MICROSCOPIA Y CULTIVO IN VITRO morfológicos de los microorganismos y las células

MICROSCOPIA de mayor tamaño.

o Las lentes del ocular pueden ampliar aún más la
1.-la detección inicial de microorganismos
imagen (generalmente de 10 a 15 veces).
2.-la identificación preliminar o definitiva de los mismos.  limitación de la microscopia de campo claro es la
resolución de la imagen, es decir, la capacidad de
 detectar células bacterianas, elementos fúngicos, distinguir que dos objetos están separados
parásitos (huevos, larvas o formas adultas) e  capacidad de resolución está determinada por la
inclusiones víricas presentes en las células longitud de onda de la luz utilizada para iluminar el
infectadas. objeto y el ángulo de la luz que entra en la lente del
 propiedades morfológicas utilizar para la objetivo
identificación preliminar de la mayoría de las  capacidad de resolución es máxima cuando se
bacterias interpone aceite entre la lente del objetivo
 microorganismos teñidos con anticuerpos marcados (habitualmente la lente de 100 × )
con colorantes fl marcadores ha sido muy útil  mayoría de las bacterias y los microorganismos de
mayor tamaño se pueden ver mediante microscopia
de campo claro
 microorganismos se deben teñir con un colorante
para poder observarlos, o s un método
microscópico alternativo

MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO

 utilizan las mismas lentes del objetivo y del ocular

MÉTODOS MICROSCÓPICOS
que en los microscopios de campo claro
MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO (ÓPTICA)
 utiliza un condensador especial que impide que la
son una fuente de luz que se utiliza para iluminar la luz transmitida ilumine directamente la muestra.
muestra colocada en una platina, un condensador para  Sólo la luz oblicua y dispersa llega a la muestra y
enfocar la luz en la muestra y dos sistemas de lentes atraviesa los sistemas de las lentes, lo que hace que
(lente del objetivo y lente del ocular) que se utilizan la muestra esté muy iluminada sobre un fondo
para ampliar la imagen de la muestra. negro.
 ventaja es e mayor que la de la microscopia de
 Se ve mediante transiluminación, de manera que la
campo claro (es decir, 0,02 mm en comparación con
luz procedente del condensador atraviesa la
0,2 mm), lo que posibilita la detección de bacterias
muestra.
muy delgadas
 se amplía la imagen, primero por la lente del
 desventaja de este método es que la luz pasa
objetivo y después por la lente del ocular.
alrededor de los microorganismos y no los
 La ampliación total de la imagen es el producto de
atraviesa, lo que difiere de su estructura interna.
las ampliaciones de las lentes del objetivo y del
ocular. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASES

se utilizan tres lentes del objetivo diferentes:  permite examinar los detalles internos de los
microorganismos.
o bajo aumento (aumento de 10 veces): explorar una
 pasan haces de luz paralelos a través de objetos de
muestra
densidades diferentes, la longitud de onda de un
o alto aumento en seco (40 veces): buscar
haz se «desfasa» en relación con el otro haz de luz
microorganismos grandes (parásitos y hongos
 el uso de anillos anulares en el condensador y en las
filamentosos)
lentes del objetivo se amplifican las diferencias de
o inmersión en aceite (100 veces) observar bacterias,
fases, la luz en fase parece más brillante que la luz
levaduras (fase unicelular de los hongos) detalles fuera de fase.
 crea una imagen tridimensional del microorganismo MÉTODOS DE ESTUDIO
o de la muestra y permite un análisis más detallado  muestras clínicas y las suspensiones de
de las estructuras internas. microorganismos se pueden colocar sobre un
portaobjetos de vidrio y se pueden explorar con el
MICROSCOPIA FL
microscopio
 fluorocromos pueden absorber la luz ultravioleta o  se pueden ver microorganismos grandes (p. ej.,
ultra azul de longitud de onda corta y emitir energía elementos fúngicos y parásitos) y material celular, a
con una longitud de onda visible y mayor. menudo es difícil el análisis de estructuras internas.
 algunos microorganismos tienen fluorescencia
ESTUDIO DIRECTO
natural (autofluorescencia)
 tinción de los microorganismos con colorantes  son los más sencillos para preparar muestras para el
fluorescentes, y un microscopio fl, una lámpara de estudio microscópico.
vapor de mercurio, de un halógeno o de xenón a  muestra se puede suspender en agua o suero salino,
presión elevada mezclada con un álcali para disolver el material de
 utiliza una serie de filtros para bloquear el calor que fondo o con una combinación de un álcali y un
genera la lámpara, eliminar la luz infrarroja y colorante para generar contraste
seleccionar la longitud de onda adecuada para  colorante tiñe de manera inespecífica contraste con
excitar el fl el fondo y permite el estudio de las estructuras
 luz que emite el fluorocromo se amplifica con las detalladas.
lentes del objetivo y del ocular tradicionales.  variación es el método de tinta china, oscurece el
 microorganismos y las muestra teñidos aparecen fondo y no la célula. Para detectar cápsulas
brillantes sobre un fondo oscuro, aunque los colores alrededor de microorganismos, como la levadura
varían del fuorocromo seleccionado. Cryptococcus y la bacteria encapsulada Bccillus
 contraste entre el microorganismo y el fondo es cnthrccis.
grande como para realizar una búsqueda rápida del
TINCIONES DIFERENCIALES
microorganismo con bajo aumento y después el
material se explora con mayor aumento, una ver  teñir microorganismos específicos o componentes
que se ha detectado fuorescencia. del material celular.
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA  tinción de Gram es la tinción mejor conocida y más
utilizada, forma la base de la clasificación de las
 utilizan bobinas magnéticas para dirigir un haz de bacterias.
electrones desde un fi de tungsteno a través de una  levaduras también se pueden teñir con este método
muestra y hacia una pantalla. (son grampositivas).
 longitud de onda es mucho más corta que la de la  tinciones de hematoxilina férrica y tricrómica útiles
luz, la resolución y la ampliación mejoran para la identificación de Wright-Giemsa se utiliza
drásticamente. para parásitos sanguíneos y otros microorganismos
 se pueden ver partículas víricas individuales seleccionados.
 muestras habitualmente se tiñen con iones
TINCIONES ACIDORRESISTENTES
metálicos para crear contraste.
 utilizan al menos tres tinciones acidorresistentes
Hay dos tipos:
diferentes
 microscopios electrónicos de transmisión: los  aprovecha de que algunos microorganismos
electrones, igual que la luz en los microscopios conservan una tinción principal incluso después de
ópticos, atraviesan directamente la muestra exponerlos a agentes decolorantes potentes, como
 microscopios electrónicos de barrido: rebotan en la mezclas de ácidos y alcoholes.
superficie determinado ángulo y genera una imagen  método de Ziehl-Neelsen es el más antiguo que se
tridimensional. utiliza, aunque precisa el calentamiento de la
muestra durante el procedimiento de tinción.
 Muchos laboratorios han sustituido este método  se debe controlar con cuidado la calidad de los
por el de la tinción acidorresistente en frío (de medios de cultivo para garantizar que su
Kinyoun) o tinción fluorocrómica (de auramina- rendimiento se corresponde con el exigido
rodamina).  Se comercializan fórmulas deshidratadas de la
 método del fluorocromo: es la tinción de elección mayor parte de estos medios de cultivo, lo que
porque se puede estudiar rápidamente una gran permite esta fabricación con mínimas diferencias
superficie de la muestra buscando microorganismos
fl fondo negro.
 Algunos microorganismos son «parcialmente TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
acidorresistentes» -> conservan la tinción principal
se pueden clasificar en cuatro grupos generales:
sólo cuando se descoloran con una solución ácida
débil. MEDIOS DE CULTIVO NO SELECTIVOS
ENRIQUECIDOS
TINCIONES FL
diseñados para permitir el crecimiento de la mayor
 tinción acidorresistente de auramina-rodamina es
parte de los gérmenes que no necesitan unas
un ejemplo
condiciones exigentes.
 se puede utilizar la tinción de naranja de acridina
para teñir bacterias y hongos, y el blanco de Agar sangre. contienen dos componentes
calcoflúor tiñe la quitina de las paredes de las fundamentales: un medio basal (p. ej., soja tripticasa,
células fúngicas. infusión de cerebro-corazón, base de Brucellc) y sangre
 la tinción de blanco de calcoflúor ha sustituido a las (de oveja, caballo, conejo).
tinciones de hidróxido potásico.
Agar chocolate. añade sangre o hemoglobina al medio
 Otro es el estudio de muestras con anticuerpos
de base calentado, se vuelve marrón (de ahí su
(tinciones con anticuerpos fluorescentes).
nombre). permite el crecimiento de la mayor parte de
CULTIVO IN VITRO las bacterias, incluidas algunas que no crecen en el agar
 El éxito depende de la biología del microorganismo, sangre
del lugar de la infección, de la respuesta inmunitaria
Agar Mueller-Hinton. medio recomendado para
del paciente frente a la misma y de la calidad del
estudios convencionales de sensibilidad bacteriana.
medio de cultivo.
Incluye extractos de ternera y caseína, sales, cationes
 El hemocultivo siempre será negativo, mientras que divalentes y almidón soluble necesario para que los
el cultivo de la lesión en la que crece el germen sí resultados sean reproducibles.
permite detectarlo.
 En muchas infecciones ( gastroenteritis, uretritis, Caldo tioglicolato. medios de cultivo de
faringitis), el germen responsable de la infección se enriquecimiento empleados para recuperar cantidades
asocia a otros muchos gérmenes que son parte de la pequeñas de bacterias aerobias y anaerobias. Mayor
flora microbiana normal de la región infectada. parte incluyen caseína, glucosa, extracto de levadura,
 Se han desarrollado muchos medios de cultivo que cisteína y tioglicolato sódico. El suplemento de hemina y
permiten suprimir estos gérmenes existentes en vitamina K mejora la recuperación de las bacterias
condiciones normales y facilitan la detección de los anaerobias.
que tienen importancia clínica.
Agar dextrosa de Sabouraud. medio de cultivo
 La inmunidad innata y adaptativa del paciente
enriquecido que contiene caseína y tejido animal
pueden suprimir el patógeno, de forma que con
digeridos suplementados con glucosa para aislar
frecuencia se necesitan técnicas de cultivo muy
hongos. Mayor parte de los micólogos utilizan la que
sensibles.
tiene baja concentración de glucosa y un pH neutro. Al
 algunas infecciones se caracterizan por la existencia reducir el pH y añadir antibióticos para inhibir las
de relativamente pocos gérmenes. bacterias, este medio de cultivo puede ser selectivo de
hongos.
 MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y Agar con inhibidor de hongos flamentosos. compuesto
DIFERENCIALES selectivo enriquecido que se emplea para el aislamiento
de hongos patógenos distintos de los dermatofsuprimir
 recuperar gérmenes específicos que pueden estar
el crecimiento de las bacterias contaminantes.
presentes en una mezcla de otros gérmenes (p. ej.,
un patógeno entérico en las heces). MEDIOS ESPECIALIZADOS
 Los medios se enriquecen con inhibidores que
para detectar gérmenes específicos exigentes o que se
suprimen el crecimiento de los gérmenes no
presentan mezclados con muchos otros.
deseados.
 se hacen diferenciales añadiendo ingredientes
específicos que permiten la identificación del
germen en una mezcla
CULTIVO CELULAR
Agar MacConkey. agar selectivo para las bacterias
gramnegativas y diferencial para distinguir las bacterias  Algunas bacterias y todos los virus son gérmenes
que fermentan la lactosa y las que no. Incluye peptonas intracelulares estrictos, de forma que sólo se
digeridas, sales biliares, lactosa, rojo neutro y cristal pueden cultivar en células vivas.
violeta.  En 1949 John Franklin Enders describió una técnica
Agar sal manitol. medio de cultivo selectivo empleado para cultivar células de mamífero y aislar el virus de
para el aislamiento de estafilococos. Incluye extractos la poliomielitis.
de caseína y tejidos animales digeridos, extracto de  pueden ser células que crecen y se dividen sobre
ternera, manitol, sales y rojo fenol. Pueden crecer en una monocapa de células o células suspendidas en
presencia de una elevada concentración de sal y S. un medio de cultivo.
cureus puede fermentar el manitol, lo que produce  Otros cultivos celulares se deben preparar
colonias de color amarillo en este agar. inmediatamente antes de infectarlos con bacterias
o virus y no se pueden mantener en el laboratorio
Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD). agar selectivo más de unos pocos ciclos de división (cultivos
utilirado en la detección de Sclmonellc y Shigellc en celulares primarios).
cultivos entéricos. para la detección de bacterias  La entrada a las células se suele regular por la
importantes en una mercla compleja de bacterias existencia de receptores específicos a la capacidad
insignificantes, levaduras con xilosa, lisina, lactosa, diferencial de infectar líneas celulares para predecir
sacarosa, desoxicolato sódico, tiosulfato sódico, citrato la identidad de una bacteria o virus.
amónico férrico y rojo fenol. Este medio, utilizado para
aislar micobacterias, contiene glicerol, harina de patata,
sales y huevos coagulados (para solidifcar el medio). Se
añade verde malaquita para inhibir las bacterias
grampositivas.

Agar Middlebrook. para aislar micobacterias. Contiene

nutrientes necesarios para el crecimiento de las
micobacterias (es decir, sales, vitaminas, ácido oleico,
albúmina, catalasa, glicerol, glucosa) y verde malaquita
para inhibir las bacterias grampositivas.

CHROMagar. agar selectivo diferencial utilizado para

aislar e identificar - tintas de la levadura Ccndidc.
Contiene cloranfenicol para inhibir las bacterias y una
mezcla de sustratos cromogénicos especiales. Ccndidc
clbiccns genera colonias verdes, Ccndidc tropicclis
genera colonias moradas y Ccndidc krusei las genera
rosadas.