UNIDAD DE TRABAJO 2: REALIZACIÓN DE CULTIVOS CELULARES

Índice

2.1 Conceptos previos

2.2 Tipos de cultivos celulares en citogenética
2.2.1 Líquido amniótico
2.2.2 Sangre periférica
2.2.3. Vellosidad corial
2.2.4. Medios de cultivo celular
2.3 Técnicas de obtención, mantenimiento y propagación de cultivos
2.3.1 Obtención de células
2.3.2 Mantenimiento de los cultivos celulares
2.3.3 Propagación de cultivos celulares
2.4. Determinación del número de viabilidad celular
2.4.1 Técnicas de contaje celular
2.4.2 Viabilidad celular
2.5. Contaminación de los cultivos celulares
2.5.1 Contaminación microbiológica
2.5.2 Contaminación química
2.5.3 Contaminación cruzada

2.1 Conceptos previos

El cultivo celular es un proceso mediante el que las células (procariotas,eucariotas o
vegetales) pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica, el término
"cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de
eucariotas pluricelulares, y especialmente de células animales.
Por lo tanto, cultivo celular puede definirse como en un sistema formado por células
provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de
cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación
y humedad controladas. De esta forma se asegura su supervivencia y multiplicación,
manteniendo todas sus funciones metabólicas de una manera semejante a las que
tenían en el huésped.

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Por otra parte, se define como línea celular a un conjunto de células que parten de un
cultivo celular u órgano y que se mantiene por un tiempo ilimitado. Una de las primeras
líneas celulares humanas son las células HeLa , obtenidas de Henrietta Lacks, quien
falleció de cáncer de útero, a partir de cuál se obtuvieron estas células, que pueden
considerarse la primera línea de células inmortales humanas.
Los cultivos celulares son de diferentes tipos:
1) Cultivo de órganos. Se coloca el órgano sobre una rejilla situada en la interfase
líquido-gas de un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los
desechos. Este tipo de cultivo permite mantener, al menos en parte, la
arquitectura característica del tejido “in vivo”. Tiene el inconveniente de que sólo
permite el crecimiento en la periferia del órgano (debido a la estructura del propio
órgano), lo que le condiciona su utilidad. En citogenética no se hace
recomendable su utilización por su forma deficiente de propagar el crecimiento
celular.
2) Explantes primarios. Es un fragmento titular que se adhiere a una superficie (por
ejemplo una placa de Petri), sobre la cual las células proliferan. Al igual que
ocurre con los cultivos de órganos, la zona que prolifera en el cultivo será la
formada por las células de la periferia.
3) Cultivos celulares primarios.

4) Cultivos histotípicos y organotípicos. Los cultivos histotípicos son cultivos de un

solo tipo celular que consigue alcanzar una elevada densidad celular (tal y como
ocurre en los tejidos). Los cultivos organotípicos constan de varios tipos celulares
que interaccionan entre sí de una forma que intenta parecerse lo más posible a la
original.
El objetivo final de este tipo de cultivos es la creación “in vitro” de tejidos u
órganos completamente funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en
transplantes. Los cultivos organotípicos constituyen la base de una nueva
disciplina denominada ingeniería de tejidos.

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Ventajas del cultivo celular
Las dos ventajas principales cuando se utilizan los cultivos celulares son: el control del
medio fisicoquímico, (pH, temperatura, presión osmótica, tensión de oxígeno y gas
carbónico de las células cultivadas), y las condiciones fisiológicas que deben ser
constantes.
La mayoría de las líneas celulares requieren para su buen desarrollo de suplementos en
el medio en que se cultivan, ejemplo de esto es el suero, que proporciona infinidad de
elementos como hormonas y otras sustancias reguladoras. El control del medio
fisicoquímico y de las condiciones fisiológicas permite el cultivo de células específicas.
Aunque los estudios in vivo pueden, en algunos casos, resultar más económicos que
los estudios in vitro, los primeros son descartados debido a los aspectos legales,
morales y éticos que conlleva la utilización de animales de experimentación. Además,
los cultivos permiten el estudio del transporte y la utilización de metabolitos.

Desventajas del cultivo celular

Las técnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de asepsia porque
las células animales crecen menos rápido que la mayoría de los contaminantes
comunes como las bacterias, los hongos y las levaduras. Además, las células
precedentes de animales no pueden desarrollarse en medios de cultivo, por lo que es
necesario agregar a los medios suplementos como suero, plasma y fluidos intersticiales,
entre otros, para proporcionar a las células cultivadas un medio lo mas semejante
posible al in vivo.
Una de las principales limitaciones en el cultivo de células es el gasto de esfuerzo y
materiales para la producción de una pequeña cantidad de células o de tejido. Los
costes de producir células en cultivo son diez veces más que el uso de tejido animal, ya
que se invierte bastante en ensayos o procedimientos preparativos que pueden ayudar
en la estandarización del proceso reduciendo tiempo de manipulación, volúmenes de
muestra, tiempos de centrifugación, etc.
En los cultivos celulares es difícil relacionar las células cultivadas con las células
funcionales ubicadas en el tejido del cual derivan, ya que en la mayoría de los casos
presentan propiedades muy diferentes; para esto es necesario utilizar marcadores de
células que van a ser de gran ayuda en el momento de caracterizar las células en
cultivo porque van a garantizar que las células crecidas en cultivo son las mismas que
las que se sembraron y no otras.
Otro inconveniente es que también suelen presentarse problemas de inestabilidad
genética cuando se realizan varios pases de cultivos de células no transformadas, lo
que va a originar una gran heterogeneidad en el crecimiento de las células y en su
diferenciación.

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Fases del cultivo celular
1. Fase de latencia (período lag). Se define como el período de fijación al sustrato e
inicio del ciclo celular.
2. Fase de crecimiento exponencial. Durante esta fase el número de células se duplica
aproximadamente cada 24 horas.
3. Fase de confluencia. Esta fase ocurre cuando las células del cultivo, que se ha
saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por contacto; suspensión: consumo
del medio).
4. Fase de muerte. Cuando el cultivo se prolonga durante demasiado tiempo, las células
entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.

Aplicaciones del cultivo celular

Los cultivos de células animales tienen aplicación, como técnicas únicas o
complementarias de otras, en gran número de lineas de investigación. De esta forma
han sido fundamentales para numerosos avances científicos alcanzadas en distintas
ramas de las ciencias biomédicas. Así por ejemplo, las técnicas de cultivo celular
permiten el estudio de las propias células, su metabolismo, el control del ciclo celular, la
modulación de la expresión genética , el cultivo del virus , la clonación y el estudio de
numerosos aspectos relacionados en el cáncer y su diagnóstico, por citar sólo algunos
ejemplos.
Otra área de gran interés se centra en la biología del desarrollo, mediante la búsqueda
de modelos experimentales que permitan explicar cómo el gran número de células
presentes en el organismo maduro derivan de una sola célula a partir de la fertilización.
Por ello las líneas celulares que conservan la capacidad de diferenciarse in vitro son
objeto de un intenso estudio.
Hay cierto tipo de investigaciones que no pueden realizarse sin el cultivo de células, por
ejemplo, el trabajo con animales transgénicos, que conduce a que organismos maduso
expresen genes nuevos, se basa totalmente en las técnicas de cultivo celular para la
inserción de genes extraños en las células receptoras.

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Asimismo se han desarrollado numerosas aplicaciones para la investigación en biología
celular y bioquímica, en farmacología y toxicología, etc. La industria farmaceútica utiliza
estas técnicas en los estudios para el desarrollo de nuevos fármacos. Además se han
desarrollado procesos industriales para la obtención de anticuerpos u hormonas y
técnica diagnósticas para el diagnóstica prenatal de enfermedades, y para el cáncer,
entre otras patologías.
Algunas aplicaciones de los cultivos celulares son:
- Actividad intracelular: transcripción de ADN, síntesis de proteínas, movimientos del
ARN, etc.
- Ecología celular: estudio de necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la
transformación inducida por agentes químicos, etc.
- Interacciones celulares: inhibición por contacto, etc.
- Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus, etc.
- Inmunología: análisis de la genética de la célula, etc.
- Ingeniería de proteínas: producción de proteínas en líneas celulares, etc.
- Estudio de diferenciación y desarrollo celular: estudio de receptores, etc.

2.2. Tipos de cultivos celulares en citogenética

Los cultivos celulares con los que se trabaja en citogenética pueden tener diferentes
procedencias, pueden ser: líquido amniótico, sangre periférica y vellosidad corial
(vellosidades a través de las cuales tienen lugar el intercambio entre la sangre materna
y la fetal).
Cada uno de ellos se utiliza con distintas estrategias sobre todo en el diagnóstico
clínico.

2.2.1 Líquido amniótico

Es un líquido claro y ligeramente amarillento que rodea el feto dentro del útero durante
el embarazo y que está contenido en el saco amniótico. El líquido amniótico se obtiene
por amniocentesis en la semana 16ª de gestación.

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Los cultivos celulares de líquido amniótico son cultivos a largo plazo de 10 a 14 días. Se
denominan cultivos directo pues no necesitan un estimulante de la división celular
(estimulante mitógeno) al igual que ocurre con los cultivos de vellosidades coriales.
Se utilizan cultivos cómo el Amniopan qué está especialmente diseñado para cariotipo
(conjunto de cromosomas de un individuo). Contiene FBS (fetal bovine serum), factores
de crecimiento (proteínas presentes en nuestras sangre y que favorecen la
regeneración celular), glutamina y gentamicina.
Otros tipos de cultivos de líquido amniótico son Ham H 10, Ham F12 , AmnioMax,
etcétera.

2.2.2 Sangre periférica

Si utilizan linfocitos de sangre periférica. Para cultivarlos necesitamos la utilización de
agentes que estimulen la división celular (mitosis). Son pues cultivos indirectos por la
necesidad de utilizar el agente mitógeno para provocar la división de las células. Estos
cultivos también son denominados cultivos de corto plazo.
En la mayoría de los casos, la utilización de los cultivos de linfocitos tiene la finalidad de
detectar alteraciones cromosómicas en las células somáticas de nuestro organismo,
como por ejemplo la detección de los síndromes: Down, Patau, Turner, etcétera.

2.2.3. Vellosidad corial

Las vellosidad coriales son proyecciones minúsculas de tejido placentario que
comparten la composición genética del feto.

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La muestra se obtiene a través de una biopsia del corión en la placenta de la madre. La
finalidad del uso de estos cultivos es el estudio prenatal de ciertas anomalías
cromosómicas del feto en edad temprana (de 9 a 11 semanas de gestación). Es una
técnica invasiva.

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Dependiendo de la posición de unión de la placenta al útero de la madre, la toma de las
vellosidades coriales se puede realizar por una biopsia transcervical o por una biopsia
transabdominal.
La muestra de vellosidad corial permite obtener información genética de forma más
precoz qué con la amniocentesis, pero cuenta con la limitación de la cantidad de
muestra, que puede ser insuficiente y con la posible contaminación tisular de la madre.
Las vellosidades coriales se cultivan con medios cómo el Amniopan, con corto período
de crecimiento (24-48 horas) aunque existe la posibilidad de realizar cultivo de mayor
tiempo de crecimiento. Otros medios de cultivo que se utiliza para vellosidades coriales
son el medio Chang B+C y el Amniomax.
2.2.4. Medios de cultivo celulares
Un medio de cultivo posee todos los componentes necesarios para su crecimiento y
división: aminoácidos, vitaminas, lípidos, cofactores, enzimas y coenzimas, sales, iones,
oligoelementos e indicadores de pH.
Debe de reunir una serie de condiciones óptimas para su desarrollo:
1. La naturaleza del sustrato o fase sobre la que crecen.
2. Las condiciones fisicoquímicas y fisiológicas del medio.
3. La composición de la fase gaseosa del medio.
4. Las condiciones de incubación en cuanto a humedad y temperatura.
Los suplementos que llevan los medios de cultivo son los siguientes:
FBS (Fetal bovine Suero fetal bovino en distintas
serum) concentraciones. Si es para cultivos de sangre
periférica, la concentración será del 20%, en
el caso de las células fetales será del 30%.
Penicilina+estrepto Son antibióticos que inhiben el crecimiento
micina bacteriano
Antimicóticos Evitan la proliferación de hongos. Uno de los
más utilizados es la anfotericina-B
L-glutamina Es un aminoácido que mejora el crecimiento
celular

Estimulantes La más utilizada es la fitohemaglutinina

mitogénicos (PHA), que es de gran utilidad, sobre todo en
el cultivo de linfocitos
Soluciones tampón HEPES, bicarbonato y tripsina
Aditivos suplementos de piruvato (sintetiza glucosa),
específicos: glucosa, etc
CO2 Ejerce un papel esencial en el manteamiento
del pH
Rojo fenol Como colorante indicador de pH

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Podemos definir cuatro tipos de medios de cultivo:

Naturales Corresponden a este grupo los fluidos

corporales, la linfa, el suero y los extractos
tisulares
Líneas celulares Poseen medios químicamente definidos
Medios Con suero y proteínas
suplementados
Medios RPMI 1640 para células linfoides
especializados Leibovitz L -15 (solución altamente nutritiva
para cultivo celular)

2.3 Técnicas de obtención, mantenimiento y propagación de cultivos celulares

Existen diferentes etapas para la obtención de un cultivo celular las cuales hay que
seguir detalladamente y se indican a continuación.
2.3.1 Obtención de células
El proceso de obtención de células implica necesariamente separar la matriz
extracelular de los tejidos. Es un proceso invasivo que puede provocar la liberación del
contenido intracelular de las células periféricas entre el que se encuentran enzimas
lisosómicas que degradan las células contiguas. Este hecho se puede evitar colocando
el tejido a 4ºC, temperatura que inactiva a las enzimas.
La matriz extracelular se trata con enzimas proteolíticas (o peptidasas) y colagenasa.
Hay que añadir un secuestrante del calcio, el EDTA (ácido etilendiamino tetraacético)
para evitar así la adherencia celular.
Después, tras una suave agitación se obtiene una suspensión celular que contiene las
células de tejidos disponibles.
Las técnicas de obtención de células son:
1. Cultivo celular primario
a) Cultivo de monocapa
b) Cultivo en suspensión
2. Línea celular
2.3.1.1 Cultivo celular primario
Las células que forman parte del cultivo celular son aquellas capaces de superar el
proceso de disgregación, adherirse al sustrato y proliferar en monocapa o en
suspensión.
En todo tejido existe una fracción de células que es capaz de crecer en suspensión, se
cree que estas son células madre.

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La obtención de un cultivo primario sigue el siguiente esquema.

Se obtiene a partir de explantes primarios de biopsias de partes más o menos grandes

de un órgano o tejido.
a) Por perfusión de un órgano específico.
b) Por disgregación de tejidos o suspensiones de células disgregadas (que consiste
en separar las células inhibiendo las interacciones célula-célula y célula-matriz
extracelular, mediante métodos mecánicos o enzimáticos).
c) A partir de fluidos orgánicos como la sangre.

Existen dos tipos de cultivos primarios:

Cultivos en monocapa
Contiene células adheridas a un soporte sólido, que puede ser de plástico o de vidrio.
La adhesión al sustrato o soporte es un requisito para la proliferación celular, por esta
razón son anclaje-dependiente. Es un método más usado para la mayoría de las
células, excepto para las hematopoyéticas.
Se obtiene por dispersión de células disgregadas por métodos enzimáticos y se pasa a
un frasco de cultivo.
Cultivos en suspensión
Crecen sin necesidad de adherirse al sustrato. Son independientes del anclaje y no
presentan inhibición por contacto.
Las células están dispersas en el medio de cultivo. Solamente podemos tener
proliferación con las células hematopoyéticas, las células madre, las líneas celulares
transformadas y las células tumorales.
Se obtienen por dilución y posterior paso a un medio fresco.
2.3.1.2. Línea celular o cultivo secundario
Las líneas celulares o subcultivos se obtienen a partir de un cultivo primario, ya sea en
monocapa o en suspensión.
Las células se multiplican hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo, formando
una monocapa de una célula de espesor.

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Cuando el recipiente de cultivo se llena de células, es el momento de subcultivar a un
medio fresco para el mantenimiento de la línea celular.
La obtención de una línea celular cumple ciertas características:
a) Aumenta el número de células obtenidas.
b) Predominan uno o dos tipos celulares, que son los que tienen mayor tasa de
crecimiento.
c) La población celular se hace uniforme y homogénea.
d) Sus características se conservan durante sucesivas generaciones.
La gran mayoría de las células de los vertebrados dejan de dividirse después de un
cierto número de divisiones en un medio de cultivo fuera del organismo vivo. Esto se
conoce como senescencia celular y es debida a un acortamiento progresivo en cada
división de los telómeros cromosómicos (extremo del cromosoma que le da estabilidad).
En las células somáticas el gen que codifica para la telomerasa (enzima que mantiene
la integridad de los telómeros), está inhibido o desactivado.
Si a las células les incorporamos el gen de la telomerasa de forma activa, este podrá
reparar la pérdida de telómeros en cada división y las células podrán proliferar
indefinidamente como una línea celular.
Pero no a todas las células humanas se les puede añadir el gen que codifica para la
telomerasa; en estos casos podemos usar oncogenes para inactivar los puntos de
control del ciclo celular, haciendo que las células se dividan indefinidamente.
Las células de roedores tienen activado el gen de la telomerasa, con lo que sus
telómeros no se acortan con las sucesivas divisiones.
Además, cuando se cultivan estas células se inactivan los puntos de control del ciclo
celular, con lo que podemos obtener células inmortales espontáneas.

2.3.2. Mantenimiento de los cultivos celulares

Cuando las condiciones de crecimiento son adecuadas, la mayoría de las células se
adhieren al sustrato y doblan su número tras 24-48 h en cultivo. De esta forma el
número de células se multiplica en cualquier cultivo en unos pocos días (ocupando toda
la superficie de la placa, en el caso de células adherentes).
Esto ocasiona un empobrecimiento del medio al consumirse los nutrientes y acumularse
productos de deshecho. Por ello, si se desea mantener el cultivo algunos días más, se
deben reponer los nutrientes de manera periódica y se deben eliminar los productos de
deshecho.
La mayoría de las células que crecen adheridas al plástico sufren una parada en su
crecimiento a densidades elevadas, debido a lo que se conoce como inhibición por
contacto.

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En algunos casos las células paran su división cuando ocupan toda la superficie de la
placa y en otras ocasiones dejan de dividirse cuando entran en contacto unas con otras,
aunque no hayan cubierto totalmente la superficie de la placa de cultivo. A esta
situación se le denomina confluencia del cultivo y nunca se debe dejar un cultivo en
confluencia durante periodos de tiempo prolongados. Para ello, tenemos que reducir la
densidad celular para permitir su crecimiento de forma continuada.
La disgregación celular se utiliza para realizar un cultivo primario y para despegar las
células del soporte.
Se rompen las uniones de células con las proteínas de la matriz extracelular (lámina,
colágeno, etc.). Por ejemplo, las células epiteliales son más difíciles de disgregar
porque tienen uniones más fuertes y las células mesenquimales son las más fáciles de
disgregar porque sólo están unidas a la matriz extracelular.
Para la disgregación celular disponemos de métodos mecánicos, químicos y
enzimáticos.
*Métodos mecánicos
Se utilizan para cualquier tipo celular y pueden causar daño mecánico. La suspensión
celular que se obtiene no es muy buena. Se trata de raspar o de levantar las células de
la superficie de cultivo. El raspado puede ser manual con raspadores celulares.
También se puede sacudir la placa ligeramente para que se suelten las células. Por
último, también se puede proceder al raspado automático con equipo denominado
Magdem, que tiene imanes que por agitación magnética arrancan las células del
sustrato.
*Métodos químicos
Este método se basa en que las integrinas, que son los receptores de membrana que
unen la matriz extracelular con el citoesqueleto necesitan iones de calcio y magnesio.
Se trata en lavar el medio con las células con PBS (solución buffer de fosfato) sin calcio
y magnesio o utilizar agentes quelantes como el EDTA, que secuestran cationes
evitando que las integrinas sean funcionales.
Un ejemplo de protocolo químico para células epiteliales es utilizar 2 lavados de EDTA
1mM con un volumen de 1ml cada 5cm2 de superficie.
*Métodos enzimáticos
Digieren las proteínas de la matriz extracelular mediante el uso de las proteasas como
la colagenasa, la tripsina, la elastasa o combinaciones de ellas.
Dependiendo del tipo celular hay que utilizar un método más o menos agresivo, usando
distintas enzimas. Después es necesario retirar el sobrenadante porque puede dañar
las células, el contener proteasas.
Un ejemplo de protocolo de disgregación celular es el prelavado con PBS sin cationes,
tripsina 0.25% en PBS a 37ºC y la tripsina lleva EDTA 1mM.

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En la práctica, el método de disgregación celular utilizado es una combinación de los
tres métodos descritos.
A continuación se realiza la tripsinización. Para la mayoría de las células que crecen
adheridas a un substrato, la forma más conveniente de levantarlas para que formen una
suspensión celular y manejarlas fácilmente, es mediante el uso de enzimas como la
tripsina, una proteasa que digiere las proteínas celulares implicadas en la adhesión
celular.
Solo en el caso de que se necesiten preservar las proteínas de membrana se
desaconseja este procedimiento, y debe recurrirse a métodos mecánicos como el
pipeteo o el barrido de la superficie de cultivo. Para que la tripsinización sea efectiva,
tenemos que asegurarnos de que no queda suero en la placa de cultivo, ya que éste
contiene un inhibidor de la tripsina.
Este procedimiento es muy importante porque si las células pasan demasiado tiempo
en contacto con la enzima pueden dañarse e incluso morir, por eso este paso es crítico
y el tiempo de permanencia con la tripsina dependerá del tipo celular con el que
estemos trabajando.
Una vez levantadas las células se resuspenden en un volumen adecuado de medio con
suero de manera que la tripsina se inactiva y se siembra en la superficie adecuada,
obteniéndose un cultivo de células disgregadas.
La fórmula de la tripsina comercial contiene de 0.25% de la misma y EDTA 1mM; se
toma una alícuota de 1-11,5mL y se almacena a -20ºC.

Protocolo general de tripsinización:

1. Sacar las células del incubador.
2. Llevar a la cabina de seguridad biológica para trabajar en esterilidad.
3. Retirar el medio con una pipeta Pasteur por aspiración conectada a una bomba
de vacío inclinación de la placa.
4. Lavar con PBS porque el suero del medio contiene inhibidor de tripsina.
5. Retirar el PBS.
6. Añadir una cantidad de tripsina suficiente para cubrir la superficie de la placa
entre 1 y 2mL
7. Incubar a 37ºC. El tiempo varía dependiendo del tipo celular.
8. Golpear la placa o el frasco para que las células se suelten del sustrato.

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Los cultivos celulares en nitrógeno líquido se conservan de forma indefinida.
Una muestra de tejido es heterogénea y a partir del tercer subcultivo o resiembra, el
cultivo celular se estabiliza y homogeniza, obteniéndose réplicas idénticas de cada
subcultivo. De tal manera que el tipo celular de mayor tasa de proliferación ocupa el
cultivo.
Los medios de cultivo que se emplean son disoluciones de menor concentración que en
el animal completo.
Hay que establecer condiciones selectivas, menos selectivos y condiciones favorables
para las líneas celulares, debido a que podemos tener proliferación de fibroblastos que
son de rápido crecimiento y no nos interesan.
En general, cuanto más indiferenciada sea una línea celular, más fácil será de sembrar.
Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las células
pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, perdiendo alguna característica.
Este hecho es reversible.
Para mantener un cultivo celular hay que controlar diferentes aspectos:
1. Las condiciones fisicoquímicas del cultivo como el pH (7.2-7.6), con un indicador que
vira de color según la acidez o basicidad del medio, la presión osmótica, la presión
parcial de oxígeno y dióxido de carbono, etc.
2. La adición de antibióticos y antimicóticos para controlar la contaminación microbiana.
3. La temperatura, que será de 3º C.
4. El número de células.

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5. El porcentaje de dióxido de carbono, que será del 5%.
6. El cultivo se realizará en un recipiente de plástico o vidrio para facilitar la adhesión
celular.
7. Las células tendrán una buena disponibilidad de nutrientes.
8. El medio no contendrá metabolitos tóxicos como el amonio y el ácido láctico.
9. El medio de cultivo será el adecuado para cada línea celular. Se realizarán curvas de
crecimiento para elegir el medio de cultivo más adecuado.
10. Las condiciones fisiológicas serán las adecuadas. Se tendrán en cuenta factores
como la presencia de hormonas, los factores de crecimiento, la densidad celular, etc.
11. Las condiciones de asepsia serán las adecuadas. El crecimiento celular es más
lento cuando existen microorganismos contaminantes (hongos, bacterias, etc.).

Los principales problemas que se generan en la manipulación de células en cultivo son:

 El agotamiento de los nutrientes.
 La acumulación de células apoptóticas (proceso de muerte celular programada), o
necróticas.
 La inhibición de la división celular por contacto.
 La acumulación de metabolitos que pueden ser tóxicos.

Estos problemas son debidos a que las células se encuentran en continua división y
crecen hasta ocupar todo el espacio que tienen. Por eso renovaremos el medio de
cultivo de manera continua.
Existen diferentes recipientes de cultivos de células. Los más relevantes son los
siguientes:
 Los frascos T individuales en los que las células crecen en su base.
 Los frascos triples, que como su nombre indica, triplican la superficie de los
frascos T.
 El biorreactor controla todas las condiciones del cultivo en tiempo real
aumentando el rendimiento.
 Los frascos rodantes cubren toda la superficie del recipiente y al girar el medio
baña a todas las células asegurando su crecimiento.
 Los frascos con paletas y los frascos de agitación aseguran que el medio bañe a
todas las células.

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Para las células adheridas en monocapa se puede aumentar la densidad celular
añadiendo perlas de 30-100 micrómetros de diámetro de dextrano, celulosa, gelatina,
vidrio o sílice, que aumentan la superficie de contacto.

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Crioconservación y almacenamiento de muestras
La crioconservación de células nos permite almacenar alícuotas celulares
indefinidamente, sin la necesidad de mantenerlas en cultivo perpetuo.
En la crioconservación se conserva el 90% de la capacidad de proliferación al
descongelar y se reduce el riesgo de contaminación cruzada y microbiana.
Las células tienen que estar en la fase logarítmica de crecimiento. Esto se consigue
cambiando el medio de cultivo 24 horas antes de la congelación y así, obtendremos el
cultivo con la densidad celular máxima para la congelación, que es entre 1x106 y 3x106.
Para la congelación el medio de cultivo debe contener una alta relación suero /proteína,
mayor o igual al 20% y un crioprotector como el DMSO (dimetilsulfóxido) al 10% o
glicerol.
Puede existir contaminación cruzada por patógenos virales por el uso de nitrógeno
líquido por eso se prefiere el almacenamiento en nitrógeno gaseoso (situar las muestras
encima del nitrógeno líquido).
La información necesaria en el criovial incluye la línea celular, el número de pase (veces
que se ha transferido a otro medio de cultivo), la fecha de congelación, la densidad
celular, el técnico responsable de la línea y el código de referencia de la línea, si lo
tiene.
Es importante descongelar las células correctamente para tener una viabilidad celular
alta.
Algunos crioprotectores como el DMSO son tóxicos para las células por encima de 4ºC;
por eso es esencial que las células se descongelen rápidamente y que se diluyan en el
medio de cultivo para minimizar los efectos tóxicos.
Para abrir los crioviales o las ampollas con células que vamos a descongelar es
aconsejable colocar un papel empapado con alcohol al 70% en la tapa de la ampolla y

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girar el tapón un cuarto de vuelta para liberar la presión de nitrógeno líquido residual y
por el cambio de temperatura al sacarlo de -196ºC.

2.3.3. Propagación de cultivos celulares

Los cultivos celulares necesitan una superficie sólida para crecer y multiplicarse, al igual
que si estuvieran en un tejido, y no pueden vivir en suspensión como los cultivos
bacterianos. Los frascos de vidrio o plástico deben recubrirse con componentes de la
matriz extracelular como el colágeno o la lámina para la adhesión de las células, debido
a que para la proliferación celular es un requisito que las mismas estén fijadas.
La propagación o el cambio de medio fresco de cultivos celulares se realizan cuando
antes de que el cultivo alcanza la confluencia, y eso se detecta observando ciertos
rasgos característicos que les asemejan a su estado original.

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El cambio de medio de cultivo o pase se realiza según los tipos de cultivos siguientes:
 En cultivos en suspensión se realiza por centrifugación o tomando unas pocas
células. Hay que realizar una dilución y resuspender en medio fresco.
 En cultivos adherentes o por contacto se realiza por aspiración, tripsinización. Se
despegan las células de forma mecánica por raspado y al cambiar de medio.
Algunos tipos de células pueden evitar la senescencia dando líneas celulares continuas
con crecimiento indefinido, como las células de roedores y las células tumorales.
Estas células pueden surgir de forma espontánea (por exposición a radiaciones
ionizantes o cancerígenos químicos) o de forma inducida (infección vírica o transfección
de DNA). Son el resultado de un cambio genotípico por transformación.
Las células transformadas crecen indefinidamente de forma aberrante, perdiéndose la
inhibición por contacto en la proliferación celular y la dependencia y anclaje. Son
malignas ya que invaden tejidos y producen el crecimiento de los tumores. También son
genéticamente inestables, con aberraciones cromosómicas de forma heteroplasmoide
(variación del número de cromosomas).

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2.4 Determinación del número y de la viabilidad celular
Existen varios métodos para determinar el número de células y establecer si son o no
son viables.
2.4.1 Técnicas de contaje celular
Actualmente existen diferentes métodos de recuento celular. Algunos de ellos están
basados en métodos espectrofotométricos, basados en las propiedades de la absorción
de la luz por las células, si bien, son alternativas que no resuelven mucho para el fin
que perseguimos, entre otros motivos porque necesitaremos determinar tanto la
densidad celular en suspensión como el porcentaje de que éstas sean viables.
La densidad celular se puede determinar mediante conteos manuales con cámaras de
Neubauer, o mediante equipos automáticos de contaje tipo Cell-counter que mide los
cambios en la resistencia eléctrica (impedancia). El dispositivo de medida consiste en
un pequeño orificio, a través del cual se hace pasar la suspensión. Tiene colocados un
electrodo a su entrada y otro a su salida. También se hace pasar una corriente eléctrica
constante a través de ese mismo orificio. Si el orificio es atravesado solamente por
líquido, la resistencia eléctrica medida por los electrodos es mínima y constante, pero
cuando el orificio es atravesado por una célula, se produce un aumento de la
resistencia eléctrica y hay un cambio de potencial entre los electrodos. El número de
señales eléctricas generadas indica el número de células presentes. Es un método
rápido que nos permite contar altas densidades.
No obstante, el recuento mediante cámara sigue siendo una alternativa preferencial por
los laboratorios puesto que es un método rápido y económico para el que se necesita la
ayuda de un microscopio.

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La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo
claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el
centro en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrícula (también pueden ser con dos depresiones y dos cuadrículas, como en la
imagen posterior).
Tiene uno o dos cuadros de 3x3mm, con una separación entre dos líneas consecutivas
de 0,25mm, Así pues, el área sombreada y marcada con una L corresponde a 1mm2.
La depresión central del cubreobjetos está hundida 0,1mm respecto a la superficie, de
forma que cuando se tapa el cubreobjetos, este dista de la superficie marcada 0,01mm.
El volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0,1mm3, es decir,
0,1microL (que serían 0,0001 ml).
El recuento en este tipo de cámara se hará para un número de células que oscilarían
entre 250.000 y 2.500.000. Los errores cometidos por la cámara de Neubauer pueden
ser del 20% al 30% y las causas pudieran ser diversas: errores de pipeteo, volumen
incorrecto, errores de conteo o por que la muestra no sea homogénea.
En la cámara hay dos zonas de conteo que llevan grabadas unas cuadrículas, superior
e inferior al eje longitudinal de la cámara. Las zonas L1, L2, L3 y L4 son las que se
destinan para contar las células.

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Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) y se observa un total de n células entre
las cuatro áreas, la concentración de la suspensión celular será:
Células/ml=4xnnx10.000
Normalmente, lo que se hace es un muestreo de cuadrículas. En este caso, para contar
lo que se debe establecer son unos criterios previos para evitar contar dos veces la
misma célula. Un método puede contar las que quedan en la parte superior de la
cuadrícula y las del borde izquierdo y proceder a contarlas en zigzag. No obstante, cada
laboratorio podrá fijar sus propios criterios.

Una vez contadas las células, hay que calcular el número de células/ml, para lo cual se
hará la media de las contadas en las diferentes cuadrículas que se han considerado, y
así expresar el resultado en células por microlitro. Si queremos hacer lo propio, pero
por mililitro, aplicaremos la siguiente fórmula:
Células/ml=número célulasx10.000/número de cuadrados contados.
2.4.2 Viabilidad celular.
Existen varios métodos para la determinación de la viabilidad celular. El más extendido
es el del azul tripán (o azul de tripano). Se trata de un agente químico que se introduce
en el interior celular con roturas de la membrana, apareciendo claramente células en la
imagen con un color azul y siendo considerado, por lo tanto no viables. No obstante, no
podemos considerar a todas las células transparentes como viables.

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Otra alternativa es la de la tinción con ioduro de propidio.

El material para realizar el contaje y viabilidad es el siguiente:

-Cámara de Neubauer.
-Cubreobjetos.
-Pipetas.
-Suspensión celular.
-Azul de tripán.
-Microscopio para el seguimiento del cultivo (de contraste de fases e invertido)
La preparación de la muestra para el conteo se hace de la siguiente manera:
1. Preparar la muestra de aproximadamente 100.000 de células. Mezclar con una
solución de tripán al 0,4% en PBS.
2. Las cantidades que se van a preparar son las siguientes: en un tubo de 1,5ml se
añadirán 20 microlitros de suspensión celular y 20 microlitros de azul de tripán.
3. Homogeneizar y tomar 20 microlitros de la mezcla, con la que procederemos a
cargar la cámara de Neubauer. Poner el cubreobjetos y llenar la cámara por
capilaridad.
4. Si se llena en exceso, el cubreobjetos se levantará y el contaje podrá ser erróneo
porque el volumen no será el adecuado de 0,1microlitros. Para evitarlo, poner
pinzas que sujetan el cubreobjetos.
5. Es importante mantener la horizontalidad de la cámara para llevarlo al
microscopio y realizar el recuento, ya que de no ser así las células pueden
quedarse irregularmente distribuidas y dar errores en el conteo.

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2.5 Contaminación de cultivos celulares
Uno de los mayores problemas que aparecen en la manipulación y almacenamiento de
los cultivos celulares es la contaminación. Esto ocurre si no se preservan las
condiciones de asepsia.
La contaminación puede deberse a una mala higiene personal o una deficiente
descontaminación de las mesas y cabinas de seguridad, así como del material.
Podemos clasificar la contaminación que aparece en el laboratorio en varios tipos:
-Microbiológica.
-Química.
-Cruzada.
2.5.1 Contaminación microbiológica
Entre los agentes de contaminación más representativos tenemos los hongos, las
levaduras, los virus, los micoplasmas y las bacterias.
En cuanto a los micoplasmas debemos decir que suelen infectar las líneas celulares
continuas. Carecen de pared celular y sus organismos diana son los humanos, especies
porcinas, bovinas y roedores.
Los problemas que causas son diversos:
1. Velocidad de crecimiento de los cultivos alterada.
2. Cambios morfológicos evidentes de nuestras células.
3. Cambios a nivel cromosómico.
4. Viabilidad de recuperación disminuida en las células preservadas.
Los micoplasmas son difíciles de detectar puestos que no causan aparentes signos de
contaminación (pH, turbidez, etc.).
Si tenemos un cultivo contaminado por micoplasma, para proceder a su eliminación,
una norma esencial es tener en cuenta que, si el cultivo es reemplazable, es preferible
eliminarlo y esterilizar cualquier instrumento que haya estado en contacto con él.
También podemos tratar el medio con kanamicina, tylocina o quilononas como la
ciprofloxacina, y también realizar un tratamiento con suero antimicoplasma (es costoso
pero efectivo).
Para reducir la contaminación por micoplasma se recomienda que:
- Cada vez que llegue un nuevo cultivo al laboratorio, se realizará un control de
micoplasmas.
- Cada seis meses se realizarán controles de los cultivos presentes en el laboratorio.

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En cuanto a los virus, si estos contaminan los cultivos, su eliminación es difícil. Virus
como el Herpes o el influenza-3 son susceptibles de mantenerse muy estables en suero
bovino.
Los virus tienen un efecto citopático marcado en los cultivos que implican cambios
morfológicos, moleculares y de viabilidad celular. A veces estos cambios se detectan
tras realizar varios pases celulares.
La contaminación por bacterias y levaduras es muy frecuente en las unidades de
cultivos celulares. Es una de las fuentes de contaminaciones más importantes, siendo
las técnicas de manipulación o la indumentaria las causas del foco.
Una solución a corto plazo, sobre todo destinado a la infección bacteriana es el empleo
de antibióticos. A largo plazo, esta solución puede ser desaconsejable ya que puede
producir problemas de viabilidad celular.
Una de las maneras de atenuar la aparición de las contaminaciones es realizar
controles de esterilidad, muy útiles para cultivos a largo plazo, pero ineficaces para los
de corto tiempo.
2.5.2 Contaminación química
Es toda presencia de sustancias que no coexisten con el cultivo celular pero que
producen efectos adversos a las células del propio cultivo.
Las fuentes de aparición pueden ser diversas: medios impuros, suero, agua con
componentes orgánicos no deseables, concentraciones de nutrientes esenciales para el
cultivo en cantidades no adecuadas y que se comportan como tóxicos en el medio de
cultivo, exposición a la luz fluorescente para alterar la composición química del medio o
tampones del cultivo celular erróneamente preparados para el medio de cultivo.
2.5.3 Contaminación cruzada
Es un tipo de contaminación que se puede dar en laboratorios que manipulen más de
un tipo de célula.
La contaminación se produce con otras células distintas; uno de los casos más
recurrentes es la contaminación de líneas celulares que contienen células HELA.
Algunos de los consejos a seguir para evitar las contaminaciones cruzadas son:
- Trabajar con células de bancos autorizados o fuentes de procedencia fiable.
- Si en un laboratorio tenemos varias líneas celulares, no tener recipientes abiertos que
puedan ser un foco de transmisión de células de una línea celular a otra.
- Manipular en solitario las líneas celulares de crecimiento rápido y utilizar soluciones
distintas, aunque su composición sea idéntica a la utilizada en otras líneas celulares.
- Manipular en última instancia del PNT (Procedimiento Normalizado de Trabajo) las
líneas celulares de mayor proliferación.

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