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RESUMEN ABSTRACT
La nueva tendencia en la ingeniería de tejidos es el empleo de las There is an increasing interest in the utility of dental pulp stem
células madre aisladas de tejidos adultos y hoy día existe un gran cells (DPSCs) for dental tissue regeneration. The purposes of
interés en el uso terapéutico de las células madre en la terapia de this study were to isolate, to characterize and to lead cellular dif-
regeneración de tejidos dentales. Por ello, el propósito de este es- ferentiation of stem cells from human dental pulp from extracted
tudio fue aislar, caracterizar e inducir la diferenciación celular de premolars of young patients. The stem cells isolated in cellular
células madre derivadas de extractos de pulpa dental de premola- cultures generated clonogenic cultures after 5 weeks, present-
res de pacientes jóvenes que fueron extraídos por cuestiones de ing elongated and flat cells. This cells expressed mesenchymal
tratamientos de ortodoncia. Las células madre aisladas en los cul- stem cell markers (STRO-1 and CD-44) as shown by immuno-
tivos celulares derivadas de los extractos de pulpa dental, forma- cytochemistry essay and they could differentiate in vitro into os-
ron colonias clonogénicas después de 5 semanas de cultivo celu- teoblastic-like lineage. This differentiation was evaluated by RT-
lar, presentando células con morfologías alargadas, aplanadas y PCR and by immunocytochemistry and the results revealed that
fibroblásticas. Estas clonas fueron positivas a los anticuerpos bone sialoprotein and osteopontin, two very important extracellu-
CD-44 y STRO-1 que reconocen epítopes membranales especí- lar matrix protein, were expressed in the induction cultures and it
ficos de células madre aisladas de tejidos adultos. Asimismo, es- also confirms the osteoblastic-like phenotype. In conclusion,
tas células fueron capaces de diferenciarse hacia un fenotipo mi- cells from dental pulp with stem cell characteristics were isolated
neralizante, por expresar moléculas asociadas al proceso de and the present study suggests that stem cells from human den-
biomineralización como sialoproteína ósea, osteopontina, analiza- tal pulp may potentially be used as a cellular therapy in the tis-
das por la técnica de RT-PCR e inmunocitoquímica. En conclu- sue engineering area.
sión, nuestros resultados muestran que a partir de pulpas denta-
les de humano es posible aislar células madre adultas con
características clonogénicas. Estas células madre son capaces
de recibir estímulos para inducir su diferenciación celular, forman-
do tejido mineral similar al depositado por las células que darán
origen a la dentina o tejidos mineralizados como hueso y cemento
radicular. Sin embargo, es necesario realizar más estudios enca-
minados a caracterizar genes específicos del linaje odontoblásti-
co, para poder utilizar estas células madre en terapias de regene-
ración celular, específicamente encaminadas al área de la
ingeniería de tejidos mineralizados.
INTRODUCCIÓN www.medigraphic.com
Hoy día el conocimiento en la bioingeniería tisular
para lograr regenerar un tejido después de una lesión * Clínica de Odontopediatría, División de Estudios de Postgra-
o de un daño causado por un ataque bacteriano han do e Investigación, Facultad de Odontología, UNAM.
§
llevado a la identificación y aislamiento de poblacio- Profesor de la División de Estudios de Postgrado e Investiga-
ción, Facultad de Odontología, UNAM.
nes de células progenitoras que bajo estímulos espe- II
Profesor e Investigador del Laboratorio de Biología Celular y
cíficos pueden diferenciarse en una población especí- Molecular de la División de Estudios de Postgrado e Investi-
fica, recibiendo el nombre de células madre (SC).1 gación, Facultad de Odontología, UNAM.
Magallanes FM y cols. Aislamiento y caracterización parcial de células madre de pulpa dental
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niería de tejidos.
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vestigación en el área de regeneración tisular e inge- Los extractos digeridos de las pulpas dentales se
dejaron crecer en cajas de cultivo de 6 pozos en pre-
Con la finalidad de contribuir al conocimiento de las sencia del medio de cultivo modificado Eagle´s suple-
células madre, el propósito de esta investigación se mentado con 10% de suero fetal bovino (SFB), una
basó en llevar a cabo el aislamiento, caracterización y solución de antibióticos (penicilina (100 UI/mL), es-
diferenciación celular de células madre derivadas de treptomicina (100 µg/mL) y fungisona (0.3 µg/mL), 100
extractos de pulpa dental de premolares de pacientes mM de aminoácidos no esenciales y 100 mM de piru-
jóvenes que fueron extraídos por cuestiones de trata- vato de sodio, hasta obtener colonias clonogénicas,
mientos de ortodoncia. aproximadamente de 2 a 5 semanas de cultivo. El me-
Revista Odontológica Mexicana 2010;14 (1): 15-20
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dio de cultivo antes mencionado se cambió cada ter- gestión enzimática es posible aislar células o colonias
cer día, para garantizar el crecimiento celular. individuales, después de un periodo de cultivo de 14 a
20 días. Esto concuerda con los resultados de otros
Inmunocitoquímica estudios donde obtienen colonias celulares desde 5 a
15 días de cultivo celular a partir de explantes de teji-
Para detectar los marcadores específicos STROH-1 y do pulpar.3 Las células que se obtuvieron de las di-
CD-44 las clonas de células madre aisladas de los ex- gestiones pulpares después de 14 días de cultivo ce-
tractos pulpares, se crecieron en cajas de cultivo de lular (Figuras 1 A y B); muestran una morfología de
Lab-Tek de 8 pozos durante 3 días. Pasado el tiempo tipo fibroblástica, alargada y aplanada que se pueden
las células se fijaron con paraformaldehído al 4% por 10 ubicar en colonias clonogénicas, característica esen-
minutos, se lavaron con buffer de fosfatos (PBS) por 2 cial de las células madre post-natales. Por otro lado,
minutos repitiendo tres veces. Para detectar los marca- los ensayos inmunocitoquímicos para detectar marca-
dores específicos las células se permeabilizaron con dores membranales específicos de células progenito-
metanol frío durante 10 minutos y se incubaron con los ras mesenquimales, muestran que las células presen-
anticuerpos específicos que reconocen a los epítopes tes en nuestros cultivos derivados de las digestiones
STROH-1 y CD-44 a una concentración de 1:100 incuba- de las pulpas dentales humanas son positivas a los
dos a 4°C durante 24 horas. Pasado el tiempo de reac- marcadores CD-44 y STRO-1 (Figuras 1 C y E). Estos
ción se lavaron 3 veces por 10 minutos con PBS-Tritón ensayos inmunocitoquímicos concuerdan con estu-
100x para eliminar la señal inespecífica del anticuerpo. dios previos donde aislaron y caracterizaron células
La señal se obtendrá por incubar con un segundo anti- madre a partir de dientes exfoliados deciduos y de cé-
cuerpo acoplado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) a lulas madre a partir del ligamento periodontal, siendo
una concentración de 1:1000. Esta señal se observó
bajo el microscopio de fluorescencia y se tomaron fotos
de 5 campos al azar para fotodocumentar la señal positi-
va de los marcadores.
positivas las colonias celulares a los marcadores CD- sona en los medios de cultivo celular. Los resultados
44 y STRO-1.5 Asimismo, estos marcadores (CD-44 y de los ensayos de diferenciación muestran que las cé-
STRO-1) en combinación con marcadores como CD- lulas madre que recibieron dexametasona a una con-
146 (MUC-18), VCAM-1, entre otros, han sido extensi- centración de 10-7 M por 15 días de cultivo, son capa-
vamente utilizados para caracterizar colonias altamen- ces de formar nódulos mineralizados (positivos a la
te puras de células madre mesenquimales aisladas a tinción con alizarina roja S) cuando se comparan con
partir de médula ósea,12-14 lo cual nos ayuda a confir- las células madre cultivadas en ausencia del estímulo
mar que las células aisladas en nuestro estudio son mineralizante (Figura 2). Sin embargo, para evaluar la
células progenitoras. diferenciación celular de las células madre derivadas
Las células madre se consideran células progenito- de la pulpa dental hacia un fenotipo mineralizante ana-
ras capaces de responder a estímulos diferenciadores lizamos la expresión de dos de las proteínas más im-
específicos. Para confirmar lo anterior expuesto, reali- portantes involucradas en el proceso de biomineraliza-
zamos un estudio de diferenciación in vitro, donde uti- ción: sialoproteína ósea (BSP) y osteopontina (OPN)
lizamos un estímulo que promovería la formación de por medio de inmunocitoquímica (Figura 3) y por me-
nódulos mineralizados por medio de utilizar dexameta- dio de la técnica de RT-PCR (Figura 4).
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Figura 3. Inmunofluorescencia
de proteínas involucradas en el
proceso de mineralización BSP
(A) y OPN (B) de células madre
que fueron estimuladas a dife-
renciación celular. Control ne-
gativo ausencia del primer anti-
cuerpo.
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Los resultados de los ensayos de inmunohistoquími- Nuestros resultados indican que las células deriva-
ca muestran que las células madre que recibieron dexa- das
ESTEde las digestiones
DOCUMENTO de pulpas POR
ES ELABORADO dentales humanas
MEDIGRAPHIC
metasona a una concentración de 10-7 M por 15 días de contienen subpoblaciones celulares, entre las cuales
cultivo, son positivas a las proteínas BSP y OPN cuan- existen células progenitoras que expresan marcadores
do se compararon con las células madre cultivadas en que las identifican como células madre postnatales.
ausencia del estímulo mineralizante (Figura 3). Estas células madre derivadas de las pulpas denta-
Asimismo, en la figura 4 se puede apreciar que les humanas, presentan una característica esencial
existe una expresión diferencial de los genes que co- que son clonogénicas y que pueden ser catalogadas
difican para BSP y OPN. El gen que codifica para como multipotenciales, con capacidad de diferencia-
BSP se observa con mayor expresión con respecto al ción hacia un fenotipo mineralizante.
gen que codifica para OPN en las células madre que Sin embargo, es necesario llevar más estudios
recibieron dexametasona a una concentración de 10-7 para caracterizar el fenotipo al cual las células se han
M por 15 días de cultivo. diferenciado con especial énfasis al fenotipo odonto-
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Ambas proteínas están involucradas en el proceso de
biomineralización. Sin embargo, el que exista una mayor
blasto/osteoblástico para pensar en un futuro en un
uso potencialmente clínico en terapias de regenera-
expresión de BSP nos habla que la diferenciación de las ción dental.
células madre es completamente hacia un fenotipo mine-
ralizante, ya que BSP es una proteína involucrada en la
REFERENCIAS
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