Los fármacos como modificadores de

funciones biológicas
Simulación del nervio
frénico/hemidiafragma de rata
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1. Introducción
El músculo esquelético está compuesto de fibras musculares, cada una de las cuales es
inervada por la rama del axón motor que se origina en el sistema nervioso central (SNC). La
transferencia de la señal de nervio al músculo tiene lugar en la placa motora (unión
neuromuscular). Dentro del axoplasma de las terminales nerviosas se encuentran numerosas
vesículas unidas a la membrana que contienen el neurotransmisor acetilcolina (ACh). La
membrana de la placa es la parte de la membrana celular muscular situada inmediatamente
debajo de las terminales del axón (Ganong, 2001). Aquí la membrana se forma en pliegues
post sinápticos en donde se encuentran muchos receptores nicotínicos de ACh. La lámina
basal de la membrana post sináptica contiene la enzima acetilcolinesterasa que hidroliza ACh
en colina y acetato (Andrew, 1972; Ganong, 2001).

Esta practica es una simulación de la preparación del nervio frénico/hemidiafragma de rata,

una robusta preparación in vitro que ha sido ampliamente utilizada en el estudio de las
acciones de los agentes bloqueadores e inversores neuromusculares y otros fármacos que
afectan la transmisión neuromuscular.

El hemidiafragma es un músculo esquelético respiratorio grande, focalmente inervado,

compuesto por fibras musculares de tipo rápido. La neurotransmisión está mediada por
receptores nicotínicos. La estimulación eléctrica del nervio frénico evoca contracciones
musculares rápidas y de corto plazo (Martin, 1975; Guyton and Hall, 2000).

Los fármacos pueden bloquear la transmisión neuromuscular tanto por la inhibición de la

síntesis o liberación de ACh de la terminal del nervio motor, como por interferencia
postsináptica con los receptores de Ach (Rang y Dale, 2008; Hibbs and Zambon, 2011). Todos
los agentes útiles en la terapéutica tienen sus acciones primarias en la terminación de la placa
motora y son clasificados en:

1. Agentes no-despolarizantes (competitivos) como la tubocurarina, gallamina y pancuronio.

2. Agentes despolarizantes (no competitivos) como el decametonio y el suxametonio.

En contraste, los bloqueadores despolarizantes, son agonistas del receptor nicotínico con
mayor afinidad que la Ach, lo que produce una despolarización persistente en la placa terminal
con la consecuente pérdida de excitabilidad. Este bloqueo no es revertido por inhibidores de la

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acetilcolinesterasa lo que indica que la acetilcolina y los bloqueadores despolarizantes actúan

en el mismo sitio (Bowman 2006).

La preparación

A continuacion, y a modo informativo, se describe la manera convencional de realizar el

experimento. Se sacrifica una rata (de aproximadamente 0.5 kg de peso) con 100% de CO2
(un procedimiento rápido e indoloro). Se abre la caja torácica y se retira el nervio frénico y el
hemidiafragma de forma triangular y se coloca en un baño de órganos que contiene solución
de Krebs, se burbujea con O2 al 95% /CO2 al 5% y se mantiene a 32°C en un baño de agua
circundante. Como se muestra en el diagrama (Fig 1.), la base del músculo está unida a un
soporte y el tendón unido a un transductor de tensión. El nervio se pasa por un electrodo de
estimulación y otro electrodo se coloca directamente sobre el músculo. Los fármacos se
aplican directamente en el baño (Hoff and Geddes, 1971). Cuando es necesario, los fármacos
pueden ser eliminados por lavado con la nueva solución Krebs.

Figura 1. Esquematización de la preparación del nervio frénico/hemidiafragma de rata

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3. Objetivo (s)
• Estudiar la farmacología del músculo esquelético utilizando la estimulación in vitro de una
preparación de músculo nervioso de una rata.

• Estudiar las acciones de los agentes agonistas y antagonistas neuromusculares y otros

fármacos que afectan la transmisión neuromuscular.

4. Equipo
Software

Se utilizara el programa Virtual Twitch V.2.2.1 desarrollado por John Dempster de la

Universidad de Strathclyde, Escocia, Gran Bretaña. El software puede ser descargado en el
siguiente vínculo:

http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/media/40/sims/Twitch_V2.2.1_Setup.exe

El programa deberá ser instalado en una PC o compatible con Windows 98 o posterior

5. Materiales y reactivos
Ordenador PC con sistema operativo Windows 98 o posterior, así mismo, un sistema
adecuado de proyección de imágenes, con fines didácticos y de explicación de
procedimientos.

6. Procedimiento Experimental
Uso de la simulación

1. Seleccione “New Rat” en el menú “File” (Fig. 2) para borrar el gráfico previo (de ser el
caso) y comenzar uno nuevo.

2. Haga clic en el botón “Start" para iniciar el registro y la grafica.

3. Para inyectar un fármaco en el baño:

a) Seleccione un fármaco en el menú “Drugs”.

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b) Seleccione la dosis deseada de la lista de dosis.

c) Haga clic en el botón “Inyect Drug” para agregar el fármaco.

4. Puede realizar mediciones cuantitativas moviendo el puntero del ratón sobre la grafica y
anotando el valor de la lectura que se muestra en la parte inferior de la pantalla.

5. Puede agregar tantas dosis y/o fármacos como sea necesario. Cuando haya terminado el
experimento, haga clic en el botón “Stop” para detener el registro.

Figura 2. Opciones del Menú “File” e interfaz del simulador

6. Para obtener una copia impresa del grafico mostrado en la pantalla, seleccione “Print” en
el menú “File”.

7. Cuando haya completado un experimento, puede guardarlo en un archivo seleccionando

“Save Rat...” en el menú “File”. (Para volver a cargar un experimento, seleccione “Load
Rat...”).

8. Para salir del programa de simulación, seleccione “Exit” en el menú “File”.

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Descripción del Menú

a) “Drugs”: La concentración de los fármacos se expresa en moles por litro (M) y

corresponde a la concentración añadida (no total). La concentración total del fármaco
aparece debajo del registro gráfico. Los fármacos se acumulan en la solución. Cuando
desee reemplazar una solución de trabajo con una nueva solución de Krebs, seleccione
“Wash”. El efecto de algunos fármacos dura algún tiempo incluso después de lavarse.

b) “Ions”: Las concentraciones de calcio y magnesio en solución se pueden cambiar en

este menú. El calcio es responsable de la liberación de ACh de las terminaciones
nerviosas. La entrada de calcio permite el desplazamiento de vesículas con ACh a la
membrana celular y su exocitosis. La entrada y salida de calcio desde y hacia las
células es muy limitada. Por lo tanto, la contracción muscular es casi independiente de
la concentración extracelular de calcio. La contracción puede verse afectada sólo
después de cambios duraderos en la concentración de calcio. El magnesio bloquea
competitivamente la entrada de calcio a la célula nerviosa de modo que afecta la
cantidad de liberación de ACh. Una alta concentración de magnesio bloquea la
transmisión neuromuscular.

c) “Wash”: Cuando se cambia la solución en el baño, todos los iones y fármacos son
eliminados. Se puede elegir entre la solución normal de Krebs y la solución de Krebs sin
calcio. El efecto de algunos fármacos dura algunas veces incluso después del lavado.

Control del experimento

En la parte inferior izquierda de la ventana se encuentran los controles del experimento. Se

dividen en dos partes: Control y Estimulador

El experimento se inicia pulsando el botón “Start”. El botón “Stop” interrumpe el experimento,

aunque este puede continuar después de volver a presionar el botón “Start”. Después de la
interrupción del experimento, se puede navegar por todo el registro usando la barra de
desplazamiento. El tiempo real y la magnitud de la contracción en un punto del cursor del ratón
se muestran en el campo debajo de los botones “Start” y “Stop”.

El músculo puede ser estimulado de dos formas:

a) DIRECTAMENTE:

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Mediante la inyección de una pequeña corriente en la fibra muscular a través del electrodo de
grabación

b) INDIRECTAMENTE:

Estimulando el nervio frénico a través de un electrodo de alambre de platino. También puede

desactivar la estimulación.

Aplicación de fármacos

Los siguientes fármacos pueden administrarse a la preparación:

Tubocurarina

Antagonista colinérgico competitivo no despolarizante, bloqueador reversible de los receptores

nicotínicos. Después del bloqueo de los receptores nicotínicos, los canales de sodio no se
pueden activar y la despolarización evocada nerviosa de la membrana presináptica disminuye.
Si esta despolarización es demasiado pequeña, el potencial de acción sobre la fibra muscular
no aparece. La unión de tubocurarina y ACh sobre los receptores nicotínicos es reversible y
competitiva (es decir, dependen de la concentración de fármacos). La dosis más baja
recomendada es 0.2 μM.

Neostigmina

Inhibidor competitivo de acetilcolinesterasa (AChE), que causa bloqueo reversible de esta

enzima. AChE disminuye la concentración de ACh en el espacio sináptico y se disocia en
colina y ácido acético. El bloqueo de AChE prolonga el efecto de la ACh sobre la membrana
presináptica. La dosis más baja recomendada es 0.2 μM.

4 –aminopiridina

Bloqueador del canal de potasio, que prolonga la duración del potencial de acción. La dosis
más baja recomendada es de 20 μM.

Atropina

Antagonista competitivo de los receptores muscarínicos.

Suxametonio
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Miorelajante despolarizante de corta duración. Se une a los receptores nicotínicos, donde

actúa como agonista de larga duración. Este enlace provoca una despolarización prolongada
de la membrana que es la forma en que el potencial de acción no aparece. La dosis más baja
recomendada es de 5 μM.

Tetrodotoxina

Bloqueador de canales de sodio. La tetrodotoxina disminuye o previene la despolarización del

nervio y del músculo. La dosis más baja recomendada es 0.2 μM.

Experiencias sugeridas

1. Describir el efecto de cada fármaco sobre el potencial de acción durante la estimulación

directa e indirecta y explicar sus observaciones.

2. Trazar el gráfico de la dependencia entre la concentración del fármaco en la solución con

tubocurarina (concentración mínima 0.5 μM e incrementos de 0.2 μM) o con suxametonio
(concentración mínima 5 μM e incrementos de 2 μM) y la magnitud de la contracción en
gramos. La concentración máxima utilizada corresponde a la dosis a la que el músculo no
responde ya a la estimulación. Utilizar sólo estimulación indirecta.

3. ¿Qué fármacos y con qué mecanismo se puede compensar el bajo nivel de concentración
de calcio (0.5 mM)? (Lavar el baño con solución de Krebs sin calcio y luego agregar 0.5
mM de calcio.)

4. ¿Cómo se puede restaurar completamente la contracción después de la aplicación de

tetrodotoxina (0.5 μM) o suxametonio (20 μM)?

5. ¿Cuál es la diferencia en la respuesta muscular entre la estimulación directa e indirecta,

cuando la solución del baño está sin calcio?

7. Forma de presentación de resultados

Presentación de reporte de prácticas, elaboración de cuestionarios y discusión grupal.

8. Mecanismo de eliminación de residuos

No aplica

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9. Bibliografía
Andrew B.L. Muscle and Nerve. In: Experimental Physiology. Churchill Livingstone. Edinburgh.
pp 19-57. 1972.

Bowman W.C. Neuromuscular block. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1:S277-786. 2006.

Ganong F.W. Neuromuscular Transmission. In: Review of Medical Physiology. Lange Medical
Books/McGraw-Hill. New York. pp 110-112. 2001.

Guyton C.A. and Hall J.E. Excitation of Skeletal Muscle; A. Neuromuscular Transmission and
B. Excitation-Contraction Coupling. In: Textbook of Medical Physiology. Saundres.
Philadelphia. pp 87-94. 2000.

Hibbs, R. and Zambon, R.E. Agents acting at the neuromuscular junction and autonomic
ganglia. In: Brunton LL, Lazo JS, Parker KL (eds) Goodman & Gilman´s. The pharmacological
basis of the therapeutics. 12th Ed. New York: McGraw-Hill 2011: 255-276.

Hoff H.E. and Geddes L.A. The Nerve-Muscle Preparation. In: Experimental Physiology. Baylor
University (Ed). Houston. USA. pp IV-1 – IV-6. 1971.

Martin D.E. Neuromuscular Physiology. Electrical Stimulation of Nerve and Muscle Tissues. In:
Laboratory Experiments in Human Physiology. Narco Bio System Inc. (Ed). Houston. pp 45-54.
1975.

Rang HP, Dale JM. Transmisión colinérgica. En: Rang HP y Dale JM (eds) Farmacología, 6a.
ed. México: Elsevier, 2008: 144-167.

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