NOMBRE DE LA EMPRESA: LABORATORIOS SAN ANGEL SA.

NOMBRE DE LA PRUEBA: Determinación Cuantitativa en microplaca de IRT (Tripsina

Inmunorreactiva), en sangre total de neonatos colectada en papel filtro.
13906828-5 (es) CLAVE DE LA PRUEBA: 40.50.006 1

3306-0010

®
GSP
Neonatal IRT kit
Fluoroinmunoensayo a tiempo resuelto

Instrucciones de uso. Reactivos para 1152 ensayos.

Fabricado por:
Wallac Oy,
Mustionkatu 6, Turku, Finlandia

PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO

2 13906828-5 (es)
SIMBOLOS

In vitro diagnostic medical device / Dispositif médical de diagnostic in vitro /

In-Vitro-Diagnostikum / Producto sanitario para diagnóstico in vitro /
Dispositivo medico-diagnostico in vitro / Medicinteknisk produkt för in vitro-
diagnostik / Para uso diagnóstico in vitro / In vitro-diagnostisk medisinsk
utstyr

Batch code / Code du lot / Chargenbezeichnung / Código de lote / Codice

del lotto / Lot nummer / Número do lote / Partikode

Packing number / Numéro d’emballage / Packnummer / Número de

envase / Numero confezioni / Förpackningsnummer / Número de
embalagem / Pakkenummer

Catalog number / Référence du catalogue / Bestellnummer / Número de

catálogo / Numero di catalogo / Katalognummer / Código / Katalognummer

Use by / Utiliser jusqu’au / Verwendbar bis / Fecha de caducidad / Utilizzare

entro / Använd fore / Data limite de utilização / Brukes innen

Temperature limitation / Limites de température / Temperaturbegrenzung /

Limite de temperatura / Limiti di temperatura / Temperaturbegränsning /
Limite de temperatura / Temperaturbegrensning

Contains sufficient for <n> tests / Contenu suffisant pour ”n” tests / Inhalt
ausreichend für <n> Prüfungen / Contenido suficiente para <n> ensayos /
Contenuto sufficiente per “n” saggi / Conteúdo suficiente para <n> testes /
Innholdet rekker til <n> tester

Consult instructions for use / Consulter les instructions d'utilisation /

Gebrauchsanweisung beachten / Consulte las instrucciones de uso /
Consultare le istruzioni per l'uso / Se bruksanvisningen / Consultar
Instruções de uso / Les bruksanvisningen

Manufacturer / Fabricant / Hersteller / Fabricante / Fabbricante / Tillverkare /

Fabricado por / Produsent

This way up / Haut / Diese Seite oben / Este lado arriba / Questo lato
in alto / Denna sida upp / Este lado para cima / Denne side opp

Recyclable / Recyclable / Recyclebar / Reciclable / Riciclabile /

Återvinningsbart / Reciclável / Resirkulerbar
13906828-5 (es) 3
TABLA DE CONTENIDO

SIMBOLOS .......................................................................................................................... 2
TABLA DE CONTENIDO ..................................................................................................... 3
FINALIDAD DEL KIT............................................................................................................ 5
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO....................................................................... 5
PRINCIPIOS DEL ENSAYO ................................................................................................ 6
CONTENIDO DEL KIT ......................................................................................................... 7
Reactivos ......................................................................................................................... 7
MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO CON EL KIT .................................. 9
TOMA Y MANIPULACIÓN DE LAS MUESTRAS ................................................................ 9
CUIDADOS Y PRECAUCIONES ....................................................................................... 12
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO ..................................................................................... 12
Estabilidad de los componentes ..................................................................................... 13
Calibración ..................................................................................................................... 13
Procedimiento del ensayo .............................................................................................. 13
Procedimiento para ensayos con placas incompletas .................................................... 14
NOTAS DE PROCEDIMIENTO ......................................................................................... 15
CÁLCULO DE RESULTADOS........................................................................................... 15
Control de elución .......................................................................................................... 15
Control de calidad .......................................................................................................... 16
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO .......................................................................... 16
VALORES ESPERADOS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ....................... 16
Distribución de los resultados ........................................................................................ 19
Notificación de resultados .............................................................................................. 20
CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS DEL ENSAYO ........................................................... 20
Precisión ........................................................................................................................ 21
Límite inferior de detección ............................................................................................ 21
Linealidad ....................................................................................................................... 22
Interferencia ................................................................................................................... 22
Comparación de los métodos......................................................................................... 22
Rendimiento del cribado................................................................................................. 23
Reacción cruzada .......................................................................................................... 24
Efecto "hook" .................................................................................................................. 24
GARANTÍA ........................................................................................................................ 24
REFERENCIAS ................................................................................................................. 25
PATENTES ........................................................................................................................ 29
Resumen del protocolo del ensayo GSP® Neonatal IRT ................................................... 30
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GSP® Neonatal IRT kit

FINALIDAD DEL KIT

Este kit sirve para la determinación cuantitativa de la tripsina (tripsinógeno)

inmunorreactiva humana (IRT) en muestras de sangre seca en papel de filtro, como ayuda
para la detección de la fibrosis quística en los recién nacidos mediante el instrumento
GSP®.

RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO

La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad genética recesiva más frecuente en las

personas de raza caucasiana, con una incidencia de 1 por cada 2 500 nacidos vivos. Los
síntomas clínicos principales se caracterizan por anomalías funcionales en el epitelio de
las vías aéreas, el páncreas exocrino, el tracto gastrointestinal y el conducto secretor de
las glándulas sudoríparas, que dan lugar a insuficiencia pancreática y pulmonar. El gen
responsable de la FQ se identificó en 1989, por clonación posicional. El producto de este
gen defectuoso se denominó regulador de la conductancia transmembranosa de la
fibrosis quística (CFTR) [1],[2]. El gen del CFTR está formado por 27 exones, que ocupan
250 kb en el brazo largo del cromosoma 7 y codifica una proteína asociada a la
membrana de 1 480 aminoácidos. El CFTR funciona como un canal selectivo para iones
Cl-, que se activa por fosforilación mediada por la proteína quinasa A y por la unión de
ATP. La mutación que causa con más frecuencia la FQ es la eliminación de tres pares de
bases que produce la pérdida de un residuo de fenilalanina en la posición 508 (∆F508)
[2],[3]. Existe una diferencia en la frecuencia de la ∆F508 dependiendo de la población. La
frecuencia es de aproximadamente un 50% en el sur de Europa, de aproximadamente un
90% en la parte más septentrional de Europa occidental y de aproximadamente un 70%
en Norteamérica [4]. Se han identificado más de 1000 mutaciones del gen del CFTR. El
diagnóstico de FQ se sospecha por manifestaciones de enfermedad sinopulmonar crónica
e insuficiencia pancreática exocrina. El diagnóstico debe confirmarse siempre mediante
una prueba de sudor [5].

La FQ no siempre se identifica rápidamente en los lactantes y en los niños y una vez que
aparecen los síntomas a veces el diagnóstico de la enfermedad se retrasa
considerablemente. La identificación del aumento en los niveles de tripsinógeno
inmunorreactivo (IRT) en la sangre de lactantes con FQ ha permitido la exploración
neonatal de la FQ a gran escala [6],[7],[8],[9],[10],[11]. El tripsinógeno es uno de los
principales productos de secreción del páncreas humano, lo que permite que su nivel en
sangre sea un marcador específico de la función pancreática. De las enzimas
pancreáticas, la tripsina es la única que se produce exclusivamente en el páncreas. Las
células acinares del páncreas secretan dos isoenzimas principales del tripsinógeno
enzimáticamente inactivo (PM ~ 24 000), que se convierten en tripsina activa cuando se
rompe un hexapéptido del extremo amino terminal. La forma principal en la sangre es el
tripsinógeno (el kit GSP Neonatal IRT sólo mide las formas principales). La tripsina activa
se une a la antitripsina α1, la macroglobulina α2 y al inhibidor de la inter-α-tripsina [12]. Es
probable que el aumento en los niveles sanguíneos de IRT y de otras enzimas
pancreáticas en los recién nacidos con FQ se deba al bloqueo de las secreciones del
conducto pancreático, ya que las células acinares parecen producir cantidades normales

GSP es una marca registrada de PerkinElmer, Inc.

6 13906828-5 (es)
del zimógeno. También se observa una disminución de los niveles de IRT relacionada con
la edad en los niños con FQ. Es probable que esto ocurra debido a la atrofia de los acini y
su sustitución por tejido fibrótico como consecuencia de la disfunción pancreática [13].

Lecoq et al. [14] han propuesto que las concentraciones neonatales de IRT están, en
parte, determinadas genéticamente. Existe una amplia variación en los niveles de IRT en
el momento del nacimiento en los pacientes con FQ, que parece estar relacionada con el
genotipo y el fenotipo clínico. Castellani et al. [15] demostraron que los portadores
identificados a través de un análisis neonatal pueden ser, en realidad, heterozigóticos, lo
que podría predisponer a estos niños a presentar síntomas "más leves" de la FQ.

Existen pruebas de que el tratamiento precoz puede ser importante para determinar el
resultado clínico posterior en niños con fibrosis quística. Estudios han demostrado que el
diagnóstico precoz a través del análisis neonatal tiene ventajas nutricionales, como lo
demuestra un mejor crecimiento y permite, por tanto, evitar la malnutrición en los niños
con FQ [8],[16],[17],[18],[19],[20]. La detección precoz de la FQ puede reducir el riesgo de
un desarrollo insuficiente [21], deficiencias de zinc [22], anemia hemolítica grave asociada
a la deficiencia de vitamina E [23], desnutrición debida a los problemas de absorción del
ácido linoléico [24] e infecciones torácicas [25],[26].

PRINCIPIOS DEL ENSAYO

El kit GSP Neonatal IRT es un ensayo en fase sólida, fluoroinmunométrico de dos sitios,
basado en la técnica directa del sandwich, en la que dos anticuerpos monoclonales
(derivados del ratón) se dirigen contra dos determinantes antigénicos distintos de la
molécula de IRT. Los calibradores, los controles o las muestras problema con IRT se
hacen reaccionar simultáneamente con los anticuerpos monoclonales inmovilizados,
dirigidos contra un sitio antigénico específico de la molécula de IRT, y los anticuerpos
monoclonales marcados con europio (dirigidos contra un sitio antigénico específico
distinto), en la solución tampón del ensayo. La solución tampón del ensayo eluye el IRT
de la sangre seca en los discos de papel de filtro. El ensayo completo sólo requiere una
incubación.

El inductor DELFIA Inducer disocia los iones de europio del anticuerpo marcado en una
solución donde éstos forman con los componentes de dicha solución quelatos altamente
fluorescentes. A continuación, se mide la fluorescencia en cada pocillo. La fluorescencia
producida en cada muestra es proporcional a la concentración en la muestra de IRT
[27],[28].
13906828-5 (es) 7

Molécula
de IRT
Incubación

IgG anti-IRT
IgG anti-IRT en marcada con Eu
la fase sólida

DELFIA
Inducer

Medición de la
fluorescencia

Figura 1. Principios del ensayo Neonatal IRT

CONTENIDO DEL KIT

Cada kit GSP Neonatal IRT contiene reactivos para 1152 ensayos.

La fecha de caducidad del kit sin abrir viene indicada en una etiqueta exterior. Almacenar
a +2–+8°C.

Reactivos

Componente Cantidad Almacenamiento y

caducidad

Neonatal IRT Calibrators 7 cassettes de papel de Almacenar en la bolsa

(Calibradores de Neonatal IRT) filtro (Whatman, nº 903) original en nevera y
(valores aprox.) con 1 juego de manchas protegido de la humedad y
de sangre seca la luz. Estable a +2–+8°C
A 0 ng/mL de sangre hasta la fecha de caducidad
B 25 ng/mL de sangre indicada en la etiqueta.
C 50 ng/mL de sangre
D 100 ng/mL de sangre Las concentraciones exactas de IRT se indican en el
E 250 ng/mL de sangre certificado de control de calidad específico del lote,
F 500 ng/mL de sangre incluido en el kit.
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Neonatal IRT Controls 5 cassettes de papel de Almacenar en la bolsa

(Controles de Neonatal IRT) filtro (Whatman, nº 903) original en nevera y
(valores aprox.) con 2 juegos de protegido de la humedad y
manchas de sangre la luz. Estable a +2–+8°C
C1 30 ng/mL de sangre seca hasta la fecha de caducidad
C2 70 ng/mL de sangre indicada en la etiqueta.
C3 110 ng/mL de sangre

Los valores de los controles del kit medidos por el

fabricante se indican en el certificado de control de
calidad específico del lote, incluido en el kit. Cada
laboratorio debe establecer su propio intervalo y valor
medio aceptables.

Los calibradores y los controles se han preparado a partir de derivados sanguíneos

humanos con un valor de hematócrito del 50–55% y se han calibrado utilizando métodos
gravimétricos.

Factor de conversión: 1 ng/mL de sangre = 2.22 ng/mL de suero (suponiendo un 55 % de

hematócrito)

Anti-IRT-Eu tracer 3 viales, 2.8 mL +2–+8°C hasta la fecha de

(Trazador anti-IRT-Eu) caducidad indicada en la
(~ 40 µg/mL) etiqueta del vial.
(ratón monoclonal)

El trazador listo para usar es una solución salina tamponada con Tris-HCl (pH 7.8) que
contiene albúmina sérica bovina y < 0.1% de azida sódica como conservante.

IRT Assay Buffer 3 frascos, 120 mL +2–+8°C hasta la fecha de

(Tampón del ensayo IRT) caducidad indicada en la
etiqueta del frasco.

Solución salina lista para usar, tamponada con Tris-HCl (pH 7.8), que contiene albúmina
sérica bovina, globulina bovina, bloqueantes, Tween 40, polietilenglicol 6000, un colorante
rojo inerte, y < 0.1% de azida sódica como conservante.

Anti-IRT Microtitration Strips. 12 placas +2–+8°C hasta la fecha de

(Tiras para microtitulación caducidad indicada en la
anti-IRT). 8 x 12 pocillos etiqueta.
recubiertos con anticuerpos
dirigidos contra un sitio
específico en la molécula de
IRT (ratón monoclonal)
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Extra barcode labels 6 unidades Nota: los códigos de barras

for the plate son específicos del lote.
(Etiquetas de código de barras
adicionales para la placa)

Lot-specific 1 unidad
quality control certificate
(Certificado de control de
calidad específico del lote)

MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO CON EL KIT

Este kit GSP Neonatal IRT se debe usar con el instrumento GSP. Se necesitan los
siguientes componentes, que se pueden obtener de Wallac Oy o de PerkinElmer, Inc. y
sus distribuidores.

1. Instrumento GSP (no de ref. 2021-0010)

2. Wash Concentrate (Concentrado de lavado) (no de ref. 4080-0010)
3. DELFIA Inducer (Inductor) (no de ref. 3304-0010)
4. Puntas de pipeta (no de ref. 1235-402 y no de ref. no. 2021-4010)
5. Wallac DBS Puncher (no de ref. 1296-071), Wallac MultiPuncher™ 1 (no de ref. 1296-
081) o Wallac AutoPuncher™ 2 (no de ref. 1296-091), o un taladro manual para cortar
los discos de papel de filtro con un diámetro de 3.2 mm (1/8 de pulgada)

Además, se necesita lo siguiente:

- agua desionizada
- tarjetas de muestras con papel de filtro que cumple las normativas locales vigentes

TOMA Y MANIPULACIÓN DE LAS MUESTRAS

Para el cribado neonatal es preferible tomar una muestra de sangre mediante punción en
el talón con aplicación directa en el papel de filtro [29].

Los programas de cribaje neonatal difieren entre sí en el tipo de muestra requerida. En

Estados Unidos, la recomendación es una mancha de sangre, de aproximadamente
12.7 mm (1/2 de pulgada) de diámetro, obtenida mediante una punción en el talón y
recogida en papel de filtro. La punción de sangre neonatal en el talón se obtiene
habitualmente de 2 a 6 días después del nacimiento, pero puede que en algunos
programas de cribado los tiempos y el número de muestras sean distintos. Consulte las
normativas de carácter local para conocer los tiempos y las tomas de muestras de cribado
adecuados. El dispositivo de toma de muestras debe cumplir las normativas nacionales.
Los métodos basados en muestras de sangre seca requieren de una obtención,
manipulación y transporte adecuados. El documento LA4-A5 [29] del CLSI describe la
técnica de toma de muestra, cuyos principales puntos se exponen a continuación:
1
MultiPuncher es una marca comercial de PerkinElmer, Inc.
2
AutoPuncher es una marca comercial de PerkinElmer, Inc.
10 13906828-5 (es)
- Limpiar la piel con una gasa mojada en alcohol y dejar secar al aire.

- Realice una punción en el talón del recién nacido con una lanceta estéril o con un
dispositivo de incisión en el talón hasta una profundidad de 1.0–2.0 mm. En los niños
pequeños una punción realizada a mayor profundidad puede causar daños óseos.

- Limpiar la primera gota de sangre. Colocar suavemente el papel de filtro sobre una
gota grande de sangre y, en un solo paso, dejar que se absorba una cantidad de
sangre suficiente como para llenar completamente el círculo preimpreso en el papel
de filtro. Examinar ambos lados del papel de filtro para comprobar que la sangre ha
penetrado y ha impregnado el papel. Si se aprieta excesivamente el sitio de punción,
podría causar hemólisis de la muestra o la mezcla de líquidos tisulares con la
muestra. No colocar varias gotas sucesivas en el círculo (esto ocasiona la formación
de capas).

- Dejar secar la muestra de sangre al aire en posición horizontal durante al menos

3 horas a temperatura ambiente (+18–+25°C), sin exponer a la luz directa. No caliente
ni apile las muestras durante el proceso de secado.

- Comprobar que se ha rellenado la información necesaria en la tarjeta de toma de la

muestra. La información preimpresa mínima necesaria sobre el dispositivo de toma de
muestras incluye:

- apellido (y nombre si está disponible), sexo, fecha de nacimiento (opcional: hora

de nacimiento), peso al nacer y edad; (indicar si tiene menos de 24 h), y número
de identificación del paciente
- nombre y apellido de la madre
- fecha de toma de la muestra (opcional: hora de toma de la muestra)
- nombre y dirección del remitente (opcional: centro en el que ha nacido)
- nombre y número de teléfono del médico (profesional de atención sanitaria)
- nombre y dirección del programa de cribado de neonatos
- cada tarjeta debe tener un número de serie único y una fecha de caducidad

- Antes de colocar las muestras en un contenedor para transporte, las manchas de

sangre seca de las tarjetas de toma de muestras deben separarse mediante una
barrera física o girarse 180° con respecto a las tarjetas que están inmediatamente
encima o debajo. También se pueden proteger las muestras de sangre colocando un
papel o cartón doblado que las cubra o bien papel cristal entre las mismas.

- Para el embalaje y transporte de la muestra siga las normativas locales de correo y

transporte. Las muestras no deben colocarse en recipientes sellados herméticamente
(por ejemplo, bolsas de plástico o aluminio). Si es necesario, deben incluirse bolsas
desecantes en número suficiente. La humedad y el vapor son perjudiciales para la
muestra de sangre seca.

- Envíe por correo u otro medio de transporte la muestra al laboratorio antes de que
transcurran 24 horas desde que se tomó, a no ser que el laboratorio de cribado lo
determine de otra forma.

Algunos laboratorios de cribado pueden solicitar información adicional en la tarjeta, por

ejemplo si el bebé fue anterior o posterior al término y, en este caso, en qué grado, si fue
un parto gemelar, información acerca de la alimentación y posibles antibióticos, y si se
13906828-5 (es) 11
realizó alguna transfusión de sangre. Consulte las normativas de carácter local y las
políticas institucionales para conocer las desviaciones con respecto a la información
mínima necesaria sobre el dispositivo de toma de muestras.

El análisis de IRT de las muestras conservadas a temperatura ambiente debe realizarse

durante las dos semanas siguientes a la obtención, ya que los niveles de IRT disminuyen
un 6–9% por semana. Para la conservación durante más tiempo, colocar las muestras en
bolsas de plástico y conservar en congelación [30],[31]. Se han descrito variaciones
estacionales en los niveles de IRT [32]. Esto puede deberse, en parte, a la inestabilidad
de la IRT durante el transporte y la conservación. Debe considerarse el establecimiento y
la modificación de las concentraciones de corte, en función de las variaciones
estacionales. También se pueden elegir valores de corte suficientemente bajos para evitar
falsos negativos durante los meses de verano, aunque esto puede aumentar el número de
falsos positivos durante los meses de invierno. La comprobación que las condiciones de
transporte de las muestras son las más adecuadas debería reducir al mínimo esta
variación.

La influencia de la duración, la humedad y la temperatura de almacenamiento en la

concentración de IRT se ha estudiado mediante dos muestras de sangre seca. Las
muestras 1 y 2 contenían IRT endógeno, y la muestra 2 se sobrecargó además con
tripsina para poder cubrir el área relevante desde el punto de vista clínico 3. Tras la toma y
la preparación, las muestras de sangre se han secado durante 24 horas a temperatura
ambiente (entre +19 y +25 ˚C) en un lugar seco. A continuación, las manchas de sangre
seca se han almacenado en bolsas de aluminio sin sellar en distintas condiciones de
almacenamiento. Los resultados se muestran en las figuras 2 y 3.

Figura 2. Estabilidad de la muestra 1.

3
Estudio realizado en Wallac Oy, Turku, Finlandia.
12 13906828-5 (es)

Figura 3. Estabilidad de la muestra 2.

CUIDADOS Y PRECAUCIONES

Para diagnóstico in vitro.

Este kit debe ser utilizado únicamente por personal cualificado.

Este kit contiene calibradores y controles fabricados a partir de componentes de sangre

humana. La sangre humana se ha sometido a métodos de ensayo aprobados por la FDA
o equivalentes, y se han obtenido resultados negativos para el antígeno de superficie de
la hepatitis B, anticuerpos anti-hepatitis C y anticuerpos anti-VIH 1 y 2. No obstante,
deben seguirse todas las precauciones recomendadas para la manipulación de derivados
sanguíneos. Consultar la publicación "Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories" del U.S. Department of Health and Human Services o las normas locales o
nacionales.

Tratar todas las muestras de pacientes como potencialmente infecciosas.

Los reactivos contienen azida sódica (NaN 3 ) como conservante. La azida sódica puede
reaccionar con el plomo o el cobre de las tuberías, formando azidas metálicas muy
explosivas. Al limpiar los reactivos, dejar correr gran cantidad de agua para evitar la
formación de azidas.

Todos los residuos se deben eliminar siguiendo la normativa en vigor.

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Consulte el manual del usuario de GSP y el manual del usuario de GSP Workstation para
obtener más información. Antes de cargar los reactivos, lea los códigos de barras del
certificado de control de calidad para introducir la información específica del lote en el
software GSP Workstation. Las muestras y las placas se pueden dejar a temperatura
13906828-5 (es) 13
ambiente (+19 a +25 °C) antes de su uso, pero las botellas y los viales de reactivos deben
cargarse refrigerados (+2 a +8 °C) en el instrumento.

Estabilidad de los componentes

Reactivos líquidos:

Los viales y botellas de reactivos deben cargarse en el instrumento llenos y sin usar. A
continuación, los reactivos deben almacenarse en el carrusel de reactivos hasta que se
usen o hasta que caduquen (máximo 14 días).

Tiras:

Una vez abiertas, las tiras son estables durante 2 semanas, cuando se almacenan con
desecante a una temperatura entre +2 y +8 °C en su envase original o en una bolsa de
plástico que se pueda sellar.

Calibradores and controles:

Una vez abiertos, los calibradores y los controles son estables durante 2 semanas,
cuando se almacenan a una temperatura entre +2 y +8 °C y se protegen de la humedad.

Se ha demostrado que las placas que contienen calibradores y controles perforados en

los pocillos se mantienen estables en el instrumento GSP hasta 11 horas.

Calibración

Debe realizarse una curva de calibración por duplicado para cada lote del kit y lote de
inductor DELFIA Inducer. Después, la curva de calibración será válida durante 24 horas o
hasta que se realice una nueva curva de calibración.

Procedimiento del ensayo

Las muestras de sangre seca deben perforarse en las placas por separado,
utilizando un taladro automático o manual.

1. Retire los tapones de las botellas y viales de reactivos y coloque los reactivos en el
cassette de reactivos tal como muestra la siguiente figura. Asegúrese de que los
códigos de barras son visibles a través de las ranuras del cassette de reactivos.
Coloque el tapón negro antievaporación sobre el vial de trazador.
14 13906828-5 (es)

Tapón antievaporación

Trazador

Tampón

2. Coloque los cassettes de reactivos en el carrusel de reactivos.

3. Perfore los calibradores, los controles y las muestras en los pocillos. Para reducir al
mínimo la variación de los calibradores y los controles, es recomendable evitar los
bordes exteriores de las manchas de sangre seca; es decir, perforar un máximo de
4 discos de cada mancha de sangre seca en los cassettes de calibradores y
controles.

4. Lea el código de barras de la placa e introduzca la información acerca de las

muestras y los controles en el software GSP Workstation.

5. Comprobar que todos los pocillos tengan un disco de papel de filtro y que aparecen
en horizontal en la parte inferior de los pocillos. Cargue las placas en la cámara de
modo que todos los códigos de barras de las mismas estén orientados en la misma
dirección.

6. Coloque la cámara en el cargador de entrada de modo que los códigos de barras de

las placas estén orientados hacia fuera.

7. Espere hasta que se complete la carga y se organicen todas las placas. Si fuera
necesario, cargue más reactivos o consumibles tal y como indique la pantalla.
Después, el ensayo comienza automáticamente.

8. Retire las placas del cargador de salida al final del ensayo.

Procedimiento para ensayos con placas incompletas

Si no se utiliza una placa completa, retire la cantidad de tiras necesarias, colóquelas sobre
un bastidor y coloque el adhesivo del código de barras adjunto tal como se muestra en la
siguiente figura. Si el número de tiras es impar, añada una tira adicional. Debería ser una
tira dummy. Nota: Abra la lámina únicamente desde tres lados, dóblela y guárdela
dejando la información específica de la placa en el embalaje. Vuelva a colocar las tiras
restantes en el embalaje y vuelva a presionar la cubierta de aluminio hasta que esté bien
cerrada. Deje el secante en el embalaje. También puede guardar las tiras restantes en
una bolsa de plástico que se pueda sellar e incluya el secante.
13906828-5 (es) 15

Coloque la etiqueta
adhesiva de código de
La etiqueta barras en la placa, de
adhesiva de manera que el pocillo
código de barras A1 quede en este lado

NOTAS DE PROCEDIMIENTO

1. Para usar este kit, es necesario leer detenidamente este folleto, el manual del usuario
de GSP y saber utilizar el software GSP Workstation. Los reactivos suministrados con
este kit están pensados para utilizarlos como una sola unidad. No mezcle reactivos de
kits que tengan diferentes números de lote. No usar los reactivos de un kit después de
la fecha de caducidad impresa en la etiqueta del mismo.

2. No se pueden utilizar dos lotes de kits diferentes que tengan el mismo número de lote
de placa simultáneamente en el instrumento.

3. Cualquier desviación del procedimiento de ensayo puede afectar a los resultados.

4. Es importante evitar la contaminación de europio por el aumento de fluorescencia que

comportaría. El cambio del frasco de inductor DELFIA Inducer debe hacerse con
cuidado, evitando tocar los tubos.

5. Manipule las placas con precaución y evite tocar o contaminar la parte inferior de la
placa.

CÁLCULO DE RESULTADOS

El sistema GSP incorpora programas para la reducción de datos, y los resultados (curvas
de calibración, concentraciones de las muestras, etc.) se guardan en el software GSP
Workstation.

Control de elución

El software de GSP contiene una función denominada 'Control de elución'. La finalidad del
'Control de elución' es detectar si faltan discos de sangre en los pocillos después de la
medición de fluorescencia. Se realiza una medición adicional y, si se sospecha que falta
un disco de sangre, se envía un mensaje de notificación. En este caso, es necesario
volver a analizar las muestras.
16 13906828-5 (es)
Control de calidad

Se recomienda el uso de muestras de control para cerciorarse de la validez de los

resultados día a día. Al menos un control debe estar cerca del límite de decisión clínica.
Los controles deben procesarse de la misma manera que las muestras. El kit incluye
controles a tres niveles distintos. Estos controles deben realizarse en cada ensayo; si el
ensayo incluye más de una placa, deben realizarse controles en cada placa. Cada
laboratorio debe establecer su propio intervalo y valor medio aceptables. La media
establecida debe estar en ± 20% de los valores indicados en el certificado de control de
calidad. Se recomienda que los laboratorios establezcan sus propios controles a
diferentes niveles, además de los controles incluidos en el kit. Sólo se deben notificar los
resultados de las muestras si los resultados de los controles del ensayo cumplen los
criterios de aceptación establecidos por el laboratorio [33]. Asegúrese de que se cumplan
los requisitos locales y nacionales aplicables.

Asimismo, se recomienda la participación en programas de control de calidad externos.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Al igual que con cualquier otra prueba de análisis in vitro, los datos obtenidos con el
inmunoensayo en manchas de sangre GSP Neonatal IRT deben utilizarse únicamente
como una ayuda a otros procedimientos médicos establecidos, y sus resultados deben
interpretarse en conjunción con otros datos clínicos de los que disponga el facultativo.

Se reconocen los siguientes factores como causantes de resultados anormales en el

ensayo analítico:
- muestras de manchas que no estén impregnadas de sangre uniformemente
- muestras de manchas taladradas demasiado cerca del borde de la mancha de sangre
- muestras obtenidas o secadas incorrectamente
- manchas de sangre que no se eluyen debido al deterioro de la muestra, causado por
la exposición al calor y a la humedad
- contaminación del papel de filtro de la mancha de sangre con materia fecal

Se sabe que se obtienen valores falsos negativos de IRT en algunos recién nacidos con
FQ que presentan íleo con meconio [12],[34]. Se recomienda realizar la prueba del sudor
a todos los recién nacidos con íleo meconial, independientemente de los resultados de
cribado [35].

Ver también la sección "NOTAS DE PROCEDIMIENTO".

VALORES ESPERADOS 4 E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

La medición de IRT en las manchas de sangre seca se utiliza como medio para identificar
una población de recién nacidos que corren un mayor riesgo de tener FQ y debe
seleccionarse para una segunda etapa de prueba. La identificación se basa en el uso de
un valor de corte fijo o un percentil de la población. Los niveles de corte de IRT debe
determinarlos cada laboratorio de cribado de recién nacidos para conseguir la sensibilidad
y especificidad del cribado y deben evaluarse periódicamente [35].

4
Estudio realizado para Wallac Oy, Turku, Finlandia.
13906828-5 (es) 17
Existen varios protocolos de cribaje que utilizan la IRT como el principal analito en el
cribaje neonatal de la FQ. El siguiente diagrama ilustra los distintos algoritmos alternativos
para el cribado de FQ descrito por el American College of Medical Genetics (Colegio
estadounidense de genética médica) [36]. Las acciones se muestran el los recuadros en
blanco y los resultados en los recuadros sombreados.

Figura 4. Algoritmos alternativos para el cribado de FQ en recién nacidos. Modificado a

partir del documento orientativo del American College of Medical Genetics [36].
18 13906828-5 (es)
Alternativa 1

El protocolo más común en EE.UU. es la estrategia de cribado IRT/ADN en dos etapas. El

cribaje inicial determina la IRT en muestras de sangre seca obtenidas de forma rutinaria.
Cuando el nivel de IRT es superior al nivel de corte o percentil fijo seleccionado, se realiza
un análisis de mutación del gen de CFTR. El valor de corte utilizado para el análisis de la
IRT varía para adaptarse a la población específica en la que se realiza el ensayo.

Alternativa 2

En otra estrategia de cribado IRT/IRT, se pide una segunda muestra de los niños que
mostraron originalmente niveles elevados de IRT. En esta segunda muestra se realiza
otra determinación de IRT y si continúa elevada, se realiza una prueba de sudor. En
ambos casos, los niños que se identifican con un mayor riesgo de presentar FQ deben
someterse a un seguimiento para excluir o confirmar la FQ [7],[37]. Los niveles de IRT
disminuyen a medida que aumenta la edad. Se debe utilizar un valor de corte distinto
(más bajo) para las muestras obtenidas después de los 30 días de edad [7],[38].

En ambas alternativas, el programa de cribado tiene la opción de enviar resultados de IRT

muy altos directamente para la prueba de diagnóstico de cloro en el sudor.

Los protocolos de screening y los valores mostrados son únicamente ilustrativos. Cada
laboratorio debe establecer su propio protocolo de ensayo y de seguimiento, teniendo en
cuenta las normativas nacionales y locales y los recursos disponibles. Se debe recordar
que los valores de IRT y la frecuencia de FQ varían en función de la geografía y la
demografía local. Por tanto, es importante que cada laboratorio establezca su propio
intervalo de referencia y valor de corte a partir de una población de muestra
representativa. Algunos laboratorios deciden establecer el nivel de corte del 1% al 5%
superior [39]. La selección del percentil del nivel de corte depende de los objetivos de
sensibilidad y especificidad del programa de cribado. Por ejemplo, la selección de un nivel
de corte del 5% de los resultados diarios de IRT, aumenta la sensibilidad del cribado,
mientras que la selección de un nivel de corte del 1% reduce el número de muestras
enviadas para la segunda etapa de prueba. Puede encontrarse más información sobre los
algoritmos de cribado de la fibrosis quística en los informes de la European Cystic Fibrosis
Foundation (Fundación europea para la fibrosis quística) [40], la Cystic Fibrosis
Foundation (Fundación para la fibrosis quística) [35] y los Centros estadounidenses para
el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC en sus siglas en inglés) [41].

Nota! Debido a posibles diferencias entre los kits disponibles en el mercado, los
valores de corte deben establecerse con el kit que se va a utilizar de forma rutinaria.

El fenómeno de hipertripsinemia neonatal transitoria (no asociada a la FQ) se observa

principalmente durante los primeros días de vida y es la causa principal de los falsos
positivos. También se pueden obtener falsos positivos en neonatos con una puntuación
APGAR baja y en los niños afroamericanos. La quimotripsina causa una reacción cruzada
débil en el ensayo, por lo que los altos niveles de quimotripsina en la sangre del recién
nacido pueden causar falsos positivos para el cribado (consulte la sección
CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS DEL ENSAYO / Reacción cruzada). Se ha demostrado
que el uso de un ensayo en una segunda fase, ya sea ADN o repetir la IRT en una
segunda muestra, reduce el número de falsos positivos [42],[43]. Los portadores sanos de
mutaciones de la FQ pueden producir un valor falso positivo de IRT, con una tasa de
13906828-5 (es) 19
aproximadamente tres veces la de la población general [15]. Se sabe que se obtienen
valores falsos negativos de IRT en algunos recién nacidos con FQ que presentan íleo con
meconio [12],[34]. Se recomienda realizar la prueba del sudor a todos los recién nacidos
con íleo meconial, independientemente de los resultados del cribado [35].

La exploración de IRT, en combinación con un análisis de mutaciones como segunda

prueba permite identificar a los portadores de la fibrosis quística. Algunas personas
consideran esto como una ventaja, ya que permite proporcionar asesoramiento genético
[8]. Otros consideran que la detección de los portadores es una desventaja debido a la
ansiedad que el asesoramiento genético precoz [44] ocasiona en los padres y a los
recursos necesarios para proporcionar este asesoramiento [43]. Sin embargo, según las
directrices, debe proporcionarse una orientación genética a los portadores como parte del
programa de cribado para FQ [35].

Distribución de los resultados

La distribución de una población de recién nacidos se ha determinado analizando la

concentración en 2106 muestras de sangre seca de recién nacidos por medio del kit
3306-0010 GSP Neonatal IRT 5. La distribución se muestra en el gráfico siguiente:

Figura 5. Distribución de los resultados utilizando el kit 3306-0010 GSP Neonatal IRT.

5
Estudio realizado para Wallac Oy, Turku, Finlandia.
20 13906828-5 (es)
Las estadísticas descriptivas de las muestras y los percentiles de la misma población se
muestran a continuación.

Media Mediana Valores de percentiles (ng/mL de

Kit n (ng/mL de (ng/mL de sangre)
sangre) sangre) 95 96 97 98 99
3306-0010 2106 17.6 15.8 33.9 35 36.8 40.6 43.4

Notificación de resultados

Se ha demostrado que el intervalo de medición es de 9 ng/mL a 500 ng/mL de sangre.

Las muestras con valores inferiores a 9 ng/mL de sangre deben calificarse como
"inferiores a 9 ng/mL de sangre". Estos resultados no deben considerarse exactos, pero sí
pueden considerarse negativos para el cribado de IRT.

Las muestras con valores superiores a 500 ng/mL de sangre deben calificarse como
"superiores a 500 ng/mL de sangre". Estos resultados no deben considerarse exactos,
pero sí pueden considerarse positivos para el cribado de IRT.

CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS DEL ENSAYO 6

A continuación, se indican los datos de rendimiento representativos. Los resultados

obtenidos por laboratorios individuales pueden variar.

A continuación se muestra una curva de calibración típica obtenida con el kit 3306-0010
GSP Neonatal IRT.

6
Estudio realizado en Wallac Oy, Turku, Finlandia.
13906828-5 (es) 21
Precisión

La precisión se determinó de acuerdo con el documento EP5-A2 del NCCLS [45].

La variación del ensayo de 3306-0010 GSP Neonatal IRT se determinó utilizando

muestras de manchas de sangre seca, tres lotes de kits y tres instrumentos GSP. El
estudio se realizó durante 21 días, con 27 ensayos cada uno compuestos por 2 placas y
4 replicados por muestra. El número total de mediciones fue de 216 por muestra. Se
utilizó el análisis de la varianza para calcular los siguientes resultados:

Tabla 1. Datos de precisión de IRT al emplear una curva de calibración completa en cada
placa

Concentración Variación dentro Variación dentro

Variación total
Muestra media de IRT n del ensayo del lote
(ng/mL de sangre) DE CV% DE CV% DE CV%
1 10.9 216 0.6 5.1 0.8 7.2 0.8 7.3
2 22.2 216 1.0 4.5 1.6 7.2 1.6 7.2
3 28.5 216 1.4 5.0 2.0 7.0 2.0 7.0
4 40.0 216 2.7 6.9 3.2 7.9 3.3 8.2
5 50.2 216 2.6 5.2 3.9 7.7 4.0 8.0
6 61.6 216 3.4 5.5 4.7 7.6 4.8 7.8
7 93.5 216 4.4 4.7 6.3 6.7 6.7 7.2
8 302 216 18.3 6.0 21.8 7.2 22.2 7.4
9 449 216 26.5 5.9 33.2 7.4 33.9 7.5

Tabla 2. Datos de precisión IRT al emplear una curva de calibración válida durante
24 horas:

Concentración Variación dentro Variación dentro

Variación total
Muestra media de IRT n del ensayo del lote
(ng/mL de sangre) DE CV% DE CV% DE CV%
1 10.8 216 0.6 5.2 0.8 7.4 0.8 7.5
2 22.1 216 1.1 5.1 1.5 7.0 1.6 7.0
3 28.3 216 1.6 5.5 2.1 7.2 2.1 7.3
4 39.8 216 2.8 7.1 3.2 8.1 3.4 8.5
5 49.9 216 3.3 6.7 4.0 8.1 4.3 8.5
6 61.1 216 4.0 6.6 4.4 7.2 4.6 7.5
7 92.9 216 4.8 5.2 5.9 6.4 6.5 7.0
8 300 216 18.6 6.2 21.4 7.1 22.1 7.4
9 446 216 27.9 6.3 33.2 7.5 34.2 7.7

Límite inferior de detección

Los límites de blanco, detección y cuantificación se determinaron de acuerdo con el

documento EP17-A del NCCLS [46].

El límite de blanco (LoB) de la IRT es de 0.76 ng/mL de sangre, definido como el percentil
95 de una distribución de muestras del blanco (n = 60). El límite de detección (LoD) es de
2.2 ng/mL de sangre basado en 504 determinaciones de 7 muestras de nivel bajo. El
22 13906828-5 (es)
límite de cuantificación (LoQ) es de 2.2 ng/mL de sangre, definido como la concentración
más baja con un CV total igual o inferior al 20%

Linealidad

La linealidad se determinó de acuerdo con el documento EP6-A del NCCLS [47].

Para la IRT, se ha demostrado que el método es lineal de 9 ng/mL de sangre a 630 ng/mL
de sangre.

Interferencia

El kit GSP Neonatal IRT se evaluó con el fin de determinar posibles interferencias de
acuerdo con el documento EP7-A2 del CLSI [49].

Las muestras ictéricas (bilirrubina no conjugada igual o inferior a 171 µmol/L, equivalente
a 10 mg/dL en sangre y bilirrubina conjugada igual o inferior a 197 µmol/L, equivalente a
16.6 mg/dL en sangre), lipémicas (Intralipid 7 igual o inferior a 15 mg/mL en sangre) y
hemolíticas (hemoglobina adicional igual o inferior a 1 g/dL en sangre) no interfieren con
el ensayo. Las muestras que contienen hasta 9.8 mg/mL en sangre de EDTA,
0.0645 mol/L en sangre de citrato de sodio o 0.375 mg/mL en sangre de heparina de litio,
no interfieren con el ensayo.

Comparación de los métodos

La comparación de los métodos se determinó de acuerdo con el documento EP9-A2 del

NCCLS [49].

El kit 3306-0010 GSP Neonatal IRT (y) se comparó con el kit B005-212 AutoDELFIA
Neonatal IRT (x) utilizando muestras de manchas de sangre de cribado de rutina dentro
del intervalo de 10–300 ng/mL de sangre en el kit B005-212, y de 16 a 390 ng/mL de
sangre en el kit 3306-0010. La correlación a partir de la regresión Deming ponderada se
determinó del siguiente modo:

y = 0.94x - 0.35 95% CI: curva (0.91; 0.97); intercept (-0.99; 0.30) (n = 1222)

El kit GSP Neonatal IRT se comparó con el kit B005-212 AutoDELFIA Neonatal IRT
midiendo la concentración de IRT en 2106 muestras de cribado rutinarias.

IRT (ng/mL de sangre)

Plataforma n
Media Mediana 95% 96% 97% 98% 99%
GSP 2106 17.6 15.8 33.9 35 36.8 40.6 43.4
AutoDELFIA 2106 18.5 16.4 36.8 38.7 40.7 43.9 48.0

7
Intralipid es una marca registrada de Fresenius Kabi AB.
13906828-5 (es) 23
Rendimiento del cribado

Utilizando los datos de muestras no afectadas, los valores de corte de los kits 3306-0010
GSP IRT y B005-212 AutoDELFIA Neonatal IRT se determinaron calculando las
concentraciones de IRT correspondientes a los percentiles de población 95 y 99.

Los resultados del cribado que incluyen las muestras de cribado retrospectivo
diagnosticadas de FC, se muestran en las siguientes tablas.

Un total de 12 muestras de casos de FQ confirmados era disponible para el estudio.

Todas eran muestras retrospectivas y se identificaron como positivas en ambos métodos.

Resultados de cribado y diagnóstico real, percentil 95

Valor de corte de Valor de corte de

3306-0010 B005-212 Total de FQ FQ no
GSP IRT AutoDELFIA IRT individuos diagnosticada diagnosticada
33.9 ng/mL 36.8 ng/mL
+ + 86 12 74
+ - 31 0 31
- + 30 0 30
- - 1971 0 1971
Total 2118 12 2106

Resultados de cribado y diagnóstico real, percentil 99

Valor de corte de Valor de corte de

3306-0010 B005-212 Total de FQ FQ no
GSP IRT AutoDELFIA IRT individuos diagnosticada diagnosticada
43.4 ng/mL 48.0 ng/mL
+ + 22 12 10
+ - 11 0 11
- + 11 0 11
- - 2074 0 2074
Total 2118 12 2106
24 13906828-5 (es)
Reacción cruzada

La reacción cruzada se determinó de acuerdo con el documento EP7-A2 del CLSI [48].

En la siguiente tabla se recoge la reacción cruzada con otras sustancias.

Concentración
Concentración Reacción
Sustancia aparente de IRT
añadida cruzada %
medida
α2 -macroglobulina 5 mg/mL de sangre < 2.2 ng/mL de sangre < 0.1

α1 -antitripsina 2 mg/mL de sangre < 2.2 ng/mL de sangre < 0.1

Fosfolipasa A2 500 ng/mL de sangre < 2.2 ng/mL de sangre < 0.1

Quimotripsina 800 ng/mL de sangre 7.8 ng/mL de sangre 1.1

IgG humana 15 mg/mL de sangre < 2.2 ng/mL de sangre < 0.1

Pepsinógeno 150 ng/mL de sangre < 2.2 ng/mL de sangre < 0.1
Factor I del
35 μg/mL de sangre < 2.2 ng/mL de sangre < 0.1
complemento

Efecto "hook"

No se observó ningún efecto "hook" con concentraciones de IRT de hasta 12 000 ng/mL
de sangre. El punto crítico del ensayo está por encima de los 100 000 ng/mL de sangre.

GARANTÍA

Los resultados aquí presentados se han obtenido por el procedimiento de ensayo

indicado. Cualquier cambio o modificación en el procedimiento no recomendado por el
fabricante puede afectar a los resultados, en cuyo caso Wallac Oy y sus filiales declinan
cualquier responsabilidad y garantía otorgada, expresa o tácita, sobre la comercialización
del producto y su uso.

En tal caso, Wallac Oy, sus filiales y sus distribuidores autorizados no asumen ninguna
responsabilidad por los daños o perjuicios directos o indirectos.
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PATENTES

Este equipo está protegido por las siguientes patentes:

US 7,211,440 y 7,381,567 y sus patentes correspondientes en los demás países.

Última revisión noviembre 2013

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Resumen del protocolo del ensayo GSP® Neonatal IRT

USUARIO GSP
 Retire los tapones de los viales de
reactivos, coloque los reactivos en el
cassette de reactivos y coloque el tapón
antievaporación en el vial de trazador.
 Coloque los cassettes de reactivos en el
carrusel de reactivos.
 Perfore los calibradores, los controles y las
muestras en los pocillos.
 Introduzca los códigos de barras de las
placas y la información sobre las muestras
y controles en el software GSP
Workstation.
 Cargue las placas en el instrumento GSP.
 Espere a que se organicen todas las
placas. Si fuera necesario, cargue más
reactivos o consumibles.
El ensayo comienza automáticamente

 Dispensación de la solución tampón

(100 µL/pocillo)
 Dispensación de la solución tampón
(5 µL/pocillo)
 Agitado e incubación (1 h)
 Medición (control de elución)
 Dispensación de la solución tampón
(100 µL/pocillo)
 Agitado e incubación (1 h)
 Retirada de discos
 Lavar (x 6)
 Dispensación del inductor DELFIA Inducer
(200 µL/pocillo)
 Agitado e incubación (5 min)
 Medición
 Retirada de líquidos
Al final del ensayo

 Retire las placas del cargador de salida

NOTA:
 El cassette de puntas debe cargarse completamente y el cassette de puntas de residuos
debe estar vacío cuando se inserte en el instrumento.