Guía Seminarios IBMC 2023 - 2C
Guía Seminarios IBMC 2023 - 2C
Guía Seminarios IBMC 2023 - 2C
A LA
BIOLOGÍA MOLECULAR
Y CELULAR
2023 2C
(en su 40º año consecutivo)
https://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/introduc
cion-a-la-biologia-molecular-y-celular/
GUÍA DE SEMINARIOS
INCLUYE:
- Listado de docentes
- Programa teórico
- Bibliografía
- Cine
- Calendario de seminarios y parciales
- Régimen de promoción
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Listado de docentes:
Profesoras/es:
2
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROGRAMA TEÓRICO:
2) Ácidos nucleicos. Experimentos de Griffith, Avery, Hershey y Chase. Estructura del DNA.
Modelo de Watson y Crick . Actividad catalítica del RNA. Comportamiento de ácidos
nucleicos en solución, hibridación molecular. Replicación del DNA. Experimento de
Meselson y Stahl. Concepto de replicón. DNA polimerasas. Actividades de proofreading y
nick translation. Helicasa, primasa, ligasa, topoisomerasa. Acortamiento de telómeros y
telomerasa. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
3
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
13) Cómo se comunican las células entre sí: las señales claves. Mediadores químicos locales,
hormonas y neurotransmisores. Receptores: de membrana e intracelulares. Concepto de
unión (binding) de ligando a receptor. Segundos mensajeros: el AMP cíclico y el calcio.
Proteínas que unen GTP. Genes cuyos productos regulan la respuesta celular a señales
externas: oncogenes. ¿Qué es el cáncer? Control de la división celular. Ciclo celular: ciclinas
y proteínas quinasas dependientes de ciclinas.
14) Neuronas. Los canales activados por voltaje y el potencial de acción. Transmisión
sináptica. Neurotransmisores. Desarrollo y conservación de la estructura neuronal. El
desarrollo de las conexiones neuromusculares. Proteínas de transporte. Las bombas
protónicas. Transporte de moléculas pequeñas. Transporte activo. Gradientes iónicos.
ATPasas. Bombas aspirantes e impelentes. Canales iónicos. Ionóforos.
15) La célula vegetal. Pared celular, vacuolas y plástidos. Elementos de biología molecular,
biología celular e ingeniería genética vegetales.
4
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
BIBLIOGRAFÍA
1) Alberts et al. Molecular Biology of the Cell (6a edición, incluye CD interactivo). Garland
Publishing, New York & London (2014). También sirve la 5a edición en inglés (2007).
3) Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P.
Essential Cell Biology (4a edición). Garland Publishing, New York & London (2013).
4) Alberts, B., Bray., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. Introducción a la
Biología Celular. Traducción al español de la 3ra. edición. Editorial Omega, Barcelona.
6) Lodish, H., Berk, A., Lawrence Zipurski, S., Matsudaira, P., Baltimore, D. y Darnell, J. E.
Biología Celular y Molecular. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, 2005 (traducción
de la 5a edición en inglés)
7) Watson J., Baker T., Bell S., Gann A., Levine M., Losick R. Molecular Biology of the Gene. (7a
edición). Benjamin Cummings (2013)
9) Freeland Judson, H. The Eighth Day of Creation. Makers of the Revolution in Biology.
Penguin Books, London (1995).
10) Purroy, J. La era del genoma. Salvat ciencia. Barcelona (2001). Distribuye Distal.
13) Sulston, J, Ferry, G. El hilo común de la humanidad. Siglo XXI de España (2003).
BÚSQUEDAS BIBLIOGRÁFICAS
Para buscar citas de trabajos originales publicados en revistas científicas en inglés mediante
el uso de palabras presentes en sus títulos o resúmenes (abstracts) o el apellido de sus
autores, se puede consultar la base de publicaciones más importante en ciencias
biomédicas y biotecnología, llamada PubMed, a la siguiente dirección de internet:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
5
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
TRABAJOS PRÁCTICOS: Asistencia obligatoria. El alumno queda libre si tiene más del 20% de
inasistencias, es decir si falta a más de 2 clases.
SEMINARIOS: Asistencia obligatoria. El alumno queda libre si tiene más del 20% de
inasistencias, es decir si falta a más de 2 clases.
FIRMA DE LOS TRABAJOS PRÁCTICOS: Aprobarán los Trabajos Prácticos aquellos alumnos que
hayan: 1) Aprobado los dos parciales teóricos o sus respectivos recuperatorios. 2) Aprobado
el parcial práctico o su recuperatorio. 3) Asistido al 80% de los TTPP. 4) Asistido al 80% de los
Seminarios. 5) Presentado TODOS los informes requeridos por el JTP.
PROMOCIÓN SIN EXAMEN FINAL: Aprobarán la materia sin rendir examen final los alumnos
que: 1) Estén en condiciones de firmar los TTPP, incluso aquellos que hayan rendido y
aprobado el recuperatorio del parcial práctico. 2) No hayan recuperado ninguno de los 2
parciales teóricos. 3) Sumen al menos 135 puntos entre los dos parciales teóricos. 4) Hayan
llenado la encuesta obligatoria a través de la web.
La nota final de promoción se calcula como 0,8 x nota promedio parciales teóricos + 0,2 x
nota parcial práctico, y eso se redondea sin decimales: por ej., un 84,5 es un 85 y por lo
tanto es un 9, pero un 84,4 es un 8.
EXAMEN FINAL: Todos aquéllos que hayan firmado los TTPP y que no reúnan las condiciones
para promocionar sin examen final, podrán rendir examen final en las fechas estipuladas
por la Facultad siempre que hayan llenado la encuesta obligatoria a través de la web.
6
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
FIRMA DE LOS TRABAJOS PRÁCTICOS: Aprobarán los Trabajos Prácticos aquellos alumnos que
hayan: 1) Aprobado el parcial teórico o su recuperatorio. 2) Aprobado el parcial práctico o
su recuperatorio. 3) Asistido al 80% de los TTPP. 4) Asistido al 80% de los Seminarios. 5)
Presentado TODOS los informes requeridos por el JTP.
PROMOCIÓN SIN EXAMEN FINAL: Aprobarán la materia sin rendir examen final los alumnos
que: 1) Estén en condiciones de firmar los TTPP, incluso aquellos que hayan rendido y
aprobado el recuperatorio del parcial práctico. 2) No hayan recuperado el parcial teórico.
3) Hayan obtenido al menos 68 puntos en el parcial teórico. 4) Hayan llenado la encuesta
obligatoria a través de la web.
La nota final de promoción se calcula como 0,8 x nota parcial teórico + 0,2 x nota parcial
práctico, y eso se redondea sin decimales: por ej. , un 84,5 es un 85 y por lo tanto es un 9,
pero un 84,4 es un 8.
EXAMEN FINAL: Todos aquéllos que hayan firmado los TTPP y que no reúnan las condiciones
para promocionar sin examen final, podrán rendir examen final en las fechas estipuladas
por la Facultad siempre que hayan llenado la encuesta obligatoria a través de la web.
7
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
*Este cronograma puede ser modificado por motivos de fuerza mayor. Los cambios siempre
se informan en el Campus Virtual de la materia.
8
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Películas cuyo contenido está relacionado con temas que se discuten en la materia:
1) Heredarás el Viento (Inherit the Wind) (EEUU, 1960) 127 min. Dirigida por Stanley Kramer,
con Spencer Tracy, Fredric March y Gene Kelly. Basada en un caso real.
2) Heredarás el Viento (Inherit the Wind) (EEUU, 1988) Telefilm "remake" del anterior con Jason
Robards y Kirk Douglas.
3) Los Niños del Brasil (The Boys from Brazil) (EEUU, 1978) 123 min. Dirigida por Franklin J.
Shaffner, con Gregory Peck, Laurence Olivier, James Mason y Lilli Palmer. Basada en la
novela de Ira Levin.
4) Parque Jurásico (Jurassic Park) (EEUU, 1993) 126 min. Dirigida por Steven Spielberg, con
Sam Neill, Laura Dern, Jeff Goldblum y Richard Attenborough. Basada en la novela de
Michael Crichton.
5) Un milagro para Lorenzo (Lorenzo's Oil) (EEUU, 1992) 135 min. Dirigida por George Miller,
con Nick Nolte, Susan Sarandon y Peter Ustinov. Basada en un caso real.
6) La bala mágica del Dr. Erlich (Dr. Erlich's Magic Bullet) (EEUU, 1940) 103 min. Dirigida por
William Dieterle, con Edward G. Robinson. Guión de John Huston. Basada en la vida del
científico alemán Paul Erlich.
7) La Vida de Luis Pasteur (The Story of Louis Pasteur) (EEUU, 1936) 85 min. Dirigida por William
Dieterle, con Paul Muni.
8) Y la Banda Siguió Tocando (And the Band Played on) (EEUU, 1993) 155 min. Dirigida por
Roger Spottiswoode, con Mathew Modine, Alan Alda, Richard Gere, Lily Tomlin, Steve Martin,
Anjelica Huston, Phil Collins.
9) Gattaca (EEUU, 1997) 112 min. Dirigida por Andrew Niccol, con Ethan Hawke, Uma
Thurman, Alan Arkin, Ernest Borgnine.
10) Avatar (EEUU, GB, 2009) 162 min. Dirigida por James Cameron, con Sam Worthington,
Zoe Saldana, Sigourney Weaver.
11) Je-bo-ja (The Whistle Blower) (Corea del Sur, 2014) 113 minutos. Dirigida por Soonrye
Yim, con Hae-il Park y Kyeong-yeong Lee. Basada en un caso real de fraude científico con
clonación de células madre.
9
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
ÁCIDOS NUCLEICOS I
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN
A) GUÍA DE ESTUDIO
7) Explique por qué a mayor concentración salina en el medio, la hibridación entre dos
hebras de DNA es menos rigurosa, y viceversa.
8) ¿En la molécula de DNA, qué uniones relacionan: a) dos desoxirribosas entre sí; b) dos
bases enfrentadas; c) dos bases apiladas?
9) ¿Qué secuencias del DNA son propicias para la formación de estructura Z? ¿Existe dicho Z
DNA in vivo?
10
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
a) En la figura señale, englobando con un trazo continuo, lo siguiente:
1- un nucleótido
2- un nucleósido
3- una base púrica
4- una base pirimídica
5-un puente de hidrógeno
6- una unión fosfodiéster
7- un extremo 3’
8- un extremo 5’
9- una desoxirribosa
10- un par de bases
b) ¿Qué peso molecular promedio tiene un DNA de cadena doble de 150 pares de bases
de longitud?
PROBLEMA 2
A diferencia de los bacteriófagos de la familia T (T2 o T4), el fago M13 no infecta a E. coli
mediante la inyección de su DNA al protoplasma, sino que penetra entero con su cápside
proteica de la cual es desnudado dentro de la bacteria. ¿Le parece a Ud. que Hershey y
Chase (experimento del fago T2 marcando proteínas con 35S y DNA con 32P, licuadora, etc.)
habrían llegado a las mismas conclusiones que llegaron si hubieran usado el fago M13 en
lugar del T2? ¿Por qué?
PROBLEMA 3
Un segmento de DNA de cadena simple tiene la siguiente composición de bases: A 31,5% C
23,7% T 17,1% G 27,7%.
¿Cuál sería la composición de bases de la cadena complementaria? ¿Cuál sería la
composición de bases de la forma de doble cadena de dicho segmento?
11
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 4
Dadas las siguientes moléculas de ácidos nucleicos de cadena doble:
a) Ninguna de las tres moléculas puede ser hidrolizada (degradada) por una RNasa.
b) Las tres moléculas tienen igual temperatura de fusión (Tm) porque tienen la misma
longitud.
c) Las 3 tienen igual Tm porque [T]/[A] = 1 y [G]/[C] = 1 (Reglas de Chargaff)
d) Las dos hebras de cada una de ellas son antiparalelas.
e) Tm a > Tm b > Tm c
f) Tm b > Tm a > Tm c
g) Tm c > Tm b > Tm a
h) Tm a > Tm c > Tm b
PROBLEMA 5
Explique el siguiente gráfico, obtenido midiendo la absorbancia (A) de luz UV de dos
muestras de DNA sometidas cada una a calentamiento gradual:
PROBLEMA 6
¿Qué consecuencias tendría para una bacteria la pérdida, por mutación, de la actividad
exo-nucleasa de 3' a 5' de la DNA polimerasa III? Justifique.
12
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 7
En un tubo de ensayo se agregan los siguientes componentes para la síntesis de DNA in vitro
a 37°C:
PROBLEMA 8
En un experimento se usaron bacterias E. coli a las cuales se les introdujo el gen de una
proteína de medusas que emite fluorescencia verde, llamada “green fluorescent protein”
(GFP). Este gen había sido previamente modificado in vitro de la siguiente manera: su DNA
estaba formado por una hebra con secuencia normal (wild-type) acompañada de su
hebra complementaria que tenía una mutación, de modo de crear un apareamiento
erróneo o mismatch en uno de sus pares de bases, es decir que no cumple las reglas de
Watson-Crick. (Tal mismatch en la doble hélice resultó estable en estas bacterias porque
éstas tenían mutaciones en algunos de sus genes, que les impedían hacer la habitual
reparación de mismatches).
¿Cuál hubiera sido el resultado si la replicación del DNA fuera conservativa en lugar de
semi-consevativa?
13
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 9
Se quiere determinar la presencia del cDNA derivado del RNA del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH o HIV, por sus siglas en inglés) insertado en el DNA de
linfocitos T de un paciente. Los linfocitos son un tipo de células de la sangre pertenecientes
al conjunto de los glóbulos blancos. En un tubo de ensayo se agregaron los siguientes
componentes para una reacción de amplificación de DNA por PCR (reacción en cadena
de la polimerasa):
- DNA molde: DNA total obtenido de linfocitos de un paciente que tiene anticuerpos anti-
retrovirus HIV circulantes en sangre.
- "primer" a, de 20 nucleótidos, cuya secuencia es complementaria a la hebra de abajo del
molde en la región a.
- "primer" b, de 22 nucleótidos, cuya secuencia es complementaria a la hebra de arriba del
molde en la región b.
- dNTPs (los cuatro desoxinucleósidos trifosfato).
- Buffer conteniendo magnesio.
- Taq polimerasa (DNA polimerasa de Thermus aquaticus).
Preguntas:
a) ¿Cuál es la longitud (en pares de bases) del producto de la PCR?
b) ¿Cuál es el peso molecular del producto de la PCR?
c) ¿Cuál es la masa aproximada de producto obtenida al cabo de 30 ciclos, si se partió de
un material conteniendo 10 moléculas de molde (genoma viral integrado)? Considere que
el nº de moléculas de producto puede calcularse aproximadamente como x.2n, donde x =
nº de moléculas de molde y n = nº de ciclos (con una eficiencia del 100%).
d) ¿Cuál sería el producto de PCR si se omitiera…
i) uno de los "primers"?
ii) los dos "primers"?
iii) el DNA molde?
e) ¿Cuál sería el producto de PCR si se reemplazara…
i) el DNA molde por DNA obtenido a partir de células de raíz capilar del mismo
individuo?
ii) el DNA molde por ácido nucleico del virus HIV purificado?
iii) el "primer" a por otro de 20 nucleótidos, pero de secuencia complementaria a la hebra
de arriba de la región a?
iv) la Taq polimerasa por la DNA polimerasa I de E. coli ?
f) Dado que la PCR es extremadamente sensible, ¿qué controles realizaría para descartar
una eventual contaminación?
14
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 10
Se desea amplificar por PCR un determinado segmento de DNA genómico como el
señalado en la parte de arriba de la Figura 1. La mezcla de reacción contiene la muestra
de DNA genómico, desoxirribonucleósidos trifosfato, buffer de pH 7 conteniendo magnesio,
los dos oligodesoxirribonucleótidos “primers” (I y II) y la Taq polimerasa. Al cabo de 30 ciclos
de PCR, se obtiene una gran cantidad de producto de PCR.
Preguntas:
a) ¿Cuál de los esquemas de la Figura 1 (A, B, C o D) corresponde al producto de PCR?
Justifique.
b) ¿Qué paso de la PCR evita la necesidad de agregar helicasa a la mezcla de reacción?
Justifique.
c) La Taq polimerasa no tiene actividad 3’-5’ exonucleasa. ¿Qué consecuencias tiene este
hecho para el producto de PCR?
d) Si los “primers” fueran parcialmente complementarios a las secuencias del DNA molde,
¿en cuáles de las siguientes condiciones experimentales sería conveniente trabajar para
que se apareen a las mismas y la reacción de PCR pueda ocurrir?
i) ¿alta o baja concentración salina?
ii) ¿alta o baja temperatura en la etapa del apareamiento?
iii) ¿alta o baja concentración de un agente desnaturalizante (por ej., dimetilsulfóxido) en
la mezcla de reacción?
Elija una opción en cada caso y justifique.
e) La secuencia a amplificar tiene un 50% de T y A. Con el objeto de obtener un producto
de PCR radiactivo, una investigadora agregó a la mezcla de reacción, al comienzo del
primer ciclo, exceso de desoxiATP marcado con fósforo 32 (radiactivo) en su fosfato gamma
(γ) (ver Figura 2). Para su sorpresa, el producto de PCR no resultó radiactivo. ¿Por qué? ¿Qué
error cometió la investigadora? Justifique.
15
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Origami 1
16
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Origami 2
17
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROTEÍNAS
1) ¿Cuáles son los aminoácidos que forman parte de las proteínas? ¿Cuáles son polares y
cuáles no polares? ¿Qué aminoácidos están cargados positivamente y cuáles
negativamente a pH neutro?
7) ¿Cuáles son las diferencias entre una proteína globular y una fibrosa? Dé ejemplos de
ambas.
9) ¿Cuál es el efecto de los siguientes tratamientos sobre una proteína nativa en solución
acuosa: urea, mercaptoetanol, SDS (dodecilsulfato de sodio), hidrólisis ácida fuerte,
calentamiento a 90ºC.
10) Mencione las características de las enzimas. Defina: sustrato, producto, energía de
activación, sitio activo, cofactor.
12) ¿Qué es una enzima alostérica? ¿El fenómeno de alosterismo está solamente restringido
a las enzimas? ¿Qué es el efecto cooperativo?
13) Señale cuáles de las siguientes sustancias son proteínas y cuáles no:
anticuerpos hemoglobina
miosina (músculo) enzimas
actina (músculo, citoesqueleto) clorofila
interleuquinas aspirina
celulosa (vegetales) bilirrubina
caseína (leche) quitina (hongos, insectos)
receptores hormonales queratina (piel, pelo)
insulina albúmina (plasma sanguíneo)
plastoquinona caroteno
adrenalina represor del operón lac
sacarosa genes
acetilcolina penicilina (antibiótico)
18
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
14) Se suele estimar la concentración de proteínas por absorción de luz ultravioleta (UV).
¿Cuáles son los aminoácidos responsables de dicha absorción?
19
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
B) PROBLEMAS DE PROTEÍNAS I
PROBLEMA 1
(Basado en trabajos de S. Satagopan, D. Filatov, K. Kosuge y J. Moreno)
Las plantas, algas y las bacterias verdes poseen la enzima llamada Rubisco, que cataliza
una etapa clave para lograr una alta eficiencia de la etapa luminosa de la fotosíntesis: la
reacción de conversión de CO2 en un compuesto orgánico de 3 carbonos. En eucariotas
fotosintéticos (algas y plantas), la molécula enzimática está compuesta de subunidades
“grandes”, de 55 kDa cada una (codificadas en el cloroplasto), asociadas a subunidades
“pequeñas”, de 15 kDa cada una (codificadas en el núcleo).
El sitio activo está localizado en la subunidad grande, motivo por el cual ésta ha despertado
gran interés de las/os científicas/os para modificarla por ingeniería genética y así desarrollar
plantas con mayor eficiencia fotosintética y por ende mejor rendimiento de cultivo en el
campo. Dicho sitio activo está conformado por los siguientes aminoácidos: T327, K334, A375,
S376 y F391 (la letra indica el aminoácido adoptando el código de 1 letra; el número, la
posición en la secuencia proteica, empezando a contar a partir de “1”, que es M =
metionina, que constituye el extremo amino [o -NH2]).
Actividad de Rubisco
101 391 471
(unidades arbitrarias)
Espinaca (planta terrestre) I F L 69
Potamogeton natans (planta acuática
V F A 70
con hojas flotantes)
Potamogeton pectinatus (planta
V W A 100
acuática totalmente sumergida)
Chlamydomonas (alga verde) V W T 98
Chlamydomonas mutante 1 E W T 50
Chlamydomonas mutante 2 V K T 1
a) ¿El sitio activo está más cerca del extremo amino o más cerca del extremo carboxi en la
secuencia primaria? Dato: PM promedio de 1 aminoácido: 110 Da
b) ¿El cambio de un aminoácido por otro genera necesariamente un drástico cambio en la
actividad de la enzima? ¿En qué casos se ve que no? ¿En qué casos se ve que sí? ¿Influye
la posición de los aminoácidos involucrados en el cambio? ¿Influyen las características
físico-químicas (polaridad, carga eléctrica) de los aminoácidos involucrados en el cambio?
c) La concentración de CO2 y la cantidad de luz suelen ser menores bajo la superficie de los
cuerpos de agua, comparadas con las atmosféricas. ¿Podría la sustitución F391W en P.
pectinatus haber tenido valor adaptativo positivo en la evolución?
d) ¿Qué cambio aminoacídico haría Ud. en la Rubisco de la espinaca o de Potamogeton
natans para mejorar su actividad?
Datos:
Aminoácidos polares o hidrofílicos:
- no cargados: S, T, N, Q, Y
- básicos: K, R, H
- ácidos: D, E
Aminoácidos no polares o hidrofóbicos: A, V, L, I, M, F, W, G, C, P
20
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 2
Dibuje los siguientes tipos de proteínas:
a) Con una subunidad y 3 dominios estructurales.
b) Con 3 subunidades y 3 dominios estructurales.
c) Con 2 subunidades y un dominio estructural.
PROBLEMA 3
Un péptido de 12 aminoácidos es sometido a 3 tratamientos por separado:
i) corte con tripsina, produciéndose los péptidos Val-Ala-Phe-Leu-Lys, Pro-Trp-Pro-Arg y
Val-Met-Gly (la tripsina corta el enlace peptídico hacia el C-terminal de lisinas o
argininas).
ii) corte con carboxipeptidasa, observándose liberación inicial de Gly (la enzima
carboxipeptidasa elimina el aminoácido C-terminal de cualquier proteína, cortando el
enlace peptídico formado entre el aminoácido terminal y el anteúltimo).
iii) corte con una proteasa capaz de cortar sólo hacia el N-terminal de las alaninas,
generando en este caso un pentapéptido y un heptapéptido.
¿Cuál es la secuencia aminoacídica del péptido original?
PROBLEMA 4
Ud. está buscando afanosamente una sustancia presente en el espárrago violeta de la
Antártida, que cura (según dicen) el resfrío de los guanacos. En sus estudios termina
purificando 2 proteínas que no le curan el resfrío a nadie, pero que dan cristales violetas
muy bonitos. Ambas proteínas son muy distintas pero tienen el mismo peso molecular en
condiciones nativas (40.000 Daltons). Tanto la proteína A como la B tienen 2 cisteínas. El
análisis de la proteína A pura indica que tiene un solo tipo de aminoácido N-terminal
(treonina), pero el análisis de la proteína B reveló la existencia de 2 tipos de extremos N-
terminales (alanina y serina).
a) ¿Qué le sugiere que las proteínas corridas en un gel PAGE-SDS, no teñido con azul de
Coomassie, den bandas de color violeta?
b) ¿Qué le indica la presencia de un solo tipo N-terminal en la proteína A y de dos tipos N-
terminales en la proteína B?
NOTA: Considere despreciable el peso molecular del grupo prostético respecto al peso
molecular del polipéptido.
PROBLEMA 5
La toxina diftérica es una proteína tóxica para células animales, debido a que posee una
actividad enzimática capaz de inhibir la biosíntesis de proteínas. Consta de una sola
cadena polipeptídica de 58.000 Daltons. La tripsina, en pequeñas cantidades, fragmenta
esta cadena en dos partes, una de 37.000 Daltons y otra de 21.000 Daltons, pero sólo en
ciertas condiciones, como se muestra en la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
de la figura. Explique por qué.
21
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 6
a) En base a las fórmulas mostradas, ¿por qué el represor del operón lac, proteína que
normalmente se une a la lactosa, puede también unirse al IPTG?
b) ¿Qué significa que el IPTG tiene mayor afinidad por el represor que la lactosa?
Walter Gilbert, premio Nobel de Química 1980, en 1966 hizo el siguiente experimento que lo
hizo famoso:
Incubó bacterias E. coli, wild-type o mutantes, junto con IPTG marcado radiactivamente
(14C). Luego rompió las células y puso los extractos resultantes en bolsitas de diálisis (cuyos
poros dejan pasar moléculas pequeñas como el IPTG pero no proteínas) sumergidas en
buffer salino. Luego de 5 horas, midió la radiactividad adentro y afuera de las bolsitas. Los
resultados que obtuvo fueron (en unidades arbitrarias de concentración):
22
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 7
Ud. tiene que eliminar de la muestra de DNA de un paciente una gran cantidad de RNA
que la contamina. Para ello, debe tratar a la solución que contiene a ambos con una
enzima RNasa (ribonucleasa). Como las RNasas altamente purificadas son muy caras y Ud.
no dispone de muchos fondos, decide comprar una RNasa que viene contaminada con
trazas de DNasa (desoxirribonucleasa). Basándose en el conocimiento de que las RNasas
son consideradas “termorresistentes” mientras que las DNasas no, decide pre-tratar la
solución de RNasa comprada, calentándola por 10 minutos a 90ºC y transfiriéndola
inmediatamente a un balde con hielo. Desafortunadamente cuando prueba su
preparación así pre-tratada sobre su muestra, Ud. comprueba que ni el DNA, ni el RNA
fueron degradados. ¿Qué error cometió Ud.?
PROBLEMA 8
El 15% del peso de una célula de E. coli corresponde a proteínas. Si una célula de E. coli
contiene 3.000 tipos diferentes de proteínas, y suponiendo un peso molecular promedio de
50 kDa para todas las proteínas de la bacteria,
a) Estime el número total de moléculas de proteína en una sola célula.
b) ¿Es posible calcular la cantidad de moléculas proteicas de cada clase?
Datos:
Suponga que la densidad del protoplasma es igual a la del agua.
Suponga que la célula de E. coli es cilíndrica con una longitud de 2 micrones y un diámetro
de la base de 1 micrón.
Número de Avogadro = 6,02 x 1023 moléculas/mol
Vol. cilindro: π.r2.h
23
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
C) PROBLEMAS DE PROTEÍNAS II
PROBLEMA 1
Al ser lineales, los cromosomas de las células eucariotas sufren un acortamiento progresivo
cada vez que duplican su DNA. Este acortamiento es contrarrestado en algunos tipos
celulares en activa división por la actividad de una enzima llamada telomerasa. La proteína
de la telomerasa está formada por 5 tipos de subunidades distintas (a, b, c , d y e), cada
uno de ellos codificado por un gen distinto. Cada molécula de telomerasa tiene 1a + 1b +
2c + 2d +2e, es decir, ocho polipéptidos en total. La figura 1 muestra una electroforesis en
gel de poliacrilamida con SDS de la telomerasa pura, teñida con azul de Coomassie, un
colorante que sólo tiñe polipéptidos. El patrón de bandas observado es el mismo con o sin
tratamiento previo con beta-mercaptoetanol.
Preguntas
a) El acortamiento progresivo de los cromosomas lineales es consecuencia del mecanismo
de duplicación del DNA. Explique cómo ocurre.
b) Teniendo en cuenta la composición polipeptídica de la telomerasa (1a + 1b + 2c + 2d
+2e) después de hacer sus cálculos (muéstrelos) usted encontrará una gran diferencia
numérica con el PM nativo estimado para la enzima completa (464 kDa). ¿A qué se debe
esta diferencia? ¿Qué tiene que ver esta diferencia con el mecanismo de acción de la
telomerasa?
c) De los datos del problema, ¿puede usted deducir si la actividad catalítica de la
telomerasa reside en alguno de los 8 polipéptidos o en la interacción entre ellos?
d) La Figura 2 muestra las dos hebras del DNA de un telómero. ¿Cuál de las dos, la de arriba
o la de abajo, es alargada por la telomerasa? ¿Cómo se completa el DNA de la hebra
complementaria a la alargada por la telomerasa?
24
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 2
La aldolasa es una proteína homo-oligomérica, soluble, de localización citoplasmática, con
función bioquímica de enzima, presente en casi todos los organismos. Cumple un papel
biológico muy importante en la glucólisis porque convierte la fructosa-bis-fosfato (molécula
de azúcar de seis carbonos) en dos moléculas de tres carbonos cada una. Mutaciones en el
gen que la codifica existen en muchas personas que sufren de intolerancia a la ingestión de
dulces. La mutación puntual más frecuente en la población mundial es un cambio en el
codón 149 que hace cambiar alanina por prolina.
Un grupo de investigadoras/es (Malay et al., J. Molecular Biology, marzo 2005) purificó la
aldolasa salvaje (wild-type), de 160 kDa, y la mutada, de 40 kDa.
La aldolasa salvaje fue cristalizada y examinada por difracción de rayos-X. De este análisis,
se elaboró el modelo de estructura espacial para el monómero que se muestra en la Figura
1, del cual surgieron las siguientes observaciones:
i) la Ala 149 interacciona con la Val 24 (por interacciones hidrófobicas)
ii) la Arg 148 interacciona con el Glu 189 (por interacciones iónicas) y juntos se unen al
sustrato
iii) de las nueve Cys que tiene la proteína, la Cys 361 es la única bien expuesta como para
situarse próxima a otra Cys en la misma posición de una subunidad vecina.
iv) muchos aminoácidos hidrofóbicos están ocluidos en el interior de la molécula,
interaccionando entre sí.
v) muchos aminoácidos no vecinos del mismo polipéptido interaccionan entre sí mediante
puentes de hidrógeno.
Además, con ambas proteínas se realizaron los siguientes experimentos por separado
(Figura 2):
A) fueron tratadas con urea y luego analizadas por métodos físico-químicos para evaluar el
grado de plegado.
B) fueron sometidas a electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) con SDS y urea, con o
sin β-mercaptoetanol (MSH)
C) fueron incubadas a distintas temperaturas en presencia de fructosa-bis-fosfato para
medir su actividad enzimática.
25
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) ¿Cuántas subunidades tienen las moléculas de proteína salvaje nativa? ¿Y las de mutada
nativa?
b) ¿Por qué la urea provocó los resultados obtenidos en la figura 2A?
c) Proponga un modelo de estructura tridimensional posible, al estilo del de la Figura 1 pero
para la proteína mutada, que muestre las posiciones aminoácidicas resaltadas en la Figura 1
y que sea compatible con los resultados de los experimentos.
Datos:
Aminoácidos polares o hidrofílicos:
- no cargados: Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr
- básicos: Lys, Arg, His
- ácidos: Asp, Glu
Aminoácidos no polares o hidrofóbicos: Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Cys, Gly, Pro
PROBLEMA 3
Una investigadora letona tiene serios problemas para caracterizar una enzima que ha
purificado y la acción que tiene sobre ella el compuesto X, un aparente activador. En la
Figura 1 se ve una migración en un gel de poliacrilamida corrido en condiciones nativas,
teñido con azul de Coomassie. En la calle 1, la proteína se incubó previamente con el
compuesto X mientras que en la 2, no.
26
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Con el material proteico eluido a partir de cada una de las tres bandas del gel nativo (A, B y
C), él hizo un ensayo de actividad, en presencia o ausencia del compuesto X (ver Tabla).
Preguntas:
a) ¿Cómo es la estructura de la proteína y cómo la afecta el compuesto X?
b) ¿Por qué en el gel nativo la muestra se siembra en el medio del gel?
c) ¿Cómo explica que la banda A haya migrado más rápido que la B en el gel nativo?
d) ¿Cómo haría para determinar si la enzima se une al compuesto X, y si lo hace, a qué
subunidad?
PROBLEMA 4
En los ’90, nuestro país fue sacudido por la noticia de la aparición de casos de cólera que
fueron en aumento debido a malas condiciones sanitarias. Vibrio cholerae es la bacteria
responsable de la diarrea aguda observada en esta enfermedad. El aislamiento y
caracterización de la misma data del siglo antepasado. Sin embargo, su biología molecular
y celular comenzó a conocerse recién en los años 80 del siglo pasado, debido
principalmente a las investigaciones de John Mekalanos, de la Harvard Medical School.
El proceso infeccioso implica la supervivencia de V. cholerae al pH ácido del estómago, su
motilidad a través del intestino y la secreción por parte del vibrión de una toxina proteica de
87 kDa compuesta por los productos de 2 genes, llamados ctx A y ctx B. El producto de ctx
A es un polipéptido de 27 kDa y el de ctx B, uno de 12 kDa. El polipéptido A sufre una
modificación post-traduccional.
27
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) Haga un dibujo de la molécula de toxina que muestre el n° de subunidades de cada
clase, el tipo de unión entre las mismas y la característica saliente del producto del gen ctx
A.
b) ¿Cuántos aminoácidos tiene la toxina aproximadamente?
Dato: PM de cada aminoácido = 110 Da.
c) ¿De qué signo es la carga eléctrica neta de la toxina a pH = 7? ¿Cómo se modificaría su
carga neta y actividad biológica a pH = 12?
d) ¿Qué modificación post-traduccional sufre "in vivo" el producto de ctx A para explicar el
resultado del gel con SDS y β-mercaptoetanol?
PROBLEMA 5
Basado en los pioneros trabajos de Arthur Kornberg (1918-2007; premio Nobel 1959) y sus
continuadores.
La replicación del DNA es un proceso clave en todos los organismos porque garantiza la
continuidad de la información genética a través de las generaciones de manera fiel y
rápida, antes de cada división celular. Por ejemplo, en E. coli, la replicación es realizada por
la DNA Polimerasa III, que es una proteína con estructura cuaternaria compuesta por 15
subunidades de 10 tipos diferentes, llamada “holoenzima”, que realiza la mayoría (pero no
todas) de las actividades enzimáticas necesarias para el proceso in vivo.
En el laboratorio de Arthur Kornberg se ha logrado purificar la holoenzima completa, así
como cada una de las subunidades que pudieron separarse entre sí mediante tratamiento
con urea solamente. La Tabla 1 indica los pesos moleculares (PM) de los diferentes tipos de
subunidades, separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS:
Tabla 1
28
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas
a) ¿Cuál de los dos modelos de estructura cuaternaria de la holoenzima representados en
la Figura 1 es consistente con todos los datos, el A o el B?
Por otra parte, los procariotas termófilos Thermus aquaticus (Taq) y Pyrococcus furiosus (Pfu)
contienen una DNA polimerasa con ciertas diferencias estructurales y funcionales a la DNA
pol descripta. Con la intención de entender algunas de esas diferencias, se hicieron 2 tipos
de experimentos:
1. Replicación de DNA in vitro a 37 ºC usando un molde de DNA de cadena simple, un
“primer” complementario al mismo, desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs) y Mg2+.
2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un molde de DNA de cadena
doble, “primers” adecuados, dNTPs y Mg2+, con 30 ciclos de 95ºC, 65ºC y 72ºC cada uno.
En cada uno de los dos tipos de experimento se usaron distintas fuentes de DNA polimerasa
purificada, según se indica en la Tabla 2:
29
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
c) Como se mencionó, el oligómero de 206 kDa que incluye una subunidad α preserva la
actividad de polimerasa y su fidelidad sólo in vitro (experimento 3 de la Tabla). ¿Por qué la
duplicación del DNA in vivo requiere de la holoenzima completa conteniendo las 2
subunidades α?
d) ¿En base a los datos de la Tabla 2, qué diferencias en cuanto a la actividad 3’- 5’
exonucleasa existen entre las DNA polimerasas de E. coli, Pfu y Taq? Fundamente su
razonamiento, aclarando la implicancia biológica de dicha actividad.
e) Interprete los resultados de los experimentos 7 y 8.
PROBLEMA 6
En las neuronas de algunos mamíferos que presentan síntomas neurológicos severos, se ha
encontrado una proteína de 30 kDa llamada PrS, que tiende a formar agregados insolubles.
A esta proteína se le atribuyen:
- la causa de la enfermedad.
- propiedades infecciosas, ya que una pequeña cantidad (teóricamente una sola
molécula) en una neurona puede desencadenar un daño importante como resultado de
una propagación de la entidad molecular infectiva, y además, porque la enfermedad
puede ser contagiosa.
Curiosamente, en neuronas no infectadas existe una proteína de función desconocida y
con idéntica secuencia de aminoácidos y las mismas modificaciones covalentes co- y post-
traduccionales, llamada PrC, pero que ni se insolubiliza ni es infectiva. Un dato interesante es
que la ausencia total de la proteína normal PrC (por ausencia del gen) no provoca
enfermedad y hasta protege contra el riesgo de contraerla vía infección por PrS.
Por otra parte, personas con ciertas mutaciones puntuales en el gen PrC (como por ejemplo
las que causan el cambio de Glu en la posición 200 por Lys, o el cambio de Pro en la
posición 102 por Leu) tienen tendencia a desarrollar espontáneamente los síntomas
neurológicos sin estar infectados.
Estudios in vitro con las proteínas purificadas demostraron que, además de la insolubilidad e
infectividad, PrS y PrC difieren en su comportamiento frente a proteasas. Además, si se
mezclan 1 µg de PrS (infectiva y resistente a proteasas) con 5 µg de PrC, la mezcla se vuelve
tan infectiva y resistente a proteasas como 6 µg de PrS.
A partir de las evidencias mencionadas, deduzca:
a) ¿A qué características estructurales de estas proteínas se deben las diferentes
propiedades observadas entre PrC y PrS en cuanto a su solubilidad y resistencia a
proteasas?
b) ¿Qué características deben tener en común las PrC mutadas y PrS para explicar la
existencia de la enfermedad neurológica de origen genético?
c) ¿Qué propiedad adicional debe tener PrS para explicar la propagación del daño que
causa in vivo y la transformación de PrC en los experimentos in vitro? ¿Cree Ud. que PrS y
PrC son capaces de interaccionar entre sí in vitro e in vivo?
d) ¿Por qué las neuronas sin PrC son resistentes a la infección?
30
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 7
Los climas extremos imponen límites a las diversas formas de vida. Sin embargo, a lo largo de
la evolución se han seleccionado organismos que han logrado adaptarse a regiones
inhóspitas. Un modelo eucariota de estudio de tal adaptación es el pez bacalao del
Atlántico Norte (Gadus morhua), de gran tamaño (Fig. 1), que vive en las frías aguas
costeras de Islandia y Noruega y que sirve de sabroso y codiciado alimento a sus
habitantes.
Las enzimas proteicas de estos organismos exhiben cierta flexibilidad, incluso en su sitio
activo, de manera que son capaces de catalizar las reacciones con gran rapidez aun a
bajas temperaturas, a diferencia de lo que sucede con los organismos que viven en
regiones de climas más cálidos, llamados “mesófilos”.
Una enzima muy estudiada de este pez es la fosfatasa, que está codificada por 1 solo gen.
Este gen codifica un polipéptido de 477 aminoácidos de los cuales 8 son cisteína. Esta
enzima contiene 1 solo sitio activo, no sufre proteólisis post-traduccional, y ninguna de sus 8
cisteínas se encuentra formando puentes disulfuro. Las Figuras 2 y 3 muestran las curvas de
actividad enzimática en función de la temperatura y de concentraciones crecientes de
urea (medida a 15ºC) respectivamente.
31
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) ¿Cuál es la estructura cuaternaria de la fosfatasa de bacalao? ¿Qué tipos de unión la
estabilizan? Justifique.
b) En base a los resultados de la Tabla 1 y de la Figura 4, ¿cuál es la causa molecular de que
la fosfatasa de bacalao pierda su actividad a 4 M de urea? ¿En qué parte de la molécula
de fosfatasa se encontrará el sitio activo de la enzima?
c) ¿Qué eventos moleculares son responsables respectivamente de las partes ascendente y
descendente de la curva de la Figura 2? Dibuje la curva esperable para la fosfatasa de
salmón, un pez mesófilo.
d) Una mutación puntual en el gen de fosfatasa de bacalao provoca el cambio de uno de
sus codones AGC por TGC (ver código genético, pág. 34). La enzima mutada muestra el
mismo comportamiento que la salvaje en el experimento de la Tabla 1. Sin embargo, el
grado de desplegado en función de la concentración de urea es diferente para la
fostafasa mutada comparando con la salvaje (Figura 5). Notablemente, si el grado de
plegado se mide en presencia de mercaptoetanol, la curva de la fosfatasa mutada da
igual que la de la normal.
¿Provocó la mutación la aparición de una nueva unión inter-o intrasubunidad? ¿Cuál es la
causa molecular del diferente comportamiento de la enzima mutada frente a la urea?
Justifique.
Dato:
PM promedio de 1 aminoácido = 110 Da.
32
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
A) GUÍA DE ESTUDIO
1) ¿Con qué polaridad son sintetizadas las proteínas en los ribosomas? ¿Con qué polaridad
es leído el mRNA?
3) ¿Qué quiere decir que el código genético es universal y degenerado? ¿Es estrictamente
universal?
4) ¿Qué entiende por hipótesis del “wobbling”? ¿Qué son los tRNAs isoaceptores?
8) ¿Cuál es la forma de las moléculas de tRNA? Señale los lugares donde se encuentra el
anticodón y el sitio de unión a los aminoácidos.
9) ¿Qué entiende por tRNA supresor, y cómo se origina ese tipo de molécula?
33
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
34
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
De arriba hacia abajo, la figura muestra 3 etapas consecutivas de la elongación de la
traducción en los ribosomas.
a) Identifique en los dibujos lo siguiente: extremos 5' y 3' del mRNA, extremo NH2-terminal del
polipéptido naciente, extremos 5' y 3' de cada anticodón, sitios "A", "P" y "E" del ribosoma,
uniones peptídicas, uniones covalentes no peptídicas, puentes de hidrógeno.
b) Sabiendo que los círculos representan a los aminoácidos metionina (M), triptofano (W),
fenilalanina (F) y ácido aspártico (D), asigne las bases que pueda al mRNA y a los
anticodones.
c) ¿En qué etapa actúa la peptidil transferasa?
PROBLEMA 2
Una mutación puntual (C que cambia a G) en un gen bacteriano produce la aparición de
un codón stop UAG en la mitad de su mensajero, lo cual provoca la pérdida de la
capacidad de usar ácidos grasos como fuente de alimento.
a) ¿Cuál era el aa codificado por el codón alterado? (utilice el código genético)
Una segunda mutación (independiente de la primera) en un gen que codifica para un RNA
de transferencia provoca la alteración de su anticodón de manera tal que se aparea con
el codón stop UAG, incorporando el aminoácido tirosina en esa posición. Tal mutación
suprime los efectos de la primera, restaurando a las bacterias su capacidad de alimentarse
de ácidos grasos.
35
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 3
La región codificante del gen de la Taq polimerasa (DNA polimerasa de la bacteria Thermus
aquaticus) comienza con la siguiente secuencia de nucleótidos como se muestra en el
esquema:
Preguntas:
a) La Taq polimerasa tiene en total .............. aminoácidos, de los cuales los 300 primeros del
extremo NH2 son responsables de la actividad exonucleasa de 5’a 3’; mientras que en el
extremo COOH reside la actividad de polimerasa.
Se sabe que además de la proteína completa de .............. kDa, T. aquaticus sintetiza a partir
del mismo mRNA una proteína de 65,5 kDa, con plena actividad de DNA polimerasa y sin
actividad 5’ a 3’ exonucleasa, como consecuencia de la iniciación en un codón interno
para metionina.
Dato: PM promedio para un aminoácido = 110 Da.
b) ¿Cuál sería el efecto (sobre la síntesis de la proteína completa y sobre la corta) de la
inserción de una A a la derecha de la T indicada en la figura? En su respuesta debe indicar
cuáles actividades (exonucleasa, polimerasa o ambas) esperaría encontrar.
c) Comparando las secuencias aminoacídicas de las DNA polimerasas de T. aquaticus y E.
coli, se observa que hay un 38% de identidad de secuencia. Sin embargo, las secuencias
nucleotídicas de los genes correspondientes muestran muy baja identidad entre sí. Dé una
explicación para este hecho en base al código genético.
d) Thermus aquaticus tiene en sus ácidos nucleicos un contenido de G+C más elevado que
E. coli. ¿Cuál puede ser la ventaja de este hecho para T. aquaticus?
e) El gen de la Taq polimerasa tiene 76 codones para arginina distribuidos así:
CGT 0 AGG 25
CGC 24 AGA 0
CGG 27
CGA 0
¿Por qué piensa Ud. que estos organismos evolucionaron de manera de poseer esta
particular distribución de codones sinónimos?
PROBLEMA 4
(inspirado en Krzycki, de Ohio, USA, Curr Opin Microbiol 2005)
Los climas extremos imponen límites a las diversas formas de vida. Sin embargo, durante la
evolución se han seleccionado organismos que resultaron adaptados a ciertas condiciones,
como por ejemplo el frío.
Se sabe que las enzimas proteicas de los organismos adaptados al frío presentan estructuras
muy “flexibles”, particularmente en su sitio activo, de manera que son capaces de catalizar
las reacciones con gran rapidez aun a bajas temperaturas.
El arqueón (arquibacteria) antártico Methanococcoides burtonii desarrolló la siguiente
estrategia evolutiva: adquirió el aminoácido raro pirrolisina (Pyl, en la nomenclatura de 3
36
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Fig. 1
Fig. 2
Preguntas:
a) La presencia de pirrolisina en esta metil transferasa se debe a su incorporación mediante
un transfer cargado con pirrolisina durante la traducción en los ribosomas, y no a una
modificación química post-traduccional de la lisina. ¿Qué tRNA nuevo habrá generado
evolutivamente esta bacteria (comparando con sus organismos antecesores) que posibilitó
su adaptación a vivir en la Antártida? Dibuje su estructura secundaria, indicando en el
dibujo la región donde se carga el aminoácido y los ribonucleótidos de su anticodón. Corrija
la tabla del código genético clásico que se muestra en la página 34, de manera de que
corresponda al usado por esta bacteria.
b) ¿La aparición de pirrolisina implicó la desaparición del aminoácido lisina de las
secuencias polipeptídicas de Methanococcoides burtonii?
PROBLEMA 5
La ciclosporina A, producida por un hongo, es un polipéptido de poderosa acción
inmunosupresora utilizado para prevenir el rechazo de transplantes. La incubación de
linfocitos T con ciclosporina A inhibe la aparición de la proteína interleuquina 2 (IL-2) que
interviene en la respuesta inmune. Este efecto podría deberse a uno o más de los siguientes
fenómenos in vivo (sabiendo que la ciclosporina no se une directamente a la molécula de
mRNA que codifica IL-2):
Para determinar cuáles de estas hipótesis podrían ser correctas, se realizó una preparación
de todos los RNAs poliadenilados de dos cultivos de linfocitos T, uno tratado y otro no
tratado previamente con ciclosporina A. Cada una de las dos preparaciones de RNA
poliadenilado fue ensayada en un sistema de traducción in vitro (ribosomas eucariotas,
tRNAs, aminoácidos, aa-tRNA sintetasas) y se midió (por medio de anticuerpos específicos y
electroforesis en geles) la cantidad de IL-2 fabricada (ver tabla).
Nota: La actina es una proteína presente en todas las células eucariotas que es
imprescindible para su estructura, forma y función.
37
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) ¿A cuáles de los cuatro niveles mencionados más arriba podría actuar la ciclosporina?
b) ¿Qué objeto tiene medir en paralelo la cantidad de actina sintetizada?
c) Vuelva a este problema luego de resolver Nucleicos II y proponga otros experimentos
para confirmar la respuesta a la pregunta a).
PROBLEMA 6
En el año 1961, un investigador llamado Dintzis (Proc. Natl. Acad. Sci. 47, 247,1961) hizo un
experimento usando reticulocitos enteros incubados a 15ºC en presencia de aminoácidos y
otros nutrientes esenciales. Luego de 1 hora de incubación, agregó aminoácidos marcados
todos radiactivamente y sacó alícuotas a diferentes tiempos para analizar los productos
marcados obtenidos.
A los 4 minutos, observó que las únicas cadenas completas de hemoglobina α que estaban
marcadas, lo estaban en el extremo -COOH, y que recién a los 60 minutos aparecían
cadenas completas marcadas en su totalidad, incluyendo su extremo -NH2.
PROBLEMA 7
Streptococcus pneumoniae, o neumococo, es una bacteria que infecta las vías respiratorias
de los humanos y es difícil de atacar con los antibióticos tradicionales porque suelen
aparecer cepas bacterianas resistentes a ellos. Por eso se están usando nuevos antibióticos
más efectivos, como la evernimicina. El neumococo es normalmente sensible a este
antibiótico, aunque también, pero muy esporádicamente, aparecen cepas resistentes. Para
aislar el gen de la resistencia se hicieron los siguientes experimentos:
Se sembraron ordenadamente y por separado bacterias provenientes de pacientes no
tratados con evernimicina en cuatro placas de Petri, tres conteniendo evernimicina y la otra
no. Las cuatro placas se incubaron a 37ºC para que crezcan las colonias. La figura muestra
lo observado al día siguiente:
38
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) ¿Cuál pudo ser la causa de la aparición de las bacterias resistentes de la figura? ¿Qué
maquinaria enzimática “se equivocó”?
b) El cambio C a T en el gen de RNA de 23S de la única colonia de la placa 2, ¿surgió como
consecuencia de la presencia de la evernimicina o era pre-existente? ¿Con qué
mecanismo evolutivo es consistente este resultado? ¿Con qué par de primers (I o II) se
obtendría producto de PCR a partir de DNA de las siguientes colonias?:
Placa 1: posiciones B3 y A5
Placa 2: única colonia (posición A5)
c) ¿A qué macromolécula se uniría la evernimicina y qué actividad enzimática inhibiría en
las bacterias sensibles?
PROBLEMA ADICIONAL
En eucariotas, la subunidad pequeña ribosomal (40S) se une al extremo 5'CAP de los mRNAs.
Luego se desliza en dirección 3' y se detiene al encontrar un AUG que se encuentre situado
dentro de una secuencia adecuada, necesaria para que sea reconocido como iniciador.
Para determinar esa secuencia, se realizó un ensayo de traducción in vitro en un lisado de
reticulocitos (lisado de células precursoras de los glóbulos rojos, libre de mRNA endógenos),
al que se le agregaron distintas variantes (artificiales) de mensajero de una dada proteína,
los cuales sólo diferían en las bases que aparecen en la tabla.
Se midió luego la cantidad de proteína correctamente sintetizada:
39
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
a) Determine cuáles de los cambios impiden el reconocimiento del iniciador y cuáles no.
b) Escriba una secuencia consenso para el contexto del AUG iniciador.
c) ¿Piensa usted que, aparte de los mRNAs, otros RNAs como los tRNAs, rRNAs o miRNAs
tendrán esta secuencia? ¿Por qué?
d) La figura de abajo muestra dos mRNAs que tienen dos AUG cerca del 5'CAP. Determine,
en cada caso, en cuál se iniciará la traducción y cuál será la secuencia de los primeros
aminoácidos:
40
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
ÁCIDOS NUCLEICOS II
A) GUÍA DE ESTUDIO
1) Haga un esquema de un gen eucariótico típico. Señale qué porciones del gen se verán
representadas en el mRNA maduro y qué porciones se verán representadas en la proteína
que codifica.
2) ¿Qué significa que la TATA box (TATA) es una secuencia consenso? Escriba todas las
secuencias posibles que caigan dentro del consenso de la TATA box. ¿Qué función
cumpliría la TATA box?
6) ¿A partir de qué sustratos se sintetiza RNA mensajero? ¿Sobre qué molde? ¿Se requiere
cebador o “primer”? Describa las enzimas que realizan la transcripción en procariotas y
eucariotas.
7) ¿La sustitución de una base por otra en una zona del DNA que codifica para proteínas
(mutación puntual) da lugar necesariamente a un cambio de aminoácido?
10) Además del splicing del RNA, ¿existe el "splicing" de proteínas? ¿Qué son las inteínas y las
exteínas? ¿Para qué codifican las inteínas?
11) ¿Qué es una enzima de restricción? ¿De dónde se obtienen? ¿Para qué se usan? ¿Qué
tipos de extremos pueden dejar en el DNA de cadena doble?
12) Complete las siguientes secuencias para que correspondan a posibles palíndromos
reconocibles por una enzima de restricción:
a) AGT
b) CAA
c) CCC
d) ATC
41
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
¿Cuáles de las siguientes preparaciones llevan secuencias de intrones?
PROBLEMA 2
Existe un solo gen para la fibronectina (FN) en cada célula de mamífero (en realidad dos
copias, dos alelos, cuyas secuencias son idénticas). El gen tiene 70 kpb de longitud. Sin
embargo, se han encontrado en el citoplasma de fibroblastos dos RNA mensajeros de 7,7 y
8,0 kb de longitud, respectivamente.
El de 7,7 kb es idéntico en secuencia al de 8,0 kb, excepto por el hecho de que carece de
un segmento interno de 0,3 kb.
a) ¿Cómo explica la gran diferencia de tamaño entre el gen (70 kpb) y sus mensajeros
(aproximadamente 8,0 kb)?
b) ¿Cómo explica la existencia de dos tipos de RNA mensajeros de FN diferentes? Discuta
los posibles mecanismos que pudieron originar los dos mRNAs. ¿Qué implicancias biológicas
podría tener la presencia de los dos mRNAs?
Ud. supone que algunos tejidos expresan el mensajero de 7,7 kb, mientras que otros sólo
expresan el de 8,0 kb, y decide investigarlo usando hibridación de sondas de cDNA
radiactivo a preparaciones de mensajero total de distintos tejidos.
c) ¿Cuál de las dos especies de mensajero detecta en un Northern con cada una de las
siguientes tres sondas? Justifique.
i) un cDNA del mRNA de FN de 7,7 kb.
ii) un cDNA del mRNA de FN de 8,0 kb.
iii) un cDNA del mRNA del segmento diferencial de 0,3 kb.
PROBLEMA 3
El splicing es una reacción enzimática por la cual se eliminan los intrones del RNA transcripto
primario y los exones son unidos entre sí para formar el RNA maduro. Se ha descripto splicing
en transcriptos primarios tanto de RNAs mensajeros (el más común) como de RNAs
ribosomales y de transferencia (menos frecuentes). Las reacciones de splicing pueden ser
reproducidas "in vitro", es decir, en un tubo de ensayo si se colocan en el mismo los sustratos
adecuados y las enzimas o complejos enzimáticos correspondientes. Se estudiaron "in vitro"
dos tipos distintos de reacciones de splicing:
I) Splicing de un transcripto primario de RNA mensajero.
II) Splicing de un transcripto primario de RNA ribosomal.
Cada uno de los transcriptos primarios marcados radiactivamente fue incubado en
presencia o en ausencia de una preparación nuclear enriquecida en spliceosomas. A
distintos tiempos (de 0 a 2 hs de incubación) se tomaron muestras y se las sembró en calles
42
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) Identifique sustrato, producto/s y molécula/s intermediaria/s de la reacción e interprete la
variación con el paso del tiempo de las intensidades de cada banda en el panel de la
izquierda.
b) ¿Por qué el patrón de bandas del panel de la derecha es diferente?
c) ¿Qué patrón de bandas habría obtenido en los siguientes experimentos en los que la
preparación de spliceosomas hubiera sido pretratada de las siguientes maneras:
i) Calentamiento a 100ºC por 10 minutos y enfriamiento rápido en hielo.
ii) Digestión con una lipasa (enzima que degrada lípidos, es decir, grasas).
iii) Digestión con una proteasa (enzima que degrada proteínas).
iv) Digestión con una DNasa (enzima que degrada DNA).
v) Digestión con una RNasa (enzima que degrada RNA).
43
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 4
(basado en Murakami, JBC 2013; y Bae et al, PNAS 2013)
La enzima RNA polimerasa dependiente de DNA (RNA Pol) de Escherichia coli ha sido muy
estudiada debido al importante proceso universal en el que participa y por constituir un
posible blanco de ataque de nuevos antibióticos. Está compuesta por 4 tipos de
subunidades (codificadas por genes diferentes): α (36 kDa), β (150 kDa), β’ (155 kDa) y σ (70
kDa).
Por otra parte, el también muy estudiado bacteriófago (o simplemente fago) T7, compuesto
por DNA dentro de una cápside proteica, y que es capaz de infectar y finalmente matar a
E. coli, también tiene un gen que codifica a una RNA polimerasa propia (RNA Pol T7). Esta
enzima se une preferencial y específicamente a los promotores de genes del fago, que no
poseen las secuencias consenso de -10 y -35.
A partir de bacterias infectadas o no con el fago T7, se purificaron en el laboratorio las RNA
polimerasas presentes en cada caso. Estas fueron analizadas en geles de poliacrilamida
con SDS, tratadas o no con glutaraldehído, sustancia que genera uniones covalentes
(distintas de los puentes disulfuro), entre subunidades en la molécula proteica nativa.
En la Tabla 1 se indican los pesos moleculares en kDa correspondientes a las bandas
observadas luego de la electroforesis del complejo de iniciación de la RNA Pol de E. coli
(izquierda) y de la RNA Pol de E. coli cuando la bacteria está infectada con el fago T7
(derecha):
44
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Tabla 1
Preguntas
a) En la Figura 1 se muestran 3 modelos de complejos de elongación de la RNA Pol de
bacterias no infectadas con fago (I, II y III), pero uno solo de ellos es compatible con los
datos de la tabla. ¿Cuál es el modelo correcto?
Hace unos años, unas/os investigadoras/es descubrieron que la banda de 7 kDa indicada
en la Tabla corresponde al producto de un gen que no es bacteriano sino que es propio del
fago llamado gp2, de función inicialmente desconocida. Más recientemente, elegantes
experimentos de cristalografia con la RNA Pol de E. coli infectada revelaron que la pequeña
proteína codificada por este gen, llamada GP2, se une a un dominio de la porción NH2-
terminal de σ, taponando el canal de entrada al DNA formado por la “mandíbula” β’.
45
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
f) Con respecto a la función de GP2, ¿ud. cree que su existencia le resulta ventajosa al fago
como estrategia? ¿Por qué?
g) Se sabe que el virión del fago T7 no tiene ninguna enzima en su interior y que todos los
genes del fago T7 son transcriptos por la RNA Pol T7 menos uno, que es transcripto por la
RNA Pol bacteriana. ¿Cuál es?
PROBLEMA 5
En el proceso de traducción eucariótica, la subunidad menor del ribosoma (40S) reconoce
al “cap” del mRNA y rápidamente lo “escanea” de 5’ a 3’ hasta encontrar el primer AUG.
Entonces se acopla la subunidad mayor (60S) y el ribosoma empieza a traducir leyendo
nucleótidos de a 3 (tripletes o codones). En su camino, el ribosoma desplaza toda proteína
que se encuentre unida al mRNA. Para estudiar este proceso se construyó un plásmido de
expresión en células eucariotas, cuyo inserto se muestra en la Fig. 1.
El polipéptido codificado por el gen de la Fig. 1 no tiene una función relevante a los fines del
problema. Lo que importa es que al gen de la figura se le han incorporado artificialmente
por ingeniería genética dos secuencias (esquematizadas en rayado y en negro),
provenientes de genomas de bacteriófagos, es decir, que no existen en ningún mRNA
celular ni procariota ni eucariota. La presencia de estas secuencias le confiere al RNA
codificado por este gen la propiedad de unirse a proteínas fluorescentes de distinto color.
La secuencia rayada es capaz de unirse específicamente a una proteína fluorescente
verde (PFV) y la secuencia negra es capaz de unirse específicamente a una proteína
fluorescente roja (PFR). La emisión de luz de color (fluorescencia) de cada una de éstas sólo
se observa cuando están unidas a la secuencia de RNA correspondiente. Cuando PFV y PFR
están unidas a sus respectivas secuencias blanco en la misma molécula de mRNA, en lugar
de sólo verde o sólo rojo, se observa una fluorescencia de color amarillo, resultante de la
combinación de ambas fluorescencias (Fig. 2).
La transcripción del gen de la Fig. 1 está bajo el control del enhancer del gen de la α1
antitripsina, una proteína que se expresa sólo en células hepáticas.
46
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) Cuando se transfecta la línea hepática con el plásmido de la Fig. 1, se observa una
fuerte fluorescencia amarilla en el núcleo y una marcada fluorescencia roja en el
citoplasma (Tabla 1, experimento 1). En cambio, si se tratan las células con el inhibidor de la
traducción cicloheximida, sólo se observa fluorescencia amarilla tanto en el núcleo como
en el citoplasma (Tabla 1, experimento 2). Explique el porqué de ambos resultados.
b) Complete la Tabla 1 y justifique sus respuestas para cada uno de los tratamientos de los
experimentos 3 al 6 (los experimentos 1 y 2 ya fueron explicados en la pregunta anterior). En
todos los casos las células hepáticas que expresan PFV y PFR fueron transfectadas con el
plásmido de la Fig. 1.
Fluorescencia en Fluorescencia en
Exp. Tratamiento núcleo citoplasma
SÍ/No Color SÍ/No Color
1 Ninguno sí amarillo sí rojo
2 Agregado de cicloheximida (inhibe traducción) sí amarillo sí amarillo
3 Agregado de actinomicina D (inhibe
transcripción)
4 Co-transfección con un plásmido que expresa un
tRNA supresor cuyo anticodón es 3’ AUC 5’
5 Co-transfección con un plásmido que expresa
microRNA (miRNA) que se aparea a una
secuencia de la región 3’ no codificante del
mRNA de PFR e inhibe totalmente su traducción.
6 Co-transfección con un plásmido que expresa un
factor de splicing que provoca la exclusión total
del exón 3 del mRNA maduro.
Tabla 1
47
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 6
Además de los RNAs mensajeros (mRNAs), de transferencia (tRNAs) y ribosomales (rRNAs), las
células eucariotas producen otros tipos de RNAs que tienen diversas funciones regulatorias.
Éstos incluyen micro RNAs (miRNAs), RNAs largos no codificantes (lncRNAs), RNAs pequeños
interferentes (siRNAs), RNA de la telomerasa (TERC), RNA 7S y RNAs circulares (circRNAs).
Los miRNAs son RNAs de doble cadena cortos (de 20 a 22 pares de bases de longitud)
producidos por la transcripción de ciertos genes nucleares que dan un transcripto largo que
adopta estructura secundaria por apareamiento interno y es luego procesado por diversas
ribonucleasas específicas hasta dar lugar al miRNA maduro en el citoplasma. Los miRNAs se
caracterizan porque sus dos hebras no son 100% complementarias sino que presentan una o
dos bases desapareadas (“mismatches”) en su interior. Su mecanismo de acción comienza
con la separación de las dos hebras en el citoplasma. Una de ellas, llamada “pasajera” es
degradada, en tanto que la otra, llamada “guía”, se asocia a una proteína conocida como
argonauta (AGO). El complejo AGO-hebra guía del miRNA reconoce, por apareamiento de
bases con la guía, secuencias blanco localizadas en la región 3’ no traducida (3’UTR) de
mRNAs específicos, lo cual provoca la degradación de estos mRNAs o la inhibición de su
traducción. Cualquiera de los dos procesos hará que haya menos proteína traducida a
partir de ese mRNA. Por lo tanto, los miRNAs funcionan inhibiendo la fabricación de
proteínas específicas de la célula. Más recientemente se descubrieron RNA circulares
(circRNAs) covalentemente cerrados. Éstos son generados a partir de transcriptos por un
mecanismo de splicing alternativo no convencional (splicing hacia atrás o back-splicing)
catalizado por spliceosoma. Algunos circRNAs llevan secuencias “blanco” para los miRNAs,
es decir, complementarias a las de las hebras guía. De este modo, pueden secuestrar los
miRNAs, impidiendo que actúen sobre los mRNAs. Este efecto ha hecho que a estos
circRNAs se los conozca con el nombre de “esponjas”, porque se “chupan” o absorben a
los miRNAs.
La “cancigerina” es una proteína de membrana sobreexpresada en células cancerosas que
actúa como receptor de factores de crecimiento que estimulan la proliferación celular. Las
células normales expresan muy poca cancigerina en sus membranas y, por lo tanto, no
proliferan. El gen de la cancigerina tiene 4 exones, encontrándose el AUG en el primer exón
y el codón STOP de la traducción UAA en el cuarto exón, dejando una región 3’ no
traducida de 600 nucleótidos de longitud. Esta región 3’UTR tiene secuencias “blanco” para
un mircro RNA específico, el miRNA199. Además, el pre-mRNA de cancigerina sufre splicing
alternativo, dando 2 variantes de mRNA maduro, una que incluye y otra que excluye el
exón 3.
Se realizaron experimentos de Northern y de Western blot de distintas líneas celulares para
analizar la expresión de cancigerina a nivel del mRNA y de la proteína.
48
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
En todas las líneas analizadas los niveles de transcripción del gen de la cancigerina son
iguales. Las líneas A y C no expresan el miRNA199, en tanto que las líneas B y D expresan
grandes cantidades del miRNA199. Las líneas C y D expresan grandes cantidades de un
circRNA “esponja” para miRNA199, en tanto que la línea B no expresa nada de este circRNA
esponja.
a) Interprete los resultados de cada calle del Northern y del Western. No los describa,
describa el mecanismo por el cual se ven o no se ven bandas de cancigerina.
b) ¿Por qué se ven dos bandas de mRNA y dos de proteína para la cancigerina?
c) ¿Por qué en la línea celular B desaparecen las dos bandas, tanto en el Northern como en
el Western, y no sólo una de ellas?
d) ¿Para qué se detectaron el mRNA y la proteína de actina?
e) ¿Cuál/es de las 4 líneas celulares será/n cancerosa/s y cuál/es será/n normal/es?
f) Dibuje el Northern y el Western que habría obtenido si el miRNA199 provocara únicamente
la inhibición de la traducción del mRNA de cancigerina.
PROBLEMA 7
El gen Bdf codifica la proteína BDF, un factor de transcripción que controla la transcripción
de diversos genes involucrados en la diferenciación del tejido óseo en los vertebrados. La
Figura 1 muestra que la transcripción del gen Bdf es "despertada" por la unión de otro factor
de transcripción, la proteína BAF, a un enhancer que está presente en la región promotora
del gen Bdf. El transcripto primario del gen Bdf puede ser procesado por "splicing" alternativo
generando 2 mRNAs distintos, uno con y otro sin el exón 3. Nunca los dos tipos de mRNAs se
dan simultáneamente en el mismo tipo celular o tejido. Uno de los dos mRNAs da
polipéptidos de BDF activos y el otro no. La inclusión del exón 3 en el mRNA es provocada
por la unión específica de la proteína SF2 (factor de splicing alternativo) a una secuencia
de 9 bases presente en el exón 3 del transcripto primario.
49
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) Ubique la señal y el sitio de corte y poliadenilación, y la TATA box en las regiones que
corresponda en los esquemas del gen, del transcripto primario y de los mRNAs de la Figura 1.
b) Defina secuencia palindrómica. ¿Cuáles de los elementos nombrados en el gen Bdf en la
Figura 1 generalmente corresponden a secuencias palindrómicas?
c) ¿Cuántas bandas de hibridación y de qué tamaño en pares de bases (pb) se observaría
en un Southern de DNA genómico humano digerido simultáneamente con las enzimas de
restricción BamHI y HindIII, en dos experimentos distintos: uno hibridado con una sonda
correspondiente al exón 2 y otro hibridado con una sonda correspondiente al exón 4? Si lo
considera necesario ayúdese con esquemas.
Se analizó la expresión del gen Bdf en 3 tejidos humanos (sangre, hueso en desarrollo e
hígado) mediante las técnicas de Northern y Western (Figura 2). En el Northern, se corrieron
RNAs de los 3 tejidos mencionados en 3 calles separadas en geles de agarosa, transferidos e
hibridados con una sonda correspondiente al exón 2. En el Western, se corrieron proteínas
de los 3 tejidos mencionados en geles de poliacrilamida con SDS, sin y con pre-tratamiento
con β-mercaptoetanol (β-MSH), transferidas y reveladas por un anticuerpo contra la porción
de la proteína BDF codificada por el exón 2.
50
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
k) Dos mutaciones distintas en el medio del exón 3 provocan el mismo fenotipo: la ausencia
de actividad de la proteína BDF. ¿Por qué mecanismo actúa cada una de ellas?
PROBLEMA 8
La pérdida de extremidades ha ocurrido en diversas líneas evolutivas de los animales. En los
reptiles, por ejemplo, se sabe que las serpientes evolucionaron a partir de ancestros con
cuatro patas. Lo mismo ocurrió en los mamíferos, donde los cetáceos (ballenas y delfines)
provienen de ancestros cuadrúpedos. En este contexto resulta importante saber si la
pérdida o reducción de extremidades fue un proceso gradual o abrupto y cuáles fueron los
genes responsables de la misma. Un modelo muy valioso para estudiar este problema lo
constituyen los "espinosos", que son peces de la especie Gasterosteus aculeatus. En los
peces en general, los dos pares de aletas (anteriores y posteriores) son los equivalentes de
las patas de los otros vertebrados. En los espinosos marinos, el par de aletas posteriores
(llamadas también aletas pélvicas) se presenta como dos espinas punzantes (Fig. 1, arriba).
Sin embargo, los espinosos de agua dulce carecen de las dos espinas pélvicas o las tienen
muy reducidas (Fig. 1, abajo).
51
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) ¿Cuál es la longitud en nucleótidos del mRNA maduro del gen Pitx1?
b) ¿Qué fenómenos ocurren en cada una de las dos posiciones numeradas como +1 y
+3362?
c) ¿Entre el +1 y qué posición como máximo podría estar situado el ATG iniciador de la
traducción del gen Pitx1?
d) Indique si se obtiene producto de PCR y en caso afirmativo de qué tamaño (longitud en
pares de bases) en los siguientes experimentos:
i) Primers 1 y 2 usando como molde DNA genómico de espinoso
ii) Primers 1 y 3 usando como molde DNA genómico de espinoso
iii) Primers 2 y 3 usando como molde DNA genómico de espinoso
iv) Primers 1 y 2 usando como molde cDNA de espinoso marino
v) Primers 1 y 3 usando como molde cDNA de espinoso marino
vi) Primers 2 y 3 usando como molde cDNA de espinoso marino
e) ¿Qué función cumplirá la proteína codificada por el gen Pitx1?
f) En ratones existe un homólogo del gen Pitx1 de peces. El gen se expresa en diversas partes
del cuerpo incluyendo la pelvis. El knockout homocigota de este gen produce severas
alteraciones en diversas partes del cuerpo de las crías que les provocan una muerte
prematura. Entre las alteraciones mencionadas figura una reducción del tamaño de sus
extremidades posteriores. Teniendo en cuenta lo que pasa en ratones, el hecho de que las
52
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
secuencias de los cDNAs de Pitx1 de espinosos marinos y de agua dulce son idénticas y los
resultados de la Figura 3, ¿qué mutación del gen Pitx1 podría haber causado la pérdida de
espinas en los espinosos de agua dulce y cómo alteraría su expresión?
g) Si se comprobara que ninguna región del gen Pitx1 se encontrara mutada en los
espinosos de agua dulce, ¿qué otro gen podría estar mutado y así causar la pérdida de
espinas?
h) ¿Por qué la diferencia genética en los espinosos de agua dulce no causa otras
alteraciones corporales y su muerte prematura, a diferencia de lo que ocurre con el
knockout de Pitx1 en ratones?
i) Los lagos post-glaciales en los que se generaron los espinosos sin espinas son muy recientes
en términos geológicos. ¿Es este hecho consistente o contradictorio con los datos del paper
de Nature?
j) La presencia de espinas pélvicas en los espinosos marinos parece ser una adaptación
defensiva contra peces predadores de estructuras bucales blandas. La ausencia de espinas
pélvicas en espinosos de agua dulce parece ser una adaptación defensiva contra
invertebrados predadores que atrapan más eficientemente a los espinosos con espinas
pélvicas agarrándose de las mismas.
53
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMAS INTEGRATORIOS
DE EJERCITACIÓN PARA EL PRIMER PARCIAL
PROBLEMA 1
En la retina del ojo de los humanos existen dos tipos de células: los bastones y los conos. Los
bastones expresan específicamente una proteína llamada rodopsina, la cual posibilita la
visión en general. En cuanto a los conos, existen tres tipos celulares diferentes: los conos
“azules”, los “rojos” y los “verdes”, expresando específica y exclusivamente cada uno de
éstos las proteínas conocidas como pigmentos visuales “azul”, “rojo” y “verde”
respectivamente. Estos pigmentos son capaces de captar luz de los colores indicados por
su nombre y el funcionamiento conjunto de los tres tipos de conos da por resultado la visión
policromática.
El gen del pigmento azul (gen A) se encuentra localizado en el cromosoma humano N° 7.
En cambio, los genes de los pigmentos rojo (gen R) y verde (gen V) se encuentran uno al
lado del otro (o sea, en tandem) en el cromosoma sexual X, no habiendo contraparte en el
cromosoma Y.
Cada uno de estos dos genes tiene su propio promotor y región regulatoria de la
transcripción, y se transcriben de manera específica, es decir, el gen R sólo en los conos
“rojos” y el gen V sólo en los conos “verdes”.
Los genes R y V tienen secuencias nucleotídicas muy similares (98% de similitud), a tal punto
que muchos sitios para enzimas de restricción se encuentran conservados en ambos genes.
La Figura 2 muestra una estructura más detallada de ellos.
54
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Se utilizó como sonda a un clon de cDNA que contiene sólo los exones 1 y 2 del gen
“verde”, marcado con 32P por “nick translation”. Esta sonda reconoce a ambos genes, aún
en condiciones de alta rigurosidad de hibridación (baja sal).
b) ¿Es el experimento anterior útil para determinar los genotipos de las cuatro personas?
Justifique.
c) Dibuje las bandas de Southern que hubiera obtenido de los mismos pacientes si en lugar
de usar la sonda indicada se hubiera usado como sonda sólo al exón 5. ¿Hubiera sido este
análisis tan informativo como el de la pregunta a)? Justifique.
d) Una manera más rápida de efectuar el análisis de los cuatro individuos es realizando una
PCR con “primers” específicos para el gen “verde” que se aparean a zonas de sus exones 4
y 5, según se ve en la Figura 3. Estos primers no se aparean con las secuencias de los exones
4 y 5 del gen “rojo”:
Diga si detecta o no productos de PCR y de qué tamaño para cada uno de los cuatro
individuos, habiendo usado como molde DNA genómico de sangre.
e) ¿Qué productos de PCR y de qué tamaño habría obtenido en cada uno de los individuos
si hubiera usado como molde cDNA total obtenido de retina?
f) ¿Con cuál de las dos hebras (codificante o no codificante) se aparea el primer izquierdo?
¿Y el derecho?
g) La deleción de la región del cromosoma X marcada como LCR en la figura 1 provoca
una fuerte disminución de la transcripción de ambos genes R y V. ¿Qué función le atribuiría
Ud. a la región LCR? ¿Qué motivos de dominio esperaría Ud. encontrar en las proteínas que
se unan a la región LCR? Justifique.
h) ¿Qué fenotipo esperaría Ud. encontrar en un animal (cuyo mecanismo de visión
policromática normal fuera similar al de los humanos) en el cual se haya introducido un
transgén que llevara la región promotora del gen “rojo” incluyendo el LCR, colocada “río
arriba” del gen de la toxina diftérica, una proteína que mata sólo a las células donde se
fabrica.
i) ¿Qué colores percibirán los humanos R-V- y los humanos que tienen delecionado el LCR?
55
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 2
Primera parte
El factor de transcripción trimerina, que se fabrica sólo en células de la glándula mamaria,
es producto de un gen maestro que determina la diferenciación de la glándula y activa la
transcripción de los genes que producen proteínas de la leche. La Figura 1 muestra la
estructura del gen de la trimerina de ratón. El mRNA de este gen presenta splicing
alternativo de su exón 3, que codifica para el dominio de transactivación de este factor de
transcripción. En condiciones normales, en cada célula de la glándula mamaria se
producen cantidades suficientes de los 2 mRNAs: el que incluye al exón 3 y el que lo
excluye.
Preguntas:
a) ¿El sitio marcado con un signo de interrogación en la Figura 1 es donde termina la
transcripción? Justifique brevemente.
b) i) Dibuje las bandas y asigne la longitud de los mRNAs en nucleótidos en un experimento
de Northern donde RNA total de glándula mamaria de ratón es hibridado con una sonda
correspondiente al exón 1 del gen de trimerina, sabiendo que la subunidad α es 10.000
Daltons más pesada que la β.
ii) Dibuje las bandas que observaría si hubiera usado como sonda al exón 3.
c) ¿Cuál será la longitud del transcripto primario del gen de trimerina? ¿La especie
molecular llamada “transcripto primario” existe realmente? Justifique.
d) ¿Está bien llamar exón al exón 1 si bien éste no codifica ninguna porción de la proteína
trimerina? Justifique.
e) Dibuje las bandas y asigne el PM en kilodaltons en un experimento de Western (gel de
poliacrilamida con SDS, una calle con y otra sin mercaptoetanol) donde proteínas de
glándula mamaria de ratón son reveladas con un anticuerpo que reconoce la secuencia
56
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Segunda parte
En un intento por disminuir el consumo de bebidas alcohólicas por parte de los jóvenes en
los boliches, el gobierno de Vacalandia quiere promover el consumo de leche. Para ello, ha
contratado a la empresa biotecnológica “Greenmuuuu” para que genere vacas
transgénicas que fabriquen una leche que se vea verde fluorescente cuando es iluminada
por luz negra (luz de 400 nm de longitud de onda, cercana al ultravioleta), justamente el
tipo de iluminación que se usa para bailar en los boliches, suponiendo que la leche verde
fluorescente resultará tan atractiva y divertida para los jóvenes que la preferirán en lugar del
alcohol.
Para lograr su cometido, la empresa obtuvo vacas transgénicas usando un plásmido en el
cual el cDNA del gen GFP fue colocado río abajo del promotor y enhancer del gen de la
quesina de vaca, un gen que sólo se expresa en glándula mamaria (Figura 3).
57
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 3
Transmitido por el mosquito Aedes aegypti, el virus del dengue es el agente causal de la
llamada “fiebre dengue”, enfermedad que ha reaparecido recientemente en forma
preocupante en diversas regiones tropicales del mundo y también en nuestro país, sobre
todo en la provincia del Chaco. Un síntoma que suele producir en los casos severos es
hemorragia debido a una exagerada respuesta de las células del sistema inmune
infectadas, lo cual provoca muerte de células de los vasos sanguíneos.
El virus, de la misma familia del de la fiebre amarilla, tiene como genoma una única
molécula de RNA de cadena simple, de 10,7 kilobases (kb) y no contiene ni codifica
transcriptasa reversa. Este genoma codifica para 10 polipéptidos virales, todos de diferente
estructura primaria. Tres de estos polipéptidos, llamados estructurales, forman parte, junto al
RNA, de la partícula viral o virión. Los 7 polipéptidos restantes (llamados NS1, NS2a, NS2b,
NS3, NS4a, NS4b y NS5) no forman parte de los viriones, pero tienen diversas actividades
enzimáticas, algunas importantes para la replicación del virus en la célula infectada. NS5 es
la polimerasa encargada de replicar al genoma viral y fabricar mRNA a partir del mismo.
Preguntas:
a) Marque en las siguientes opciones qué tipo de polimerasa será NS5 y justifique su opción:
i) DNA polimerasa DNA dependiente
ii) RNA polimerasa DNA dependiente
iii) RNA polimerasa RNA dependiente
iv) DNA polimerasa RNA dependiente
b) ¿Necesitará la polimerasa viral NS5 un “primer” para funcionar? Justifique.
c) ¿Tendrá esta polimerasa actividad de "proofreading" o lectura de pruebas (3’-5’
exonucleasa)?
Analizando la secuencia del mRNA de una de las variedades argentinas se observó que a
partir del primer codón AUG en adelante, no hay ningún codón stop de la traducción (UAA,
UAG o UGA) hasta el codón número 3.393 (UAA), localizado muy cerca del extremo 3’ del
mRNA. Este mRNA da origen a los 10 tipos de proteínas diferentes codificadas por el virus
arriba mencionados.
d) Sabiendo que el genoma de dengue no tiene intrones y que tiene un solo marco de
lectura abierto, ¿qué mecanismo puede explicar la aparición de 10 polipéptidos diferentes?
e) Uno solo de los 10 polipéptidos tiene metionina como primer aminoácido, ¿cuál es?
f) NS3 tiene actividad de helicasa de RNA de cadena doble y también de proteasa. ¿En
qué ayudarán estas dos actividades de NS3 al proceso de replicación del virus?
g) No habiendo vacuna disponible por el momento, las/os investigadoras/es están tratando
de desarrollar drogas que inhiban específicamente a la polimerasa viral. Se piensa que este
tipo de drogas no afectaría a las células no infectadas del paciente, con lo cual no tendría
efectos secundarios perjudiciales. ¿Por qué tales drogas no afectarían:
i) la duplicación del DNA?
ii) la transcripción de los genes celulares?
iii) el alargamiento de los telómeros de los cromosomas celulares?
58
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 4
Un cultivo de células de embrión de pollo (cultivo normal) produce grandes cantidades de
la proteína X. Cuando estas células en cultivo son infectadas con el virus de sarcoma
(cultivo infectado) las células no mueren, pero en ellas ya no se detecta actividad biológica
de la proteína X. Por otra parte, existe un tipo de células de embrión de pollo que no
presenta actividad biológica de la proteína X en ninguna condición (cultivo mutante). Se
dispone de un clon de cDNA de la proteína X y de anticuerpos anti-proteína X (que
reconocen a la proteína X tanto nativa como desnaturalizada). Estos reactivos son utilizados
como “sondas” en los siguientes experimentos de Southern, Northern y Western:
Complete los lugares donde haya puntos suspensivos y responda cada pregunta:
a) Sabiendo que el clon de cDNA usado como sonda no posee sitios para la enzima PvuII y
que existe un solo gen para la proteína (2 alelos) por genoma, ¿qué indica la presencia de 3
bandas de hibridación en los carriles a y b del experimento de Southern?
b) ¿A qué nivel está afectada la actividad de la proteína X en el cultivo infectado?
c) ¿Y en el cultivo mutante?
d) ¿Qué conclusiones le sugiere la existencia de 2 bandas de hibridación en los carriles A y B
del experimento de Northern?
e) El mRNA más largo de la proteína X es de 6 kb. Este mRNA daría una proteína de a lo
sumo .............. aminoácidos. El peso promedio de cada residuo aminoacídico es 110
Daltons, por lo tanto el polipéptido más grande de la proteína X debería pesar .............
Daltons. ¿Cómo se explica que la banda más grande en el Western presente un PM
aparente mayor (300.000 Daltons)?
59
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 5
Se utilizó la construcción de la Figura 1 para obtener ratones transgénicos. En dicha
construcción se clonaron el gen de la alternatina (proteína de nombre imaginario) de ratón,
bajo las órdenes del promotor y región regulatoria del gen de la antitripsina y el cDNA de la
proteína SF2 de ratón, bajo las órdenes del promotor y región regulatoria del gen de la
metalotioneína. Ambas unidades transcripcionales fueron separadas por un segmento de
DNA "nexo" que no codifica para nada ni tiene actividad regulatoria de la transcripción.
Preguntas:
a) ¿Qué longitud (en nucleótidos) tienen el transcripto primario y los 2 mRNAs maduros de
"alternatina" que se producen por "splicing" alternativo del exón 2?
b) ¿Qué peso molecular tienen los 2 polipéptidos de "alternatina", sabiendo que las regiones
5' y 3' no codificantes de su gen son de 100 y 70 pb respectivamente? PM 1 aa = 110 Da.
c) ¿Qué peso molecular tiene la proteína SF2 sabiendo que las regiones 5' y 3' no
codificantes de su gen son de 50 y 110 pb respectivamente?
d) Para identificar cuáles de las crías eran transgénicas se preparó DNA genómico de las
colas de los ratoncitos, se lo digirió con la enzima de restricción Eco RI, y se lo sometió a la
técnica de Southern, usando como sondas de hibridación o bien al intrón 1, o bien al intrón
2 del gen de "alternatina".
i) ¿Qué resultados habría esperado (número de bandas y tamaño) sabiendo que río
abajo del gen endógeno de "alternatina" las secuencias del cromosoma de ratón no
tienen nada que ver con lo que se encuentra río abajo de dicho gen en la
construcción de la figura?
ii) ¿Cuál de las 2 sondas es informativa para saber qué ratones son transgénicos y cuáles
no? Justifique.
e) En aquellas condiciones y tejidos del transgénico en que ambos promotores están
encendidos, la construcción de la Figura 1 produce 3 tipos de mRNAs: los 2 de "alternatina" y
60
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
61
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 6
En un filtro de nitrocelulosa como el de la Figura 1 se depositaron 24 clones genómicos
distintos conocidos (es decir, se sabe exactamente a qué gen corresponde cada uno) en
forma de manchas circulares ordenadas en una matriz A1, A2,...; B1, B2,...; etc. Todos los
clones habían sido obtenidos con el mismo vector plasmídico y los 24 insertos corresponden
a 24 genes humanos diferentes.
El DNA depositado en las manchas fue inmovilizado y desnaturalizado por tratamiento del
filtro con NaOH 0,5 N. Luego el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una sonda
radiactiva correspondiente al DNA del vector plasmídico solo, lavado en condiciones
rigurosas y expuesto a una película radiográfica, obteniéndose el resultado de la Figura 2.
Esta técnica se llama "dot blot".
Una vez obtenido el resultado, el filtro fue tratado con agua destilada a 100ºC durante 10
minutos, tratamiento (llamado "strip off") que despega y lava la sonda radiactiva hibridada
pero no despega a los DNAs de los clones que habían sido inmovilizados en el filtro. Luego el
filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una preparación de RNA mensajeros de
hígado humano marcados radiactivamente, y luego del lavado y autorradiografía se
obtuvo el resultado de la Figura 3.
Por último, se realizó un nuevo "strip off" y el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con
una preparación de RNA mensajeros de páncreas humano marcados radiactivamente y,
luego del lavado y autorradiografía, se obtuvo el resultado de la Figura 4.
Preguntas:
a) ¿Cuál es la causa de que en la Figura 2 todas las manchas den hibridación positiva?
b) ¿Cuáles de los 24 genes:
i) se expresan solamente en hígado?
ii) se expresan solamente en páncreas?
iii) se expresan en ambos órganos?
iv) no se expresan en ninguno de los dos órganos?
c) Si unos de los clones llevara por inserto al gen de la insulina humana, ¿qué señal esperaría
62
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Busque información periodística, de divulgación científica o en la web sobre los "DNA chips",
también llamados "DNA microarrays" y discuta su importancia.
PROBLEMA 7
En las plantas la luz controla la expresión de muchos genes involucrados en procesos
importantes como el crecimiento, y la formación de flores y frutos. La molécula encargada
de transferir la señal luminosa a estos efectos biológicos es una holoproteína llamada
fitocromo. El fitocromo está constituido por una porción proteica (apofitocromo, de 240.000
Daltons de peso molecular nativo) unido a un grupo prostético no proteico (tetrapirrol) de
bajo peso molecular. Existen dos formas del fitocromo, una llamada Pfr y otra llamada Pr. La
conformación del apofitocromo es idéntica en las dos formas. Lo que las distingue es una
distinta conformación del grupo prostético. La secuencia aminoacídica del apofitocromo
no presenta motivos tipo cierre de leucinas, dedos de zinc o hélice-vuelta-hélice.
En la oscuridad, las moléculas de fitocromo se encuentran como Pr. Si se iluminan las plantas
con luz roja, ésta es absorbida por el grupo prostético, el cual cambia de conformación y el
fitocromo se vuelve Pfr.
Preguntas:
a) Conociendo el PM nativo del apofitocromo (ver enunciado) y sabiendo que el mRNA del
apofitocromo es de 4000 bases, que su región 5’ no codificante es de 50 bases y que su
región 3’ no codificante es de 350 bases (incluyendo al codón “stop”), ¿cuál es la estructura
cuaternaria del apofitocromo? Para facilitar los cálculos considere el PM de 1 aminoácido =
100 Daltons.
Con el fin de averiguar cuál es el mecanismo por el cual el fitocromo controla la expresión
de los genes vegetales se realizaron los siguientes experimentos:
63
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Se comprobó que la proteína PIF es capaz de unirse al enhancer (DNA doble cadena)
5’CACGTG3’. Buscando genes que tuvieran este enhancer en su región promotora se
encontró al gen que codifica para una proteína llamada MYB. MYB es una proteína
dimérica cuyos polipéptidos tienen un motivo estructural tipo hélice-vuelta-hélice. La figura
muestra un esquema del gen que codifica para MYB.
Se realizaron Northerns de RNA de una planta normal (I) y 3 plantas mutantes (II, III y IV),
previamente sometidas a oscuridad o a luz roja. En la hibridación se usó una mezcla de
sondas para los mRNAs de MYB y de la proteína de expresión constitutiva actina. La
mutante II es homocigota para un codón “stop” prematuro en el gen de PIF. La información
para las mutantes III y IV se traspapeló, pero se sabe que una es una mutante homocigota
que sólo fabrica la conformación Pfr del fitocromo (no puede cambiar a Pr), mientras la otra
es una mutante homocigota para una deleción de la TATA box del gen MYB.
64
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
65
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
1) El inglés
66
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
67
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
RECOMENDACIONES:
- No lea una traducción hecha por otro. Se desvirtuaría el objetivo del T.P.
- Dé una primera leída al paper. Ubique las palabras o frases que no entiende. Trate de
ayudarse con el glosario de esta guía y con el diccionario.
- En un principio pase por alto todo aquello que le parezca incomprensible y tome ventaja
reafirmando todo aquello que le resulte fácil entender. En lecturas sucesivas se aclararán las
porciones originalmente incomprensibles.
- No se detenga en los detalles técnicos de la sección de Procedimientos Experimentales.
Para nuestros fines es mucho más importante la interpretación de los resultados.
5) Cuestionario.
6) Glosario:
Phage: fago
λ PL promoter: promotor de la transcripción del fago lambda (left).
To target: apuntar, dirigir a.
Translation: traducción.
Template: molde.
To anneal: en este caso, re-hibridar.
Temperature sensitive represor: Proteína represora (represor) del promotor que funciona
(reprime) a 30ºC, pero deja de funcionar (no reprime) a 42ºC.
Media: medios de cultivo. Singular: medium.
To transfect: transfectar; en este caso, sinónimo de transformar.
To sonicate: sonicar, romper las bacterias con ultrasonido.
To prevent: prevenir, impedir.
To titrate: titular, como en la titulación de una solución.
To encompass: abarcar.
Feasible: factible.
68
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
SIDNEY PESTKA, BRUCE L. DAUGHERTY, VINCENT JUNG, KUNIMOTO HOTTA, AND ROBERT K. PESTKA
Roche Instituteof MolecularBiology, Roche ResearchCenter,Nutley, NJ 07110
ABSTRACT A plasmid was constructed to generate RNA the mRNA transcribed upon induction of this operon is poly-
complementary to the i-galactosidase mRNA under control of cistronic, it would be possible to determine the extent of po-
the phage X PL promoter. When this anti-mRNA was pro- larity of the inhibition of translation if RNA complementary
duced, synthesis of P-galactosidase was dramatically inhibited only to the lacZ (/P-galactosidase) coding sequence was used
(98%). Syntheses of galactoside permease and transacetylase, as the anti-mRNA.
whose coding sequences are downstream of the f3-galactosidase An 831-base-pair DNA fragment of the lactose operon,
coding region, are inhibited to a lesser degree, 80% and 55%, cloned in phage M13mp7 (6), was the source of a DNA frag-
respectively. The generation of anti-mRNA that can be target- ment containing the sequence coding for the NH2 terminus
ed to inhibit a single species of mRNA molecule within cells of/3-galactosidase. This fragment was isolated and placed in
provides a potent mechanism by which specific transcripts can reverse orientation under control of the phage X PL promot-
be translationally inactivated. This can be used to determine er. The gene coding for a temperature-sensitive repressor of
the function of proteins as well as to select cloned genes in a PL, CIts, is carried on a compatible plasmid pRK248cIts (7-
single rapid and convenient step. 9). Thus, at 30?C, no anti-mRNA would be made, but at 42?C
anti-mRNA would be synthesized extensively. On hybridiz-
Inhibition of translation has been efficiently carried out by ing with the mRNA, the anti-mRNA would block translation
antibiotics and other inhibitors of protein synthesis (1). In of the message for /3-galactosidase highly specifically, acting
specific instances, physiological mechanisms have been ma- as a precisely directed anti-mRNA "missile."
nipulated to turn on or off genes such as the lac operon of
Escherichia coli grown in the presence or absence, respec- EXPERIMENTAL PROCEDURES
tively, of a /-galactoside (see ref. 2). However, no general Media, Enzymes, and Electrophoresis. M9 medium consist-
method has been described to block the translation of a spe- ed of 50 mM Na2HPO4, 28 mM KH2PO4, 8.5 mM NaCl, 19
cific mRNA molecule. mM NH4CI, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 0.4% Casamino
It has been known that RNA with substantial structure, acids, 1% glycerol, and thiarnin at 2 ptg/ml. Restriction endo-
such as double-stranded RNA, serves as a poor template for nucleases were obtained from Bethesda Research Labora-
protein synthesis (1, 3). Knowledge of this has been used tories. T4 DNA ligase was obtained from Amersham. Aga-
effectively to block translation in cell-free extracts. In vitro, rose gel electrophoresis was performed according to the pro-
hybrid-arrested translation has been reported to prevent the cedures of Sharp et al. (10). Fragments were isolated from
synthesis of specific proteins (4, 5) and has been used to de- the gels by the method of Schmitt and Cohen (11).
tect recombinant DNA molecules containing sequences Construction of Plasmids. Phage M13mp7 was used to iso-
complementary to a given mRNA. The procedures of hy- late a BamHI/Cla I fragment containing some of the se-
brid-arrested translation involve DNA RNA hybridization, quence coding for the NH2-terminal region of 8-galacto-
wherein the double-stranded DNA is denatured by heating sidase, beginning at amino acid 6 (Fig. 1). The plasmid
and annealed with a population of mRNA molecules. Hy- pRC23, which contains the phage A PL promoter, was cut
bridization of DNA to the mRNA effectively blocked trans- with restriction endonucleases Cla I and BamHI. The large
lation of these mRNA molecules that formed hybrids. Cla I/BamHI fragment from the plasmid was isolated and
To develop a method to block the translation of specific ligated to the small BamHI/Cla I fragment containing part of
mRNA molecules in intact cells, we postulated that RNA the lacZ as described above (Fig. 1). Ligations were per-
complementary to mRNA would also effectively block formed in 66 mM Tris-HCl, pH 7.5/5 mM MgCl2/5 mM di-
translation if RNA RNA hybridization would occur readily thiothreitol/l mM ATP for 16 hr at 15?C. DNA concentra-
under physiological conditions within the cell. Because sin- tion was between 1 and 10 nM and phage T4 DNA ligase was
gle-stranded complementary RNA molecules can be readily used at 300 units/ml. The result was a plasmid, pBD4/lacZ'-
generated within cells by appropriate vectors, the hypothesis (rev), containing a lacZ gene fragment in reverse orientation
could be tested conveniently. The objective was to generate with respect to the PL promoter. This plasmid was transfect-
anti-mRNA intracellularly to block translation of specific ed into E. coli 294 harboring the compatible plasmid
proteins. The present communication describes the con- pRK248cIts containing the temperature-sensitive X repres-
struction and use of complementary RNA generated in vivo sor cIts (7-9). Little or no anti-mRNA would be synthesized
to block translation of only a single species of mRNA mole- at 30?C. At 42?C, anti-lacZ mRNA would be synthesized at
cules to which it can specifically hybridize. high levels.
Growth of Bacteria. E. coli 294(pRK248cIts) harboring
PRINCIPLE OF THE PROCEDURE pRC23 or pBD4/lacZ'(rev) was grown in 10 ml of M9 medi-
Because the lac operon of E. coli is well understood, it was um containing 1% glycerol overnight at 30?C. To start the
chosen as the focus of these initial studies. In addition, since experiment, two flasks containing 150 ml of fresh M9 medi-
um (1% glycerol) were inoculated with the E. coli containing
Thepublicationcosts of thisarticleweredefrayedin partby pagecharge pRC23 and another two flasks containing the same medium
payment.Thisarticlemustthereforebe herebymarked"advertisement"
in accordancewith 18 U.S.C. ?1734solely to indicatethis fact. Abbreviation:IPTG, isopropyl/3-D-thiogalactoside.
7525
69
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
7526 Genetics: Pestka et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984)
-
BomHI
Bgll EcoRt
C/oI 4
/> -BaomHI / '^c ^-C/ol
tPsI IM13mp7
pRC23
/loI
BomHI
? CloI
BomHI / BomHI
BomHI
JL
BomiI Clio
T4 DNALIGASE
~~II~~ ~VI
C/al
BarnHI
pB )4/ l
rev)
FIG. 1. Construction of pBD4/lacZ'(rev) from pRC23 and M13mp7. I )etailsare given in the text. The portionof the lacZ gene containedin
the BamHI/ClaI fragmentfrom M13mp7representsnucleotides19-440 of lacZ, with the initiatorAUG of the lacZ gene taken as position 1.
This fragment is designated lacZ'. Amp, ampicillin; Tet, tetracycline.
were inoculated with the E. coli containing pBD4/lacZ'- mM MgSO4 and resuspended in 0.2 ml of the same buffer. In
(rev). These were grown at 30?C until the optical density at each of four tubes, 50 ul of the bacterial suspension was add-
600 nm reached about 0.5. At this point, isopropyl /3-D-thio- ed, after which they were incubated at 26?C for 5 min. With a
galactoside (IPTG) was added to one flask of each of the Hamilton syringe, 2 /1 of 10 mM [14C]methyl/-D-thiogalac-
cultures to a final concentration of 1 mM. Aliquots of each of topyranoside (New England Nuclear; 22.5 mCi/ml; specific
the four cultures were removed and placed at 0?C at the activity 25.6 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq) was added to each of
starting time of induction (0 min). The cultures were then the four tubes for 0, 15, 30, and 60 sec. The reaction was
placed in a 42?C water bath and shaken vigorously. Aliquots stopped by the addition of 3.5 ml of 0.1 M potassium phos-
from each of the four cultures were taken at 15, 30, 60, 90, phate buffer, pH 5.5, containing 100 mM LiCl. The solution
and 120 min and placed at 0?C until assayed a short time was filtered on a 25-mm 0.45-pm Amicon filter (no. 041255)
later. and washed with 3.5 ml of the same solution. The radioactiv-
Enzyme Assays. Assays for 8-galactosidase, lactose per- ity on the filter was then measured in 10 ml of Bray's solu-
mease, transacetylase, and alkaline phosphatase were per- tion in a scintillation spectrometer.
formed as described (12-15). Enzyme concentrations were Assay of thiogalactoside transacetylase. Aliquots of bac-
determined from the linear portions of the curves in all cas- terial suspension were centrifuged at 10,000 x g for 5 min.
es. The specific procedures are given below. The pellets, resuspended in 250 ul of 50 mM Tris.HC1, pH
Assay off-galactosidase. /-Galactosidase was measured 7.8, were assayed for thiogalactoside transacetylase as re-
as described (12) with minor modifications. Samples of bac- ported (14). The suspensions were sonicated twice for 15 sec
terial cultures were diluted with Z buffer (50 mM sodium on ice. The extracts were heated at 70?Cfor 5 min and centri-
phosphate, pH 7.0/10 mM KCI/1 mM MgSO4/50 mM 2-mer- fuged in a Microfuge for 15'min. Each supernatant was trans-
captoethanol) into a total volume of 1.1 ml. Two drops of ferred to a fresh tube. The reaction was started by mixing 0.5
chloroform and one drop of 0.1% sodium dodecyl sulfate ml of a solution consisting of 50 mM Tris HCI at pH 7.8, 2
were added, after which tubes were swirled on a Vortex mix- mM EDTA, 1 mM 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), 0.1
er for 10 sec. The tubes were then placed in a water bath for mM acetyl-CoA, and 50 mM IPTG with 200 Al of the bacteri-
5 min at 30?C. A 1-ml sample was then added to a cuvette. al extracts. The solution was transferred to a cuvette, which
The reaction was started by adding 0.2 ml of o-nitrophenyl 3- was placed in a Beckman DU-8 spectrophotometer that was
D-galactoside (4 mg/ml) and mixed for a few seconds. The programmed to calculate changes in absorbance at 412 nm as
cuvette was then placed in a Beckman DU-8 spectrophotom- a function of time.
eter which was programmed to determine changes in absorb- Assay of alkaline phosphatase. Aliquots of bacterial sus-
ance at 420 nm per min. pensions were centrifuged at 10,000 x g for 5 min. The pel-
Assay of lac carrier protein. Lactose permease was as- lets were washed in 2 ml of 0.1 M Tris'HC1,pH 7.4. After
sayed as described (12, 13) with modifications as noted be- centrifugation, the pellets were resuspended in 2 ml of the
low. Aliquots of bacterial suspensions were centrifuged at same buffer. The assay consisted of mixing 0.5 ml of the
10,000 x g for 5 min. The pellets were washed with 2 ml of bacterial suspension with 1 ml of 1 M Tris.HCl, pH 8.8, and
0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 10 incubating at 37?C for 5 min. The reaction was started by the
70
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Genetics: Pestka et al. Proc. NatL Acad. Sci. USA 81 (1984) 7527
0
0
o 0.02 -a-
'c/
E 2-
0 E RevZ
z V RevZ + IPTG
-^
pRC23
addition of 0.5 ml of 0.04 M p-nitrophenyl phosphate and the thesis of lactose permease and thiogalactoside transacety-
mixture was incubated at 37?C. At 30, 60, and 120 min, 0.7 lase encoded by the same polycistronic message, these en-
ml was centrifuged in a Microfuge for 5 min and the superna- zymes were also assayed in the same series of cultures with
tant was transferred to a fresh tube. The absorbance at 420 and without induction with IPTG (Figs. 3 and 4). The per-
nm was measured in a spectrophotometer and the change per mease and transacetylase were induced concomitantly with
min was determined from the readings at different times. /3-galactosidase; however, their synthesis was not inhibited
as much as that of/3-galactosidase by anti-lacZ mRNA (Figs.
RESULTS 3 and 4; Table 1). Nevertheless, the same pattern of inhibi-
When E. coli 294 containing the parental plasmid pRC23 was tion was seen as with /-galactosidase. The synthesis of an
induced at 429C with IPTG, there was a rapid rise in synthe- enzyme, alkaline phosphatase, encoded by another mRNA
sis of /-galactosidase (Fig. 2). When E. coli 294 with the was not affected either by IPTG or by the anti-lacZ mRNA
plasmid containing the reverse orientation was induced, the (Fig. 5). Thus, in all cases, the presence of the plasmid con-
rise in 3-galactosidase synthesis on induction with IPTG was taining lacZ in the reverse orientation was sufficient to in-
essentially prevented. The higher uninduced level of/3-galac- hibit the synthesis of /3-galactosidase, permease, and trans-
tosidase in the presence of the plasmid carrying the lacZ acetylase.
fragment was due to titration of the lac repressor by the lacZ When induction of E. coli 294 containing plasmid pRC23
segment containing the secondary repressor binding site or pBD4/lacZ'(rev) was performed with IPTG at 30?C, /3-
(refs. 16 and 17; also see discussion below). In the absence of galactosidase in both cultures increased to about the same
IPTG, induction of the PL promoter at 42?C decreased the levels (data not shown). Under these conditions, there was
endogenous level of /3-galactosidase in E. coli 294/pBD4/ no inhibition of 8-galactosidase synthesis in E. coli 294 con-
lacZ'(rev). taining the plasmid pBD4/lacZ'(rev), as expected, since no
TQ determine if the anti-lacZ segment also prevented syn- reverse transcript is synthesized at 30?C, where the PL pro-
moter remains repressed.
' I 'I I
LACTOSEPERMEASE Table 1. Inductionof enzymes of lac operon in presence or
1000 absence of reverse lacZ
pR8 l/3 pRC23+IPTG Inhibitionof
Inductionby IPTG,% nhi b
synthesis by
I-_
Enzyme Control lacZ'(rev) lacZ'(rev),%
,/-Galactosidase 100 2 98
C Lactose permease 100 20 80
w 500 o
c~
E Thiogalactosidase
transacetylase 100 45 55
The inductionof each enzyme at 90 minafterthe additionof IPTG
was takenfrom the data of Figs. 2-4. Backgroundvalues at 0 min in
the absence of IPTGwere subtractedfrom the enzyme levels at 90
min to determine the level of induction. Control cells contained
0 30 60 90 120 plasmidpRC23.The cells with the segmentof the lacZ gene oriented
MINUTESAT420C in the reverse directionwith respect to the PL promotercontained
plasmidpBD4/lacZ'(rev). With the level of increase (inductionby
FIG.3. Lactose permeaseas a functionof time after cells were IPTG)in enzyme taken as 100%in the controlcells, the increasein
transferredto 42?Cin the presence or absence of IPTG.Curvesare the cells containingpBD4/lacZ'(rev)is shownas a percentageof the
labeled as in Fig. 2. TMG, thiomethylgalactoside. values in the control cells.
71
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
7528 Genetics: Pestka et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984)
-
.e I , I , I I I The use of anti-mRNA that can be induced within cells
ALKALINEPHOSPHATASE provides a potent mechanism by which specific transcripts
o 0.002- can be translationally inactivated. This procedure should
000 pRC23 pRC23+IPTG
provide a convenient and rapid method to determine the
function of proteins or other RNAs within cells. The tech-
E 0.001 niques should be applicable to eukaryotic cells with appro-
o RevZ RevZ+ IPTG
priate vectors and regulatory elements. During the comple-
tion of these initial experiments, Izant and Weintraub (19)
0 30 60 90 120 reported the use of anti-mRNA in mammalian cells. Indeed,
MINUTESAT 420C it is possible that anti-mRNA transcripts have physiological
roles in cells, as suggested by Simons and Kleckner (20) and
FIG. 5. Alkaline phosphatase as a function of time after cells by Mizuno et al. (21). We hope to be able to determine the
were transferred to 42?C in the presence or absence of IPTG. Curves optimal size and region for targeting by anti-mRNA seg-
are labeled as in Fig. 2. ments in the near future. As hybrid-arrested translation has
been used in vitro to screen recombinant DNA clones, anti-
DISCUSSION mRNA recombinants may be employed in vivo to screen and
The presence of anti-lacZ mRNA can be controlled by the k select for phenotypically altered cells lacking single func-
phage PL promoter. Under conditions in which no anti-lacZ tions. The method may be applicable to screen for recombi-
mRNA is made, /3-galactosidase, lactose permease, and nants that inhibit gene products in diploid cells where simul-
transacetylase are induced by IPTG. When anti-lacZ mRNA taneous insertional inactivation of genes is not feasible.
is present, the syntheses of all three enzymes produced from
the same polycistronic mRNA are inhibited, whereas the 1. Pestka, S. (1977)in MolecularMechanismsof ProteinBiosyn-
synthesis of alkaline phosphatase, produced from a different thesis, eds. Weissbach, H. & Pestka, S. (Academic, New
mRNA template, is not affected. It is thus clear that anti- York), pp. 467-553.
mRNA can be generated and can function in intact E. coli. 2. Miller, J. H. & Reznikoff, W. S., eds. (1980) The Operon
(Cold SpringHarborLaboratory,Cold SpringHarbor,NY).
Although the syntheses of all the enzymes made on the poly- 3. Singer,M. F., Jones, O. W. & Nirenberg,M. W. (1963)Proc.
cistronic lac mRNA are inhibited by the anti-lacZ mRNA, Natl. Acad. Sci. USA 49, 392-399.
inhibition of the synthesis of permease and transacetylase, 4. Paterson, B. M., Roberts, B. E. & Kuff, E. L. (1977)Proc.
whose coding regions are distal to the coding region of 3- Natl. Acad. Sci. USA 74, 4370-4374.
galactosidase, occurs to a smaller degree than inhibition of 5. Hastie, N. D. & Held, W. A. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci.
,/-galactosidase synthesis (Table 1). There is a polarity to the USA 75, 1217-1221.
inhibition in that permease synthesis is inhibited 80%, 6. Messing, J. (1982) in RecombinantDNA, ed. Walton, A. G.
whereas synthesis of transacetylase, whose coding region is (Elsevier, Amsterdam),pp. 143-153.
most distal to that of/3-galactosidase, is inhibited only 55%. 7. Lieb, M. (1966)J. Mol. Biol. 16, 149-163.
Ribosomes initiating within polycistronic mRNAs (18) at the 8. Bernard,H.-U. & Helinski, D. R. (1979)Methods Enzymol.
68, 482-492.
permease and transacetylase initiation codons must account 9. Crowl, R. (1985)MethodsEnzymol.,in press.
for this lower degree of inhibition, and these observations 10. Sharp,P. A., Sugden, B. & Sambrook,J. (1973)Biochemistry
support direct reinitiation at AUG codons corresponding to 12, 3055-3063.
these enzymes. 11. Schmitt,J. J. & Cohen, B. N. (1983)Anal. Biochem. 133,402-
The presence of the plasmid containing the lacZ' region in 404.
reverse orientation with respect to the PL promoter in- 12. Miller,J. H. (1972)Experimentsin MolecularGenetics (Cold
creases the level of /-galactosidase. The plasmid appears to SpringHarborLaboratory,Cold SpringHarbor,NY), pp. 352-
be titrating the repressor protein even though there is no lac 355.
13. Trumble, W. R., Viitanen, P. V., Sarkar, H. K., Poonian,
operator segment present. This is consistent with the results M. S. & Kaback, H. R. (1984)Biochem. Biophys. Res. Com-
of Reznikoff et al. (16), who reported the existence of a sec- mun. 119, 860-867.
ondary binding site for lac repressor within the operator- 14. Alpers, P. M., Appel, S. H. & Tomkins,G. M. (1965)J. Biol.
proximal third of the lacZ gene. This site was precisely de- Chem. 240, 10-13.
fined by Gilbert et al. (17) to be located at position 357-391 15. Torriani,A. (1960)Biochim.Biophys.Acta 38, 460-469.
of the lacZ gene, starting from the initiator codon, ATG, of 16. Reznikoff,W. S., Winter,R. B. & Hurley,C. K. (1974)Proc.
lacZ taken as position 1. The segment of the lacZ gene incor- Natl. Acad. Sci. USA 71, 2314-2318.
porated in pBD4/lacZ'(rev) represents positions 19-440 and 17. Gilbert,W., Maxam,A. & Mirzabekov,A. (1976)in Controlof
thus encompasses this secondary binding site for lac repres- Ribosome Synthesis, Proceedingsof the Alfred Benzon Sym-
sor. When this secondary binding site was deleted from the posiumIX, eds. Kjeldgaard,N. O. & Maal0e, O. (Academic,
New York), pp. 139-148.
plasmid pBD4/lacZ'(rev), there was no titration of repressor 18. Berberich,M. A., Venetianer,P. & Goldberger,R. F. (1966)
and thus no increase in /3-galactosidase in the absence of J. Biol. Chem. 241, 4426-4433.
IPTG compared to control cells. Nevertheless, 8-galacto- 19. Izant, J. G. & Weintraub,H. (1984)Cell 36, 1007-1015.
sidase synthesis induced by IPTG was inhibited 97% upon 20. Simons, R. W. & Kleckner,N. (1983)Cell 34, 683-691.
induction of the anti-lacZ mRNA fragment at 42?C (unpub- 21. Mizuno, T., Chou, M.-Y. & Inouye, M. (1984) Proc. Natl.
lished data). Acad. Sci. USA 81, 1966-1970.
72
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
CÉLULA I
A) GUÍA DE ESTUDIO
9) ¿Qué son los hoyos revestidos (coated pits) y las vesículas revestidas (coated vesicles)?
¿De qué están revestidos?
12) ¿Qué es un liposoma? Mencione alguna de las utilidades de los mismos en biología
molecular y celular.
14) ¿Qué estructuras conforman el aparato de Golgi? ¿Qué funciones tiene el mismo? ¿Y
específicamente en células vegetales?
15) ¿En qué compartimento celular se glicosilan las proteínas? ¿Qué ocurre con las cadenas
de oligosacáridos unidas a proteínas en el aparato de Golgi?
16) ¿Qué destino celular tienen las proteínas cuyo mRNA codifica para una secuencia
hidrofóbica (péptido señal) en el extremo N-terminal? ¿Qué entiende por descarga
vectorial?
73
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
18) ¿Dónde y de qué manera se originan los lisosomas? ¿Cuál es el contenido de los
lisosomas? ¿Qué ocurre si penetra al lisosoma una droga como la cloroquina que es capaz
de captar ávidamente H+?
21) Describa cómo participan los canales de Na+ y K+ en la generación de los potenciales
de reposo y acción de las células nerviosas. ¿Qué es el "patch clamp"?
74
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
La adenilil ciclasa (AC, también llamada adenilato ciclasa) eucariótica es una enzima de
membrana plasmática que fabrica cAMP hacia el citoplasma. Para que la producción de
cAMP sea estimulada, la AC tiene que encontrarse unida a un receptor celular, el cual a su
vez haya unido su ligando específico (hormona adrenalina, por ejemplo). Se dispone de dos
tipos celulares mutantes: las células A poseen receptores para adrenalina pero no tienen
AC. Las células B poseen AC, pero no tienen receptores para adrenalina.
Preguntas:
a) ¿Por qué se observa activación solamente en el caso 8?
b) ¿Qué ocurrió en los otros experimentos y para qué fueron realizados?
c) ¿Habría cambiado el resultado si las células A y B hubieran sido obtenidas de animales
alimentados durante largo tiempo con una dieta rica en ácidos grasos saturados?
PROBLEMA 2
La enzima X es una proteína de membrana mitocondrial interna y está formada por dos
polipéptidos (a de 40.000 Da y b de 22.000 Da) unidos por fuerzas no covalentes. Se dispone
de preparaciones de membranas mitocondriales abiertas y de mitocondrias sometidas a
diversos tratamientos, obteniéndose las siguientes fracciones:
75
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Actividad
Polipéptido a Polipéptido b
enzimática (*)
P1 0 No No
I
S1 100 Si (40 kDa) Si (22 kDa)
P2 0 Si (40 kDa) No
II
S2 0 No Si (22 kDa)
P3 100 Si (30 kDa) Si (22 kDa)
III
S3 0 No No
P4 0 Si (20 kDa) No
IV
S4 0 No No
V F5 0 Si (40 kDa) No
76
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
f) ¿Qué le indica el hecho de que el tratamiento con tripsina de las vesículas de membrana
interna right side out (III) no afecte a la actividad de la enzima X?
g) Haga un esquema de un trozo de membrana mitocondrial y ubique, con su orientación
correcta, los polipéptidos a y b de acuerdo con lo respondido en las preguntas anteriores.
PROBLEMA 3
Hace algunos años se ha descubierto que, pese a tener secuencias aminoacídicas muy
diversas, las proteínas peroxisomales poseen cerca de su extremo carboxi-terminal la
secuencia Ser-Lys-Leu (SKL, en el código de una letra). Esta secuencia consenso SKL sirve de
"etiqueta" para dirigir a estas proteínas a los peroxisomas. Por métodos de ingeniería
genética es posible construir un plásmido de expresión en células de mamíferos con un
cDNA para la proteína peroxisomal luciferasa que contiene la secuencia SKL (Figura 1).
Cuando se transfectan células de mamíferos en cultivo con este plásmido se observa que la
luciferasa codificada por el mismo se almacena correctamente en los peroxisomas, por un
mecanismo similar al de la catalasa. Por manipulaciones génicas fue posible delecionar la
secuencia SKL o agregar secuencias provenientes de genes de otras proteínas (ver figuras).
En todos los casos las modificaciones no alteran el marco de lectura del resto de la
luciferasa.
Preguntas:
a) ¿Por qué mecanismo entra al peroxisoma la luciferasa codificada por el plásmido de la
Figura 1?
b) ¿En qué compartimento celular se almacenará la luciferasa codificada por el plásmido:
i) de la Figura 2?
ii) de la Figura 3?
Justifique sus respuestas describiendo los pasos por los que la proteína llega al
compartimento correspondiente. Describa los mecanismos moleculares y si corresponde la
orientación final de la proteína.
c) Los tres cDNAs de luciferasa codifican para la secuencia consenso de glicosilación
Asparagina-X-Serina (NXS en el código de una letra) ¿Cuáles de las tres luciferasas
producidas terminarán glicosiladas? Justifique su respuesta.
PROBLEMA 4
77
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
En las levaduras la degradación de los ácidos grasos ocurre en los peroxisomas. Los ácidos
grasos (ácidos carboxílicos de cadena larga que forman parte de los fosfolípidos) se
degradan totalmente hasta fragmentarse en moléculas de Acetil-CoA. Este Acetil-CoA sale
del peroxisoma gracias a una enzima proteica de localización peroxisomal llamada
carnitina acetiltransferasa y entra en la mitocondria ayudado por la misma enzima, de
localización mitocondrial. Una vez en la mitocondria, el Acetil-CoA entra al ciclo de Krebs,
contribuyendo a la obtención de energía metabólica (ATP) del mismo modo que lo hace el
Acetil-CoA proveniente de la glucólisis. Un único gen de localización nuclear codifica para
las dos formas (peroxisomal y mitocondrial) de la carnitina acetiltransferasa:
Preguntas:
a) ¿En qué compartimento celular se sintetizan las carnitina acetiltransferasas mitocondrial y
peroxisomal; y qué tipo de translocación las lleva a sus destinos?
b) ¿En qué compartimento/s celular/es se acumulará la actividad de carnitina
acetiltransferasa en las siguientes condiciones:
i) levaduras cultivadas sin ácidos grasos en el medio de cultivo.
ii) levaduras cultivadas con ácidos grasos en el medio de cultivo.
c) ¿Cuál será la ventaja (valor adaptativo) de que el promotor 2 (y no sólo el 1 o ambos)
sea inducible por ácidos grasos?
d) Para cada una de las dos condiciones de cultivo de la pregunta b), indique el o los
destinos celulares de la actividad de carnitina acetiltransferasa para las siguientes
mutaciones de su gen (suponga en todos los casos que las mutaciones se encuentran en
homocigosis):
i) Deleción de la secuencia que codifica para la señal de transporte a mitocondria
(MTS).
ii) Deleción de la secuencia que codifica para AKL.
iii) Deleción de ambas secuencias (MTS y AKL).
iv) Inserción, en el exón 2, río abajo del ATG y en fase de traducción con éste (se
mantiene el marco de lectura), de una secuencia codificante para un péptido señal
start transfer, que incluye el sitio de reconocimiento para la peptidasa de la señal.
e) ¿Cuál es la causa molecular de que ninguna de las carnitina acetiltransferasas
estudiadas (ni la enzima normal ni las mutantes descriptas en la pregunta d) se almacenen
en los lisosomas?
f) La entrada de la carnitina acetiltransferasa a los peroxisomas y a las mitocondrias es
inhibida por agentes desacoplantes (dinitrofenol). El agregado de ATP revierte la inhibición
de la entrada a peroxisomas, pero no a mitocondrias. ¿Qué le indica esto sobre la
naturaleza de la energía necesaria para la translocación a cada uno de los dos destinos?
78
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 5
La calreticulina es una proteína con actividad de chaperona, localizada normalmente en el
lumen del retículo endoplasmático rugoso. Su actividad consiste en plegar correctamente
proteínas mal plegadas, a las cuales reconoce sólo si están glicosiladas en asparragina con
un oligosacárido que aún contenga la glucosa terminal. Se obtuvo una línea celular de
ratón donde se anularon (knockearon) los dos alelos del gen de la calreticulina (células
calret-). Si bien estas células son viables, pliegan mal algunas de sus proteínas, en particular
a una glicoproteína de secreción llamada fibronectina.
Se transfectaron células calret- con distintos clones de cDNA de calreticulina (Figura 1) que
la dirigen a diferentes compartimentos celulares. La construcción A corresponde a la
calreticulina normal (salvaje), en tanto que las construcciones B a E son variantes
artificialmente creadas.
79
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) ¿Por qué las células calret- sin transfectar tienen niveles mucho más bajos de fibronectina
en el medio condicionado que las células normales? Justifique.
b) ¿A qué compartimentos celulares se dirigieron y en qué forma se acumularon (soluble o
de membrana) las calreticulinas codificadas por las construcciones A, B, C, D y E usadas
para transfectar las células calret-? Justifique su respuesta poniendo en evidencia sus
conocimientos teóricos sobre los mecanismos de direccionamiento de proteínas en las
células eucariotas. En los casos de membrana dibuje la topología de la proteína
calreticulina en la misma.
c) ¿Por qué las transfecciones con las construcciones B, C, D y E no recuperaron los niveles
de fibronectina en el medio? Justifique su respuesta para cada una de las construcciones
indicando si en cada destino la chaperona encontró o no a la fibronectina, y, en caso de
haberla encontrado por qué no pudo plegarla correctamente.
d) ¿Qué resultados habría obtenido si en los experimentos de la Figura 2, en lugar de medir
cantidad de fibronectina en el medio, hubiera medido cantidad de fibronectina
intracelular? Dibuje el gráfico de barras y justifique.
PROBLEMA 6
La proteína 1 es una proteína lisosomal. Se obtuvieron 3 variantes (2 a 4). Todas ellas, al igual
que la 1, se translocan co-traduccionalmente en el retículo endoplasmático rugoso. Indique
justificando:
a) el destino final de cada una de las 3 variantes.
b) cuál/cuáles de las 4 podrá/n estar sujeta/s al control de calidad de plegado que tiene
lugar en el lumen del rugoso.
80
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 7
El Dominio de Agregación Condicional (DAC) es una secuencia aminoacídica que, por
presentar alta afinidad por sí misma, provoca el agregado y precipitación de las proteínas
que la poseen. A su vez el DAC presenta sitios de unión específica para el ligando sintético
AP22542 (una molécula orgánica, no tóxica, pequeña e hidrofóbica que no es fabricada en
células animales). Cuando se une al DAC, AP22542 promueve la desagregación de la
proteína, permitiendo que la misma se pliegue correctamente y no precipite.
La agregación de proteínas en el retículo endoplasmático rugoso provoca la retención de
las mismas en su lumen, mientras que si se encuentran solubles y bien plegadas, dichas
proteínas siguen la vía normal de secreción. La agregación de proteínas en el citoplasma
(citosol) provoca la inmediata degradación total de las mismas por proteasas inespecíficas.
Teniendo en cuenta estos conceptos, Rivera et al. (Science 287, 826-830, 2000) transfectaron
células humanas en cultivo con la construcción I con el fin de desarrollar un sistema de
expresión de proteínas recombinantes controlable por la adición o no del ligando AP22542
al medio de cultivo de las mismas. Entre el cDNA para DAC y el cDNA para la proteína X
introdujeron una región que codifica para el sitio de reconocimiento de la proteasa FURINA,
presente en todos los tipos celulares de mamíferos, pero de localización exclusiva en el
lumen del aparato de Golgi.
Preguntas:
a) ¿En qué destino (núcleo, citosol, lisosomas, peroxisomas, RER, Golgi, mitocondrias, medio
extracelular) encontrará Ud. una banda que sea reconocida por el anticuerpo
mencionado? ¿Qué peso molecular tendrá la banda observada? (considere 1 aminoácido
= 100 Daltons). Justifique su respuesta.
b) ¿En qué compartimentos encontrará Ud. una banda que sea reconocida por el
anticuerpo mencionado y qué peso molecular tendrá la banda observada en una
transfección igual a la de la pregunta a) pero en presencia del ligando AP22542? Justifique.
c) ¿Qué resultados de Western habría obtenido en cada caso si se hubieran usado para
transfectar las construcciones II y III, en ausencia y en presencia del ligando AP22542?
Justifique.
81
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
e) Si con fines de terapia génica se utilizara una construcción similar a la I donde la proteína
X fuera insulina y el promotor fuera de expresión en todos los tejidos, introduciéndola de
manera estable en cualquier tipo celular del paciente, ¿qué debería administrarse a los
pacientes y en qué momentos del día, para garantizar una secreción y función de insulina
recombinante similares a las fisiológicas? Justifique.
PROBLEMA 8
La fusión entre una vesícula de transporte y una membrana "blanco" ("target" en inglés) se
lleva a cabo gracias a la existencia de proteínas integrales de membrana específicas
llamadas SNAREs. La vesícula presenta en su membrana un v-SNARE, anclado por un
dominio de transmembrana hidrofóbico, exponiendo hacia el citoplasma un dominio (DIE)
que interacciona específicamente con el DIE del t-SNARE que se encuentra anclado en la
membrana "target". Los DIEs son alfa hélices e interaccionan entre sí formando un "coiled-
coil" o torzada. La unión de los dos tipos de SNARE por sus DIEs atrae físicamente a las dos
membranas a una distancia tan corta (1,4 nm) que sus fosfolípidos se reordenan
espontáneamente y se produce la fusión. La Figura 1 muestra el paso previo a la fusión de
una vesícula de transporte y la membrana plasmática que dará lugar a una exocitosis.
82
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Con el fin de usar el mecanismo de los SNAREs para lograr fusión de células entre sí, se
fabricó una serie de clones de expresión de cDNAs de v- y t-SNAREs modificados con el
agregado de un péptido señal start transfer y sitio para la peptidasa de la señal, para
dirigirlos a otro destino celular y/o con otra topología (Fig. 2).
Preguntas:
a) Explique para cada una de las 10 transfecciones por qué razón hubo o no fusión celular
describiendo el destino celular de las proteínas recombinantes expresadas, su topología y
glicosilación. Justifique.
b) La tunicamicina es una droga que inhibe la glicosilación de proteínas en asparagina.
Sabiendo que los v- y t- SNAREs normales tienen en sus DIE las secuencias Asn-Ala-Ser y Asn-
Glu-Thr repectivamente, ¿qué efectos tendrá el agregado de tunicamicina sobre:
i) la fusión de vesículas con membranas "target" en células normales no transfectadas?
ii) la fusión de células entre sí en células transfectadas con C+D?
iii) la fusión de células entre sí en células transfectadas con A+B?
Justifique
PROBLEMA 9
La enzima RNA polimerasa II (RNA pol II) es la encargada de transcribir los genes que
codifican RNAs mensajeros en las células eucariotas. Es una proteína con estructura
cuaternaria formada por 13 subunidades. Las mismas se asocian en el citoplasma formando
la enzima completa. Hasta 2011 no se sabía cómo entraba la RNA pol II al núcleo, donde
ejerce su función, ya que ninguno de sus 12 polipéptidos tiene señal de localización nuclear
(NLS, por nuclear localization signal), caracterizada por una seguidilla de aminoácidos
básicos (lisinas, argininas y/o histidinas). El 2/4/11, el grupo de Patrick Cramer publicó un
trabajo en Molecular Cell en el que se demuestra que la proteína Iwr es la responsable de
“acarrear” a la RNA pol II del citoplasma al núcleo. Iwr está formada por un único
polipéptido que posee una NLS y por lo tanto entra al núcleo. Iwr también posee:
83
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
- una región de unión a la enzima RNA pol II (denominada PIIB) a través de la cual se une
específicamente, por uniones débiles de alta afinidad, a una hendidura en la molécula de
RNA pol II en cuyo fondo se encuentra el sitio activo de la enzima, y
- una señal de exportación del núcleo al citoplasma (denominada NES, por nuclear export
signal).
Una vez en el núcleo, el complejo RNA pol II – Iwr se disocia por acción de la unión de
factores de transcripción basales a la molécula de RNA pol II, y la proteína Iwr vuelve al
citoplasma para continuar el ciclo de entrada de RNA pol II al núcleo.
La figura muestra la configuración de la proteína Iwr salvaje (1) y de cinco variantes o
mutantes de la misma (2-6) en las que se han delecionado segmentos y/o agregado
nuevas señales que no existen en Iwr, sin alterar el resto de la secuencia aminoacídica.
Preguntas:
a) Cuando las células expresan la proteína 1 (Iwr salvaje, o sea, WT), la RNA pol II se
encuentra exclusivamente en el núcleo y la Iwr puede ser encontrada tanto en núcleo
como en citoplasma. Indique en qué compartimentos celulares encontrará usted cada una
de las variantes 2 a 6 de Irw y la RNA pol II en cada caso. Justifique explicando en detalle el
mecanismo que lleva cada variante de Iwr a su correspondiente destino y la razón de la
localización de la RNA pol II en cada caso.
b) Sabiendo que los factores basales de transcripción que interaccionan con la RNA pol II
no compiten con el sitio de unión a Iwr, ¿cómo explica que la unión de los mismos a la RNA
pol II en el núcleo provoque la disociación de Iwr?
c) ¿Qué consecuencias tendría una mutante de Iwr en que su PIIB tuviera una afinidad tan
alta por la RNA pol II que no se disociara de la misma? Justifique.
PROBLEMA 10 (OPTATIVO)
La siguiente es una clave dicotómica que permite identificar proteínas de acuerdo a su
localización precisa en los distintos compartimentos de una célula eucariota. Los caracteres
(o “etiquetas”) mencionados corresponden a los de los precursores de las proteínas
maduras.
84
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
a) Asigne correctamente el número de una o más proteínas de las listadas más abajo, a
cada casillero de la clave.
Ayuda para el uso de la clave: Para cada proteína compare los dilemas de igual jerarquía
(A y AA, por ejemplo). Si la proteína pertenece a A, entonces continúe comparando los
dilemas B y BB. Si la proteína pertenece a AA, entonces continúe comparando los dilemas G
y GG.
Clave:
A. Con péptido señal hidrofóbico N-terminal que reconoce al SRP (“signal recognition
particle”) y secuencia de reconocimiento para la peptidasa de la señal.
B. Con péptido hidrofóbico interno “stop transfer” (de anclaje).
C. Con secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal .............................................
CC. Sin secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal ................................................
BB. Sin péptido hidrofóbico interno “stop transfer” (de anclaje).
D. Con secuencia de retención KDEL............................................................................
DD. Sin secuencia de retención KDEL.
E. Con secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal.
F. Con señal conformacional para adición de Man-6P ...............
FF. Sin señal conformacional para adición de Man-6P ..................
EE. Sin secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal ..................................
AA. Sin péptido señal hidrofóbico N-terminal que reconoce SRP.
G. Con péptido “señal” para translocación a mitocondria.
H. Con péptido de anclaje a membrana mitocondrial .............................................
HH. Sin péptido de anclaje a membrana mitocondrial ................................................
GG. Sin péptido “señal” para translocación a mitocondria.
I. Con secuencia SKL de entrada a peroxisoma ........................................................
II. Sin secuencia SKL de entrada a peroxisoma.
J. Con secuencia básica de transporte a núcleo .......................................
JJ. Sin secuencia básica de transporte a núcleo ..........................................
85
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
INMUNOLOGÍA
A) GUÍA DE ESTUDIO
3) ¿Dónde se producen las células precursoras de las células blancas? ¿Dónde maduran los
linfocitos? ¿En qué órganos se pueden encontrar linfocitos?
4) Explicar las diferencias entre una respuesta inmune humoral y una respuesta inmune
celular: ¿Qué se produce, contra qué reaccionan estos productos y como se destruye el
antígeno en cada respuesta?
5) ¿Cómo se explica que un organismo sea capaz de producir anticuerpos contra una
sustancia sintética que no existe en la naturaleza?
6) ¿Qué hecho determina que un determinado clon de linfocitos sea seleccionado para
multiplicarse y madurar?
7) ¿Por qué la segunda exposición a un antígeno suele provocar una respuesta inmune más
rápida e intensa que la primera?
8) ¿Por qué un mismo animal no fabrica anticuerpos contra sus propias macromoléculas?
12) ¿Qué son las regiones constantes, la región variable y la región hipervariable de una
inmunoglobulina?
13) ¿Cómo se explica que un ser humano sea capaz de producir más moléculas diferentes
de anticuerpos que las que podrían ser codificadas por todo el ADN de su genoma?
14) ¿Por qué son variables las zonas variables de cada cadena? ¿Qué otros factores
aumentan la diversidad de los anticuerpos? ¿Cuántos anticuerpos diferentes son
producidos por un único linfocito B?
15) ¿Qué determina que se produzca el cambio de clase del anticuerpo secretado por la
misma célula plasmática?
86
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
18) Explique por qué una célula infectada con un virus se convierte en un blanco del
sistema inmune.
19) ¿En qué células se encuentran los antígenos de MHC de tipo I? ¿Qué tipos de células
reconocen?
20) ¿En qué células se encuentran los antígenos de MHC de tipo II? ¿Qué tipos de células
reconocen?
21) ¿Cómo presentan las células B y los macrófagos los antígenos provenientes del exterior a
las células T?
87
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
La iguana voladora de la isla de Krakatoa poseía en su saliva una exótica proteína, la
krakatoína, que inyectada en una persona, tenía como único efecto matar a aquellos
linfocitos B que se unieran por sus receptores a la krakatoína. En 1987, el profesor Vulkan
descubrió que si la saliva de las iguanas voladoras era hervida antes de ser inyectada, la
persona podía producir anticuerpos contra la Krakatoína y quedaba vacunada por un
tiempo contra la mordedura de la iguana voladora. Los estudios del Prof. Vulkan fueron
interrumpidos por la famosa erupción volcánica que destruyó la isla y extinguió
completamente a las iguanas y al Prof. Vulkan, por lo que quedaron pendientes las
siguientes cuestiones:
a) ¿Era letal la mordedura de la iguana?
b) ¿Quedaban vacunadas contra la krakatoína aquellas personas mordidas por iguanas
vivas que, se entiende, no habían sido hervidas previamente?
c) ¿Podían ser vacunadas con krakatoína hervida aquellas personas que previamente
habían sido mordidas por iguanas voladoras?
d) ¿Habían perdido muchos linfocitos B por acción de la krakatoína las personas mordidas?
PROBLEMA 2
Tomando en cuenta el esquema del DNA que codifica para las cadenas pesadas (H) de los
anticuerpos que se muestra en la Figura 1 y la curva de respuesta de un animal de
experimentación a la inyección de un antígeno "X" que se ilustra en la Figura 2:
a) Dibuje:
i) Un esquema de los mRNAs más abundantes de las cadenas H de los linfocitos B (B1,
B2, B3 y B4) que respondan al antígeno "X", indicados en la Figura 2.
ii) Un esquema donde muestre las proteínas correspondientes a los mRNAs B2 y B3,
dibujándolas con la célula que las produce.
b) Diga qué otras células y proteínas participan en el paso de B1 a B2. Use esquemas y
justifique.
c) En el tiempo que se indica en la Figura 2, se inyecta otro antígeno diferente, "Y", que es la
primera vez que se inyecta en el organismo en estudio. Dibuje:
i) La curva de respuesta al antígeno "Y" en el mismo gráfico de la Figura 2.
ii) Un esquema del mRNA de cadena H de las células que responderán al antígeno "Y",
pre- y post respuesta al mismo.
88
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 3
Hace algunos años (Nature 415: 1035, 2002), Hochenlinger y Jaenisch generaron un ratón
clonado por transferencia de un núcleo de un linfocito B ya exitosamente rearreglado (de
aquí en más llamado donante) a un cigoto al cual se le había destruido su propio núcleo.
Preguntas:
a) ¿Qué quiere decir que una respuesta B humoral a una infección es policlonal? Responda
brevemente. La respuesta a esta pregunta le ayudará a seguir adelante con el problema.
b) Todos los linfocitos B del ratón clonado resultaron monoclonales. ¿Qué significa esta
afirmación?
c) Para comprobar la afirmación anterior, las/os investigadoras/es hicieron 100 Northern
blots de RNAs obtenidos de 100 linfocitos B maduros individualmente obtenidos de ganglios
del animal. ¿Cuál de las siguientes sondas fue la que se usó en la hibridación del Northern
que permitió concluir que todos los linfocitos B del ratón clonado eran monoclonales?
Justifique.
Segmentos de DNA correspondientes a:
i) un rearreglo VDJ (de cadena pesada), distinto del arreglo del linfocito B donante.
ii) el rearreglo VDJ (de cadena pesada) del linfocito B donante.
iii) la porción constante mu (Cµ) de cadena pesada del linfocito B donante.
iv) la porción constante delta (Cδ) de cadena pesada del linfocito B donante.
89
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
f) ¿Qué habría concluido respecto a la célula B donante si sólo hubieran encontrado IgA?
¿Es posible obtener sólo IgA?
g) ¿Cómo serán en cuanto a su variabilidad los receptores de células T (TCR) de los linfocitos
T de este ratón, monoclonales o policlonales?
Finalmente hicieron también otro ratón clonado por transferencia nuclear a partir de un
linfocito T ya exitosamente rearreglado, con resultados similares en cuanto a la
monoclonalidad de las células maduras del ratón en los linajes celulares correspondientes.
h) ¿Cuál/es de los dos animales (clonado a partir de célula B o clonado a partir de célula T)
será capaz de:
i) Generar una respuesta inmunológica a un transplante de órgano o tejido heterólogo.
Justifique.
ii) Generar una respuesta humoral a la inyección de un antígeno.
PROBLEMA 4
Para estudiar la colaboración entre distintos tipos de linfocitos en la generación de la
respuesta inmune, se obtuvieron linfocitos B, T, y células dendríticas (DC) de un hombre
inmunizado con la toxina del tétano inactivada (TOXT). Los linfocitos fueron cultivados in vitro
durante varios días en presencia de TOXT e interleuquina 2 para producir clones B y T
específicos para TOXT.
Se hizo el siguiente experimento con un clon B, un clon T y las células dendríticas: las células
del clon B o las células dendríticas fueron incubadas con diferentes sustancias, luego
lavadas para eliminar su exceso y finalmente enfrentadas con células de un clon T. Al cabo
de 2 días se observó si había o no proliferación de las células T.
Aclaraciones:
Anti-hIg: anticuerpo anti-inmunoglobulinas humanas
TOXT desnat.: TOXT desnaturalizada por calor
DNP: dinitrofenol (desacoplante)
Preguntas:
a) Analice detalladamente los resultados de cada uno de los diez tratamientos. En su
análisis debe responder a las siguientes preguntas:
i) ¿Cuál es el antígeno en este sistema?
ii) ¿Qué tienen en su membrana los linfocitos B?
iii) ¿Por qué en algunos casos hay proliferación de los linfocitos T y en otros no?
iv) ¿Cuál es el efecto y cómo actúan el Anti-hIg, la cloroquina y el DNP?
b) Haga un dibujo sencillo que muestre la cooperación entre un linfocito B y un linfocito T
específicos para TOXT.
c) ¿Son las células dendríticas capaces de presentar antígeno a las células T?
90
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 5
Los ratones de la cepa CH3, que son resistentes a la infección con el parásito protozoario
Leishmania, desarrollan una respuesta mediada por linfocitos T helper 1 (TH1) después de la
infección, mientras que los ratones de la cepa BALB/c hacen una respuesta mediada por
linfocitos T helper 2 (TH2) y son más susceptibles a la infección (es decir que están menos
protegidos).
Si se hace una segunda exposición al antígeno (parásito), las curvas de la respuesta de
memoria son las siguientes:
Preguntas:
a) ¿En cuál de los dos casos estarán involucrados linfocitos CD4+?
b) ¿Cuál es el tipo de anticuerpo predominante en I? ¿Cómo lo demostraría por Western
blot?
c) ¿En cuál de los dos casos se encontrará abundante cantidad de linfocitos CD8+?
d) Si después de la activación por el antígeno se realiza un Northern blot de RNA extraído de
linfocitos TH1 y TH2, ¿qué sondas utilizaría para diferenciarlos, detectando mRNAs que estén
presentes selectivamente en cada uno de ellos?
e) Los pocos anticuerpos obtenidos en II y la gran cantidad de anticuerpos obtenidos en I
¿son mono o policlonales?
f) ¿Se verán afectadas ambas cepas por la extracción del timo en su capacidad de
responder contra Leishmania? ¿En igual medida?
g) Después de la activación por el antígeno, los linfocitos CD8+ expresan en membrana un
receptor para una de las interleuquinas, el cual no está presente, por ejemplo, en los
macrófagos. ¿Cuál es la interleuquina que actúa como ligando de este receptor?
PROBLEMAS OPTATIVOS
PROBLEMA 1
91
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Se sabe que existe un solo par de alelos para la inmunoglobulina M (IgM) por célula. Hay
dos formas de IgM, la de membrana y la secretada, las cuales difieren en las regiones C-
terminales de sus cadenas pesadas. La IgM de membrana tiene una secuencia hidrofóbica
de transmembrana (o anclaje) que no está presente en la forma secretada. Ud. dispone de
un oligonucleótido sintético correspondiente a la secuencia de anclaje, como así también
de un anticuerpo monoclonal que sólo reconoce dicha secuencia aminoacídica. Con estas
dos herramientas moleculares, Ud. analiza DNA, RNA y proteínas de dos tipos celulares:
linfocitos B inmaduros (LB) y plasmocitos (PL).
PROBLEMA 2
Ud. entra a trabajar a un laboratorio de inmunología como becaria/o y su director/a le pide
que realice 3 experimentos de Western. La idea es confirmar, para cada uno de 8 cultivos
celulares (del A al H), de qué tipo celular se trata: linfocitos B (inmaduros, maduros o de
memoria), precursores de linfocitos B o plasmocitos.
Cada Western fue revelado con un anticuerpo específico diferente según muestra la figura:
92
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
a) Complete la siguiente tabla con los resultados de los experimentos de Western indicando a
qué tipo celular corresponde cada cultivo y qué función o tipo de respuesta realiza.
Se realizó un cuarto Western que fue revelado con un anticuerpo anti Vh del clon X. Los
resultados se muestran en la siguiente figura:
b) Interprete los resultados del cuarto Western. ¿Qué células pertenecen al mismo cluster y
cuáles al mismo clon?
c) Dibuje detalladamente para los cultivos A y H el RNA mensajero maduro de la cadena
pesada de Ig.
PROBLEMA 3
Darrah et al. publicaron en Nature Medicine (13: 843, 2007) un estudio acerca del tipo de
respuesta y del tipo de células del sistema inmune que están involucrados en la inmunidad
generada por la vacunación contra Leishmania major, un parásito cuya infección afecta a
millones de personas en la actualidad. La vacunación consiste en la inyección en los
pacientes de un virus recombinante no inmunogénico que no enferma pero al entrar en las
células del vacunado expresa una proteína del parásito que funciona como antígeno.
Para ensayar la efectividad de la vacunación hicieron el siguiente experimento. A ratones
vacunados o no, les hicieron distintos tratamientos detallados en la figura y al cabo de dos
semanas los desafiaron mediante la inoculación de parásitos para medir la cantidad de los
mismos en los ratones después de otra semana. Obtuvieron los resultados que se muestran
en la figura.
93
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) ¿Cómo interpreta los resultados de los puntos 1 y 2 de la figura en términos de la eficacia
de la vacunación?
b) ¿Cómo afectó a la efectividad de la vacuna el tratamiento del punto 4 en la figura?
¿Para qué hicieron el tratamiento indicado en el punto 3?
c) De acuerdo a los resultados del tratamiento del punto 4 del experimento de la figura,
i) ¿Qué célula colaboradora está actuando?
ii) ¿Qué CD estará expresando la misma?
iii) ¿Qué otra citoquina produce?
iv) ¿Es una célula de memoria?
d) i) ¿Serán las células descriptas en la pregunta c) las únicas que participan? Si considera
que hay otras, indique cuáles y con qué CD las identificaría. ¿Qué tipo de respuesta
inmune se está generando? Justifique.
ii) ¿Qué otra célula del sistema inmune innato estaría también involucrada?
e) Las/os investigadoras/es aislaron de un ratón vacunado las células descriptas en las
preguntas c) y d) y las transfirieron a un ratón gemelo del original, naïve (que nunca había
sido expuesto a los antígenos de este parásito), y previamente irradiado.
i) ¿Por qué las/os investigadoras/es usaron para este experimento ratones gemelos,
naïve e irradiados?
ii) ¿Qué resultado obtuvieron cuando a estos ratones los desafiaron con el parásito,
como 1 ó 2 de la figura? Justifique.
iii) ¿Qué resultado habrían obtenido si hubieran desafiado con parásitos a ratones
gemelos, naïves e irradiados pero a los que previamente no se les hubiera inyectado
las células descriptas en las preguntas c) y d)? Justifique.
PROBLEMA 4
Se estudió la proliferación de linfocitos T en las siguientes condiciones in vitro:
Aclaraciones: k.o.= knock out del gen que codifica para una proteína del retículo
endoplasmático con actividad de bomba de los péptidos producidos en el proteasoma.
94
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 5
Los cambios en los ecosistemas favorecen las infecciones humanas por el hantavirus (HTNV).
Recientemente, Lalwani y colaboradores (Eur J Immunol, 2013) han dilucidado cómo es la
presentación antigénica y la respuesta inmune frente a este virus.
Como se ve en la Figura 1, en las células pulmonares infectadas con el virus, éste se replica y
produce nuevos virus, cuyo número aumenta con el paso del tiempo (de 2 a 4 días)
A continuación, miden la cantidad de moléculas MHCI intracelular en las mismas células y
condiciones, obteniendo los siguientes resultados:
Preguntas
1. ¿Qué muestran los resultados de la Figura 2?
2. Además de medir la cantidad de MHCI intracelular, las/os investigadoras/es midieron la
cantidad de MHCI en la membrana plasmática de las células infectadas y obtuvieron
resultados similares a los de la Figura 2. ¿Qué demuestra este resultado?
3. Si las células pulmonares son infectadas con una preparación de virus HTNV que se
encuentra inactivado para replicarse se obtienen resultados similares al control (barra
correspondiente a células de pulmón sin infectar). ¿Qué demuestra este experimento?
A continuación, las/os investigadoras/es trataron a las células con epoximicina, un inhibidor
específico e irreversible del proteasoma, y obtuvieron los siguientes resultados:
95
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Por último, evaluaron qué ocurre al incubar células dendríticas con el virus HTNV, y
encontraron que:
A) Se detectan péptidos virales en las células dendríticas
B) Si se bloquean los receptores TOLL-3 (TLR3), NO se detectan péptidos virales en las células
dendríticas
7. Explique los resultados de A y B
A su vez, cuando se co-cultivan las células dendríticas expuestas al virus HTNV junto con
Linfocitos T, se observa el efecto en los niveles de interferón-γ (IFN-γ) indicado en la Figura 5.
96
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 6
Se desea probar la existencia de linfocitos CD8 citotóxicos en una preparación de linfocitos
totales de un individuo A. Para ello se realiza un ensayo de citotoxicidad "in vitro" utilizando
como blanco ("target") células de un individuo Z, las cuales habían sido previamente
cargadas con 51Cr e irradiadas para inmunosuprimirlas. Se obtiene una gran respuesta
citotóxica, es decir, una gran liberación de 51Cr desde el interior de las células del individuo
Z, cuando se las incuba con los linfocitos del individuo A.
a) ¿Qué resultado esperaría si el ensayo de citotoxicidad se hubiera hecho con linfocitos del
individuo A que pasan de largo por una columna de afinidad de anticuerpo monoclonal
anti-CD4-agarosa? ¿Por qué?
b)¿Qué resultado esperaría si al ensayo hecho en a. se le agrega IL-2 exógena? ¿Por qué?
c) ¿Qué le ocurriría al individuo Z si se lo inmunosuprime y luego se lo inyecta con:
i) la preparación de linfocitos original del individuo A?
ii) la preparación de linfocitos del individuo A que pasó de largo por la columna de
afinidad?
PROBLEMA 7
El brillante inmunólogo Dr. Leukin diseñó un experimento para evidenciar activación y
proliferación de linfocitos T. Para ello disponía de dos anticuerpos, cada uno de ellos
covalentemente unido a un marcador fluorescente de distinto color (anticuerpos
fluorescentes). Uno de los anticuerpos unido a un marcador fluorescente rojo reconocía
exclusivamente células CD4. El otro, unido a un marcador fluorescente verde, reconocía
células CD8.
Se realizó el siguiente experimento de activación y expansión clonal:
Tubo 1: Pool de linfocitos T + antígeno proteico + células presentadoras de antígeno.
Tubo 2: Pool de linfocitos T + antígeno viral + células autólogas infectadas por virus + células
presentadoras de antígeno.
Luego de realizar estas incubaciones, hizo reaccionar cada tubo con los anticuerpos
fluorescentes para detectar qué subpoblación de linfocitos T había proliferado en cada
caso. Complete el siguiente cuadro indicando el tipo de fluorescencia que Ud. hubiera
esperado encontrar en cada caso. Justifique su respuesta, utilice esquemas. Indique las
principales interleuquinas que intervienen en cada caso.
PROBLEMA 8
Las células foliculares de la tiroides son las que secretan la tiroxina, una pequeña molécula
yodada que regula el metabolismo energético de los mamíferos. La captación del iodo
97
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 9
Ud. dispone de los siguientes anticuerpos monoclonales:
1- anti-receptor IL-2
2- anti-proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC clase I).
3- anti-receptor de BCGF (IL-4)
4- anti-proteínas del MHC clase II
Indique cuáles de estos anticuerpos bloquean:
a) la proliferación clonal de linfocitos B
b) la proliferación clonal de linfocitos CD8+
Justifique brevemente. Ayúdese con un diagrama de cooperación celular.
98
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
CÉLULA II
A) GUÍA DE ESTUDIO
CITOESQUELETO
1) Describa los tres componentes del citoesqueleto incluyendo: monómeros que los
componen, estructura, tamaño, localización, polaridad y orientación (si la tienen).
5) ¿Cuáles de los componentes del citoesqueleto son estables y cuáles dinámicos? Describa
los distintos procesos celulares en los cuales intervienen los dinámicos.
7) ¿Qué función cumplen las proteínas motor dineína y kinesina? ¿Con qué componentes
del citoesqueleto interaccionan?
8) ¿Qué tipo de microtúbulos participan en la división celular y qué papel que cumple cada
uno? ¿Cuáles son los distintos modelos postulados sobre el papel de los microtúbulos en la
segregación de los cromosomas?
12) ¿Qué tipo de moléculas forman la lámina nuclear? ¿Qué ocurre con la lámina nuclear
durante la mitosis?
13) Describa los distintos tipos de uniones célula-célula y célula-matriz extracelular. ¿Con
qué elementos del citoesqueleto interaccionan?
CICLO CELULAR
99
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
8) ¿Cuáles son las distintas fases del ciclo celular y qué procesos ocurren en cada una de
ellas?
10) ¿Qué tipos de moléculas regulan los puntos de control de las transiciones entre una fase
y la siguiente y cómo se regula su actividad?
11) ¿Qué significa que el ciclo celular sea unidireccional? ¿Cómo se logra?
100
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
B) PROBLEMAS
CITOESQUELETO
PROBLEMA 1
La figura muestra una fotografía de microscopía electrónica de un corte transversal de un
flagelo eucariota.
a) Asigne los siguientes componentes a las posiciones indicadas por números en la figura.
Túbulo "A" Vaina interna
Túbulo "B" Nexina
Brazo externo de dineína Radio
Brazo interno de dineína Microtúbulo único
b) ¿Cuáles de las estructuras mencionadas están compuestas por tubulina?
c) ¿Cuáles de las estructuras son continuas con componentes del cuerpo basal o
blefaroplasto?
d) Mutaciones en los genes que codifican para las dineínas causan esterilidad masculina
porque los flagelos de los espermatozoides no se mueven. ¿Por qué estos pacientes
presentan también trastornos en las vías respiratorias tales como congestiones bronquiales?
e) ¿Por qué el tratamiento de un hombre con cáncer con taxol, una droga que estabiliza los
microtúbulos polimerizados, inhibe la proliferación de las células cancerosas y disminuye la
cantidad de espermatozoides producidos por los testículos pero no afecta la motilidad de
los mismos? Justifique cada uno de los 3 casos.
PROBLEMA 2
El movimiento ondulatorio de un flagelo eucariota se produce porque éste se curva en
ciertas regiones y esa curvatura se va corriendo a lo largo del flagelo, según se ilustra en la
Figura 1.
101
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
b) Las moléculas elásticas de nexina que unen dobletes adyacentes deben estirarse para
acomodar la curvatura del flagelo hasta un semicírculo. Si el largo de una banda de nexina
no estirada situada en la base del flagelo es de 30 nm. ¿cuál es el largo de la banda de
nexina estirada situada en la punta del flagelo?
c) ¿Qué ocurriría con los dobletes adyacentes de la figura si se destruyeran las bandas de
nexina y los radios por un tratamiento suave con proteasas, que no destruye a los
microtúbulos de tubulina?
Datos:
- perímetro del círculo: p = 2.π.r (r: radio)
- teorema de Pitágoras: a²+b² = c² (a y b son los catetos y c es la hipotenusa)
PROBLEMA 3
Los microtúbulos del cinetocoro, que unen a los centrosomas con los cinetocoros, guían a
los cromosomas hacia los polos de la célula durante la mitosis. De cada centrosoma sale
también, en forma radial, un conjunto de microtúbulos que no se enganchan a
cromosomas, llamados microtúbulos del áster. Se realizó el siguiente experimento in vitro:
Centrosomas aislados fueron incubados con tubulina soluble (monomérica) para iniciar el
crecimiento de microtúbulos y posteriormente se agregaron cromosomas aislados. Los
cromosomas se unieron espontáneamente a los extremos libres de los microtúbulos, como
se ilustra en la figura. Los complejos fueron luego diluidos a una concentración muy baja de
tubulina soluble y fueron observados nuevamente. Como se ve, sólo los microtúbulos del
cinetocoro resultaron resistentes a la dilución.
102
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
a) ¿Por qué piensa Ud. que los microtúbulos del cinetocoro son más estables que los del
áster?
b) De todos modos, los microtúbulos del cinetocoro no son 100% estables en una célula.
¿Cuál es la evidencia para esta afirmación?
c) Explique el mecanismo de la desaparición de los microtúbulos del áster luego de la
dilución. ¿Se despegan del centrosoma; se despolimerizan de un extremo o se desintegran
al azar en varios puntos a lo largo de su longitud?
PROBLEMA 4
En la figura se grafica la velocidad de crecimiento para los dos extremos (+ y -) de
microfilamentos de actina en función de la concentración de actina globular soluble.
PROBLEMA 5
La doble membrana nuclear está sostenida, desde el lado nuclear, por una malla fibrosa de
laminas llamada lámina nuclear. Las laminas son 3 tipos de proteínas (lamina A, lamina B y
lamina C) que forman filamentos intermedios. Cuando las células entran en mitosis, la
lámina nuclear se desarma y la membrana nuclear se desintegra. El armado y desarmado
de la lámina nuclear está controlado por la fosforilación reversible y regulada de las
laminas. Para investigar el rol de la fosforilación Ud. marca células con un aminoácido
radiactivo y luego purifica las laminas tanto de células que están en mitosis como de células
en interfase. Después somete las laminas purificadas a electroforesis bidimensional en geles
de poliacrilamida.
103
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Nota: Ojo!, no confundir los términos lamina (proteína) con lámina (estructura nuclear
formada por laminas) y mucho menos con laminina (otra proteína no emparentada con las
laminas que forma parte de la matriz extracelular de muchas células).
104
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
CICLO CELULAR
PROBLEMA 6
Critique las siguientes afirmaciones y justifique.
a) El ciclo celular se divide en varias fases, las cuales están marcadas en el diagrama. De
todas ellas, la más rica en eventos regulatorios conocidos es “G1”.
PROBLEMA 7
Una gran parte del conocimiento actual sobre el funcionamiento del ciclo celular ha sido
conseguida gracias a estudios realizados con levaduras que tienen mutados genes
esenciales para que el ciclo prosiga. Cuando uno de esos genes está mutado las levaduras
son incapaces de dividirse y eso se considera evidencia de que esos genes codifican para
proteínas de importancia para la progresión del ciclo. Este concepto, si bien ha resultado
sumamente útil plantea una paradoja: Si esas cepas mutantes no pueden dividirse, las
colonias de levaduras no pueden crecer. ¿Cómo es que existen entonces estas levaduras?
¿Cómo se hace para poder propagarlas?
PROBLEMA 8
Las proteínas quinasas agregan un grupo fosfato a sus proteínas blanco, acción que se
denomina “fosforilar” en la jerga de los laboratorios de biología molecular. Estas se dividen
en serín/treonín quinasas y tirosín quinasas dependiendo del tipo de aminoácido al cual
fosforilen. El Factor Promotor de la Mitosis (MPF) es una proteína dimérica compuesta por
una ciclina (ciclina B) y una Cdk o “quinasa dependiente de ciclinas” que se llama Cdc2, y
es del tipo serín/treonín quinasa.
Además del control de la actividad quinasa de las Cdks dado por la aparición y
desaparición periódica de las ciclinas, existe un nivel adicional de control dado por un
105
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Un aminoácido crítico de Cdc2 es el #15, tirosina, abreviado como Y15, el cual es fosforilado
por la quinasa de tirosinas Wee1 y desfosforilado por la fosfatasa de tirosinas Cdc25. El
balance entre las actividades de estas dos proteínas determina el estado de fosforilación
de Y15 en Cdc2. Cuando Wee1 está más activa que Cdc25, Y15 queda fosforilada y por lo
tanto MPF resulta inactivo. En el caso inverso, Y15 queda desfosforilada y MPF se muestra
activo.
Las actividades regulatorias varias de MPF y sus proteínas asociadas se estudian en extractos
de ovocitos de rana. En esos extractos, la quinasa Wee1 está activa y la fosfatasa Cdc25
está inactiva.
Como dato adicional de la complejidad del sistema sabemos que, así como la actividad de
MPF es regulada por fosforilación, también lo es a su vez la actividad de Cdc25.
El ácido okadaico (OA) es un potente inhibidor de las fosfatasas del tipo serina/treonina. El
agregado de OA es usado comúnmente como método para lograr una rápida activación
de MPF.
106
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 9
La duración del ciclo celular puede variar mucho de acuerdo al entorno en el que se
encuentra un tipo celular determinado a expensas de la duración de cada una de las
distintas fases, excepto de la M, que es bastante constante y de aproximadamente 1 hora.
Para medir la duración del ciclo celular de los hepatocitos que forman parte del hígado de
un ratón adulto, se prepararon cortes de hígado y se los tiñó con un colorante para que las
células en mitosis resulten fácilmente reconocibles al microscopio. Habiendo observado
25.000 células en total, se encontraron solamente 3 células en mitosis.
a) Calcule la duración del ciclo celular de los hepatocitos en el hígado de un ratón adulto.
b) En base a las Figuras 1 y 2 calcule la duración total del ciclo celular y de la fase G2 de los
hepatocitos en cultivo.
c) Con los datos anteriores y del enunciado, y sabiendo que el período S dura 6 horas,
¿cuánto dura G1?
d) Si la velocidad de avance de la DNA polimerasa en la fase S es siempre 2 kpb/minuto y el
tamaño del genoma de ratón es 3x109 pb, ¿en cuánto tiempo se terminaría de replicar todo
el genoma? ¿Es consistente el resultado de este cálculo con las respuestas anteriores?
107
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 10 (OPTATIVO):
En las neuronas, muchas proteínas que terminan alojadas en el espacio sináptico viajan
dentro de vesículas de secreción desde el cuerpo celular a lo largo del axón hasta su
porción terminal. Los ribosomas libres y asociados al retículo endoplasmático se encuentran
exclusivamente en el citoplasma del cuerpo celular.
Preguntas:
a) ¿Qué efectos tendrá la colchicina, un alcaloide que afecta el equilibrio dinámico
tubulina/microtúbulos, sobre la secreción de proteínas en el botón axonal? Justifique.
b) La secreción requiere ATP in situ (en el lugar), lo cual es coherente con el hecho de que
las mitocondrias también viajen por la misma vía hasta el terminal axonal (a una velocidad
aproximada de 1 metro por día!). No obstante, el ATP también es requerido a lo largo de
todo el axón. ¿Para qué?
c) La enfermedad hereditaria de “Charcot*-Marie-Tooth” es una neuropatía causada por la
mutación del gen de la kinesina KIF1B que impide a esta proteína unir ATP. El síntoma más
notorio de esta enfermedad es debilidad muscular. ¿Cuál es el mecanismo molecular de la
enfermedad?
* Nota histórica: Jean-Martin Charcot (1825-1893) fue un famoso neurólogo francés que fue
maestro de Sigmund Freud durante su visita al hospital “La Salpetrière” de París.
PROBLEMA 11: Problema integrador de citoesqueleto, tránsito de proteínas y metabolismo
(OPTATIVO)
Los animales alternamos períodos de vigilia (estar despiertos) con períodos de sueño (estar
dormidos). Poco se sabía de los eventos moleculares que determinan el pasaje de la vigilia
al sueño y viceversa, hasta que se descubrió una proteína, llamada orexina (hipocretina),
que es fabricada por algunas neuronas (llamadas aquí neuronas de tipo I) de una región
del cerebro llamada hipotálamo. La orexina es sintetizada en el retículo endoplasmático
rugoso y empaquetada en vesículas de transporte que viajan, mediante una proteína
motor, por los microtúbulos maduros (o estables) de los axones de las neuronas de tipo I
hacia sus terminales nerviosas donde es secretada por exocitosis. La orexina secretada
difunde por la sinapsis hasta encontrarse con la membrana de neuronas de tipo II, donde
interactúa con un receptor específico constituido por una proteína integral de siete pasos
de membrana. La unión de la orexina a su receptor produce una serie de efectos biológicos
que incluyen promover la vigilia y el apetito.
108
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Existe una enfermedad en los humanos llamada narcolepsia en la cual los pacientes tienen
somnolencia diurna y sufren ataques repentinos de sueño, desplomándose de golpe por
falta de tono muscular. Esta enfermedad ha sido muy estudiada en perros. Existen
dobermans y “salchichas” alterados genéticamente que sufren narcolepsia. Se los puede
observar jugueteando activamente hasta que de repente caen dormidos por unos 30 a 60
segundos, sin tono muscular alguno, luego de lo cual despiertan de golpe y siguen jugando
por unos minutos antes de repetir el ciclo. En 1999 se descubrió que los perros narcolépticos
tienen mutado el gen del receptor de orexina. Al poco tiempo se encontró que algunos
humanos narcolépticos tienen destruidas las neuronas de tipo I, mientras que otros tienen
mutado el gen de la orexina. Como prueba experimental de estas observaciones, se
hicieron ratones knock out para el gen de la orexina, los cuales nacieron y crecieron
normalmente pero presentaron narcolepsia y además comían menos que los normales. Si
quiere ver filmaciones reales de dobermans, humanos y ratones narcolépticos, baje archivos
de la siguiente dirección de web:
http://med.stanford.edu/school/Psychiatry/narcolepsy/moviedog.html
Preguntas:
a) ¿Cuáles de las siguientes mutaciones en el gen de orexina causarán narcolepsia?
Justifique indicando los destinos celulares de las proteínas mutadas.
i) Deleción del péptido señal “start transfer”, sin alterar el resto del marco de lectura.
ii) Introducción de una secuencia de aminoácidos básicos (localización nuclear,) sin
alterar el marco de lectura ni el plegamiento del resto de la proteína.
iii) Cambio de un aminoácido por otro que provoca un mal plegamiento irreversible de la
proteína.
iv) Introducción de una secuencia SKL (de entrada a peroxisoma) en el extremo C-
terminal, sin alterar el marco de lectura ni el plegamiento del resto de la proteína.
v) Deleción de la secuencia de reconocimiento para la peptidasa de la señal, sin alterar
el resto del marco de lectura.
b) El taxol es una droga usada frecuentemente en quimioterapia del cáncer, cuyo
mecanismo de acción consiste en inhibir el equilibrio polimerización/despolimerización de
los microtúbulos de tubulina. Sabiendo que ni las neuronas de tipo I ni las de tipo II se dividen
en el adulto, pero que los microtúbulos son imprescindibles para la llegada de las vesículas
109
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
con orexina a los terminales nerviosos, ¿producirá el tratamiento con taxol trastornos en el
sueño en los pacientes? Justifique.
c) ¿Cómo se definen el extremo (+) y el extremo (–) del microtúbulo de tubulina?
d) El receptor de orexina (7 pasos de membrana) es una glicoproteína.
i) ¿Con qué tratamientos se lo podrá solubilizar? Justifique.
ii) ¿Por qué a pesar de ser una glicoproteína no se dirige a los lisosomas?
iii) Su secuencia aminoacídica presenta 3 sitios de N-glicosilación (Asn-X-Ser): uno de ellos
se encuentra en uno de los segmentos transmembrana, otro en uno de los dominios
extracelulares y el tercero, en uno de los dominios intracelulares. Sólo uno de los 3 está
glicosilado, ¿cuál y por qué?
e) (Pregunta extra con conceptos de metabolismo)
La termogenina es una proteína que se integra a la membrana interna mitocondrial y actúa
como desacoplante. Tanto la sobreexpresión de termogenina como la falta de oxígeno
(anoxia) producidas en neuronas de tipo I de ratones normales reducen los niveles de ATP
sin matar a las células. Explique las diferencias entre los mecanismos de acción de la
termogenina y la anoxia; y por qué ambos eventos causan narcolepsia a pesar de no matar
a las neuronas de tipo I. Justifique.
110
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
CÉLULA III
A) GUÍA DE ESTUDIO
3)
A) Dibuje un corte de una mitocondria típica vista al microscopio electrónico (haga un
dibujo GRANDE). Señale y dé nombre a todas sus partes y compartimentos y ubique en su
dibujo lo siguiente: a) protones (H+) acumulados por el bombeo de la cadena respiratoria;
b) ATPasa (ATP sintetasa); c) isocitrato deshidrogenasa; d) oxidación de ácidos grasos; e)
citocromo b; f) FADH2; g) síntesis de ATP; h) cardiolipina; i) conversión de piruvato en Acetil
CoA; j) NADH+H+; k) ARN ribosomal.
7) ¿Qué ocurre con el ciclo de Krebs, la cadena respiratoria y la síntesis de ATP mitocondrial
en presencia de cianuro? ¿Y en presencia de un desacoplante como el dinitrofenol?
111
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
11) ¿Cuáles son los productos primarios de la fotosíntesis, cómo se originan y para qué son
utilizados?
112
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
¿Qué produce mayor cantidad de ATP en la respiración aerobia, una molécula de glucosa
o una de un ácido graso de 16 carbonos, sabiendo que hasta la formación de Acetil-CoA la
degradación de ácidos grasos no produce energía? Enumere (no los describa) los procesos
involucrados en la producción de ATP a partir de Acetil-CoA y los compartimentos
mitocondriales en donde ocurren.
PROBLEMA 2
El factor de crecimiento epidermal (EGF) es una proteína que para cumplir su rol biológico,
es decir, estimular el crecimiento de las células animales, se une desde afuera a un receptor
específico situado en la membrana plasmática de las células blanco. Luego, el complejo
EGF-receptor es internalizado por un proceso de endocitosis mediada por receptor y
ambos, el EGF y su receptor, son degradados en el interior celular. Para estudiar este
mecanismo se realizaron distintos pretratamientos a cultivos de células hepáticas humanas,
luego se agregó EGF marcado radiactivamente y se determinó la cantidad del mismo
unido a membrana y degradado en el interior celular al cabo de 45 minutos de incubación
a 37°C. En la siguiente tabla se esquematizan los resultados.
2 cianuro 1000 0 --
4 tripsina 0 0 --
* Una vez pretratadas las células, los correspondientes reactivos fueron eliminados por
lavado antes de ensayar la unión del EGF.
** En unidades arbitrarias.
PROBLEMA 3
La figura muestra el aumento de la turbidez -que es directamente proporcional al número
de bacterias presentes- de un cultivo de E. coli a 37°C en diversas condiciones.
113
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 4
El tubo A contiene una preparación de tilacoides intactos a la cual se le agrega ferredoxina
(purificada por separado). El tubo B contiene una preparación de mitocondrias intactas
mientras que el tubo C contiene una preparación de liposomas que incluyen
bacteriorrodopsina y ATPasa de mitocondrias de corazón bovino (igual que en el
experimento de Racker y Stockenius). Todas las preparaciones membranosas se encuentran
en una solución acuosa conteniendo Mg2+, el buffer apropiado, ADP y fosfato inorgánico.
114
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 5
El proceso de crecimiento y maduración del ovocito ocurre casi totalmente dentro del
folículo ovárico. El ovocito se encuentra dentro de la cavidad interna del folículo (atrio)
recubierto de una capa de células especializadas, el "cumulus". La maduración nuclear se
detiene en la profase I de la meiosis hasta que las gonadotrofinas liberadas en el período
preovulatorio provocan la reanudación de la meiosis. El ovocito puede experimentar
espontáneamente este fenómeno en condiciones "in vitro". La respuesta meiótica en cultivo
puede ser evaluada morfológicamente mediante la observación microscópica de la
ruptura de la membrana nuclear, proceso conocido como ruptura de la vesícula germinal
(GVB, germinal vesicle breakdown). La evolución de este fenómeno depende de las fuentes
de energía disponibles. Con motivo de evaluar la fuente de energía utilizada por los
ovocitos durante la maduración, se incubaron ovocitos desnudados (es decir, separados de
las células del cumulus mediante una digestión con hialuronidasa). La Figura 1 muestra las
curvas obtenidas al graficar las respuestas observadas (% de GVB) a dosis crecientes de
diferentes sustratos.
115
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Dato: El oxalacetato puede generar piruvato por una reacción enzimática independiente
de su participación en el ciclo de Krebs. Por este motivo, en presencia de oxalacetato
siempre hay piruvato suficiente como para generar la Acetil-CoA necesaria para el ciclo de
Krebs.
Preguntas:
a) ¿Qué infiere de la falta de respuesta en presencia de glucosa o lactato?
b) ¿Qué indican los resultados obtenidos en presencia de piruvato y oxalacetato?
Ud. cuenta con dos inhibidores del ciclo de los ácidos tricarboxílicos: malonato y
fluoroacetato. El malonato bloquea la acción de la succinato deshidrogenasa, mientras
que el fluoroacetato inhibe la conversión de citrato en isocitrato.
c) ¿Qué experimento realizaría para comprobar la hipótesis deducida de la Figura 1?
Grafique y explique los resultados que espera obtener.
Con el objeto de averiguar el origen del piruvato utilizado como sustrato por los ovocitos
desnudados, Dows y col. cultivaron ovocitos desnudados; complejos cumulus-ovocitos (tal
cual son extraídos del ovario) y un co-cultivo de células del cumulus y ovocitos desnudados.
Los cultivos fueron realizados en medio con glucosa en presencia y ausencia de un inhibidor
de la glucólisis, el iodoacetato. La Figura 2 muestra los % GVB obtenidos en cada caso.
116
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 6
La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) es un hongo unicelular que puede
crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno (es aerobio facultativo). En
ausencia del mismo produce CO2 y etanol.
Se tienen dos cultivos de levaduras:
A) En medio mínimo con glucosa en presencia de O2.
B) En medio mínimo con glucosa en ausencia de O2.
b) Explique y justifique qué sucedería en los cultivos A y B para los ítems I a IV al agregar:
i) un agente desacoplante como el dinitrofenol (DNP).
ii) un inhibidor del transporte de electrones como el cianuro.
117
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 1
El citocromo b2 es una proteína soluble de 481 aminoácidos, de la cadena respiratoria de
las mitocondrias de levaduras, localizada en el espacio intermembrana. Está codificada por
un gen nuclear y llega a su destino final por translocación post-traduccional. En su región
amino-terminal, el precursor del citocromo b2 (561 aa) posee dos secuencias que le marcan
el camino a seguir: la secuencia de importación (S.I.), de 31 aminoácidos, con carga neta
positiva, seguida de la secuencia de exportación (S.E.), de 49 aminoácidos, de naturaleza
hidrofóbica.
Preguntas:
a) ¿En qué ribosomas se sintetiza el precursor del citocromo b2?
b) ¿A qué grupo de proteínas pertenece hsp60?
c) Describa el camino y el destino preciso (compartimento, unión o no a membrana, etc.)
que tendría el citocromo b2 (o sus precursores) en cada una de las siguientes alteraciones:
i) Se ha mutado el sitio de reconocimiento de la peptidasa del espacio intermembrana.
ii) Con S.I. / sin S.E.
iii) Sin S.I. / sin S.E.
iv) S.I y S.E. han sido reemplazados por un "péptido señal" de inserción clásico.
v) Igual a iv), pero además se le ha agregado en su extremo C-terminal la secuencia de
entrada a peroxisomas Ser-Lys-Leu.
vi) Igual a iii), pero además se le ha agregado en su extremo C-terminal la secuencia de
entrada a peroxisomas Ser-Lys-Leu.
d) Si se agrega el desacoplante valinomicina, la fase de exportación de esta translocación
se interrumpe aún si la mitocondria tiene exceso de ATP. ¿Cómo actúa la valinomicina y
qué le indica este experimento sobre la fuerza que propulsa la translocación de proteínas a
la mitocondria?
118
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Existe una cepa mutante de levaduras, llamada mif4, donde el gen que codifica para la
proteína hsp60 no se expresa.
f) ¿Qué ocurre con la cadena respiratoria? ¿Qué pasa con la producción de ATP en esta
cepa, a nivel citoplásmico y mitocondrial?
g) De hecho, la mutante sobrevive y crece. ¿Cómo lo logra? ¿Cómo se reoxida su
NADH+H+?
h) Las bacterias tienen una proteína llamada GroEL, la cual tiene una secuencia
aminoacídica muy parecida a la de hsp60. In vitro, GroEL, al igual que hsp60, es capaz de
mantener desplegado al precursor del citocromo b2 de levaduras. ¿Qué le indica este
experimento sobre el origen evolutivo de las mitocondrias? ¿Cuál sería la función de GroEL
en bacterias?
PROBLEMA 2
Luego de egresar de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y doctorarse en Biología,
un entusiasta ex-alumno y ex-docente de IBMC decidió fundar una empresa para
desarrollar fármacos. La primera línea de investigación se concentró en obtener un fármaco
para tratar el Dolor Neuropático (DN). El DN es una condición crónica que ocurre cuando se
dañan los nervios, por ejemplo, por una infección viral con el virus del Herpes zoster, algún
trauma que aplaste los nervios o incluso una enfermedad autoinmune, y es muy difícil de
tratar, entre otras cosas justamente porque es crónico, llegando a durar muchos años,
incluso toda la vida.
Los efectos psicoactivos son mediados por el receptor de endocannabinoides llamado CB1
mientras que la disminución del dolor está mediada tanto por los receptores CB1 como CB2.
Ambos receptores son del tipo conocido como receptores acoplados a proteína G (GPCRs)
que, como usted sabe, son proteínas de 7 pasos transmembrana. CB1 y CB2 actúan a
través de la proteína Gi disminuyendo la producción del segundo mensajero AMP cíclico
(cAMP).
b) Haga un esquema donde se muestren todas las señales que usted supone que tiene la
secuencia aminoacídica del receptor CB2 para poder tener 7 pasos transmembrana,
dejando su extremo N-terminal mirando hacia el exterior. Además, haga un dibujo de cómo
queda la proteína en la membrana plasmática.
119
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
e) ¿Cómo haría para separar los linfocitos B de memoria que presentan HcABs que
reconocen CB2 del resto de los linfocitos de la llama?
120
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 3
La bacteria Escherichia coli, los espermatozoides humanos y el alga verde unicelular
Chlamydomonas se mueven en medio líquido gracias a que tienen flagelos. La estructura y
el mecanismo de movimiento de los flagelos son totalmente diferentes en procariotas
respecto de eucariotas.
121
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Moles de ATP
Movimiento flagelar
producidos por
en presencia de glucosa
mol de glucosa
con O2 sin O2 sin O2 DNP
Agregados con O2 sin O2 DNP colchicina
sin luz sin luz sin luz + ATP
Bacteria
38 2 sí no no no no sí
Escherichia coli
Espermatozoide
36 2 sí no no no sí sí
humano
Alga verde
36 2 sí sí no no sí sí
Chlamydomonas
COLUMNA 1 2 3 4 5 6 7 8
Aclaraciones:
Las columnas 1, 2 y 5 son en oscuridad; las demás, en presencia de luz.
DNP: Dinitrofenol. Es un desacoplante.
Colchicina: droga que inhibe la polimerización de microtúbulos.
Preguntas:
a) Explique las causas de las diferencias en la cantidad de ATP producido por mol de
glucosa en cada tipo celular y en las distintas condiciones (columnas 1 y 2).
b) Explique sintéticamente para cada condición (cada columna) por qué hay o no
movimiento del flagelo en cada tipo celular (columnas 3 a 8).
PROBLEMA 3
En las bacterias, la glucólisis y el ciclo de Krebs ocurren en el protoplasma (no hay
citoplasma y núcleo), mientras que la cadena respiratoria tiene lugar en la membrana
plasmática. Se transformó Escherichia coli con un plásmido que expresa el cDNA de la
proteína “desacoplina” bajo las órdenes del promotor/operador del operón lactosa (Figura
1). La desacoplina funciona como un desacoplante de la cadena respiratoria. Para cumplir
esta función debe insertarse en la membrana.
En el cromosoma bacteriano se encuentran todos los elementos génicos involucrados en el
sistema del operón lactosa, incluyendo los genes para las proteínas crp (cap) y adenilato
ciclasa.
Escherichia coli tiene un flagelo macizo constituido por la proteína flagelina, que se mueve
por rotación gracias a un cuerpo basal proteico que actúa como motor impulsado por
fuerza protón motriz.
122
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
Preguntas:
a) Dibuje en la Figura 1 la enzima responsable de la síntesis de ATP en la fosforilación
oxidativa, respetando su forma y orientación y señale el sitio activo.
b) ¿Cuál es el equivalente topológico del espacio periplásmico en las células eucariotas?
c) En base al enunciado, tache lo que no corresponda en la siguiente tabla y justifique
todas sus respuestas para cada una de las condiciones de cultivo, todas con aereación por
agitación.
d) ¿Qué habría pasado con el movimiento del flagelo si las bacterias se hubieran cultivado
en presencia de lactosa y exceso de ATP? Justifique.
123
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
f) Escherichia coli habita normalmente el colon (intestino grueso) de los vertebrados. El colon
es un segmento del aparato digestivo principalmente anaerobio. En esas condiciones E. coli
realiza distintos tipos de fermentaciones, entre ellas la láctica. ¿Cuál es el valor adaptativo
de la misma?
g) ¿Por qué el balance de la respiración aerobia en bacterias es de 38 ATP producidos por
molécula de glucosa, mientras que en los eucariotas es de 36 ATP? No explique todo el
balance, simplemente diga a qué se debe la diferencia.
PROBLEMA 4
Si se incuba un cultivo de la bacteria Escherichia coli en presencia del disacárido lactosa
marcado con el isótopo radiactivo 14C en todos sus carbonos, al cabo de un tiempo, las
bacterias sintetizan grandes cantidades de ATP (lo cual les permite dividirse y crecer) y
liberan CO2 radiactivo al medio.
a) ¿Qué procesos de control genético y metabólico están ocurriendo en la bacteria para
que se produzcan las dos moléculas mencionadas?
b) Si al mismo cultivo, que aún posee un exceso de lactosa marcada radiactivamente, se le
agrega un exceso de glucosa no marcada, al cabo de un tiempo las bacterias siguen
produciendo ATP y CO2, pero éste último no es más radiactivo. ¿Por qué? ¿Qué ocurrió?
c) ¿Qué ocurrirá con la producción de ATP y de CO2 en los experimentos planteados en las
preguntas a) y b), si en cada caso se agrega un exceso del desacoplante dinitrofenol?
124
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
A) GUÍA DE ESTUDIO
1) ¿Qué característica de las histonas hace que éstas se peguen fuertemente al ADN?
2) ¿Cuáles son las histonas presentes en el nucleosoma? ¿Cuántas moléculas de cada una
de ellas hay por nucleosoma?
4) ¿Qué ocurre con la estructura de la cromatina cuando ésta es tratada con nucleasa
(DNasa) micrococal?
10) ¿Qué es un cromosoma politénico, qué organismos los poseen y cómo se originan?
11) Dibuje las distintas fases de la mitosis y describa los principales eventos de cada una de
ellas.
12) ¿Qué son las fibras polares y las del cinetocoro? ¿Cuáles son las evidencias de que los
centríolos no son los centros organizadores del huso mitótico?
13) Defina: fenotipo, genotipo, gen dominante, gen recesivo, heterocigota, homocigota,
alelos, ligamiento genético.
14) Ud. concursa para obtener un cargo de Profesor de Biología en un colegio secundario.
En la prueba de oposición le piden que enuncie (y resuelva) tres problemas que ilustren:
a) la primera ley de Mendel
b) la segunda ley de Mendel
c) co-dominancia en grupos sanguíneos humanos A, B y O y que defina el concepto de
alelos múltiples.
15) ¿Qué son los poros nucleares? ¿Qué sustancias pueden pasar a través de los mismos?
¿Cuál es la ultraestructura de los poros?
16) Esquematice los distintos pasos que involucra el armado de los ribosomas en el nucléolo
y en el citoplasma.
17) ¿Cómo está constituida la lámina nuclear? ¿Qué factores regulan su armado y
desarmado?
125
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
Las histonas son proteínas cuya secuencia está muy conservada a lo largo de la evolución
(por ejemplo, la histona H4 de vaca difiere en sólo 2 de sus 102 aminoácidos con la de
arveja) ¿Qué le sugiere esta observación con respecto a un posible rol regulatorio de la
expresión genética por parte de las histonas?
PROBLEMA 2
Señale verdadero o falso. Justifique SOLO las falsas.
a) La cromatina inactiva está más empaquetada que la cromatina activa.
b) Las histonas fosforiladas se unen más fuertemente al ADN.
c) Sólo el ADN procariota se encuentra superenrollado en condiciones fisiológicas.
d) Los nucleosomas estabilizan el superenrollamiento del ADN en la cromatina.
e) Los sitios hipersensibles a la digestión con DNasa I se encuentran preferentemente en las
regiones codificantes del ADN.
f) El núcleo celular está recubierto por una envoltura nuclear doble formada por una
bicapa lipídica interna y una lámina proteica externa.
g) El movimiento de los cromosomas hacia los polos es causado por polimerización y
despolimerización de microfilamentos de actina.
h) El nucléolo es la región asociada a los genes ribosomales donde se acumula y procesa el
ARN ribosomal.
i) La lámina nuclear se desarma en el período S de la interfase.
j) Los cuerpos basales o blefaroplastos son los que realizan el trabajo mecánico que
posibilita el movimiento de cilias y flagelos.
PROBLEMA 3
¿Cuántas moléculas de ADN contiene un cromosoma de una célula eucariótica en:
a) el período G1 del ciclo celular?
b) el período G2 del ciclo celular?
c) en la profase mitótica?
d) en la metafase mitótica?
e) en la anafase mitótica?
Señale en cuál de las etapas mencionadas dicho cromosoma podría ser visto con
morfología de bastón al microscopio óptico.
PROBLEMA 4
Señale V o F y justifique:
a) En la mitosis se separan los cromosomas homólogos.
b) Los cromosomas homólogos se separan en la segunda división meiótica.
c) Los cromosomas homólogos se separan en la primera división meiótica.
d) Las cromátidas hermanas se separan en la segunda división meiótica.
e) Las cromátidas hermanas se separan en la mitosis.
f) En el crossing over intercambian material genético las cromátidas hermanas.
g) En un individuo con 2n=36, las dos células resultantes de la primera división meiótica
tienen 18 cromosomas cada una.
h) Si dos genes se encuentran ligados pero sus loci están tan alejados que la frecuencia de
recombinación entre ambos es del 50%, los cruzamientos en que se tenga en cuenta a
ambos genes seguirán la segunda ley de Mendel.
126
IBMC 2023 - 2do cuatrimestre
PROBLEMA 5
Los grupos sanguíneos A, B y O están determinados por tres alelos en la población humana:
IA, IB e IO, siendo IA e IB codominantes entre sí y dominantes sobre IO.
El grupo sanguíneo Rh está determinado por un par de alelos (Rh+ dominante sobre Rh-)
ubicados en otro par de cromosomas. Una mujer de grupo B Rh+ da a luz a un bebé de
grupo A Rh-.
a) Dé todos los genotipos posibles de la madre y del niño.
b) ¿Qué tipos sanguíneos (fenotipos y genotipos) debería tener su marido para asegurar
que su esposa le ha sido fiel?
c) Si Ud. fuera un abogado representando a un esposo engañado en un juicio sobre
paternidad, involucrando los mismos hechos básicos que los descriptos más arriba, ¿qué
grupo o grupos sanguíneos debería tener su cliente para demostrar fehacientemente que
su esposa lo engañó y así ganar el juicio?
PROBLEMA 6
Un pterodáctilo (reptil volador) puede tener ojos rojos (RR o Rr) o azules (rr). En un locus
ubicado en otro par de cromosomas existe un gen que si es tt hace que los ojos sean
incoloros, mientras que si es Tt o TT hay expresión de color en los ojos (ya sea rojo o azul).
PROBLEMA 7
En el pollo, las plumas sedosas están determinadas por un gen recesivo respecto al que rige
plumas normales.
a) Si de un cruzamiento entre individuos heterocigotas para dicho gen se criasen 98 aves,
¿cuántos cabría esperar que fuesen sedosos y cuántos normales?
b) Si tuviese un pollo de plumas normales, ¿cuál sería el camino más rápido para determinar
si es homocigótico o heterocigótico?
PROBLEMA 8
Groff y Odland encontraron una variedad de pepinos cuyas flores no podían abrirse al
madurar. Sin embargo dichas flores podían ser polinizadas abriéndolas artificialmente. Los
resultados de dichos experimentos fueron:
Fenotipos de la progenie
Progenitores Flores abiertas Flores cerradas
cerrado x abierto todas ninguna
F1 x F1 145 59
cerrado x F1 81 77
Designe los símbolos para los genes involucrados e indique el genotipo de: a) los
progenitores cerrados; b) los progenitores abiertos; c) la F1.
127