso:

Para ello tomar en cuenta las características propias de la proteína
como tamaño, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos

8. Minimizar el número de pasos:

En cada paso se pierde proteína (↓rendimiento)
 FASES PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA
PROTEÍNA

1 2
El objetivo es Clarificación del extracto
obtener un crudo:
homogenato o El objetivo es remover los
extracto crudo contaminantes (proteínas,
ácidos nucleicos, H de C, etc.)

3
El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas
trazas de contaminantes: se utilizan uno o la combinación
de varios métodos cromatográficos
 Fase I. Obtención del homogenato o extracto crudo
A menos que se trate de una proteína extracelular, liberada al
medio, las células o tejidos deben romperse para extraer la
proteína de interés.

Esta rotura debe ser sólo la necesaria, no excesiva, para evitar

la extracción inútil de proteínas contaminantes

El método de rotura a elegir dependerá de las características

mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la
proteína, así como de su localización.
 SUSCEPTIBILIDAD A LA RUPTURA CELULAR
Célula Susceptibilidad
ANIMAL Muy fáciles de romper: carecen de pared celular
Muy fáciles de romper: pese a tener pared celular, su
VEGETAL
gran tamaño las hace vulnerables a la ruptura mecánica
Son resistentes. Esta propiedad depende si son: Gram
(+) o (-).
BACTERIANA
Gram (+): más sensibles a métodos suaves que las
negativas.
Muy resistentes a la ruptura. Tienen paredes celulares
FÚNGICA / que contienen hasta 80-90 % de polisacárido (quitina y
LEVADURAS glicanos en hongos, manano y glucano en levaduras),
además de lípidos y proteínas.
 MÉTODOS DE ROTURA CELULAR

MÉTODOS MECÁNICOS

MÉTODOS NO MECÁNICOS
 EN ESTADO LIQUIDO
Homogenización de La ruptura se realiza en un
cuchillas mezclador

Las células son forzadas a

pasar a través de un pequeño
Homogenización
orificio lo que produce su
ruptura por el esfuerzo de corte
Homogenización de alta junto con el cambio rápido de
presión presión. Los más utilizados son
los microfluidizadores.

Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión

Sonicación celular. Esto produce una intensa agitación lo que destruye
las membranas celulares

Ruptura de las células en una combinación de presión y

Prensa francesa
filtración.
 METODOS MECÁNICOS EN ESTADO
LIQUIDO

HOMOGENIZACIÓN DE ALTA PRESIÓN SONICACIÓN

 MÉTODOS MECÁNICOS EN ESTADO LIQUIDO
Se suele utilizar:
 EDTA para complejar metales pesados
 Agentes reductores para mantener la Ae
 Osmoreguladores para aislar organelas (0,25 M sacarosa)

METODOS MECÁNICOS EN ESTADO SÓLIDO

Las células son rotas por medio de una molienda

Molienda
con abrasivos, ejemplo: arena.

Molinos de Las células son trituradas con esferas de vidrio o

bolas acero.
 MÉTODOS NO MECÁNICOS

FÍSICOS / FISICOQUÍMICOS
Shock osmótico Ruptura osmótica de la membrana celular
Temperaturas
extremas Formación y fusión de cristales de hielo. Ruptura
(congelación, con nitrógeno líquido de tejidos vegetales.
descongelación)
Descompresión Ruptura de las células por la generación de
de gas burbujas al disminuir la presión (ley de Henry)

Cavitación Ruptura de la pared celular por formación de

hidrodinámica microburbujas producidas por cambios de presión.
 1. Secado por aire
forzado.
Deshidratación celular: ruptura de
Desecación 2. Secado al vacío
las células.
3. Secado por
solventes
Transiciones en la escala de pH: básico y ácido. Algunas
pH extremos
células no son resistentes a estas variaciones.
Permeabilización de células por solubilización de proteínas
Detergentes de membrana, debido a apertura de poros.
Ejemplo: Triton X-100, SDS, Tween, etc.
QUÍMICOS
Afectan la síntesis de la pared celular (Ej.:
Antibióticos
penicilinas)
Atrapan cationes divalentes (Ca+2), debilitando la
Agentes quelantes
membrana celular (Ej.: EDTA)
Favorecen la disolución de proteínas y minerales de
Agentes
la pared celular de algunas bacterias (urea, sales de
caotrópicos
guanidina, isotiocianato de guanidinio, etc.)
Disuelven la pared celular fundamentalmente por la
Solventes
disolución de lípidos asociados a membranas (Ej.:
orgánicos
tolueno, acetona, etc.)
 BIOLÓGICOS
Lisozima + EDTA: digiere las paredes celulares por ruptura de los
enlances β(1→4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurímico
Adición de enzimas (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopéptido.

Otro ejemplo: la proteinasa K junto con SDS.

Es un proceso biológico por el cual una célula se autodestruye:
• Cel. Vegetal: la absorción de agua en exceso puede causar la
ruptura de vacuolas
Autolisis • Cel. Animal: la producción de la enzima autolisasa puede
ocasionar la hidrólisis celular
• Cel. Bacteriana: las enzimas autolíticas de la pared
bacteriana (autolisinas) lleva a la lisis celular
Exponer las células a soluciones concentradas con sales y/o
Lisis inducible
tratamiento radioactivo puede inducir la lisis celular.
Inhibidores de pared Algunas sustancias alteran la permeabilidad de la membrana
celular celular como: polienos, polimixinas e imidazoles.
 Fase II. Clarificación del homogenato o extracto crudo

Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan

propiedades fisicoquímicas o biológicas de la proteína de interés
para separarla del resto de las moléculas

Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el

rendimiento en la purificación, pureza y actividad específica de
cada fracción obtenida.

Si bien no hay una sola secuencia de técnicas a seguir, en general

se recomienda empezar por técnicas de alta capacidad y seguir con
las de baja capacidad.

Habitualmente se desea obtener una gran pureza (según los

objetivos) acompañada de un gran rendimiento.
Característica Procedimientos
Tamaño • Centrifugación
• Diálisis- Ultrafiltración
• Electroforesis en gel
• Cromatografía de exclusión molecular
Solubilidad • Precipitación con sales
• Precipitación por pH
• Precipitación con solventes orgánicos
Polaridad • Cromatografía de absorción
• Cromatografía en papel
• Cromatografía en fase reversa
• Cromatografía de interacción hidrofóbica
Carga • Cromatografía de intercambio iónico
• Electroforesis
• Isoelectrorenfoque
Selectividad • Cromatografía de afinidad
CENTRIFUGACIÓN
 A partir de la Fase I se obtiene un lisado u homogenato: mezcla de
distintas macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos, etc.) y
restos celulares.
 Para poder clarificar dicho extracto, donde se encuentra la
proteína a purificar, se suele recurrir como primera etapa a la
centrifugación,
 Este método aprovecha las propiedades de tamaño, forma y
densidad de las proteínas para separarlas de otras moléculas que
presentan características distintas (Ej.: lípidos > densos)

SEDIMENTACIÓN

• La velocidad a la que sedimenta una partícula en la

ultracentrífuga se relaciona con su masa
• La fuerza de sedimentación = F centrífuga – F flotación
 • Fuerza de sedimentación = m ω2 r – Vp ρ ω2 r
 m es la masa de la partícula
 r es la distancia al eje del rotor
 ω es la velocidad angular (rad)
 Vp es el volumen de la partícula
 ρ es la densidad de la solución

Fuerza de sedimentación

Tiempo de centrifugación
Centrifugación: Si se
aplica de 10.000 a
15.000 rpm

1. Sobrenadante
2. Precipitado

1. Sobrenadante: contiene las proteínas solubles

2. Precipitado: contiene las proteínas de membrana + restos

celulares
Para solubilizar las proteínas de memb. se requiere de solventes
 PRECIPITACIÓN

1. Salting out
2. Precipitación isoeléctrica
3. Adición de solventes orgánicos
4. Uso de polímeros de exclusión

SALTING IN – SALTING OUT

Salting-in: ↑ solubilidad por salado

 Se da a bajas [I]
 Conforme aumenta la [Sal], los contraiones adicionales
recubren con mayor eficacia las numerosas cargas iónicas de las
moléculas proteicas, lo que contribuye a aumentar su
solubilidad
Salting-out: ↓ la solubilidad por salado
 Se da a elevadas [I]
 Los iones salinos adicionados compiten con las proteínas por las
moléculas de solvatación.
 Se reduce la actividad del solvente, volviéndose más fuerte la
interacción entre solutos  precipitación de los solutos
(a) Solución inicial
(b) Solución inicial + Sulfato de amonio C1
(c) Solución inicial + Sulfato de amonio C1 + Sulfato de
amonio C2
SALTING-OUT: PRECIPITACIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS
Salting-out: Tanto si se trabaja con el precipitado o con el
sobrenadante esta técnica en general va seguida de una
técnica de “de-salado”
La sal puede interferir en los posteriores pasos de purificación
La sal puede alterar las propiedades biológicas de la proteína
PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA

Precipitación isoeléctrica
PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA
 BAJAR O ELIMINAR LA CONCENTRACIÓN DE SAL/AGUA

1. Diálisis
2. Utilizar la cromatografía filtración
en gel, para perder las moléculas
de bajo peso molecular (Sefadex-
G25)
3. Remoción a través de una
membrana semipermeable
(ultrafiltración). Celdas filtrantes.
 DIÁLISIS: separa las moléculas según su tamaño, mediante el
uso de membranas semipermeables cuyo tamaño de poro es
menor al de las macromoléculas (Ej.: < 500 Da)
Suele usarse para cambiar el solvente en donde está disuelta la
proteína de interés.
Para eliminar sales utilizadas en el proceso de precipitación salina
(de-salado)
ULTRAFILTRACIÓN
 •En la ultrafiltración además de
eliminar las sales hay una
concentración de las
macromoléculas
•Se obtiene un permeado y un
retenido.

El Flujo (J) a través de le

membrana está definido
como:
J (mL/cm2 s) = Caudal del
permeado (mL/s) / Área
efectiva total de la
membrana (cm2)
 PRECIPITACIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS
Los solventes orgánicos miscibles con el agua (acetona, etanol,
metanol, etc.), modifican la constante dieléctrica y el poder de
solvatación de las proteínas (deshidratación)  precipitación

Requieren de bajas temperaturas:

Se debe trabajar a T de 0°C o menores dado
que a mayores T se favorece la
desnaturalización proteica (los solventes
orgánicos en agua liberan calor).
Puede emplearse junto con la precipitación
salina (slating out), dado que los solventes
orgánicos ↓ la constante dieléctrica de las
proteínas
 Los solventes orgánicos miscibles con
el agua (acetona, etanol, metanol,
etc.), se suelen usar hasta en un 20%

100 mL = 80 mL agua + 20 mL de
solvente orgánico

 Al reducir la D se favorece la
interacción entre los grupos iónicos
de las proteínas  cambios
irreversibles
  Ecuación de solubilidad proteica con solventes
orgánicos:

S es la solubilidad de la proteína
Sw es la solubilidad de la proteína en agua
A es una constante
e es la constante dieléctrica del medio
ew es la constante dieléctrica del agua
Fase III. El objetivo es obtener una proteína pura o con
mínimas trazas de contaminantes.
 CROMATOGRAFÍA

Método físico de separación en el que los compuestos a

separar se distribuyen entre dos fases:
• Fase estacionaria (gran área superficial):
a. Sólida (matriz: celulosa, dextrano, agarosa,
poliacrilamida, sílica + recubrimiento)

b. Líquida (dispuesta sobre un sólido que actúa como

soporte)

• Fase móvil, fluido que pasa a través o a lo largo de la

fase estacionaria (elución):
a. Gaseosa
b. Líquida
c. Fluido en estado supercrítico
ESQUEMA DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO
 TIPOS DE FASE ESTACIONARIA
SOLIDOS RIGIDOS: matriz de sílica. Soporta alta
presiones y se pueden adherir varios tipos de grupos
terminales.
GELES DUROS: polímeros sintéticos. Ej. Poliesterino
entrecruzado (intercambio iónico)
GELES BLANDOS: se usan en filtración en geles o
soportan altas presiones. Ej. Agarosa dextranos,
celulosa, poliacrilamida
 PARCHES HIDROFÓBICOS:
GRUPOS TIOL:
(Phe, Val, Leu, Ile, Trp, etc)
(Cys)
Cromatografía de interacción hidrofóbica
Cromatografía covalente

GRUPOS CARGADOS
(Asp, Glu, Arg, Lys, His) TAMAÑO Y FORMA
Cromatografía de Intercambio Cromatografía de filtración por gel
iónico
Cromatografía

SITIOS DE UNION GRUPOS QUELANTES DE METALES

Cromatografía de afinidad (Hys, Trp, Cys)
bioespecífica Cromatografia de quelación de metales
 CARACTERÍSTICAS DESEABLES DE LA FASE ESTACIONARIA

1. Tamaño y forma adecuada de poros: Tamaño de

partícula adecuado al flujo de solvente deseado y a
la presión operativa
2. Alta área superficial interna y alta resistencia
mecánica
3. Alta selectividad y mínima adsorción no específica
4. Estabilidad física y química
5. Resistencia a los microorganismos y esterilización
6. Bajo costo y de calidad constante
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA SEGÚN LA PRESION DE TRABAJO

1. Corridas a presión normal (LPLC, low-pressure liquid

chromatography). Presión < a 5 bar. Pueden usarse matrices de
escasa rigidez, como la agarosa o el dextrano.
2. Corridas a presión intermedia (MPLC, medium-pressure liquid
chromatography, también llamada FPLC (Fast protein liquid
chromatography). Presión entre 6 y 50 bar. Requiere matrices más
rígidas. Permite flujos mayores.
3. Corridas a alta presión (HPLC, high-pressure - o high-performance
liquid chromatography). Presiones > a 50 bar. Requiere matrices de
rigidez alta, partículas pequeñas y columnas y tuberías de material
altamente resistente a la presión, como el acero inoxidable o el
titanio.
Característica LPLC HPLC
Tamaño de partícula (μ) 100 10
Flujo (ml.cm-2.h-1) 10-30 100-300
Presión de trabajo (bar) <5 >50
Tiempo de separación Hasta 24 1-3
(hs.)
Volumen de muestra mL-L μL- mL
Etapa de purificación variable En general tardía
Resolución buena excelente
Dificultades Largo tiempo, cámara fría Alto costo de equipo,
Posible desnaturalización
por presión
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

TIPOS SEPARACIÓN POR

 DE EXCLUSIÓN MOLECULAR FORMA Y TAMAÑO (Filtración en

Gel)

 DE INTERCAMBIO IÓNICO CARGA NETA

 DE AFINIDAD UNIÓN A GRUPOS

CON FUNCION BIOLOGICA

 DE PARTICIÓN O REPARTO SOLUBILIDAD EN LA FASE

MÓVIL/ESTACIONARIA

 DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA HIDROFOBICIDAD

 ETAPAS EN UNA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
1. EQUILIBRADO DE LA COLUMNA
• Generalmente con 10 volúmenes de columna con el tampón de equilibrado
(fase móvil)
2. INTRODUCCIÓN DE LA MUESTRA
3. LAVADO DE LA MUESTRA
• Para eliminar las proteínas que no interaccionan con la fase estacionaria
(excepto en la cromatografía de exclusión molecular)

4. ELUCIÓN DE LA MUESTRA
• Utilización de otro tampón para desestabilizar las uniones entre la fase
estacionaria y las proteínas que interactúan con ella
-Elución Isocrática: composición constante de la fase móvil
-Elución por gradiente: los distintos analitos son eluídos con cambio de la
composición de la fase móvil en la fase orgánica. Las proteínas eluyen
gradualmente conforme varían las condiciones del tampón, primero las
unidas débilmente y por último las unidas más fuertemente a la fase
estacionaria.
 CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN POR GELES

El material cromatográfico es un gel formado por partículas

esféricas porosas (porosidad controlada), sin derivatizaciones.
La separación se hace en base a la forma y la masa de la proteína.
La elución es isocrática.
Las proteínas que no penetran en absoluto en los poros del gel son
las que salen primero (volumen de exclusión o Vo). Las demás
moléculas en la muestra se separan, saliendo últimas las que
penetran por completo en las partículas de gel (Ve).
Se usa en general fuerza iónica ↑, para minimizar las interacciones
de las proteínas entre sí, y de las proteínas con la matriz (en este
último caso, no relacionadas con el tamaño de poro).
 200,00

180,00
Volumen exclusion (>20 kDa)

160,00

140,00

120,00
Abs 214 nm

100,00
516 Da

80,00

60,00

40,00

20,00

0,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

Volumen elucion (ml)

 CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN POR GELES
Los soportes se caracterizan por:
1. Rango de separación de PM
2. Diámetro partículas
Los materiales mas comunes
3. Volumen que ocupan son geles de:

 Dextrano (Sephadex)

 Agarosa (Sepharosa)

 Agarosa y poliacrilamida
(Biogel A)

 Poliacrilamida (Biogel P)
 CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN POR GELES

En la filtración por gel es crítica la relación entre el volumen de

muestra y el volumen de la columna (1 a 5 % del volumen total
(Vt) del gel), por lo cual es una técnica en la que se puede
aumentar la escala hasta un cierto punto.

APLICACIONES

- PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
- DETERMINACIÓN DE PESOS MOLECULARES DE PROTEÍNAS
NATIVAS
- DESALADO
 DETERMINACIÓN DEL PM

(Ve-Vo/Vt-Vo)
 DETERMINACIÓN DEL PM

Kav = constante de equilibrio de adsorción = (Ve-Vo) / (Vt-Vo)

Vt = 260 mL Vo = 100 mL

Proteína estándar Ve (mL) PM (kDa) PM (Da) Log PM Kav

Ribonucleasa 250 13,7 13700 4,1367206 0,9375
Quimotripsinógeno 230 25 25000 4,39794 0,8125
A
Ovoalbúmina 210 43 43000 4,6334685 0,6875
Albúmina 200 67 67000 4,8260748 0,625
Aldolasa 170 158 158000 5,1986571 0,4375
Catalasa 150 232 232000 5,365488 0,3125
Ferritina 130 440 440000 5,6434527 0,1875
Tiroglobulina 116 669 669000 5,8254261 0,1
 DETERMINACIÓN DEL PM

6
Log PM

4
y = -1,9972x + 6,027
2 R² = 0,9974

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
K av

Log PM = - 1,9972 Kav + 6,027

Proteínas Ve Kav
¿X? 134 0,2125 Log PM = (- 1,9972 x 0,2125) + 6,027

Log PM = 5,6025

PM = 400493 Da  400,5 kDa

 DESALADO

Rango de fraccionamiento
Tipo de Sephadex Péptidos y proteínas
G 25 1000 – 5000
G 50 1500 – 30000
G 75 3000 – 70000
G 100 4000 – 150000
G 150 5000 – 400000
G 200 5000 – 800000

COLUMNA DE SEPHADEX G 25
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE INTERCAMBIO IÓNICO
•La fase estacionaria está compuesta por una matriz de partículas
cargadas positiva o negativamente.

•Las proteínas con CARGA OPUESTA interaccionan con la matriz y

quedan retenidas. Las proteínas más cargadas se unirán más
fuertemente al intercambiador y por lo tanto serán más DIFÍCILES de
eluir.

Las proteínas con IGUAL CARGA NO interaccionan con la matriz y

pasan entre las partículas

La asociación entre las proteínas y la

matriz dependen del pH y de la
fuerza iónica de la Fase Móvil.
Modificándolas se controlan los
distintos pasos: carga de muestra,
lavado y elución
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE INTERCAMBIO IÓNICO
CARGA DE MUESTRA ELUCIÓN
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE INTERCAMBIO IÓNICO

a. La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes

debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional
cargado negativamente (SO3-, CO2-):
R-A-H+ + M+ + B- ↔ R-A-M+ + H+ + B-

b. La cromatografía de intercambio de aniones retiene aniones

usando grupos funcionales cargados positivamente, como un
catión de amonio cuaternario (R4N+):
R4-N+L- + M+ + B- ↔ R4-N+B- + L- + M+
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE INTERCAMBIO IÓNICO
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE INTERCAMBIO IÓNICO
 A valores de pH por debajo del pH isoeléctrico la carga neta de
la proteína es positiva
 A valores de pH por encima del pH isoeléctrico, la carga neta de
la proteína es negativa
• Enzima con pI de 5,0 + dos proteínas contaminantes con pI > 8,0.
• Columna de DEAE-celulosa (intercambiador aniónico) a pH 7,0
600

500

Absorbancia (280 nm)

400

300

200

100

0
0 5 10 15 20 25
Volumen de elucion (ml)
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE INTERCAMBIO IÓNICO
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE PARTICIÓN O REPARTO

 LA FASE MÓVIL Y LA FASE ESTACIONARIA POSEEN DISTINTA

POLARIDAD (relacionada con el carácter hidrofílico (polar)
/hidrofóbico (no polar) de una sustancia
 LAS PROTEÍNAS SE DISTRIBUYEN ENTRE AMBAS FASES DE
ACORDE CON SU CARÁCTER HIDROFÍLICO/HIDROFÓBICO
 ESTE TIPO DE CROMATOGRAFÍA SE UTILIZA
FUNDAMENTALMENTE EN HPLC
La llamada originalmente “cromatografía de partición” utilizaba
una fase estacionaria polar y una fase móvil orgánica.
 CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA

Utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar.

La fase estacionaria está en general formada por cadenas alifáticas

de hasta C18 unidas a una matriz de sílica.
La fase móvil es un solvente polar como metanol, propanol, etanol o
acetonitrilo.

 Estas condiciones pueden causar la desnaturalización de muchas

proteínas. Por ello se las utiliza en general en HPLC en fase reversa (RP-
HPLC), para purificar proteínas y péptidos para su secuenciación.

Se usan contraiones como el ácido trifluoroacético para asociarse

con grupos cargados en la proteína y aumentar su hidrofobicidad.
 CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA
Migración: los compuestos polares migran más rápido, los
apolares quedan retenidos por interacción hidrofóbica.
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

En general, las proteínas tienen sitios de unión para algún

ligando, ya sea una molécula pequeña (p.ej.: un análogo del
sustrato de una enzima, una hormona para un receptor) u otra
proteína (p-ej.: la Concanavalina A para unir glicoproteínas de alta
manosa, o anticuerpos específicos para ligar sus antígenos).

El ligando elegido para la proteína que se desea purificar debe

inmovilizarse sobre una matriz adecuada.

La especificidad del ligando puede ser absoluta (p.ej.: avidina

para carboxilasas con biotina) o relativa (p.ej.: Cibacron Blue para
dehidrogenasas NAD o NADP dependientes).
 La afinidad de la proteína por el ligando debe ser moderada (KL
entre 10-4 y 10-8 M) para permitir una buena unión y una
disociación ulterior del complejo en condiciones no
desnaturalizantes.

Para desarrollar el material para cromatografía de afinidad,

primero hay que activar la matriz (p.ej.: agarosa con BrCN) y luego
fijarle el ligando.

El material debería ser lo suficientemente ESTABLE como para

permitir su reutilización.
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE AFINIDAD
Flujo de Solvente (Fase Móvil)

La Fase Estacionaria
está compuesta por una matriz
con partículas que llevan unidas
covalentemente un ligando
(sustrato/análogo enzimático,
anticuerpo, ...)

Las proteínas capaces de

interaccionar con el ligando
quedan unidas a la matriz

El resto de proteínas pasan

sin ser retenidas
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE AFINIDAD

La elución de las proteínas de la matriz se realiza mediante:

-Un cambio de pH
-Altas concentraciones salinas
-Concentraciones elevadas del sustrato
CROMATOGRAFÍA DE QUELATOS METALICOS:

La matriz tiene unido covalentemente un quelante, como el ácido

iminodiacético.
Se carga la columna con un ión adecuado: Zn2+, Ni2+, Cu2+
Co2+. La proteína se adsorbe a la columna si tiene residuos
agrupados de His, Cys o Trp. Se puede eluir con quelantes, o bajando
el pH a 4 - 6, o compitiendo con imidazol.
Esta técnica es muy usada actualmente para purificar proteínas
recombinantes, expresándolas como fusiones con un “tag” de poly-
His (en general 6 residuos), que pueden agregarse en el N o en el C-
terminal.
Se eluyen con imidazol.
Se puede tener proteína recombinante pura en un solo paso de
purificación. Debe tenerse en cuenta que iones como el Co2+ pueden
catalizar la oxidación de grupos en la proteína, en especial de -SH.
 ISOELECTROENFOQUE
Se utiliza para determinar el pI de una proteína
Se forma un gradiente de pH dentro de la columna, utilizando
anfolitos apropiados y aplicando campo Elect.
La muestra se carga en la columna y se aplica campo E.
La proteína al descender en la columna encontrará valores
crecientes de pH;
Como el buffer sigue corriendo,
la proteína se separará y unirá
sucesivamente, hasta detenerse
en una banda muy definida
(“enfocada”) al pH correspon-
diente a su pI.
 MÉTODOS DE SEGUIMIENTO DEL PROCESO DE PURIFICACIÓN

1. Métodos colorimétricos para determinar proteínas

2. Electroforesis
3. Actividad biológica (Ae, Ag-Ac, hormona-Receptor,
etc.)
Métodos colorimétricos para determinar proteínas:
- Método de Lowry
Fundamento: reducción de un reactivo fosfomolíbdico-fosfotúngstico en
medio alcalino en presencia de Cu2+ (Abs = 750 nm). El color se debe a
Tyr y Trp.
Ventaja: alta sensibilidad (5-100 ug BSA)
Desventaja: el color varía de proteína en proteína
- Método del ácido bicincónico
Fundamento: reducción del reactivo en medio alcalino en presencia de
Cu2+ (Abs = 362 nm).
Ventaja: color estable y lecturas reproducibles
- Método de Bradford
Fundamento: unión del colorante Azul de Coomassie en medio ácido
(Abs cambia de 465 nm a 620 nm en presencia de proteína).
Ventaja: simplicidad, rapidez, alta sensibilidad
Desventaja: el color varía de proteína en proteína
- Método de Gornall (reacción de Biuret)
Fundamento: unión al Cu2+ en medio alcalino (Abs = 540-560 nm).
Ventaja: simplicidad, independiente de la característica de la prot
Desventaja: útil para muestras conteniendo 1-10 mg/ml de prot

- Absorbancia a 280 nm
Fundamento: absorción de AA aromáticos (Trp, Tyr y Phe).
Ventaja: simplicidad
Desventaja: dependiente de la característica de la prot
La elección de un determinado método para medir
proteínas dependerá de:

1. La cantidad total de proteína disponible

2. La concentración de la solución

3. La presencia en la muestra de compuestos que interfieran en el

ensayo

4. La rapidez con la que se necesite el resultado

 DETERMINACIÓN MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS
(Curva de calibrado)
El procedimiento analítico habitual consiste en tomar una serie de patrones (al
menos 5) de los que se conoce la concentración de proteína y una muestra
blanco, y medir sus respuestas por triplicado (r= 3) en el espectrofotómetro bajo
las mismas condiciones en que van a ser analizadas las muestras.

B 1 2 3 4 5
ELECTROFORESIS COMO MÉTODO DE SEGUIMIENTO DEL PROCESO
DE PURIFICACIÓN
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Gel de poliacrilamida (PAGE)
Es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis, ya que es con
el que mejor se logra separaciones electroforéticas.
Es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rápida y reproducible.
Forma geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua,
relativamente no iónicos y que permite buena visualización de las bandas
durante tiempo prolongado.
Tiene la ventaja que variando la concentración de polímeros, se puede
modificar de manera controlada el tamaño del poro.
El tamaño de poro opone resistencia al paso de las moléculas ya que es
similar al de las proteínas, de tal modo que existe un efecto de tamizado
molecular y la separación electroforética depende de la densidad de carga
de las moléculas y de su tamaño.
 Inconvenientes: Neurotoxicidad
 Gel “Stacking” (Empaque)
Gel “Stacking”
• Menor concentración de acrilamida
• Tamaño de poro mayor
• pH ácido-neutro
Gel “Separating”

Función: acumular las proteínas a la

entrada del gel separador para que
salgan al mismo tiempo.

Gel “Separating” (Separación)

• Mayor concentración de acrilamida

• Tamaño de poro menor
• pH alcalino

Función: separar las proteínas

Tipos principales de electroforesis:

En condiciones nativas las proteínas se separan en función de su

carga/masa
En condiciones desnaturalizantes la electroforesis se realiza en
presencia de un detergente aniónico, el SDS (dodecil sulfato sódico)
que se une a todas las proteínas en la misma proporción formando
una especie de micela cargada (-) que enmascara la carga intrínseca
de las proteínas, con lo que éstas se separan sólo en función de su
masa e independientemente de su carga.
El SDS desnaturaliza las proteínas y las proteínas multiméricas se
separan en sus subunidades.
Las SDS-PAGE permiten calcular el PM de las cadenas
polipeptídicas e indican las distintas subunidades que posee la
proteína.
SDS-PAGE:

 La electroforesis con SDS es un excelente método para:

1. Identificar y monitorear las proteínas durante un proceso
de purificación
2. Para la determinación del PM de las diferentes
subunidades proteicas.

Desventajas:
1. Es lenta y laboriosa
2. Tiene poca reproducibilidad
3. Difícil de automatizar
4. No proporciona resultados cuantitativos precisos
PROTOCOLO DE ELECTROFORESIS
PROTOCOLO DE ELECTROFORESIS
PROTOCOLO DE ELECTROFORESIS
DETERMINACIÓN DE PM POR ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
 EJEMPLO DE PURIFICACIÓN

Purifica
V ACTIVIDAD PROTEÍNA Prot Rend. Rend.
FRACCIÓN Aesp Atotal ción
(mL) (U/mL) (mg/ml) totales parcial total
total
I 1800 0,23 12,5 0,0184 414 22500
0,21428
II 75 3 14
5714 225 1050 54,3
III 20 5 1 5 100 20 44,4
IV 1,5 40 0,5 80 60 0,75 60,0 14,5 4347,8

Actividad específica (Aesp): Kcat/kg de proteína ó Ae / Concentración de proteínas

Actividad total (AT): Ae x Volumen total
Proteínas totales: Concentración de proteínas x Volumen total
Rendimiento parcial (%): (Actividad total (AT) etapa / Actividad total (AT) etapa anterior) x 100
Rendimiento total o recuperación (%): (Actividad total (AT) etapa / Actividad total (AT) primera etapa)
x 100
Purificación total: Aesp etapa / Aesp primera etapa