Biología Celular y Molecular 2022

Práctico Genética

Práctico de laboratorio - Módulo Genética BCM 2022

Detección de genotipos relacionados a la intolerancia a la lactosa

En los mamíferos, la posibilidad de digerir la lactosa presente en la leche y los productos

lácteos disminuye con la edad, debido a una disminución de la producción de la enzima
lactasa en el intestino delgado. Es más, en los seres humanos, la lactasa utilizada para
digerir este disacárido sigue expresándose en los adultos, un fenotipo conocido como
persistencia de lactasa (LP). Los individuos LP son tolerantes a la lactosa y mantienen la
capacidad de digerir productos lácteos hasta la edad adulta; en contraposición, las personas
intolerantes a la lactosa (LNP) no pueden digerir cantidades importantes de lactosa. La
persistencia de la actividad de la lactasa se ha relacionado con algunos polimorfismos de
nucleótido simple (SNP) en una región ubicada a unos 14 Kb río arriba del gen de la lactasa
(gen LCT). La LP se hereda como un carácter mendeliano dominante. En poblaciones
europeas, la variante genética C/T-13910 (rs4988235) se asoció con la actividad de lactasa
en la edad adulta: el genotipo CC se asoció con hipolactasia y los genotipos CT y TT con
persistencia de lactasa. Este alelo actúa como potenciador de la expresión de lactasa,
aumentando su transcripción en las líneas celulares. En diferentes poblaciones, la
frecuencia de este SNP varía dependiendo de la historia demográfica de cada región. En la
población uruguaya, que cuenta con un mestizaje moderado (con predominio de aporte
europeo y modesto aporte nativo americano y africano), la frecuencia de C/T-13910 es
similar a la de otras poblaciones sudamericanas con predominio del aporte parental europeo
así como a poblaciones de la Península Ibérica.

En el presente práctico estudiaremos la mutación C/T-13910 en una muestra de 3 pacientes

con sospecha de intolerancia a la lactosa. El objetivo es determinar el genotipo de cada
uno de los pacientes para el SNP C/T-13910, mediante PCR-RFLP. El polimorfismo del
largo de los fragmentos de restricción (RFLP) detecta diferencias en el tamaño de
fragmentos digeridos por una enzima de restricción, indicativo de una diferencia de
secuencia entre alelos.

Para ello se realizó una extracción de ADN de cada uno de ellos a partir de una muestra de
mucosa yugal. La región flanqueante al SNP se amplificó mediante PCR, con los siguientes
oligonucleótidos: (F) 5′-TCTGTATTGCCAGCGCAGAG-3′ y (R)

1
Biología Celular y Molecular 2022
Práctico Genética

5′-TGTTCCATTGCTTCAGCTTGT-3′. Luego el fragmento amplificado (1014 pb) fue digerido

con la enzima de restricción BsmFI que reconoce como sitio de corte la secuencia

En presencia de la variante T se generan dos fragmentos de 392 y 622 pb cada uno.

En el salón de práctico su docente le proveerá 3 muestras de ADN ya amplificadas por PCR

para la región que incluye C/T-13910 (rs4988235) y digeridas con la enzima de restricción
BsmFI. También se le proveerá una muestra control amplificada, pero sin digerir, y un
marcador de peso molecular. Cada grupo deberá analizar el largo de los fragmentos de
restricción obtenidos, mediante una corrida electroforética. Se espera que con estos
resultados cada grupo pueda predecir el estado de tolerancia a la lactosa para cada
individuo analizado.

Protocolo:

Atención: Durante todo el práctico deberá usar túnica y guantes para la manipulación. Se
recomienda llevar ambos al práctico.

1. Preparación del Gel

a. Según la cuba que vaya a usar su grupo, calcular la cantidad de agarosa
necesaria para preparar una solución de agarosa al 2% en un matraz. Pesar
la cantidad de agarosa calculada.

Los geles de agarosa se preparan utilizando una solución porcentual

peso/volumen. La concentración de agarosa en un gel dependerá del
tamaño de los fragmentos de ADN que se van a separar, y la mayoría
de los geles oscilan entre el 0,5 % y el 2 %. En este práctico
usaremos 2%.

Por ejemplo: para preparar 100ml de solución de agarosa se precisan

2g de agarosa disueltos en 100ml de buffer TBE 0,5X.

2
Biología Celular y Molecular 2022
Práctico Genética

b. Agregar la cantidad necesaria de buffer de corrida TBE 0,5X. Mezclar

agitando suavemente el matraz.
c. Derretir la mezcla de agarosa/buffer en microondas. A intervalos de 30
segundos, retire el matraz (¡recordar que esta caliente!) y agite suavemente
el contenido para mezclarlo bien. Repita hasta que la agarosa se haya
disuelto por completo.
d. Añadir GoodView a la solución de agarosa, según las siguientes
indicaciones:
i. Si es un gel de 30ml, agregar 1,5ul de GoodView.
ii. Si es un gel de 60ml, agregar 3ul de GoodView.
iii. Si es un gel de 100ml, agregar 5ul de GoodView.
e. Deje que la agarosa se enfríe en la mesa de trabajo. Si no lo hace, la
bandeja donde verterá el gel se deformará.
f. Mientras enfría, prepare el molde donde vertirá el gel. Coloque un peine
apropiado para crear los pocillos.
g. Vierta la agarosa fundida en el molde de gel. Permita que la agarosa se
asiente a temperatura ambiente. Esto llevará unos minutos. Una vez
solidificado, retire el peine y coloque el gel en la cuba electroforética.

2. Configuración la cuba electroforética y separación de fragmentos de ADN

a. Pídale a su docente 3 muestras de ADN de individuos a analizar, una
muestra control sin digerir y marcador de peso molecular. Cada muestra ya
tiene incluido el colorante de carga.

El colorante de carga de gel ayuda a rastrear qué tan lejos ha viajado

su muestra de ADN en el gel y también permite que la muestra se
hunda en el gel (en oposición a difundirse en el buffer de la cuba).

b. Programe la fuente de alimentación a 120V.

c. Agregue suficiente buffer de corrida para cubrir la superficie del gel. Es
importante utilizar el mismo buffer de corrida que el utilizado para preparar el
gel: en este caso TBE 0,5X.
d. Lenta y cuidadosamente, cargue las muestras de ADN y el control en los
pocillos del gel. Además de las muestras, deberá cargar un marcador de

3
Biología Celular y Molecular 2022
Práctico Genética

tamaño de ADN adecuado (Marcador de peso molecular). Deberá cargar

10ul por pocillo.
e. Vuelva a colocar la tapa de la cuba electroforética. Conecte los cables de la
misma a la fuente de poder.

El cátodo (conductores negros) debe estar más cerca de los pocillos

que el ánodo (conductores rojos).

f. Vuelva a verificar que los electrodos estén enchufados en las ranuras

correctas de la fuente de poder.
g. Encienda la fuente y corra el gel hasta que el colorante haya migrado a una
distancia adecuada.
3. Observación de fragmentos de ADN separados
a. Cuando se haya completado la electroforesis, apague la fuente de poder y
retire la tapa de la cuba electroforética.
b. Retire el gel. Drene el exceso de buffer de la superficie del gel. Retire el gel
de la bandeja de gel y exponga el gel a la luz ultravioleta, en un
transiluminador. Tome una foto del gel.
c. Deseche correctamente el gel.
d. Tomar una foto del gel obtenido (será necesario subir la foto en eva como
parte de la evaluación de esta actividad).
4. Discusión de resultados

¿Qué genotipos tienen los individuos analizados? ¿Qué conclusiones puede

sacar con respecto a su fenotipo esperado?