Valdiviano Ts

Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Universidad del Perú. Decana de América

Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela Profesional de Genética y Biotecnología
Actividad antiviral in vitro del aceite esencial de

Ophryosporus peruvianus contra los virus Zika y
Dengue-2
TESIS
Para optar el Título Profesional de Bióloga Genetista
Biotecnóloga
AUTOR
Stefanny Fiorella VALDIVIANO TOYCO
ASESOR
Dra. Egma Marcelina MAYTA HUATUCO
Lima, Perú
2023
Reconocimiento - No Comercial - Compartir Igual - Sin restricciones adicionales
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
Usted puede distribuir, remezclar, retocar, y crear a partir del documento original de modo no
comercial, siempre y cuando se dé crédito al autor del documento y se licencien las nuevas
creaciones bajo las mismas condiciones. No se permite aplicar términos legales o medidas
tecnológicas que restrinjan legalmente a otros a hacer cualquier cosa que permita esta licencia.
Referencia bibliográfica
Valdiviano, S. (2023). Actividad antiviral in vitro del aceite esencial de

Ophryosporus peruvianus contra los virus Zika y Dengue-2. [Tesis de pregrado,
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Ciencias Biológicas,
Escuela Profesional de Genética y Biotecnología]. Repositorio institucional
Cybertesis UNMSM.
Metadatos complementarios
Datos de autor
Nombres y apellidos Stefanny Fiorella Valdiviano Toyco
Tipo de documento de identidad DNI
Número de documento de identidad 72838102
URL de ORCID https://orcid.org/0000-0001-7028-7375
Datos de asesor
Nombres y apellidos Egma Marcelina Mayta Huatuco
Tipo de documento de identidad DNI
URL de ORCID https://orcid.org/0000-0001-8471-1675
Datos del jurado
Presidente del jurado
Nombres y apellidos Enrique Walter Mamani Zapana
Tipo de documento DNI
Miembro del jurado 1
Nombres y apellidos Erasmo Honorio Colona Vallejos
Miembro del jurado 2
Nombres y apellidos Miguel Angel Francisco Talledo Rivera

Datos de investigación
Línea de investigación A.1.3.1. Salud Pública

Virología Clínica Molecular,
Grupo de investigación Inmunopatogénesis y Antivirales -
VIRMOLPA
Perú. Universidad Nacional Mayor de San
Marcos. Vicerrectorado de Investigación y
Agencia de financiamiento Posgrado. Proyectos de investigación con
Financiamiento para Grupos de Investigación.
B19100951-PCONFIGI.
Laboratorio de Virología Clínica y Molecular
Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad
Nacional Mayor de San Marcos.
País: Perú
Ubicación geográfica de la
Departamento: Lima
investigación
Provincia: Lima
Distrito: Lima
Latitud: -12.059785661597498
Longitud: -77.08213229921539
Año o rango de años en que se
Octubre 2019 – Julio 2022
realizó la investigación
Virología
URL de disciplinas OCDE
https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.02
A mis padres, hermana, abuelos, tíos y primos por su apoyo
incondicional en mis momentos más difíciles.

AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a mi asesora de tesis, la Dra. Egma Mayta Huatuco por brindarme la
oportunidad de desarrollar el proyecto de investigación en su laboratorio, y confiar en
mí.
Al Blgo. Juan Sulca por su apoyo durante toda la realización de mi trabajo de
investigación, por toda su paciencia y por brindarme su tiempo para resolver mis dudas.
Al profesor Enrique Mamani por sus consejos, apoyo y ayuda durante el desarrollo de
la parte experimental de mi trabajo.
A la Dra. Graciela Vilcapoma por brindarme parte de su tiempo para viajar y recolectar
mis muestras vegetales.
A la Dra. Ingrid Collantes Díaz por su ayuda en el proceso de hidrodestilación del aceite
esencial en la primera etapa del trabajo experimental.
A mis compañeros del laboratorio de Virología Molecular y Clínica de la UNMSM, Kathy
Paz, Harumy Rojas, Brenda Ojanama, Rubén Arancibia, Bernardo Quispe, por su gran
ayuda en el laboratorio y especialmente a mis amigas Sandra Landazabal Castillo y Alys
Chávez Alvarado por su apoyo no solo en el ámbito académico, si no también emocional.
A mis padres Juan y Edith, mi hermana Pierina, mis tíos, abuelos y primos, por siempre
ser un soporte para mí, con quienes crecí y tengo recuerdos maravillosos. Y
especialmente agradecer a mi abuelo Julián y mi tía Sonia, por alentarme a seguir
adelante y por siempre hacerme sentir apoyada en las cosas que me proponía hacer.
A Sandra, Samira, Stacy por hacer de mis años en la universidad más alegres, por
inspirarme profesionalmente y por nuestras reuniones virtuales en las que me brindaron
sus mejores consejos.
A Ingrid, Jose, Yersin, Jean Percy, por su amistad y apoyo moral constante y a mis
amigos del colegio por el tiempo compartido y los momentos vividos.

TABLA DE CONTENIDO
ÍNDICE DE TABLAS ………..……….…………………………………………………...… V
ÍNDICE DE FIGURAS …………….……………………………………………………...… VI
ÍNDICE DE ANEXOS …………………………………………………………………….... VII
ABREVIATURAS ………………………………………………………………………..… VIII
RESUMEN ……………………………....……………………………………………….….. IX
ABSTRACT ………………………..………..………………………………..…...…….…... X
I. INTRODUCCIÓN …………………………………....………………………..….…… 1
II. MARCO TEÓRICO ……………………………..……………………………..….…... 3
2.1. Antecedentes …………………………………………………………………….......... 3
2.1.1. Problemática de DENV y ZIKV ……………………………………………….….. 3
2.1.2. Importancia farmacológica de las plantas …………………………………….… 4
2.1.3. Estudios previos sobre Ophryosporus peruvianus ………………………...….. 5
2.2. Ophryosporus peruvianus ………………………….………………………………… 6
2.2.1. Clasificación taxonómica …………………………………………………………. 6
2.2.2. Sinónimos ………………………………………………………………………….. 6
2.2.3. Nombres comunes ………………………………………………………………... 6
2.2.4. Distribución geográfica …………………………………………………………… 6
2.3. Aceite Esencial ………………………………………………………………………… 7
2.3.1. Definición …………………………………………………………………………… 7
2.3.2. Usos de los aceites esenciales ………………………………………..………… 7
2.3.3. Hidrodestilación por arrastre de vapor ..………………………………………… 7
2.4. Género Flavivirus ……………………………………………………………………... 8
2.4.1. Organización genómica ………………………………………………………….. 9
2.4.1.1. Proteínas estructurales ...…………………………………………..……….. 10
2.4.1.2. Proteínas no estructurales …………………………………………...……... 12
2.5. Virus Zika …………………………………………………………………………....... 17
2.5.1. Estructura ……………………………………………………………………........ 17
I
2.5.2. Clasificación ……………………………………………………………..……….. 18
2.5.3. Linajes …………………………………………………………………………….. 18
2.5.4. Sintomatología de la infección por Zika ………………………..……..……….. 18
2.5.4.1. Síndrome Congénito del Zika ………………………………………………. 19
2.5.5. Historia del Zika .…………………………………………………………………. 20
2.5.6. Mecanismos de transmisión ………………………………………………….… 21
2.5.7. Epidemiología de Zika en el Perú …………………………………………….... 23
2.5.8. Vacunas y Tratamiento …………………………………………………….….… 24
2.6. Virus Dengue ……………………………………………………………………........ 26
2.6.1. Estructura …………………………………………………………………….…… 26
2.6.2. Clasificación …………………………………………..………………………….. 27
2.6.3. Serotipos ……………………………………………………………………….…. 27
2.6.4. Clasificación de la enfermedad ………………………………………………… 28
2.6.4.1. Dengue ………………………………………………………………………... 28
2.6.4.1.1. Sin signos de alarma …………………………………………………….. 28
2.6.4.1.2. Con signos de alarma ………………………………………………........ 28
2.6.4.2 Dengue grave …………………………………………………………………. 29
2.6.5. Historia del Dengue ...……………………………………………………………. 30
2.6.6. Epidemiología de Dengue en el Perú ………………………………………….. 30
2.6.7. Mecanismos de transmisión ……………………………………………………. 31
2.6.8. Vacunas y Tratamiento …………………………………………………………...33
2.7. Cultivo Celular …………………………………………………………...…….…….. 35
2.7.1. Líneas celulares ………………………………………………………………..… 35
2.7.2. Prueba de plaqueo ……..………………………………………………………... 37
2.7.4. Prueba de neutralización por reducción de placas …………………………... 38
III. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS……………….………………….……………………... 39
3.1. Hipótesis ………………………………………………………………………...……. 39
II
3.2. Objetivo general …………..…………………………………………..……………… 39
3.3. Objetivos específicos ………..………………………………………………………. 39
IV. MATERIALES…………………………………….……………….………………….. 40
4.1. Materiales Biológicos ….…………………………………………………………..… 40
4.2. Material de Laboratorio …….………………………………………………………... 40
4.2.1. Reactivos ………….…………………………………………….………………... 40
4.2.2. Material Plástico …….…………………………………………..……………..… 41
4.2.3. Equipos ………….………………………………………………………….…….. 41
V. METODOLOGÍA …………………………….………………………...…………..… 42
5.1. Recolección de muestra de Ophryosporus peruvianus ..………………………… 42
5.2. Extracción del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus mediante
hidrodestilación por arrastre de vapor ………………….……………..........…. 42
5.3. Descongelamiento de células Vero-76 ……………………………………………. 43
5.4. Propagación de la línea celular ……………………………………………………. 43
5.5. Preparación de placas de cultivo celular ….………………………………………. 43
5.6. Análisis de citotoxicidad del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus
……………………..………………………………………………………….……. 44
5.7. Replicación de la semilla viral de ZIKV y DENV- 2 en línea celular
Vero - 76 ……………………..……………………………………………………………. 44
5.7.1. Semilla viral ………..…………………………………………..………………… 44
5.7.2. Infección de la línea celular Vero- 76 ……..……………………………….….. 44
5.7.3. Cosecha viral …………..……………………………………..…………………. 45
5.8. Titulación de la semilla viral de ZIKV en la línea celular Vero-76 mediante la
prueba de plaqueo .....……….…………………………………..………………. 45
5.9. Prueba de reducción de placas de ZIKV ……………………………………......... 46
5.10. Titulación de la semilla viral de DENV- 2 en la línea celular Vero-76 mediante la
prueba de plaqueo. ……………………...……………………………………….. 46
III
5.11. Prueba de reducción de placas de DENV- 2 ……………………………….…… 47
5.12. Análisis de resultados …………………………………………………………....... 48
5.12.1. Prueba de citotoxicidad ……………………………………………………...… 48
5.12.2. Titulación de semillas virales …………………………………………..……… 48
5.12.3. Prueba de reducción de placas …………………………………………..…… 48
5.12.4. Análisis estadístico ……………………………………………………………… 48
VI. RESULTADOS ……………………...…………………………….……………….… 49
6.1. Extracción del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus …………….…….. 49
6.2. Citotoxicidad del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus sobre la línea
celular Vero-76 ……………………………………………..…………..……....… 50
6.3. Título viral de ZIKV en células Vero -76 ..…………………………………...…….. 51
6.4. Inhibición del aceite esencial de O. peruvianus contra ZIKV ……………….……52
6.5. Título viral de DENV - 2 en células Vero- 76 ..…………………………………..... 55
6.6. Inhibición del aceite esencial de O. peruvianus contra DENV-2 ……………...…56
VII. DISCUSIÓN ……………………...……..……………………………………………. 59
VIII. CONCLUSIONES ……………………..………………………………………......... 63
IX. RECOMENDACIONES ……………………..…………………………….………... 64
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………...………….……... 65
XI. ANEXOS ………………………………………..……………………………...…….. 89
IV
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 01. Proceso de extracción del aceite esencial de O. peruvianus 49
mediante el método de hidrodestilación por arrastre de vapor.
Tabla 02. Citotoxicidad del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus sobre 50
la línea celular Vero-76.
Tabla 03. Título de ZIKV mediante prueba de plaqueo sobre la línea celular 51
Vero-76.
Tabla 04. Ajuste del Control Viral (CV) de ZIKV pasaje 4 para la prueba de 51
reducción de placas.
Tabla 05. Prueba de reducción de placas (PRP) del aceite esencial de 52
Ophryosporus peruvianus contra ZIKV.
Tabla 06. Controles virales (CV) obtenidos en las pruebas de reducción de 54
placas (PRP) contra ZIKV.
Tabla 07. Título de DENV-2 mediante prueba de plaqueo sobre la línea celular 55
Vero-76.
Tabla 08. Ajuste del Control Viral (CV) de DENV-2 pasaje 12 para la prueba de 55
Tabla 09. Prueba de Reducción de Placas (PRP) del aceite esencial de 56
Ophryosporus peruvianus contra DENV-2.
Tabla 10. Controles virales (CV) obtenidos en las pruebas de reducción de 58
placas (PRP) contra DENV-2.
V
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 01. Países con riesgo de infección por Zika o Dengue debido a la 4
presencia de Aedes aegypti o Aedes albopictus.
Figura 02. Hidrodestilación por arrastre de vapor en aparato tipo Clevenger. 8
Figura 03. Árbol filogenético del género Flavivirus 9
Figura 04. Representación de la proteína NS3 anclada a la membrana 14
del retículo endoplasmático mediante NS2B.
Figura 05. Organización genómica del género Flavivirus. 16
Figura 06. Organización genómica del virus del Zika. 17
Figura 07. Anomalías neurológicas del Síndrome Congénito del Zika (CZS). 20
Figura 08. Ciclo de transmisión del virus del Zika que muestra un ciclo 23
selvático y un ciclo urbano.
Figura 09. Vacunas contra ZIKV en estudios clínicos. 26
Figura 10. Organización estructural del genoma viral del dengue. 27
Figura 11. Amplificación dependiente de anticuerpos del virus del dengue. 29
Figura 12. Composición de la vacuna comercial contra el dengue 34
Dengvaxia (CYT-TDV) de Sanofi Pasteur y la vacuna en fase 3 TV003/005 del
NIAID/Instituto Butantan.
Figura 13. Efecto citopático de ZIKV en células Vero. 36
Figura 14. Placas obtenidas en la titulación de ZIKV en células Vero – 76. 37
Figura 15. Prueba de Reducción de Placas (PRP) del aceite esencial de 53
Ophryosporus peruvianus contra ZIKV.
Figura 16. Gráfico de Levey- Jennings de los controles virales (CV) en las 54
Pruebas de Reducción de Placas (PRP) contra ZIKV.
Figura 17. Prueba de Reducción de Placas (PRP) del aceite esencial de 57
Ophryosporus peruvianus contra DENV-2.
Figura 18. Gráfico de Levey- Jennings de los controles virales (CV) en las 58
Pruebas de Reducción de Placas (PRP) contra DENV-2.
VI
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 01. Recolección y procesamiento de muestras de Ophryosporus peruvianus. 89
Anexo 02. Preparación de reactivos y medios de cultivo. 93
Anexo 03. Flujogramas de protocolos de trabajo. 94
Anexo 04. Fórmulas. 95
Anexo 05. Placas de prueba de citotoxicidad. 96
Anexo 06. Efecto citopático (ECP) de ZIKV y DENV-2 sobre Vero-76. 97
Anexo 07. Placas de titulación de ZIKV y DENV-2. 99
Anexo 08. Placas de Pruebas de Reducción (PRP) del aceite esencial de 102
Ophryosporus peruvianus contra ZIKV y DENV-2.
VII
ABREVIATURAS
°C : Grado (s) Celsius.
AE : Aceite esencial.
T-E : Tween 80- Etanol.
CC : Control de células.
CV : Control de virus.
ECP : Efecto citopático.
gr : Gramo (s).
MC : Medio de crecimiento.
MM : Medio de mantenimiento.
2X : Medio doble concentrado.
mg, μg: Miligramo (s), Microgramo (s).
min : Minuto (s).
mL, μL: Mililitro (s), Microlitro (s).
PRP : Prueba de reducción de placas.
PRP50 : Concentración de aceite esencial que reduce el N° de placas en 50 %.
rpm : Revoluciones por minuto.
UFP : Unidad formadora de placa.
ST : Solución de trabajo.
ZIKV : Virus Zika.
DENV : Virus Dengue
SE : Semana Epidemiológica
TIA : Tasa de Incidencia Acumulada
CC50 : Concentración citotóxica media
IC50 : Concentración inhibitoria media
IS : Índice de Selectividad
MNCC : Máxima Concentración No Citotóxica
VIII
RESUMEN
Dengue y Zika son arbovirus de importancia en salud pública en Perú y las Américas,
que afectan a millones de personas al año. A pesar de los esfuerzos, no existe hasta el
momento un tratamiento efectivo contra estos flavivirus, lo que ha conllevado a la
búsqueda de soluciones en la medicina tradicional, sabiendo que las plantas son una
amplia fuente de moléculas con propiedades farmacológicas eficaces y de pocos efectos
adversos. Especies de la flora peruana han sido evaluadas para determinar su potencial
antioxidante, antibacterial y antimicótico; no obstante, poca importancia se ha dado a su
potencial antiviral, sobre todo contra agentes endémicos de nuestro país. En el presente
estudio, se evaluó el potencial inhibitorio in vitro del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus contra ZIKV y DENV-2. La especie O. peruvianus fue recolectada en el
distrito de Canta, departamento de Lima e identificado en el Museo de Historia Natural
de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM). La extracción del aceite
esencial del tallo y hojas se realizó mediante hidrodestilación por arrastre de vapor con
éter de petróleo como solvente. La citotoxicidad del aceite esencial (AE) fue evaluada
en la línea celular Vero - 76 utilizando una mezcla de AE - Tween 80- etanol (TE),
hallándose la concentración máxima no citotóxica (MNCC) en 70.4 µg/mL. Las semillas
de ZIKV y DENV- 2 pertenecientes al Laboratorio de Virología Molecular y Clínica de la
UNMSM, fueron propagadas en células Vero- 76 y tituladas mediante la prueba de
plaqueo utilizando células en monocapa y suspensión, hallándose un título de 8.5×106
en ZIKV y 2.5 ×105 para DENV-2, respectivamente. En la prueba de reducción de placas,
el aceite esencial de O. peruvianus redujo en un 35.8 % las placas de ZIKV en la
concentración de 70.4 µg/mL, mientras que para DENV-2, redujo en un 59.05 % y 61.76
% la aparición de placas en las concentraciones 117.33 y 176.0 µg/mL, respectivamente.
Esto lo hace un buen candidato para futuros estudios in vivo con miras de hallar un
tratamiento efectivo contra DENV-2.
Palabras clave: Dengue, Zika, Aceite Esencial, Ophryosporus peruvianus, Vero-76.
IX
ABSTRACT
Dengue and Zika are arbovirus with public health importance in Peru and the Americas,
affecting millions of people per year. Despite the efforts, up to now there is no effective
treatment against these flaviviruses, which has led to the search for solutions in
traditional medicine, knowing that plants are a wide source of molecules with effective
pharmacological properties and few adverse effects. Species of the Peruvian flora have
been evaluated to determine their antioxidant, antibacterial and antifungal potential;
however, little importance has been given to its antiviral potential, especially against
endemic agents in our country. In the present study, the in vitro inhibitory potential of the
essential oil of Ophryosporus peruvianus against ZIKV and DENV-2 is evaluated. The
species O. peruvianus was collected in Canta district, Lima department and it was
identified in the Natural History Museum of the National University of San Marcos
(UNMSM). The essential oil extraction from the stem and leaves was carried out by
hydrodistillation by steam stripping with petroleum ether as solvent. The cytotoxicity of
essential oil (EA) was evaluated in Vero-76 cell line using a mixture of EA - Tween 80-
ethanol (TE), finding the maximum non-cytotoxic concentration (MNCC) at 70.4 µg/mL.
ZIKV and DENV-2 seeds belonging to the Molecular and Clinical Virology Laboratory at
UNMSM, were propagated in Vero-76 cells and titrated by plaque essay using cells in
monolayer and suspension, finding a titer of 8.5×106 for ZIKV. and 2.5 ×105 for DENV-2,
respectively. In plaque reduction test, the O. peruvianus essential oil reduced ZIKV
plaques by 35.8 % at 70.4 µg/mL concentration, while it reduced the appearance of
DENV plaques by 59.05 % and 61.76 % at 117.33 and 176.0 µg/mL concentrations,
respectively. These results show O. peruvianus essential oil a good candidate for future
in vivo studies in order to find an effective treatment against DENV-2.
Keywords: Dengue, Zika, Essential oil, Ophryosporus peruvianus, Vero-76.
X
I. INTRODUCCIÓN
El Dengue y Zika son enfermedades infecciosas causadas por virus miembros de la
familia Flaviviridae. El dengue es la enfermedad viral humana más importante
transmitida por artrópodos (Beltrán-Silva et al., 2018). Se estima que ocurren 390
millones de infecciones por dengue al año, de las cuales solo 96 millones son
sintomáticas y derivan en manifestaciones clínicas (Da Silveira et al., 2019). Además,
se calcula que 3900 millones de personas están en riesgo de infección por el virus del
dengue (Santana et al., 2022). En el caso del virus Zika, a pesar de que la enfermedad
suele ser leve, con síntomas inespecíficos; la Organización Mundial de la Salud, declaró
en el año 2016, que las microcefalias en recién nacidos y otros trastornos neurológicos
como el síndrome de Guillain-Barré, son asociables a este virus, constituyéndose así,
como una emergencia de salud pública de importancia internacional (Baud et al., 2017).
En el Perú, al igual que en el resto del continente americano, existen brotes persistentes
de ambos flavivirus, relacionados con factores sociales, ambientales, geográficos y,
sobre todo, debido a la amplia distribución del vector. Ambos arbovirus son transmitidos
por especies del género Aedes, y en las Américas, principalmente por hembras del
mosquito Aedes aegypti (Kramer & Ciota, 2015), estando este presente actualmente en
22 regiones de nuestro país (MINSA, 2022).
El tratamiento para ambas enfermedades, es principalmente de soporte y está
relacionado con el control de los síntomas (MINSA, 2017), puesto que aún no existen
vacunas aprobadas contra el Zika; además, la vacuna comercial Dengvaxia, contra el
Dengue, presenta ciertas limitaciones relacionadas con la seroprevalencia y el riesgo de
desarrollar dengue grave en personas seronegativas vacunadas (Wilder-Smith et al.,
2019). Estas limitaciones hacen necesaria la búsqueda de nuevos fármacos que inhiban
su actividad infecciosa.
La medicina natural es utilizada para tratar distintos males debido a la fuente inagotable
de metabolitos (Süntar, 2020). Es así que actualmente existe un gran número de
1
investigaciones que buscan determinar la capacidad de los extractos de plantas, y sus
derivados, para inhibir una amplia gama de agentes virales (Flechas et al., 2018;
Zakaryan et al., 2017). Ophryosporus peruvianus es una planta perteneciente a la familia
de las asteráceas presente en varios departamentos del Perú y usada tradicionalmente
como antiséptico, para heridas y lesiones en la piel (Cáceres & Quispe, 2011). Estudios
le atribuyen actividad antimicótica y antimicrobiana (Rojas et al., 2003); sin embargo, no
existen estudios previos sobre su capacidad antiviral.
Los brotes de Zika y Dengue, son una muestra de la presencia de estos virus en el país
y es un llamado a fortalecer las acciones de respuesta frente a estos; además, hace
necesaria la búsqueda de tratamientos alternativos que inhiban el mecanismo de acción
de estos flavivirus. En ese sentido, el objetivo del presente estudio fue determinar el
potencial antiviral in vitro del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus contra ZIKV
Y DENV-2, en la línea celular Vero-76.
2
II. MARCO TEÓRICO
2.1. ANTECEDENTES
2.1.1. Problemática de DENV y ZIKV
Dengue y Zika son arbovirus de importancia en salud pública en las Américas y en el
mundo, ya que se estima que un gran número de países se encuentra en riesgo de
infección, debido a la presencia de los vectores más frecuentes de ambas
enfermedades Aedes aegypti y Aedes albopictus en sus regiones (Figura 01). Es así
que, en el Perú, durante el año 2022, se ha notificado un total de 2 780 798 casos de
enfermedad por arbovirus, de los cuales un 89.9 % fueron casos de Dengue y un 1.1
% de Zika entre las Semanas Epidemiológicas 1 a la 40 (SE-1 a SE-40) (OPS, 2022),
siendo el Perú el tercer país de la región con más casos de dengue después de Brasil
y Nicaragua, con 60 183 casos. Tal es así, que nuestro país en el presente año, lanzó
una alerta durante la Semana Epidemiológica-12-2022, por el incremento de casos
de dengue y la ocurrencia de brotes en distintas partes del país.
A principios del año 2021, el mosquito vector de ambas enfermedades Aedes aegypti
se identificó en 525 distritos de 21 departamentos, siendo los distritos de más alto
riesgo pertenecientes principalmente a los departamentos de Loreto, Piura, Madre de
Dios, Junín, Ayacucho, Tumbes, Lambayeque, Cajamarca, San Martín y Ucayali
(MINSA, 2021). Mientras que, en el 2022, este número aumentó a 528 distritos en
total, pertenecientes a 22 regiones de la costa, sierra y selva de nuestro país (MINSA,
2022).
El plan de prevención de estas arbovirosis se basa principalmente en el control del
vector en las localidades infestadas de Aedes aegypti, y la atención ambulatoria una
vez la persona está infectada; esto debido a la falta de tratamiento específico contra
ambas enfermedades, además, la vacuna comercial Dengvaxia presenta limitaciones
en su uso y no es administrada de manera rutinaria debido al riesgo potencial de
3
desarrollar dengue grave en personas seronegativas (Dirección General de
Medicamentos, 2018; INS, 2016).
En el panorama actual, el sistema de salud peruano ha concentrado sus esfuerzos
en contener la pandemia del COVID-19, disminuyendo en gran medida el control y la
vigilancia sobre estas arbovirosis de importancia en la salud pública (MINSA, 2022).
Figura 01. Países con riesgo de infección por Zika o Dengue debido a la presencia
de vectores Aedes aegypti o Aedes albopictus. Extraído de Poland et al., 2019.
2.1.2. Importancia farmacológica de las plantas
Uno de los enfoques para el descubrimiento de nuevos fármacos antivirales es el uso
de productos derivados de plantas debido a su eficacia y su menor cantidad de
efectos adversos en comparación con drogas sintéticas (Katiyar et al., 2012). Es así
que casi entre el 30- 50 % de los medicamentos disponibles actualmente son
derivados de plantas (Anand et al., 2019; Sohail et al., 2011). Debido a la falta de
tratamientos para algunas enfermedades, son numerosos los estudios que se
realizan para evaluar la eficacia de plantas y sus derivados contra ciertos patógenos,
4
representando así, un campo de investigación en constante crecimiento (Costa Da
Silveira et al., 2017).
Se ha evaluado el efecto inhibitorio de varios extractos contra Dengue y Zika
habiéndose demostrado la inhibición de DENV por Boesenbergia rotunda (Kiat et al.,
2006), Cryptocarya chartacea (Allard et al., 2011), Sambucus nigra (Castillo-
Maldonado et al., 2017), Cissampelos pareira (Bhatnagar, 2017), entre otros. Para el
caso de ZIKV, se ha observado en ensayos in vitro que extractos de Lippia alba
(Quispe, 2018), Aphloia theiformis, y Psiloxylon mauritianum (Clain et al., 2018,
2019), mostraron un efecto inhibitorio contra el virus.
2.1.3. Estudios previos en Ophryosporus peruvianus
Ophryosporus peruvianus, conocido comúnmente como Sheklla o Té Inka, es
utilizado popularmente para la cicatrización de heridas y como antiséptico (Rojas et
al., 2003), además de problemas estomacales, del hígado, molestias de la próstata,
como regulador de la sangre, para el mal aliento, desinflamante, entre otros
(Montenegro, 2001).
Los extractos de esta planta han presentado actividad antimicrobiana y antifúngica
contra Bacillus subtilis, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes and
Sporothrix schenckii (Rojas et al., 2003; Simirgiotis et al., 2017; Waller et al., 2016).
Un estudio sobre la citotoxicidad de su extracto crudo en embriones de erizo de mar
mostró que a concentraciones de 166 µg/mL y 333 µg/mL, se presentó una tasa de
mortalidad del 21.27 % y 49.73 %, respectivamente (Alvarado, 2017).
En un estudio químico sobre los componentes del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus, se hallaron 34 compuestos principalmente, de los cuales 1 se identificó
como trans-1 (2)-epoxi-8(14)-cariofileno (Montenegro, 2001).
Analizaron la variación estacional de los componentes del aceite esencial de
Ophryosporus peruvianus e identificaron 89 compuestos por cromatografía de gases
5
acoplada a espectrometría de masas, conteniendo como uno de sus componentes
mayoritarios al β- cariofileno (Mattos & Collantes, 2020).
2.2. Ophryosporus peruvianus
2.2.1. Clasificación taxonómica
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Orden: Asterales
Familia: Asteraceae
Género: Ophryosporus
Especie: Ophryosporus peruvianus (J.F.Gmel) R.M King & H.Rob.Pers.
2.2.2. Sinónimos
Flaveria peruviana J.F. Gmel., Piqueria artemisioides Kunth, Piqueria peruviana (J.F.
Gmel.) B.L. Rob.
2.2.3. Nombres comunes
Té Inka (Montenegro, 2001), Sheklla (Rojas et al., 2003), Chichís (Cáceres & Quispe,
2011), Chincha- chincha, shacashaca (Plos, 2012), Kipicsá (Castañeda, 2011),
tsayanku (Castañeda, 2014), escoba (Santa Cruz, 2011), mala mujer, quives, arenilla
(De La Cruz, 2007), chichipia (Quinteros, 2009), sayanco (Alarcon & Lucas, 2020).
2.2.4. Distribución geográfica
Ophryosporus peruvianus se distribuye en Perú y Ecuador. En el Perú se encuentra
desde los 500 a 3700 msnm, desde el departamento de Tacna hasta Cajamarca
(Beltrán, 2016).
6
2.3. Aceite esencial
2.3.1. Definición
Los aceites esenciales son una mezcla de compuestos volátiles no polares y
liposolubles y aromáticas como los terpenoides, policétidos, shikimatos y alcaloides,
siendo el primero su componente mayoritario (Aumeeruddy-Elalfi et al., 2016;
Montenegro, 2001).
2.3.2. Usos de los aceites esenciales
Los usos de los aceites esenciales obtenidos por hidrodestilación son muy amplios,
aunque básicamente están orientados a la perfumería; la cosmética; la industria
farmacéutica, como aditivo e insumo para sintetizar compuestos; la alimentaria, como
aditivo y como insumo para la fabricación de productos de higiene personal y de
limpieza doméstica.
2.3.3. Hidrodestilación
La hidrodestilación es un proceso que permite obtener el aceite esencial de una
planta aromática, mediante el uso del vapor saturado a presión atmosférica (Cerpa,
2007). El proceso consta en depositar la materia prima vegetal (molido, cortado,
entero o la combinación de éstos) en un recipiente, que contiene agua, y que estará
sometido a un flujo constante de calor. Conforme la materia prima se calienta, va
liberando el aceite esencial contenido y éste, a su vez, debido a su alta volatilidad se
va evaporando. Este es arrastrado hacia el tope del hidrodestilador y fluye hacia un
condensador. En el condensador, la mezcla es enfriada, hasta la temperatura
ambiente. A la salida del condensador, se obtiene una emulsión líquida inestable.
Este equipo está lleno de agua fría al inicio de la operación y el aceite esencial se va
acumulando, debido a su casi inmiscibilidad en el agua y a la diferencia de densidad
y viscosidad con el agua (Figura 02).
7
Figura 02. Hidrodestilación por arrastre de vapor en aparato tipo Clevenger.
Modificado de Kowalski et al., 2015.
2.4. Género Flavivirus
El género Flavivirus consiste en un grupo de virus zoonóticos, donde varios de sus
miembros son conocidos por causar enfermedades de importancia en el ser humano.
Son un total de 73 virus divididos en cinco grupos: transmitidos por mosquitos (MBFV),
garrapatas (TBFV), con vectores no conocidos (NKFV), insecto-específicos (ISFV) y el
grupo no clasificado (Figura 03). Dentro de este género se encuentran virus tales como
dengue (DENV), zika (ZIKV), el virus del Nilo Occidental (WNV), fiebre amarilla (YFV),
encefalitis japonesa (JEV), entre otros (Fernández et al., 2017; Ramos et al., 2021).
8
Figura 03. Árbol filogenético del género Flavivirus. Construido utilizando una región de
2757 nucleótidos de la proteína no estructural NS5. Extraído de Weaver et al., 2016.
2.4.1. Organización genómica
Los virus dentro del género Flavivirus se caracterizan por ser pequeños virus
envueltos (40-60 nm) con un genoma no segmentado de una sola cadena de ARN
de sentido positivo, de aproximadamente 11 kb con una caperuza en el extremo 5’,
regiones no traducidas (UTR) en ambos extremos de la cadena y un único marco de
lectura (ORF). En el extremo 3’ UTR se encuentra una región altamente conservada
dentro del género, de 90-120 nucleótidos que forma una estructura tipo horquilla
(Brinton & Basu, 2015; White et al., 2016).
9
El ARN genómico de los flavivirus codifica una poliproteína única que es procesada
en tres proteínas estructurales (C, prM y E) y siete no estructurales (NS1, NS2A,
NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5) (Figura 05)(Idrees & Ashfaq, 2012; Qureshi, 2018;
Wang et al., 2017).
2.4.1.1. Proteínas estructurales
La región amino-terminal de los Flavivirus codifica tres proteínas estructurales:
Proteína de la cápside “Core protein” (C), Proteína asociada a membrana
“Membrane associated protein” (prM) y la proteína de envoltura “Envelope protein”
(E).
a. Proteína C (Core Protein)
Tiene un tamaño aproximado de 12 kDa con un aproximado de 120 aminoácidos
cuya identidad entre distintos miembros de la familia flavivirus puede variar entre
el 15 % al 90 % (Mukhopadhyay et al., 2005). Está conformada por dos regiones
muy conservadas: una región hidrofóbica y una región catiónica. La proteína
madura forma principalmente un dímero conformado por cuatro alfa-hélices (α1-
α4), mientras que la proteína C inmadura contiene adicionalmente una región α-
hélice transmembrana llamada “anchor” o α5, cuya función principal es la de
actuar como un péptido señal para la maduración de la proteína prM a M. Juega
un importante rol en la encapsulación del genoma viral, promoviendo el
plegamiento del ARN (Barnard et al., 2021; Zhang et al., 2021). También se sabe
que induce la respuesta del sistema inmune celular, específicamente en las
células T CD4+ (Faheem et al., 2019).
10
b. Proteína prM (Membrane Associated Protein)
La proteína M tiene un peso aproximado de 9 kDa y consiste en aproximadamente
75 aminoácidos; mientras que la proteína precursora prM se conforma por un total
de 165 aminoácidos. Hay un total de 180 copias de la proteína M en la envoltura
lipídica de los Flavivirus (Faheem et al., 2019). La proteína M se encuentra en la
superficie externa de la partícula viral madura, mientras que su precursor prM se
encuentra en el virión inmaduro, no infeccioso (Idrees & Ashfaq, 2012), esto
debido al clivaje del fragmento pr en el trans Golgi por la proteína del hospedero
furina, para generar viriones maduros (Ye et al., 2016). Presenta dos dominios
transmembrana que contienen un dominio “stop transfer” y una secuencia señal,
las que le confieren una función de chaperona en el plegamiento y ensamblaje de
la proteína de envoltura E y su transferencia hacia el lumen del retículo
endoplasmático, donde ambas forman un heterodímero, necesario para la
conformación del virión (Mukhopadhyay et al., 2005).
c. Proteína E (Envelope protein)
La proteína E tiene un peso aproximado de 53 kDa con 495 aminoácidos y tres
dominios y desempeña un papel vital en la entrada del virus a la célula. El dominio
I constituye el dominio estructural, el dominio II contiene un péptido hidrófobo
importante en la fusión de la membrana viral y de la célula huésped, mientras que
el dominio III es el principal dominio de unión y antigénico del virus (Faheem et al.,
2019). Existe un aproximado del 40 % de identidad entre las proteínas E de los
flavivirus (Mukhopadhyay et al., 2005). En el virus DENV, el aminoácido Asn67 de
la proteína E se encuentra glicosilado, característica importante para la unión del
virus al receptor. La proteína E de ZIKV carece de esta característica; no obstante,
se encuentra glicosilado en el Asn154, lo que comparte con DENV (Asn153), y
está relacionado con la liberación del virión (Wang et al., 2017). Estas diferencias
11
entre ZIKV y DENV pueden influir en la interacción con sus receptores y la
respuesta inmune.
2.4.1.2. Proteínas no estructurales
El genoma viral de los flavivirus contiene 7 proteínas no estructurales, estas son:
NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4a, NS4b y NS5, responsables de la replicación viral,
de la evasión inmune, entre otras funciones celulares.
a. NS1 (Non structural protein 1)
La proteína no estructural 1 (NS1), es una proteína glucosilada de
aproximadamente 48 kDa expresada en la superficie celular, con dos sitios de N-
glicosilación conservados y seis puentes disulfuro intramoleculares. Entre los
miembros del género, NS1 está bien conservada, exhibiendo un 20-40 % de
identidad y un 60-80 % de similaridad (Puerta et al., 2019).
NS1 se sintetiza como un monómero y forma un dímero después de
modificaciones postraduccionales que tienen lugar en el lumen del retículo
endoplasmático, se procesa y es secretada al medio extracelular en forma de
hexámero, por lo que sirve como diana para el sistema inmune humoral. NS1
interactúa con distintas proteínas del hospedero, siendo un componente
importante en la replicación viral y la evasión inmune, tanto es así que deleciones
en esta proteína previenen la replicación y la infección viral por completo (Edeling
et al., 2014; Jacobs et al., 2000).
La proteína NS1, es un marcador utilizado para el diagnóstico temprano de
pacientes infectados con dengue (antes de los nueve días posteriores al inicio de
los síntomas), ya que se ha demostrado su presencia a altas concentraciones en
sueros cuando estos han sido evaluados por ensayo ELISA (Ensayo de
nmunoabsorción ligado a enzimas) contra esta proteína (Datta & Wattal, 2010;
12
WHO, 2009). La reacción cruzada que suele observarse en ensayos serológicos
entre miembros del género Flavivirus ha sido evaluada en pacientes con infección
por dengue, zika y coinfección, durante la epidemia de Zika ocurrida en Brasil en
2016, encontrándose que este tipo de test fue específico para el diagnóstico de
dengue en un 99.32 % y preciso en la no detección de Zika en un 92.43 % (Lima
et al., 2019). Si bien actualmente no existen kits comerciales para la detección de
Zika utilizando la proteína NS1, existen esfuerzos para su desarrollo (Yap et al.,
2021).
b. NS2A (Non structural protein 2A)
La proteína no estructural 2A (NS2A), es una proteína transmembrana no
estructural de carácter hidrofóbico con un peso aproximado de 22 kDa, siendo
importante para la replicación viral pues está relacionada con la síntesis de RNA
y el proceso de ensamblaje (Faheem et al., 2019). NS2A tiene la función de
reclutar el ARN viral, la poliproteína de la cápside- prM - envoltura y el complejo
proteasa NS2B-NS3 hacia los sitios de ensamblaje del virión y su interacción con
la región 3’ UTR del ARN viral es necesaria para el empaquetado del mismo
(Barnard et al., 2021).
c. NS2B (Non structural protein 2B)
La proteína no estructural 2B (NS2B), es una proteína con un peso aproximado de
14 kDa, que participa en conjunto con la proteína NS3 en la escisión de proteínas
virales. Su región N- terminal es importante para estabilizar la proteína NS3 y, por
tanto, importante en la infectividad y replicación viral (Yildiz et al., 2013).
13
d. NS3 (Non structural protein 3)
NS3 es una proteína no estructural de aproximadamente 68 kDa. Su extremo N-
terminal contiene una serina proteasa (NS3Pro) y su extremo C- terminal,
altamente hidrofílico, contiene una RNA trifosfatasa (NS3RTPasa) y una RNA
helicasa (NS3Hel) relacionadas con el capping y la síntesis de RNA,
respectivamente (Bollati et al., 2010).
NS3 participa en la infección viral, la replicación del ARN y la formación de nuevas
partículas (Faheem et al., 2019) y su actividad depende fuertemente de su unión
a una sección de 40 aminoácidos de la proteína NS2B que actúa como un factor
para el dominio proteasa de NS3 (Figura 04) (Bollati et al., 2010).
Figura 04. Representación de la proteína NS3 anclada a la membrana del retículo
endoplasmático mediante NS2B. Obtenido de Bollati et al., 2010.
e. NS4A (Non structural protein 4A)
La proteína no estructural 4A (NS4A) es una proteína hidrofóbica transmembrana
de aproximadamente 16 kDa que presenta tres regiones (Faheem et al., 2019),
14
una región N- terminal hidrofílica en el citoplasma, una región hidrofóbica asociada
a la membrana del retículo endoplasmático y un extremo C- terminal altamente
hidrofílico, llamado 2K, que sirve como señal para la translocación del NS4B hacia
el lumen del retículo endoplasmático (Idrees & Ashfaq, 2012). NS4A tiene un rol
en el remodelamiento de membrana característico de las infecciones por flavivirus,
es un antagonista de la respuesta de los interferones en el mecanismo antiviral
innato del hospedero y modula la autofagia (Klaitong & Smith, 2021).
f. NS4B (Non structural protein 4B)
La proteína no estructural 4B (NS4B) es una proteína de un peso aproximado de
27 kDa con un total de 248 aminoácidos. Está constituida por cinco segmentos
hidrofóbicos y está involucrada en la replicación viral y la inmunomodulación del
huésped (Gopala et al., 2018). Al igual que la proteína NS4A, esta juega un papel
en los rearreglos de membrana del retículo endoplasmático durante la infección
viral (Morita & Suzuki, 2021). Numerosos estudios han mostrado que NS4B de
DENV-2 interactúa con distintas proteínas del huésped, entre ellas la
fosfoglicerato quinasa (PGK1), la queratina citoesquelética 8 tipo II (KRT8) y la
enzima conjugadora de SUMO, Ube2i, que son necesarias en la replicación de
virus de ARN. Asimismo, actúa como antagonista del interferón tipo I (IFN)
bloqueando la señalización IFN- α/β (Zmurko et al., 2015).
g. NS5 (Non structural protein 5)
Es una proteína no estructural con un peso molecular aproximado de 104 kDa
(Faheem et al., 2019) y las más conservada dentro del género Flavivirus. Presenta
tres dominios funcionales; un dominio metil-tranferasa en el extremo N- terminal,
un dominio polimerasa en el extremo C-terminal y dos secuencias de localización
nuclear (Idrees & Ashfaq, 2012). El dominio metil- transferasa tiene un tamaño de
15
33 kDa y comprende los residuos 1-260/270 de la región N- terminal de la proteína
NS5. Se caracteriza por ser de estructura globular y poseer una elevada
homología estructural entre los Flavivirus debido a la conservación de un 30-90 %
de su secuencia aminoacídica (Bollati et al., 2010). El dominio polimerasa de NS5
tiene un tamaño de 74 kDa
Tiene un papel importante en la replicación viral gracias a su actividad de ARN
polimerasa dependiente de ARN (RdRP).
Figura 05. Organización genómica del género Flavivirus. Los Flavivirus codifican
una sola poliproteína con tres proteínas estructurales y siete proteínas no
estructurales. La proteína de envoltura E (consta de tres dominios) y la proteína M
se encuentran unidas a la membrana. El virión de los Flavivirus presenta dos
estados: inmaduro (smooth) y maduro (spike), este último con la proteína M
clivada del fragmento pr. Extraído de Pierson & Diamond, 2018.
16
2.5. Virus Zika (ZIKV)
El virus del Zika (ZIKV) es un arbovirus de ARN perteneciente al género Flavivirus de
la familia Flaviviridae transmitido por mosquitos del género Aedes (Wang et al., 2017)
y considerado por la Organización Mundial de la Salud como una Emergencia de Salud
Pública (Quanquin et al., 2020).
2.5.1. Estructura
El virus del Zika es de simetría icosaédrica. Contiene una nucleocápside
aproximadamente de 25-30 nm de diámetro rodeado de una bicapa lipídica derivada
de la membrana del huésped que contiene proteínas de la envoltura E y M. El virión
es de aproximadamente 40 nm de diámetro, con proyecciones superficiales que
miden aproximadamente 5 a 10 nm. El genoma de ZIKV tiene un tamaño aproximado
de 10.8 kb (10.794 nt) y las regiones 5’ UTR y 3’ UTR poseen un tamaño aproximado
de 100 y 400 nucleótidos, respectivamente. Al igual que el resto del género Flavivirus,
posee un único marco de lectura abierto (ORF) de 10 kb aproximadamente (Figura
06).
Figura 06. Organización genómica del virus del Zika. Genoma constituido por 10.8
kbs que codifica una poliproteína de tres proteínas estructurales y siete no
estructurales. Obtenido de Rombi et al., 2020.
17
2.5.2. Clasificación
El virus del Zika es un virus ARN monocatenario de polaridad positiva del género
Flavivirus, perteneciente al grupo IV de Baltimore.
2.5.3. Linajes
El virus del Zika se conforma por dos principales linajes: africano y asiático. El linaje
africano circula principalmente en las regiones de África occidental y oriental mientras
que, el linaje asiático se descubrió por primera vez en el sudeste asiático, y se
expandió posteriormente hacia las Islas del Pacífico y las Américas, siendo este el
causante de los principales brotes en estas regiones, tales como el brote de los años
2016-2017 en América (Crooks et al., 2021; WHO, 2019).
El linaje asiático ha sido asociado a los problemas neurológicos subyacentes a la
infección por Zika durante el embarazo; sin embargo, estudios recientes han sugerido
que las cepas pertenecientes al linaje africano presentan una mayor patogenicidad y
virulencia. Cuando cepas del linaje africano fueron probadas en células del trofoblasto
conllevaron a mayor muerte celular y altos títulos virales en comparación a cepas
asiáticas, indicando que estas podrían conducir directamente al término del
embarazo durante estadios tempranos, a diferencia de las cepas asiáticas, que serían
menos destructiva pero más crónicas (Sheridan et al., 2017; Simonin et al., 2017).
2.5.4. Sintomatología de la infección por ZIKV
En el caso de las personas con enfermedad sintomática, los síntomas incluyen
sarpullido, fiebre, dolor de cabeza, dolor ocular, mialgias, entre otros; y por lo general,
la enfermedad es autolimitada y los síntomas desaparecen dentro de una semana
(Ramos et al., 2020). Sin embargo, la infección con el virus del Zika también se ha
asociado con un aumento del riesgo de complicaciones neurológicas como el
Síndrome de Guillain-Barré, neuropatías y mielitis (Wang et al., 2017) y con la
18
aparición de anomalías congénitas en niños cuyas madres estuvieron expuestas al
virus durante su embarazo, siendo este conjunto de síntomas conocido como
Síndrome Congénito del Zika (CZS).
2.5.4.1. Síndrome Congénito del Zika (CZS)
El síndrome congénito del Zika (CZS) consiste en una serie de afecciones en recién
nacidos, causada por la infección de madres gestantes con el virus del Zika
(Kennedy et al., 2018). Debido a la naturaleza neurotrópica del virus, este tiene
como principales características clínicas el padecimiento de microcefalia severa,
anomalías cerebrales, pliegues cutáneos en el cuero cabelludo anomalías
oftálmicas, contracturas congénitas, hipertonía, irritabilidad y la subsecuente
presencia de secuelas neurológicas (Figura 07) (Matos et al., 2017). Se sabe que
entre el 5 % y el 42 % de niños nacidos de madres infectadas desarrollan el CZS y
que aquellas madres infectadas durante el primer trimestre de embarazo, tienen
hijos con mayor predisposición a padecerlo (Lima, 2019). El CZC es causa de
muerte fetal y aquellos niños nacidos con padecimientos neurológicos severos
como la microcefalia, no presentan un desarrollo neuropsicomotor adecuado, tales
como falta de habla o problemas para caminar con apoyo (Alves et al., 2018; Melo
et al., 2019). Por otra parte, aún se siguen descubriendo nuevos aspectos del CZS
debido al monitoreo de aquellos niños que nacieron con este padecimiento.
Problemas como obesidad debido a desórdenes hormonales, problema del corazón
y susceptibilidad a infecciones en las vías respiratorias y el tracto urinario, son
algunos de los problemas a largo plazo del CZS. Un reciente estudio aborda este
tema, donde un total de 22 niños entre 9 y 65 meses de edad con CZC fueron
evaluados, hallándose alteraciones morfológicas en el timo, bazo y nódulos
linfáticos en aquellos niños con CZS; así como alteraciones morfológicas de sus
19
linfocitos y neutrófilos y niveles altos de IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5 y IFNs tipo I (Salmeron
et al., 2022).
Figura 07. Anomalías neurológicas propias del Síndrome congénito del Zika (CZS)
como microcefalia severa y contracturas congénitas. Obtenido de Moore et al.,
2017.
2.5.5. Historia del Zika
Este se identificó por vez primera en Uganda, en 1947 en macacos de la India a
través de una red de monitoreo de la fiebre amarilla selvática. Meses después, en
enero de 1948, se efectuó una captura de mosquitos en el mismo bosque de Zika,
cerca del área donde se había efectuado el aislamiento original en monos,
20
detectando la presencia del mismo virus en los extractos preparados a partir de
ejemplares de Aedes africanus.
El primer reporte de Zika en humanos se halló en el suero de una niña de 10 años en
Nigeria en 1954 y fuera de África se encontró por primera vez en 1966 en Malasia en
mosquitos Aedes aegypti. El virus Zika se diseminó fuera del continente africano,
primero hacia la Micronesia en el 2007, luego a la Polinesia francesa entre 2013 y
2014, y finalmente a Sudamérica, América Central y el Caribe, donde emergió con
un brote epidémico de gran magnitud entre 2015 y 2016 en Brasil (Gubler et al.,
2017).
2.5.6. Mecanismos de transmisión
Las principales vías de transmisión reportadas del Zika son: vectorial, vertical
(transplacentaria, perinatal y por lactancia materna), sexual y por transfusión
sanguínea; mientras que, en su minoría, se han reportado casos de contagio por
mordeduras de monos, pinchazos por agujas, trasplantes y hemodiálisis (Runge-
Ranzinger et al., 2019).
2.5.6.1. Vectores
El virus del Zika se transmite principalmente por la picadura de un mosquito
infectado siguiendo dos ciclos principales de transmisión. El ciclo selvático, que
consiste en la transmisión y mantenimiento del virus entre el mosquito y primates
no humanos; y el ciclo urbano que consiste en la transmisión del Zika entre
mosquitos y humanos en áreas urbanas (Figura 08). Al igual que casi todos los
Flavivirus, ZIKV aún prescinde de un ciclo selvático para su mantenimiento en la
naturaleza (Musso & Gubler, 2016; Oliveira et al., 2012b).
21
En el ciclo urbano, la transmisión de ZIKV es mediada principalmente por dos
mosquitos dentro del género Aedes, Aedes aegypti y Aedes albopictus; siendo el
primero, el vector primario relacionado con los constantes brotes de la enfermedad.
Por otro lado, ZIKV ha sido aislado de otras especies de mosquitos en Asia y África,
entre ellos A. africanus, A. apicoargenteus, A. furcifer, A. luteocephalus, A. opok y
A.vittatus. A.hensilli y A.polynesiensis fueron especies reportadas como
transmisoras del virus durante los brotes de la isla Yap y la Polinesia Francesa
durante el 2007 y 2013-2014, respectivamente (Song et al., 2017).
Miembros de otros géneros como Culex quinquefasciatus se ha descrito como
vector potencial para la diseminación del Zika y ha sido aislado de ejemplares
capturados en Brasil; no obstante, son necesarios estudios de competencia
vectorial que permitan dilucidar la real capacidad del vector de transmitir la
enfermedad (del Carpio-Orantes & González-Clemente, 2017; Jones et al., 2020).
2.5.6.2. Transmisión vertical
Durante los años 2013 y 2014, el caso de dos madres y sus recién nacidos
infectados con ZIKV fue reportado en la Polinesia Francesa (Besnard,2014), lo que
sugiere una ruta de transmisión perinatal. Así mismo, se ha sugerido una posible
transmisión por lactancia (Dupont-Rouzeyrol et al., 2016), puesto que se han
detectado partículas virales de ZIKV en muestras de leche materna, y la aparición
de efecto citopático cuando las mismas muestras fueron inoculadas en líneas
celulares Vero-76 (Blohm et al., 2018).
Acerca de la transmisión transplacentaria, se tiene mayor evidencia. Esta puede
presentarse en todos los periodos de gestación; sin embargo, se ha observado que
infecciones durante el primer trimestre del embarazo presentan un mayor riesgo de
complicaciones al término del mismo, tales como defectos del sistema nervioso,
restricción de crecimiento del feto o pérdida (Robinson et al., 2018).
22
2.5.6.3. Transmisión sexual
ZIKV puede ser transmitido sexualmente por un paciente infectado a sus parejas,
esto debido a la presencia del virus en el semen, con títulos de hasta 2 × 108 copias/
mL (D’Ortenzio et al., 2016). Por tanto, se han reportado casos de transmisión
sexual de hombre a mujer, y de hombre a hombre, siendo el primer caso, el más
frecuente (Deckard et al., 2016; Fréour et al., 2016; Russell et al., 2017). Por otro
lado, ZIKV también ha sido detectado en fluidos vaginales y cervicales (Nicastri et
al., 2016; Prisant et al., 2016), haciendo posible la transmisión sexual de mujer a
hombre (Davidson et al., 2016).
2.5.6.4. Transmisión por transfusión sanguínea
ZIKV puede ser transmitido mediante transfusión sanguínea por personas
previamente infectadas (Motta et al., 2016; Musso et al., 2016). El potencial de
transmisión mediante transfusión fue demostrado en la Polinesia Francesa, en
donde un 3 % de donadores, asintomáticos, fueron positivos para infección por ZIKV
(Musso et al., 2014).
Figura 08. Ciclo de transmisión del virus del Zika: ciclo selvático y ciclo urbano.
Obtenido de Sharma et al., 2020.
23
2.5.7. Epidemiología de ZIKV en el Perú
En el Perú, se identificaron los primeros casos autóctonos de Zika, en los distritos de
Yurimaguas y Jaén en el año 2016. En el 2017, una epidemia de Zika se registró
principalmente en los departamentos de Lima e Ica, con una Tasa de Incidencia
Acumulada (TIA) de 19.2 por cada 100 000 habitantes. En el 2018, se reportaron
brotes de Zika en los departamentos de Amazonas, Ucayali y Piura y en el 2019,
brotes en Cajamarca, Huánuco y Lambayeque con una TIA de 7.2 por cada 100 000
habitantes (MINSA, 2019) . Cabe destacar que, durante el año 2020 en adelante se
observó una disminución de casos notificados de Zika, relacionado con la emergencia
sanitaria por SARS-CoV-2. Desde el año 2016 hasta el primer semestre del 2022, se
han notificado 10 999 casos confirmados (41 %) y sospechosos (59 %) de Zika
pertenecientes a 13 regiones y 133 distritos del Perú (MINSA, 2022b).
2.5.8. Vacunas y tratamiento
El tratamiento para una persona con infección por Zika es de soporte y consiste en
el control de síntomas, esto incluye hidratación constante y el uso de medicamentos
como paracetamol y acetaminofén para el dolor y la fiebre. En cuanto a las gestantes,
se recomienda llevar un control prenatal y evitar el consumo de sustancias dañinas
para el bebé (MINSA, 2016).
Si bien actualmente no existe vacuna específica aprobada contra el virus del Zika (C.
García, 2017), el desarrollo de las vacunas comenzó con la determinación de las
secuencias de los primeros aislados del virus en Brasil y la clonación de sus genes
en varios vectores.
Dentro de los objetivos de la Organización Mundial de la Salud para el desarrollo de
una vacuna contra el Zika, publicados en el 2017, se requiere principalmente que
esta permita la protección en dos escenarios. El primer escenario se contempla
durante un brote o inminente brote epidémico, donde la vacuna proteja sobre todo
24
mujeres en edad reproductiva y mujeres gestantes, con el fin de prevenir riesgos
asociados como el síndrome del Zika congénito (CZS). Mientras que, el segundo
escenario se traza sobre un periodo inter-epidémico que permita campañas de
vacunación a la población en general, desde niños hasta adultos con el fin de
establecer una inmunidad comunitaria (WHO, 2017).
La vacuna que se encuentra en una mayor fase de estudio es la desarrollada por el
National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), cuya vacuna, VRC5283,
consiste en un plásmido de ADN que codifica el precursor de la proteína de
transmembrana M (prM) y la proteína de envoltura E de una cepa salvaje de ZIKV
(H/PF/2013). En los resultados de las pruebas clínicas de la fase I, presentó una
buena protección y alta inmunogenicidad, por lo cual, en el 2017, empezó las pruebas
clínicas de la fase II/IIb con la finalidad de evaluar su seguridad, inmunogenicidad y
eficacia en adultos sanos y adolescentes (Gaudinski et al., 2018; Pattnaik et al., 2020;
Wilder-Smith et al., 2018).
Por su parte, en junio del 2021, la vacuna mRNA-1893, desarrollada por la compañía
Moderna, empezó las pruebas clínicas de la fase II con el fin de evaluar su seguridad,
tolerabilidad e inmunogenicidad en adultos entre 18 y 65 años pertenecientes a áreas
endémicas y no endémicas de Zika. Esta vacuna consiste en una secuencia de
mRNA que codifica las proteínas estructurales de ZIKV, que en fases preclínicas
mostró protección contra la transmisión del virus en ratonas preñadas, lo cual abre la
posibilidad de presentar protección contra el desarrollo del CZS en humanos (Wang
et al., 2022).
Alrededor de otras 20 vacunas contra ZIKV se encuentran en la fase I de pruebas
clínicas dentro de las cuales se tienen vacunas de ADN, mRNA, con vectores virales,
vacunas vivas atenuadas o inactivadas, pertenecientes a centros de investigación
tales como Inovio Pharmaceuticals, NIAID, Sanofi Pasteur, entre otros (Figura 09)
(Castanha & Marques, 2020).
25
Figura 09. Vacunas contra ZIKV en estudios clínicos. Vacuna de DNA, VRC5283,
con información genética de las proteínas prM y E de una cepa asiática de ZIKV y la
secuencia señal del virus de la Encefalitis japonesa (JEV), actualmente en estudios
clínicos de fase 3. Obtenido de Pierson & Diamond, 2018.
2.6. Virus Dengue (DENV)
2.6.1. Estructura
El virus dengue posee forma icosaédrica y está conformado por una membrana
lipídica, sobre la cual se insertan las proteínas de membrana y de envoltura. El virión
de dengue tiene dos formas conocidas: el virión maduro “smooth” que cuenta con un
tamaño de 50 nm de diámetro y el virión inmaduro “spiky” de 60 nm. El interior del
virus contiene el complejo riboproteico conformado por la proteína de la cápside y el
genoma viral que consiste en una única hebra de ARN de sentido positivo de 11kb
que codifica para un polipéptido único, que contiene tanto las proteínas estructurales,
como las proteínas no estructurales (Velandia & Castellanos, 2011). La región no
traducida 5’ UTR sirve como sitio de iniciación para la traducción del genoma viral,
mientras que la región UTR 3’ no presenta cola poli-A y el stem-loop presente en esta
región juega un papel importante en los cambios conformacionales de genoma viral.
La región 5’ UTR se conforma por un aproximado de 95 a 101 pares de bases en
26
cada serotipo de dengue, mientras que la longitud de la región 3’ UTR varía entre
ellos (Figura 10)(Harapan et al., 2020; Nanaware et al., 2021).
Figura 10. Organización estructural del genoma viral del dengue. Se observa el
genoma conformado por tres proteínas estructurales y siete proteínas no
estructurales. Obtenido de Nanaware et al., 2021.
2.6.2. Clasificación
El virus del dengue (DENV) es un virus de ARN monocatenario positivo,
perteneciente al grupo IV de Baltimore, miembro del género Flavivirus.
2.6.3. Serotipos
El DENV presenta cuatro serotipos: DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 que
difieren entre sí en un 25 a 40 % a nivel de aminoácidos, y se separan aún más en
genotipos que varían en hasta 3 %. La infección con cualquier serotipo de DENV
puede conducir a una variedad de resultados de la enfermedad, desde enfermedad
febril leve hasta manifestaciones hemorrágicas severas y muerte (Forshey et al.,
27
2016), siendo el principal factor de riesgo para el desarrollo de la enfermedad grave,
la reinfección por otro serotipo de DENV, lo que se da principalmente en zonas
endémicas (Diamond & Pierson, 2015).
Una quinta variante DENV-5 fue reportada en octubre del 2013, proveniente de un
hombre de 37 años hospitalizado en el año 2007 en Malasia, específicamente en un
hospital en el estado de Sarawak. Posterior a ello, este quinto serotipo solo ha sido
hallado en las zonas boscosas de Zarawak por lo que se cree que sigue un ciclo
selvático (Mustafa et al., 2015).
2.6.4. Clasificación de la enfermedad por dengue
La Organización Mundial de la Salud clasifica la enfermedad por dengue desde el
2009, en un sistema binario: Dengue (con o sin signos de alarma) y Dengue Grave
(OPS, 2016).
2.6.4.1. Dengue
2.6.4.1.1. Sin signos de alarma (DSSA)
Los principales síntomas en esta etapa son fiebre, náuseas o vómitos, mialgia,
artralgia, dolor de cabeza, leucopenia y resultado positivo a la prueba del
torniquete. En esta etapa, el paciente puede recuperarse favorablemente o
evolucionar a un cuadro clínico más grave con presencia de signos de alarma
(Martínez, 2008).
2.6.4.1.2. Con signos de alarma (DCSA)
Los signos de alarma suelen presentarse cerca a la caída de la fiebre o al cese de
esta. Estos signos de alarma son: dolor abdominal intenso, los vómitos se hacen
más frecuentes, acumulación de líquidos, irritabilidad, sangrado de mucosas,
hepatomegalia y aumento del hematocrito (Martínez, 2008). Estos síntomas
suelen indicar la posible evolución del paciente a un cuadro de dengue grave, por
28
ende, los pacientes que lo presentan deben estar en constante vigilancia médica
(OPS, 2016).
2.6.4.2. Dengue grave (DG)
La principal diferencia entre el dengue y el dengue grave es la presencia de
extravasación severa de plasma, hemorragias severas y la afectación de órganos
como el hígado, el sistema nervioso central, corazón u otros. La extravasación
severa del plasma conduce a un shock hipovolémico (Síndrome del choque del
dengue) o a la dificultad respiratoria por acumulación de líquidos (Martínez, 2008).
Esta es la forma más severa de la enfermedad, siendo un factor de riesgo para su
desarrollo, la infección con un serotipo de dengue distinto al de la primera
infección, siendo la hipótesis más aceptada, el fenómeno de “Amplificación
dependiente de anticuerpos” (ADE). Los anticuerpos existentes generados en una
infección previa con un serotipo de dengue se unen a los virus de la nueva
infección, el complejo antígeno- anticuerpo formado es internalizado
principalmente por macrófagos; sin embargo, el virus no es neutralizado y esto
facilita la entrada a las células de nuevos virus y a su replicación, lo que resulta en
una amplificación de la infección y un mayor riesgo de desarrollar dengue grave
(Figura 11)(Oliveira et al., 2012).
Figura 11. Amplificación dependiente de anticuerpos (ADE) del virus del dengue.
Anticuerpos heterotípicos de una infección previa con DENV se unen, pero no
neutralizan las nuevas partículas virales de DENV, facilitando la entrada del virus
en los monocitos circundantes. Obtenido de Whitehead et al., 2007.
29
2.6.5. Historia del Dengue
El primer reporte de caso definitivo de dengue data del 1779; no obstante, reportes
de casos compatibles con la enfermedad por dengue se remontan a muchos años
atrás. La trata de esclavos y el comercio entre África y las Américas fueron la causa
de la expansión del mosquito Aedes aegypti al nuevo continente y fue hasta 1906
que la transmisión por el mosquito Aedes fue confirmada. Para el año 1907 el dengue
se proclamaba como la segunda enfermedad que se conocía, que era causada por
un virus. Durante la Segunda Guerra Mundial hubo una marcada expansión de este
virus y de sus serotipos. Las formas severas de la enfermedad fueron por primera
vez reportadas en Filipinas en 1953; en los años 70, se había convertido en la mayor
causa de mortalidad infantil en el Pacífico y parte de América. La fiebre hemorrágica
y el choque por dengue fueron por primera vez referidas en América Central y
Sudamérica en 1981, en personas que habían contraído el serotipo DENV-2, y que
ya habían tenido contacto previo con el serotipo DENV-1. A principios de los años
2000, el dengue se volvió la segunda enfermedad más común transmitida por
mosquitos, que afectan a los seres humanos (Gubler, 2006).
2.6.6. Epidemiología del Dengue en el Perú
El dengue es una enfermedad endémica en el Perú, cuyos primeros reportes
compatibles con la enfermedad, más no confirmados, datan de los años 1700, 1818,
1850 y 1876 (Cabezas et al., 2015). En el año 1990 ocurrió un brote epidémico de
dengue causado por el serotipo DENV-1, año desde el cual han existido constantes
brotes en nuestro país. En el Perú se encuentran circulando los cuatro serotipos de
dengue (Cabezas et al., 2015); principalmente el serotipo DENV-2; mientras que, en
Madre de Dios, se confirmó una nueva variante, denominada DENV-2 Cosmopolitan
(MINSA, 2020). La presencia de casos graves y fatales en nuestro país ha tenido
30
correlación con el ingreso del linaje DENV-2 genotipo americano/asiático a finales del
2010 (Durand et al., 2011).
A inicios del año 2022, los casos de dengue en nuestro país aumentaron
sustancialmente, emitiéndose una alerta epidemiológica en la SE-12 debido al
incremento de casos y la co-circulación de DENV-1 y DENV-2. Además, hubo un
aumento del número de distritos con presencia del vector Aedes aegypti, con un total
de 528 distritos en 22 regiones del país (MINSA, 2022a).
En lo que va del 2023 (SE-15-2023), se han reportado 47 655 casos de dengue en el
país y 49 fallecidos, un número 87.3 % mayor en comparación al mismo periodo en
el año 2022 (MINSA, 2023). Actualmente presenta una tasa de incidencia acumulada
a nivel nacional de 140,85 por cada 100 mil habitantes hasta la Semana
Epidemiológica SE-15-2023, y un total de 438 distritos con al menos un caso de
dengue, siendo Piura, Ucayali y Loreto, los departamentos con la mayor cantidad de
casos (MINSA, 2023).
Además de la presencia del vector, los casos de dengue en nuestro país están
asociados a factores ambientales y geográficos. La temperatura y el Fenómeno de
El Niño aumentan el riesgo de aparición de brotes de dengue (Dostal et al., 2022).
2.6.7. Mecanismos de transmisión
Las formas más comunes de transmisión de DENV son la transmisión vectorial,
vertical y por trasfusiones sanguíneas; no obstante, las formas menos comunes de
transmisión incluyen infección por trasplantes o por trabajos en entornos de
laboratorio como es el caso de infecciones por pinchazos, para lo cual se han
reportado muy pocos casos (Chen & Wilson, 2004).
2.6.7.1. Vectores
Si bien el virus del dengue se transmite mediante un ciclo urbano y un ciclo
selvático, este está tan bien adaptado a los humanos que es el único miembro del
31
género Flavivirus que no requiere de sus reservorios animales para su
mantenimiento en la naturaleza. En el ciclo urbano, el virus es transmitido
principalmente por mosquitos Aedes aegypti y Aedes albopictus, siendo el primero
su vector principal, puesto que ha sido asociado a epidemias a gran escala
(Diamond & Pierson, 2015). Aedes aegypti se distribuye en áreas tropicales y
subtropicales, principalmente en ambientes urbanos; mientras que, Aedes
albopictus, se encuentra en áreas templadas y ambientes rurales (Rocklöv & Tozan,
2019). Aedes albopictus, es el vector secundario del dengue en Asia y está presente
en todos los continentes a excepción de la Antártida. En las Américas se encuentra
presente en 21 países; sin embargo, aún no existen reportes de su presencia en
nuestro país (Garcia-Rejon et al., 2021).
En el ciclo selvático, que se lleva a cabo principalmente en el sudeste asiático y en
África occidental, Aedes luteocephalus, A. furcifer y A. taylori son los vectores
principales (Harapan et al., 2020).
2.6.7.2. Trasmisión vertical
Aunque no existe mucha información sobre la transmisión vertical del dengue y es
un tipo poco común de transmisión; los casos reportados a la fecha han asociado
la infección por dengue durante el embarazo con complicaciones en la madre y el
feto y un aumento en el riesgo de muerte materna, muerte fetal y muerte neonatal
e incluso el riesgo de desarrollo de dengue grave en la madre (Morgan et al., 2014;
Rathore et al., 2022).
2.6.7.3. Transmisión por transfusiones
La presencia de casos asintomáticos, que se estima puede ser de 7 por cada
sintomático; aumenta el riesgo de infección por transfusión sanguínea de dengue.
En algunos países endémicos, se ha estimado que el riesgo de transmisión por
transfusiones sanguíneas del virus dengue es de 1.6- 6 por cada 10 000 donaciones
(Cerdas, 2013; Leyva, 2020).
32
2.6.8. Vacunas y Tratamiento
No existe terapia antiviral específica contra el virus del dengue, por ello, el tratamiento
de los pacientes con dengue continúa siendo sintomático y de soporte, y consiste en
la hidratación adecuada, control de la fiebre, del dolor del músculo esquelético y la
detección de los signos de alarma (INS, 2016). Por otro lado, la vacuna comercial
contra dengue, Dengvaxia de Sanofi Pasteur, presenta ciertas limitaciones, por ende,
no es utilizada de manera rutinaria en nuestro país.
La primera vacuna aprobada contra el dengue, Dengvaxia (CYT-TDV), es una vacuna
tetravalente de virus vivo atenuado que es una quimera de la cepa 17D del virus de
la fiebre amarilla y genes prM y E de los cuatro serotipos de dengue, mas no incluye
las proteínas no estructurales del virus dengue (U.S. Food and Drug Administration,
2015). La eficacia de esta vacuna responde a factores de edad, serotipo y estado
serológico, es así que reportes recientes muestran que la vacuna es eficaz solo en
personas con infección previa a dengue, mientras que, en personas seronegativas,
existe un elevado riesgo de desarrollar formas severas de la enfermedad (INS, 2018).
Además, no se recomienda su uso en mujeres embarazadas, lactantes, personas
con VIH, inmunocomprometidos, viajeros o trabajadores sanitarios. En
Latinoamérica, se ha reportado una eficacia de esta vacuna del 74 % para DENV-3,
77.7 % para DENV-4, 50.3 % para DENV-1 y una baja eficacia para DENV-2, lo que
resulta preocupante, puesto que DENV-2 es considerado el serotipo más virulento
(Palomares-Marín J et al., 2018). En ese sentido, la Organización Mundial de la Salud
ha recomendado su introducción en zonas de alta endemicidad, de al menos un 80
%, y la implementación de una estrategia de screening previo a la vacunación en
orden de determinar el estatus serológico de la persona (WHO, 2018).
Actualmente dos vacunas más se encuentran en la fase III de los ensayos clínicos
con la similitud de que ambas son también vacunas de virus vivo atenuado. La
vacuna TAK-003 (TDV) de Takeda Pharmaceuticals, es una vacuna tetravalente que
33
se basa en la estructura de una cepa atenuada de DENV-2 que contiene los genes
estructurales prM y E de los serotipos DENV-1, DENV-3 y DENV-4, y, a diferencia de
Dengvaxia, esta sí contiene proteínas no estructurales. En las pruebas clínicas de
fase 3/3b, TAK-003 mostró una eficacia de 76.1 % en individuos seropositivos y 66.2
% para aquellos seronegativos. Esta eficacia varió entre serotipos con 69.8 % contra
DENV-1, 95.1 % contra DENV-2, 48.9 % contra DENV-3 y 51.0 % contra DENV-4
(Wilder-Smith, 2020). TetraVax-DV (TV-003/005) del NIAID/Instituto Butantan,
comprende los genomas completos de los serotipos 1, 3 y 4 de dengue y un cuarto
componente quimérico en el cual los genes prM y E de DENV-2 reemplazan a los de
DENV-4. A diferencia de CYD-TDV y TAK-003, sus estudios indican que solo una
dosis es requerida (Figura 12)(Kirkpatrick et al., 2015; Swaminathan & Khanna, 2019;
Whitehead, 2016).
Figura 12. Composición de la vacuna comercial contra el dengue, Dengvaxia (CYT-
TDV) de Sanofi Pasteur y la vacuna en fase 3 TV003/005 del NIAID/Instituto
Butantan. Obtenido de Whitehead, 2016.
34
2.7. Cultivo celular
Se conoce como cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento
de células obtenidas de distintas fuentes, en un ambiente controlado de temperatura,
pH y nutrientes. En la actualidad y desde sus inicios, la técnica de cultivo celular ha
permitido el desarrollo de vacunas contra virus de importancia en salud pública, desde
que se comprobó su utilidad en la propagación del virus de la polio en diferentes líneas
celulares y el posterior desarrollo de su vacuna (Taylor, 2014). Así mismo, la
evaluación de fármacos en cultivos celulares contra diversos patógenos, ha tenido un
amplio desarrollo en las ciencias de la salud, puesto que es un sistema efectivo para
la evaluación de la toxicidad de muchos compuestos y un elemento valioso para
determinar el impacto sobre la proliferación celular, citotoxicidad y efectos
antioxidantes (Acevedo Fernández et al., 2013).
2.7.1. Líneas celulares
El desarrollo de la vacuna de la polio permitió un gran avance en el desarrollo de los
cultivos celulares; sin embargo, se presentaron distintas problemáticas como temas
de contaminación o la poca duración de los cultivos pues eran inicialmente cultivo
primario o no se podían utilizar a gran escala. Problema que luego fue resuelto con
la creación de medios de cultivo adecuados y la llegada de las líneas celulares
continuas, que tienen la característica de presentar crecimiento infinito bajo las
condiciones y cuidados adecuados; no obstante, no fueron utilizadas con este fin
hasta que se pudo comprobar que no presentaban potencial tumorigénico. Es así que
la Organización Mundial de la Salud autorizó el uso de líneas celulares continuas
para la producción de vacunas humanas, siendo las células Vero, las primeras en ser
autorizadas y actualmente las más utilizadas para este fin (Barrett et al., 2017).
La línea celular Vero proviene de células del riñón de mono verde africano
Chlorocebus sabaeus (antes Cercopithecus aethiops) y tiene la ventaja de permitir el
35
crecimiento de un amplio rango de virus pues no produce interferón alfa o beta
después de una infección viral, debido a una deleción en el cluster de genes del
interferón tipo I. Las células Vero se pueden separar en cuatro principales sublineas
celulares: Vero E6 (Vero C1008), Vero JCRB0111, Vero CCL-81 y Vero 76, las cuales
presentan algunas variantes en sus genomas que contribuyen a sus diferencias
fenotípicas (Konishi et al., 2022).
Los virus del dengue y del Zika producen un efecto citopático (ECP) marcado en las
células Vero. Células Vero infectadas con el virus del dengue o del Zika muestran la
formación de vesículas y vacuolas en las primeras 24- 72 horas post-infección, siendo
este el rasgo más evidente cuando son observadas por microscopía electrónica.
Macroscópicamente, esto se evidencia en el desprendimiento de la monocapa debido
a la lisis celular, y redondeamiento celular (Figura 13)(Barreto et al., 2017; Matsumura
et al., 1971; Sherman et al., 2019).
Figura 13. Efecto citopático de ZIKV en células Vero. Se observa redondeamiento
celular y citólisis 72 horas post- infección. Obtenido de Barreto et al., 2017.
Otras líneas celulares de importancia incluyen las células CHO (Chinese hamster
ovary cells) que son un modelo biológico, son usadas para la producción de fármacos
recombinantes y citocinas, y para el estudio de la morfología del cromosoma (Taylor,
2014); la línea celular HEK293 (Human embryonic kidney 293 cells); las células HeLa
36
(Henrietta Lacks cells); la línea celular MDCK (Madin-Darby canine kidney cells),
BHK21 (Baby hamster kidney cells), entre otras (Verma, 2014).
2.7.2. Prueba de plaqueo
La prueba de plaqueo fue desarrollada por Salvatore Luria, con el propósito de
cuantificar fagos en cultivo celular. Posteriormente, Renato Dulbecco, usando el
mismo principio, demostró que se podían cuantificar distintos virus humanos, como
el poliovirus, mediante la misma técnica (Dulbecco & Vogt, 1953).
La prueba de plaqueo se basa en que algunos virus al caer sobre una superficie
celular, son capaces de generar espacios en blanco en la monocapa, conocidos
como placas o calvas líticas, esto debido a la muerte celular por la replicación del
virus y la infección del mismo sobre las células adyacentes a la inicial (Figura 14).
Considerando que estos virus provienen de un único virus inicial en la semilla, se
realizan diluciones conocidas de esta y se inoculan sobre la monocapa, permitiendo
su cuantificación. Para evitar que las nuevas partículas virales se propaguen
indiscriminadamente sobre toda la monocapa y entorpezcan la cuantificación, se
utiliza un medio de recubrimiento sólido o semisólido como agar o
carboximetilcelulosa. A su vez, para mejorar la visibilidad de las placas, se suelen
utilizar colorantes como el cristal violeta o el Naphthol blue black (Taylor, 2014).
Figura 14. Placas obtenidas de la titulación de ZIKV en células Vero - 76, 6 días post-
infección.
37
2.7.3. Prueba de Neutralización por Reducción de placas (PRNT)
La prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT) es una técnica que
permite la detección y cuantificación de anticuerpos neutralizantes en una muestra
de suero enfrentándolo con una concentración viral conocida y calculando el
porcentaje de reducción de las placas virales (Zannoli et al., 2018).
Es la prueba Gold Standard para medir los anticuerpos contra Dengue y es
generalmente utilizada para observar la respuesta serológica a vacunas de dengue
y estudios de seroprevalencia (INS, 2016). En el diagnóstico de Zika, esta prueba es
usada para la detección de anticuerpos específicos cuando se tienen resultados
inconclusos o cuando se desea verificar una posible reacción cruzada de anticuerpos
IgM, sobre todo en áreas donde más de un flavivirus es endémico (Chua et al., 2017;
Loyola et al., 2021).
El principio de inhibición de placas puede ser utilizado para evaluar la actividad
antiviral de extractos vegetales, conociéndose esta técnica como Ensayo de
Inhibición de Placas (Rodríguez- Ortega et al., 2013).
38
III. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
3.1. HIPÓTESIS
El aceite esencial de Ophryosporus peruvianus presenta actividad antiviral in vitro
mayor al 50 % (PRP50) contra ZIKV y DENV-2.
3.2. OBJETIVO GENERAL
- Determinar el potencial antiviral in vitro del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus contra los virus de ZIKV y DENV-2, en la línea celular Vero- 76.
3.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Determinar la máxima concentración no citotóxica (MNCC) del aceite esencial de
Ophryosporus peruvianus en la línea celular Vero- 76.
- Determinar el porcentaje de inhibición viral del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus contra ZIKV en la línea celular Vero- 76.
- Determinar el porcentaje de inhibición viral del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus contra DENV-2 en la línea celular Vero- 76.
39
IV. MATERIALES
4.1. MATERIAL BIOLÓGICO
- Aceite esencial de Ophryosporus peruvianus.
- Línea celular Vero-76
- Semilla viral de ZIKV
- Semilla viral de DENV-2.
4.2. MATERIAL DE LABORATORIO
4.2.1. Reactivos
- Suero Bovino Fetal (F4135 Sigma)
- Ácido acético glacial
- Agua bidestilada
- Alcohol 70°
- Aminoácidos no esenciales 100X (M7145 Sigma)
- Antibiótico- antimicótico 100X (A5955 Sigma)
- Dimetilsulfóxido (13-0091-01 LGC Biotecnología)
- E- MEM (11700-077 GIBCO)
- Hepes (H4034 Sigma)
- Hipoclorito de sodio 5 %
- L- Glutamina 200mM (G7513 Sigma)
- Solución Bicarbonato de Sodio 7.5 % (S8761 Sigma)
- Naphthol Blue Black 25g (N9002 Sigma)
- Sodio piruvato 100 mM (S8636 Sigma)
- Sulfato de sodio anhidro (010264 CDH)
- Tripsina- EDTA (T4049 Sigma)
40
4.2.2. Material plástico
- Cámara de Neubauer
- Cinta masking tape
- Frascos de cultivo celular de 25 cm2 (70125 SPL Life Sciences)
- Frascos de cultivo celular de 75 cm2 (70175 SPL Life Sciences)
- Gasa aséptica
- Guantes de nitrilo
- Microplacas de 96 pozos (30096 SPL Life Sciences)
- Microplacas de 24 pozos (30024 SPL Life Sciences)
- Parafilm
- Pipetas serológicas desechables (08313010 ISOLAB)
- Filtros de membrana de 0.22 µm
- Puntas estériles con filtro de 1000 µl (TF-1000-L-R-S Axygen)
- Puntas estériles con filtro de 20 – 200 µl (TX- 523L Axygen)
- Tubo de centrífuga de 50 mL (07802004 ISOLAB)
- Tubo de centrífuga de 15 mL (07802002 ISOLAB)
- Tubos de microcentrífuga 1.5 mL (07803022 ISOLAB)
- Tubos de microcentrífuga 0.5 mL (07803021 ISOLAB)
4.2.3. Equipos
- Autoclave
- Balanza analítica
- Cabina de Bioseguridad Clase 2 Tipo A-II
- Incubadora
- Vórtex XH- D
- Baño María
- Tanque de Nitrógeno
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- Microscopio invertido
- Micropipeta de 1000 µl ISOLAB
- Micropipeta de 200 µl Watson
- Micropipeta de 10 µl Watson
V. METODOLOGÍA
5.1. Recolección de muestra de Ophryosporus peruvianus.
Ophryosporus peruvianus fue colectada en el distrito de Canta, provincia de Canta,
región Lima (11°28'33.0" S; 76°37'40.1" W) a 2791 msnm. La determinación de la
especie fue realizada en el Herbario del Museo de Historia Natural de la Universidad
Nacional Mayor de San Marcos (N° 063-2022-USM-MHN) (Anexo 01.D).
hidrodestilación por arrastre de vapor.
La extracción del aceite esencial fue realizada mediante el método de hidrodestilación
por arrastre de vapor en un equipo tipo Clevenger. Se realizaron 3 procesos de
extracción a partir de muestras de tallos y hojas de la planta. Estas muestras fueron
cortadas usando guantes y tijeras estériles e incorporada al balón esmerilado con agua
bidestilada. Cuando se inició el proceso de evaporación, fue agregado el éter de
petróleo en el tubo receptor del equipo, para recuperar las gotas de aceite esencial
extraído (Anexo 01.E). Cada proceso de hidrodestilación duró un tiempo aproximado
de 3 h desde el momento en que el agua bidestilada empezó a ebullir.
El aceite esencial fue separado del agua, deshidratando la mezcla con sulfato de sodio
anhídrido y el éter de petróleo eliminado por evaporación. El aceite esencial fue
almacenado a -20 °C en frascos de color ámbar.
42
5.3. Descongelamiento de células Vero-76.
Los viales de células Vero-76 almacenadas en nitrógeno líquido fueron descongelados
en baño maría a 37 °C y el contenido del vial fue transferido a un frasco de cultivo T-
25 con medio de crecimiento (MC). Una hora después el medio fue retirado y
reemplazado por nuevo. Finalmente, el frasco de cultivo fue incubado en condiciones
herméticas a 37 °C sin CO2, hasta la formación de monocapa.
5.4. Propagación de la línea celular
Cuando las células llegaron a formar monocapa, se retiró el medio del frasco de cultivo
y se agregó 1 mL de tripsina- EDTA, a manera de prelavado. La tripsina- EDTA fue
retirada y se volvió a agregar 1.5 mL. El frasco fue incubado durante 10 min a 37 °C y
se agregó MC para estabilizar las células. El contenido fue homogenizado y repartido
en frascos de cultivo T-75. Se dejó incubando a 37 °C sin CO2, en condiciones
herméticas hasta la formación de la monocapa.
5.5. Preparación de placas de cultivo celular.
Se utilizaron células Vero-76 propagadas en frascos de cultivo T-75. Las células fueron
disgregadas del frasco con tripsina - EDTA, como se mencionó anteriormente. Una vez
se tuvieron las células separadas del frasco, fueron centrifugadas a 3000 rpm durante
10 min y se eliminó el sobrenadante. El pellet obtenido fue resuspendido en Medio de
Crecimiento (MC) y se realizó el conteo celular con azul de tripán en cámara de
Neubauer. Las células fueron llevadas a una concentración de 1.25 x 10 5 células/mL
en Medio de Crecimiento. Para placas de 96 y 24 pozos, fueron agregados 100 µL y
500 µL de suspensión celular por pocillo, respectivamente. Finalmente, las placas
fueron incubadas a 37 °C sin CO2 en condiciones herméticas, por 48 h hasta la
formación de la monocapa.
43
5.6. Análisis de citotoxicidad del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus.
Se preparó una solución madre del aceite esencial (AE) con Tween 80 - etanol (T-E)
(1:0.5) que consistió en 25 µl de AE y 100 µl de T-E. Se realizaron diluciones de la
solución madre, desde 1/120 a 1/5000, usando Medio de Mantenimiento (MM) como
diluyente y fueron incubadas a 37 °C durante 1 h. Pasado ese tiempo, cada dilución
del aceite esencial fue inoculada por triplicado en los pocillos en placas de 96 pozos,
que contenían las células Vero- 76, para luego incubar la placa a 37 °C sin CO2, en
condiciones herméticas, durante 6 días. Para analizar la citotoxicidad del Tween 80-
etanol (T-E), se prepararon diluciones de este compuesto a partir de una solución
madre de 100 µL de TE y 25 µL de MM (Control de T-E) y se realizó el procedimiento
descrito anteriormente.
5.7. Replicación de la semilla de ZIKV y DENV- 2 en línea celular Vero- 76.
5.7.1. Semilla viral
Se utilizó una semilla de ZIKV, con 3 pasajes previos en células Vero- 76, y una
semilla de DENV-2, con 11 pasajes previos en células Vero- 76, ambas
pertenecientes al laboratorio de Virología Molecular y Clínica de la Universidad
Nacional Mayor de San Marcos.
5.7.2. Infección de la línea celular Vero-76.
La semilla viral de ZIKV o DENV-2 almacenada a -80 °C fue descongelada a 4 °C,
manteniendo la cadena de frío. Se realizó una dilución de 1:5 de la semilla viral en
Medio de Mantenimiento (MM) y 300 µL fueron inoculados en un frasco de cultivo T-
25 con células Vero- 76 con confluencia de 90- 100 %, a la cual se le había retirado
el medio de cultivo. El frasco fue incubado durante 1 h a 37 °C. Posteriormente se
agregó 5 mL de MM al frasco y se incubó en condiciones herméticas a 37 °C. El
cultivo fue observado diariamente hasta la aparición de efecto citopático (ECP).
44
5.7.3. Cosecha viral
Una vez observado el efecto citopático (ECP) de tres cruces (3+) en las células Vero-
76 (Anexo 06), se procedió con la cosecha viral. El sobrenadante en el frasco fue
recolectado en un tubo de centrífuga, y centrifugado a 3000 rpm, por 10 min a 4 °C.
El sobrenadante obtenido fue alicuotado en crioviales y estos fueron almacenados a
-80 °C (Anexo 03.C).
5.8. Titulación de la semilla viral de ZIKV en la línea celular Vero-76 mediante
prueba de plaqueo.
Se siguió la metodología empleada por Quispe (2018) con algunas modificaciones. Se
realizaron diluciones seriadas en Medio de Mantenimiento (MM) de la semilla viral de
ZIKV pasaje 4, desde 10-3 hasta 10-5. Se añadieron 50 µL/pozo de cada dilución por
triplicado en células Vero- 76 en monocapa previamente plaqueadas en placas de 24
pozos (método en monocapa). Las placas fueron incubadas durante 3 h a 37 °C con
movimiento cada hora para evitar el secado. Finalmente, fueron agregados 500
µL/pozo de medio de recubrimiento sobre cada pozo y las placas selladas e incubadas
a 37 °C sin CO2 durante 6 días hasta su coloración.
Se realizó una prueba de ajuste del título viral previa a la prueba de reducción, donde
fueron preparados distintos controles virales (CV) en MM considerando un rango de
títulos de 5 - 9×106 UFP/mL. La semilla viral de ZIKV fue descongelada a 4°C y se
preparó la solución de trabajo (ST) de manera que contenga 40 UFP/50 µL. Para
obtener los CV, los ST preparados fueron mezclados en proporción 1:1 con MM, de
manera que los CV contengan 20 UFP/50 µL. Los CV fueron incubados por 1 h a 37
°C y posteriormente inoculados por triplicado en placas de 24 pozos con células Vero-
76 en monocapa. Las placas fueron incubadas durante 3 h con movimiento cada hora.
Se agregó 500 µL de medio de recubrimiento en cada pozo y las placas fueron selladas
e incubadas a 37 °C sin CO2 durante 6 días.
45
5.9. Prueba de reducción de placas de ZIKV.
Se siguió la metodología empleada por Quispe (2018) con algunas modificaciones. Se
prepararon las diluciones 1/1000, 1/1500, 1/2000, 1/2500 y 1/3000 del aceite esencial
y del control de T-E. Así también, se preparó una dilución de la semilla viral de ZIKV
en MM, que contenía aproximadamente 40 UFP/50 µL (Solución de trabajo -ST), según
los datos obtenidos en la titulación. La mezcla extracto antiviral - ST (1:1) y el control
viral (CV), conteniendo ST - MM (1:1), fueron incubados a 37 °C durante 1 h. Se inoculó
50 μL/pozo por triplicado de cada dilución sobre una placa de 24 pozos que contenía
células Vero-76 en monocapa y se incubó la placa durante 3 h con movimiento cada
hora para evitar el secado. Finalmente fue añadido el medio de recubrimiento y las
placas fueron selladas e incubadas a 37 °C sin CO2 durante 6 días.
5.10. Titulación de la semilla viral de DENV- 2 en la línea celular Vero-76 mediante
prueba de plaqueo.
Para la titulación de DENV-2 se siguió lo recomendado por Sevilla (2018). Se
prepararon placas de 24 pozos con células Vero- 76 a una concentración de 2.5 x 105
células/mL, las cuales fueron incubadas durante 1 h a 37ºC selladas herméticamente
(método en suspensión). Durante este tiempo, se realizaron diluciones seriadas en
medio de mantenimiento (MM) de la semilla viral de DENV- 2 desde 10-1 hasta 10-7.
Pasada la hora de incubación, se añadió 50 µL/pozo de cada dilución por triplicado.
Las placas fueron incubadas durante 4 h a 37 °C. Finalmente, se agregaron 500
µL/pozo de medio de recubrimiento y las placas fueron selladas e incubadas a 37 °C
sin CO2 durante 9 días hasta su coloración.
Para la prueba de ajuste de título viral, se prepararon células Vero -76 a una
concentración de 2.5 × 105 cel/mL y se agregó 500 µL de suspensión celular en placas
de 24 pozos. Paralelamente, la semilla de DENV-2 fue descongelada y se preparó la
solución de trabajo (ST) de manera que contenga 40 UFP/50 µL, considerando los
46
títulos del 2.5 y 3×105. Para obtener los CV, se mezcló cada ST con MM en proporción
1:1, de manera que los CV contengan 20 UFP/50 µL. Las placas y los CV fueron
incubados por 1 h a 37 °C y posteriormente, inoculados por triplicado en las placas.
Las placas fueron incubadas durante 4 h. Se agregó 500 µL de medio de recubrimiento
en cada pozo y se incubó las placas selladas a 37 °C sin CO2 durante 9 días.
5.11. Prueba de reducción de placas de DENV- 2.
Para la prueba de reducción de placas de DENV-2 se siguió la metodología de Sevilla
(2018) con algunas modificaciones. Se prepararon las diluciones 1/500, 1/1000, 1/1500
y 1/2000 del aceite esencial y del control de T-E. Por otro lado, se preparó una dilución
de la semilla viral de DENV-2 en MM, que contenía aproximadamente 40 UFP/50 µl
(Solución de trabajo -ST), según los datos obtenidos en la titulación. La mezcla extracto
antiviral - ST (1:1) y el control viral (CV), conteniendo ST - MM (1:1), se incubaron a 37
°C durante 1 h.
Paralelamente, se prepararon placas de 24 pozos de células Vero-76 a una
concentración de 2.5 x 105 cel/mL y se incubaron a 37 °C por 1 h en condiciones
herméticas. Se inoculó 50 μL/pozo por triplicado de cada dilución y del control (CV)
sobre las células. Las placas fueron selladas herméticamente e incubadas a 37 °C por
4 h. Se adicionó 500 μL de medio de recubrimiento por pozo. Las placas fueron
incubadas a 37° C en condiciones herméticas a 37 °C sin CO2 durante 9 días.
Para la coloración, el colorante Naphthol Blue Black (NBB) fue agregado a cada pocillo
y las placas se dejaron reposando en el colorante durante 12 h. Posteriormente, los
restos de colorante fueron eliminados y se realizó el análisis respectivo. Para las
pruebas de titulación, ajuste y reducción, se retiró previamente el medio de
recubrimiento.
47
5.12. Análisis de resultados
5.12.1. Prueba de citotoxicidad
Se observó el porcentaje de desprendimiento de la monocapa celular de la mezcla
AE + T-E y del control MM + T-E. Según los resultados obtenidos de esta prueba, se
trabajaron las diluciones para la prueba de reducción.
5.12.2. Titulación de las semillas virales
Se calculó el título de ZIKV y DENV-2 mediante prueba de plaqueo, considerando el
promedio de placas (UFP) que aparece por cada dilución trabajada, según la
siguiente ecuación (Anexo 04).
En la prueba de ajuste del título viral, fue seleccionado el título cuyo control viral (CV)
fuese mayor a 20 UFP/50 µL.
5.12.3. Prueba de Reducción de Placas (PRP)
El porcentaje de reducción de placas para cada mezcla ST – (AE- T-E) fue calculado
en relación al promedio de control de virus (CV), al igual que para el control de Tween
80 ST- (MM + T-E). Cuando el porcentaje de reducción fue mayor al 50 % se
consideró que el AE seleccionado presentaba actividad inhibitoria contra el virus
analizado.
A su vez, se calculó el porcentaje de reducción de cada mezcla ST – (AE- T-E), con
respecto al control de Tween 80 ST- (MM + T-E).
5.12.4. Análisis estadístico
Los gráficos y estadísticos descriptivos fueron obtenidos mediante el programa SPSS
v24 y Excel 2016.
48
VI. RESULTADOS
hidrodestilación por arrastre de vapor.
Durante los 3 procesos de extracción de O. peruvianus, fueron obtenidos un total de
3.47 gramos de aceite esencial de Ophryosporus peruvianus de un total de 749.11
gramos de planta. Los resultados se muestran en la Tabla 01. Para hallar el valor de
la densidad del AE, se pesó un volumen 100 µL de AE, obteniéndose como densidad
un valor de 0.88 kg/L, que fue utilizado para los cálculos de concentración en µg/mL.
Tabla 01. Resultados del proceso de extracción del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus mediante el método de hidrodestilación por arrastre de vapor.
N° Extracción Peso de la planta (g) Peso del aceite esencial (g)
1° 279.7 1.329
2° 263.72 1.021
3° 205.69 1.12
Total (gramos) 749.11 3.47
Promedio (gramos) 249.70 1.157
49
6.2. Citotoxicidad del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus sobre la
línea celular Vero-76.
Los resultados de la prueba de citotoxicidad del AE sobre las células Vero-76, se
muestran en la Tabla 02 y el Anexo 05 en porcentaje de desprendimiento de la
monocapa celular. La máxima concentración no citotóxica (MNCC) del aceite esencial
sobre la línea celular Vero- 76 se encontró en la concentración 70.4 µg/mL, mientras
que en el control de Tween 80- etanol (T-E), se halló en 122.22 µg/mL.
Tabla 02. Citotoxicidad del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus sobre la línea
celular Vero-76.
Desprendimiento de Monocapa (%)

Concentración
Dilución T-E + AE T-E + MM
(µg/mL)
d1 1/120 1466.67 100 100
d2 1/480 366.67 100 90
d3 1/960 183.3 100 50
d4 1/1440 122.22 90 0
d5 1/1920 91.67 20 0
d6 1/2500 70.4 0 0
d7 1/3500 50.29 0 0
d8 1/4000 44 0 0
d9 1/5000 35.2 0 0
T-E: Tween 80- Etanol, AE: Aceite esencial, MM: Medio de mantenimiento.
50
6.3. Título viral del ZIKV en línea celular Vero-76.
La semilla viral de ZIKV fue propagada en células Vero-76 mostrando ECP al día 5
post-infección (Anexo 06.A). En la prueba de titulación, el título de la semilla de ZIKV
pasaje 4 fue en promedio de 8.18 × 106 UFP/mL (Tabla 03). En la prueba de ajuste, el
título seleccionado para las posteriores pruebas de reducción fue de 8.5 × 106 UFP/mL
(Tabla 04).
Tabla 03. Título del ZIKV pasaje 4 mediante prueba de plaqueo sobre la línea celular
Vero-76.
Dilución
10-3 1:2000 1:5000 10-4 1:20000 1:50000 10-5

Promedio
NC NC NC 26.67 18 8.67 4.33
UFP/pozo
Título viral
- - - * 7.2×106 8.67×106 8.66×106
(UFP/mL)
Log10 Título
- - - * 6.86 ± 0.12 6.93 ± 0.25 6.92 ± 0.38
viral
IC 95 %
(6.74-6.98) (6.68-7.18) (6.54-7.3)
(Log10)
Título viral
promedio
8.18 ×106 UFP/mL
(UFP/mL)
log10 ± IC 6.903 ± 0.094
NC: No contable, *: superposición, UFP: Unidad formadora de placa, IC 95 %: Intervalo de
confianza al 95 %.
Tabla 04. Prueba de ajuste del Control Viral (CV) del ZIKV pasaje 4 para la prueba de
Título viral (UFP/mL) ×106
5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9

Control Viral
promedio * * * * * 26.67 26.50 23.67 21
(UFP/pozo)
Título viral TS
UFP: Unidad Formadora de Placa, TS: Título viral seleccionado, *: superposición.
51
6.4. Inhibición del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus contra el ZIKV.
El aceite esencial de Ophryosporus peruvianus no presentó efecto inhibitorio in vitro
contra ZIKV. A la concentración de 70.4 µg/mL se obtuvo un porcentaje de reducción
del 35.8 %, considerando la acción inhibitoria propia del Tween 80- etanol. Este efecto
también se visualiza en concentraciones mayores a 70.4 µg/mL, mientras que, a
menores concentraciones, ni el Tween 80- etanol ni el aceite esencial inhiben
notablemente la aparición de placas de infección (Tabla 05, Figura 15).
En la tabla 06 se observan los controles virales (CV) hallados en todas las pruebas de
inhibición contra ZIKV, con un promedio de 19.62 ± 0.74. Mientras que en la figura 16,
el gráfico de Levey- Jennings, que es un gráfico de control estadístico, nos indica que
los controles virales usados en esta prueba se encuentran dentro de la media ± 2
desviaciones estándar (±2SD), a excepción de un único valor que se encuentra
ligeramente por debajo de esta (Figura 16).
Tabla 05. Prueba de reducción de placas (PRP) del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus contra ZIKV.
Promedio UFP/pozo ± IC 95 %
Concentración Control
Dilución T-E + AE %R T-E + MM %R %D
(µg/mL) Viral
1/1000 176.0 20.8 0 100 0 100 0
1/1500 117.33 18.78 0 100 0.22 ± 0.34 98.83 1.17
1/2000 88.0 19.9 0.83 ± 0.58 95.84 0.40 ± 0.55 97.88 -2.04
1/2500 70.4 18.67 3.11 ± 1.12 83.59 9.71 ± 1.83 47.79 35.8
1/3500 50.29 20.06 15.83 ± 3.21 21.64 18.83 ± 3.21 6.27 15.37
1/4500 39.11 19.33 16 ± 1.83 16.97 16.25 ± 2.00 5.63 11.33
1/6000 29.33 19.33 17.75 ± 5.26 8.57 19.25 ± 4.18 0.38 8.19
UFP: Unidad Formadora de Placa, T-E: Tween 80- Etanol, AE: Aceite esencial, MM: Medio de
mantenimiento, IC 95 %: Intervalo de confianza al 95 %, % R: Porcentaje de reducción, % D:
Diferencia en porcentajes de reducción entre el aceite esencial y el control de Tween 80- etanol.
52
Figura 15. Prueba de Reducción de Placas (PRP) del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus contra ZIKV, expresado en UFP/pozo.
53
Tabla 06. Controles virales (CV) obtenidos en las pruebas de reducción de placas
(PRP) contra ZIKV.
Control viral (CV) (UFP/pozo)
16 21 18 19 22
21 21 18 19 22
20 22 21 18 21
20 24 18 20 18
16 19 18 20 18
18 24 21 20 16
15 21 21 20 16
22 22
Promedio ± IC 95 % 19.62 ± 0.74

Desviación Estándar 2.23
IC 95 %: Intervalo de confianza al 95 %. UFP: Unidad formadora de placa.
Gráfico de Levey- Jennings

28
26
24
22
Control viral
UFP/pozo
20
Media
18
±1*DS
16
±2*DS
14
±3*DS
12
10
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Proceso
Figura 16. Gráfica de Levey- Jennings de los controles virales (CV) obtenidos en la
prueba de reducción de placas (PRP) contra ZIKV.
54
6.5. Título viral del DENV-2 en la línea celular Vero-76.
Las células Vero- 76 infectadas con la semilla de DENV-2 con 11 pasajes previos,
mostraron efecto citopático (ECP) al día 8 post- infección (Anexo 6.C). La semilla de
DENV-2 pasaje 12 fue titulada en la mencionada línea celular, obteniéndose un título
promedio de 2.93 × 105 (Tabla 07). En la prueba de ajuste, el título seleccionado fue
2.5 × 105 (Tabla 08).
Tabla 07. Titulación del DENV-2 pasaje 12 mediante prueba de plaqueo sobre la línea
celular Vero-76.
Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
Promedio UFP/pozo NC NC 14.67 1.67 0 0 0
Título viral (UFP/mL) - - 2.93×105 3.34×105 - - -
-
Log10 Título viral - - 5.46 ± 0.26 5.5 ± 0.43 - -
-
IC 95 % (Log10) - - (5.20-5.72) (5.07- 5.93) - -
Título viral promedio
3.135 ×105
(UFP/mL)
5.48 ± 0.25
log10 ± IC
NC: No contable, *: superposición, UFP: Unidad formadora de placa, IC 95 %: Intervalo de
confianza al 95 %.
Tabla 08. Prueba de ajuste del Control Viral (CV) del DENV-2 pasaje 12 para la prueba
de reducción de placas.
Título viral (UFP/mL) ×105
2.5 3
Control Viral promedio (UFP/pozo) 22.67 19.17
Título viral TS
UFP: Unidad Formadora de Placa, TS: Título viral seleccionado.
55
6.6. Inhibición del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus contra DENV-2
sobre la línea celular Vero-76.
El aceite esencial de Ophryosporus peruvianus presentó efecto inhibitorio contra
DENV-2 desde la concentración 117.33 a 176 µg/mL, con porcentajes de reducción
del 59.05 % y 61.76 %, respectivamente. Las concentraciones mayores a 176 µg/mL,
no presentaron placas de infección, mientras que en concentraciones menores a
117.33 µg/ml no existe efecto inhibitorio del Tween 80- etanol o el aceite esencial
(Tabla 09, Figura 17).
Los controles virales (CV) hallados en estas pruebas tienen un promedio de 19.63 ±
0.87 (Tabla 10), mientras que, el gráfico de Levey- Jennings muestra que estos se
encuentran dentro de la media ± 2 desviaciones estándar (±2SD) (Figura 18).
Tabla 09. Prueba de Reducción de Placas (PRP) del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus contra DENV-2.
Promedio UFP/pozo ± IC 95 %
Concentración Control
Dilución T-E + AE %R T-E + MM %R %D
(µg/mL) Viral
1/500 352.0 18.39 0 100 0.11 ± 0.26 99.43 0.57
1/1000 176.0 17.83 0.67 ± 0.86 96.24 12 ± 2.48 34.49 61.76
1/1500 117.33 18.75 2 ± 1.33 89.25 13 ± 3.72 30.20 59.05
1/2000 88.0 19.5 17.89 ± 1.46 8.24 19 ± 1.58 2.61 5.63
1/2500 70.4 18.75 17 ± 1.30 6.94 18.25 ± 1.52 4.70 2.24
1/3000 58.67 18.58 17.60 ± 2.57 4.45 18.20 ± 2.22 1.28 3.17
1/3500 50.29 20.25 16.75 ± 3.28 17.22 19 ± 2.25 6.14 11.08

UFP: Unidad Formadora de Placa, T-E: Tween 80- Etanol, AE: Aceite esencial, MM: Medio de
mantenimiento, IC 95 %: Intervalo de confianza al 95 %, % R: Porcentaje de reducción, % D:
Diferencia de porcentajes de reducción entre el aceite esencial y el control de Tween-etanol.
56
Figura 17. Prueba de Reducción de Placas (PRP) del aceite esencial de Ophryosporus
peruvianus contra DENV-2, expresado en UFP/pozo.
57
Tabla 10. Controles virales (CV) obtenidos en las pruebas de reducción de placas
(PRP) contra DENV-2.
Control viral (CV) (UFP/pozo)
18 21 22
17 21 20
18 21 21
20 20 18
19 18
22 18
19.63 ± 0.87
Promedio ± IC 95 %
Desviación Estándar 1.63
IC 95 %: Intervalo de confianza al 95 %, UFP: Unidad formadora de placa.
Gráfico de Levey- Jennings

26
24
22 Control viral
UFP/pozo
20 Media
±1*DS
18
±2*DS
16
±3*DS
14
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Proceso
Figura 18. Gráfica de Levey- Jennings de los controles virales (CV) obtenidos en la
prueba de reducción de placas (PRP) contra DENV-2.
58
VII. DISCUSIÓN
Uno de los puntos principales para la formulación de fármacos es garantizar que estos
generen el menor daño posible al hospedero; en ese sentido se han desarrollado
diferentes ensayos in vitro para predecir los efectos tóxicos de drogas y compuestos
químicos, dentro de lo cual se utilizan como modelos experimentales, cultivos primarios
o líneas celulares establecidas (Arencibia et al., 2003).
La línea celular Vero-76, derivada de Cercopithecus aethiops es una de las líneas
celulares de mamíferos más comúnmente usadas en investigación, existen protocolos
establecidos para su propagación en laboratorio (Ammerman et al., 2008) y han sido
autorizadas para la producción de vacunas virales vivas e inactivadas, para la
producción de virus y para ensayos de citotoxicidad (Almeida et al., 2011). Además, esta
línea celular es la recomendada por la OMS para la realización de las pruebas de
inhibición por reducción de placas de sueros de pacientes con infección por DENV,
debido a su amplio uso en laboratorios, su origen mamífero y que semillas de DENV
propagadas en líneas celulares de insecto, como C6/36, tienen una proteína prM con un
procesamiento diferente al de los seres humanos (WHO, 2007). Por tanto, se utilizó esta
línea para la evaluación de la citotoxicidad y del efecto antiviral del aceite esencial de
Ophryosporus peruvianus a distintas concentraciones.
En la prueba de citotoxicidad, la mezcla Tween 80- etanol presentó una Máxima
Concentración No Citotóxica (MNCC) sobre Vero-76 de 122.22 µg/mL; mientras que el
aceite esencial presentó una MNCC de 70.4 µg/mL, punto en el cual se dejó de
evidenciar desprendimiento de la monocapa de células. Si bien no existen reportes
previos sobre la actividad citotóxica del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus en
líneas celulares o en cultivos primarios de mamíferos, Alvarado (2017) evaluó la
citotoxicidad del extracto crudo de esta planta sobre huevos de erizo de mar a
concentraciones de 166 µg/mL y 333 µg/mL, encontrando que, en ambas
59
concentraciones, el desarrollo embrionario se detiene en etapa de blástula o gástrula y
las tasas de mortalidad son del 21.27 % y 49.73 % respectivamente. Adicionalmente,
estudios previos han evaluado la citotoxicidad de especies dentro del género
Ophryosporus. Carraz et al. (2015) evaluó el extracto crudo de O. chilca sobre las líneas
celulares hepáticas Hep3B, HepG2 y PLC/PFR/5, utilizando el ensayo de ATP (adenosín
trifosfato), obteniéndose un IC50 de 17.1, 36.9 y 28.4 µg/mL, y en cultivo primario de
hepatocitos humanos un IC50 > 100 µg/mL. González et al. (2018) probaron la
citotoxicidad del extracto etanólico de O. charua sobre células tumorales de leucemia
linfoblástica aguda CCRF-CEM, leucemia mieloide crónica CLM K562 y sus líneas
celulares derivadas resistentes a drogas CEM/ADR5000 y Lucena 1, encontrando
valores de IC50 de 47, 23, 33 y 36 µg/mL, respectivamente. Sin embargo, no existen
estudios de la actividad citotóxica de los aceites esenciales de estas especies, siendo
estudios no comparables debido a la diferencia en la composición de los aceites
esenciales y los extractos crudos y/o extractos etanólicos.
Estudios farmacológicos más detallados suelen utilizar ciertos criterios para la
determinación de la actividad antiviral de un extracto o componente proveniente de una
especie vegetal, tales como el CC50, IC50 y el Índice de Selectividad (IS), que en conjunto
permiten dilucidar con mayor precisión el efecto de inhibición antiviral in vitro (Nogueira
et al., 2021). Sin embargo, tal como en las pruebas de PRNT con anticuerpos
neutralizantes, fueron evaluados los porcentajes de inhibición como el criterio más
importante, teniendo presente que porcentajes superiores al 50 % o 90 % en zonas
endémicas son los más adecuados (Timiryasova et al., 2013; WHO, 2007). El ensayo
de inhibición de placas o prueba de reducción de placas, se basa en el fundamento de
la prueba de PRNT con el objetivo de analizar la inhibición de extractos vegetales sobre
un virus de interés (Rodríguez- Ortega et al., 2013). En ese sentido, fue este el criterio
usado en el presente trabajo para evaluar el efecto antiviral in vitro de nuestro aceite
esencial.
60
En cuanto a la actividad inhibitoria del aceite esencial de O. peruvianus para ZIKV, este
mostró una notable reducción de placas de ZIKV en la concentración 70.4 µg/mL
(1/2500); sin embargo, esta se debió principalmente a la acción del Tween 80- etanol,
no superando el umbral de reducción del 50 % (PRP50).
El aceite esencial de O. peruvianus tuvo un elevado efecto inhibitorio contra DENV-2
desde la concentración 117.33 hasta 176 µg/mL con porcentajes de reducción del 59.05
% y 61.76 %, respectivamente. En esta prueba, se utilizó células Vero- 76 en suspensión
al momento de la infección (método en suspensión), ya que permiten una mejor
visualización de las placas de DENV en comparación con el método en monocapa
(Álvarez et al., 2010).
O. peruvianus presentó porcentajes de reducción in vitro del 35.8 % contra ZIKV y del
59.05 % y 61.76 % contra DENV-2, lo que lo hace un buen candidato para posteriores
estudios de su actividad inhibitoria in vivo contra DENV-2 y sus otros serotipos.
Según los resultados obtenidos, se reporta un posible potencial antiviral de
Ophryosporus peruvianus contra DENV-2, de manera que se requiere un estudio más
detallado de los componentes presentes en su aceite esencial con miras a dilucidar qué
compuestos/metabolitos se encuentran relacionados al efecto antiviral. Por otro lado, es
importante considerar que la composición de los aceites esenciales de una planta puede
variar según la genética, parte de la planta de la cual fue extraído, estado de desarrollo
y factores ambientales, tales como estación del año, composición del suelo, método de
procesamiento, entre otros (Barra, 2009). Esto es primordial para un entendimiento más
claro del efecto observado en nuestro trabajo bajo las condiciones previamente
descritas. Mattos & Collantes (2020) realizaron un primer acercamiento al tema,
analizando los componentes del aceite esencial de O. peruvianus colectados en
diferentes estaciones del año en la zona de Andahuaylillas, Cusco. Dentro de los
componentes mayoritarios del aceite esencial de esta planta se encontró al β-
61
cariofileno, compuesto que se sugiere actúa sobre los pasos iniciales del ciclo de
replicación viral de DENV-2, esto es, previniendo la unión virus-célula (Flechas et al.,
2018; Islam et al., 2021; Pájaro et al., 2015). Otros componentes con interacción con las
proteínas de DENV son el β-Bourboneno, Germacreno D y el óxido de β- cariofileno,
también presentes en el aceite esencial de O. peruvianus, pero en menor medida
(Balasubramani et al., 2018). El aceite esencial de Lantana grisebachii, presentó
actividad antiviral contra DENV-2, y su vez, se determinó al Biciclogremacreno,
Germacreno D, Espatulenol y β- cariofileno, como sus componentes mayoritarios (C. C.
García et al., 2010). Por otra parte, el β- cariofileno, compuesto mayoritario del aceite
esencial de Lippia alba, también se ha evaluado como antiviral contra ZIKV, hallándose
que inhibe su replicación al interactuar con las proteínas no estructurales NS2B-NS3 y
NS5 (Nogueira et al., 2021).Los aceites esenciales de Lippia alba y Lippia citriodora
también ha demostrado inhibir a los cuatro serotipos de DENV cuando el tratamiento se
realiza antes del ingreso del virus a la célula (Lim et al., 2021).
62
VIII. CONCLUSIONES
- El aceite esencial de Ophryosporus peruvianus mostró una máxima concentración
no citotóxica (MNCC) de 70.4 µg/mL sobre células Vero-76.
- El aceite esencial de Ophryosporus peruvianus no mostró actividad antiviral in vitro
significativa contra ZIKV, su porcentaje de reducción máximo fue de 35.8 % en la
concentración 70.4 µg/mL de aceite esencial, siendo este un porcentaje por debajo
del PRP50.
- El aceite esencial de Ophryosporus peruvianus demostró tener actividad antiviral in
vitro contra DENV-2 en el rango de concentración de 117.33 hasta 176.0 µg/mL con
porcentajes de reducción del 59.05 % y 61.76 %, respectivamente.
63
IX. RECOMENDACIONES
- Realizar estudios de caracterización bioquímica de los componentes del aceite
esencial de Ophryosporus peruvianus con el fin de dilucidar cuales son aquellos
componentes antivirales activos contra DENV-2, considerando que estos
componentes pueden variar según los aspectos ambientales, lugar de procedencia,
clima, fecha de colecta, presencia de inflorescencia, etc.
- Realizar pruebas in silico con los componentes presentes en el aceite esencial de
Ophryosporus peruvianus para caracterización de posibles mecanismos de acción.
- Una vez identificados los componentes presentes en el aceite esencial de
Ophryosporus peruvianus, evaluar su acción frente a otros genotipos de ZIKV y
serotipos de DENV a través de estudios in vitro.
- Determinar los valores de CC50 (concentración citotóxica media), IC50
(concentración inhibitoria media) y el Índice de Selectividad (SI), que en conjunto
permitirán dilucidar con mayor exactitud el efecto antiviral del aceite esencial de O.
peruvianus visto en este estudio.
64
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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88
XI. ANEXOS
Anexo 01. RECOLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE Ophryosporus

peruvianus
A. Recolección de Ophryosporus peruvianus en el distrito de Canta en el mes de febrero
de 2020.
B. Ubicación del lugar de colecta de O. peruvianus en el distrito de Canta, provincia de
Canta, región Lima. Zonas rocosas al lado de la carretera.
Coordenadas: 11°28'33.0" S; 76°37'40.1" W
89
C. Muestra de Ophryosporus peruvianus con inflorescencia colectada en el distrito de
Canta.
90
D. Clasificación taxonómica de Ophryosporus peruvianus realizada en el Museo de
Historia Natural de la Universidad Nacional de San Marcos. N° 063-2022-USM-MHN.
91
E. Extracción de aceite esencial mediante el método de hidrodestilación por arrastre de
vapor en aparato tipo Clevenger.
92
Anexo 02. PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
A. Medio de Crecimiento (MC).
Reactivo Cantidad
Suero Bovino Fetal 10 %
EMEM 9.39 g/L
L- glutamina 1%
Piruvato de Sodio 1%
Aminoácidos no esenciales 1%
Antibiótico- Antimicótico 1%
B. Medio de Mantenimiento (MM).
Reactivo Cantidad
Suero Bovino Fetal 2%
EMEM 9.39 g/L
L- Glutamina 1%
C. Medio Doble Concentrado (2X).
Reactivo Cantidad
Suero Bovino Fetal 10 %
EMEM
L- Glutamina 2%
D. Overlayer o medio de recubrimiento (medio semisólido).
Reactivo Cantidad
Carboximetilcelulosa 3 % 50 mL
Medio 2X 50 mL
E. Colorante Naphtol Blue Black.
Reactivo Cantidad
NBB 1g
Acetato de sodio 13.6 g
Ácido acético glacial 60 mL
Agua destilada 940 mL
93
Anexo 03. FLUJOGRAMAS DE PROTOCOLOS DE TRABAJO
A. Protocolo de prueba de plaqueo de línea celular Vero-76.
B. Protocolo de infección de la semilla viral de ZIKV o DENV- 2 sobre la línea celular
Vero - 76.
94
C. Protocolo de cosecha de la semilla viral ZIKV o DENV-2.
Anexo 04. FÓRMULAS
A. Cálculo del título viral de ZIKV y DENV-2.
𝑃 × 10 ˣ
𝑈𝐹𝑃/𝑚𝑙 =
𝑉
P = Promedio del número de placas contabilizadas por dilución.
10 x = Dilución en que se contaron las placas.
V = Volumen del inóculo expresado en mL.
Cuando el volumen del inóculo es de 50 µL:
𝑼𝑭𝑷/𝒎𝑳 = 𝑷 × 𝟏𝟎 ˣ × 𝟐𝟎
95
Anexo 05. PLACAS DE PRUEBA DE CITOTOXICIDAD
A. Prueba de citotoxicidad del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus sobre línea
celular Vero- 76, revelada al día 6 de incubación.
CC: Control de células
d1-9: Diluciones seriadas de T-E + AE.
T1-9: Diluciones seriadas de T-E + MM.
96
Anexo 06. EFECTO CITOPÁTICO (ECP) DE ZIKA Y DENGUE SOBRE VERO-76
A. Vista al microscopio del efecto citopático 3+ de ZIKV pasaje 3 sobre la línea celular
Vero-76 al día 6 post-infección. (A) ECP +3 a los 6 días post- infección. (B) Células Vero-
76 control incubadas en MM.
Aumento: 20X
B. Vista al microscopio de placas de lisis de la infección por ZIKV en línea celular Vero-
76 de una prueba de plaqueo revelada al día 6 post-infección.
Aumento: 40X
97
C. Vista al microscopio del efecto citopático 3+ de semilla viral de DENV- 2 pasaje 12
sobre la línea celular Vero-76 al día 6 post-infección. (A)ECP +3 a los 6 días post-
infección. (B) Células Vero- 76 control incubadas en MM.
Aumento: 20X
D. Vista al microscopio de placas de lisis de la infección por DENV-2 en línea celular
Vero-76 de una prueba de plaqueo revelada al día 6 post-infección
Aumento: 40X
98
Anexo 07. PLACAS DE TITULACIÓN DE ZIKA Y DENGUE-2
A. Titulación de ZIKV pasaje 4 mediante prueba de plaqueo, sobre la línea celular Vero-
76.
CC: Control de Células.
10-3, 1:2000, 1:5000, 10-4,1:20000,1:50000,10-5: Diluciones virales.
99
B. Ajuste de ZIKV pasaje 4 mediante prueba de plaqueo, sobre la línea celular Vero-76.
CV: Control Viral
ST: Solución de trabajo
100
C. Titulación de DENV-2 mediante prueba de plaqueo, sobre la línea celular Vero-76.
CC: Control de Células.
10-1,10-2,10-3,10-4,10-5, 10-6,10-7: Diluciones virales.
D. Ajuste de DENV-2 pasaje 12 mediante prueba de plaqueo, sobre la línea celular Vero-
76.
CV: Control Viral
ST: Solución de trabajo
ST-1: Dilución 10-1 del ST
101
Anexo 08. PLACAS DE PRUEBAS DE REDUCCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE
Ophryosporus peruvianus contra ZIKA Y DENGUE – 2.
A. Prueba de reducción de placas del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus
contra ZIKV sobre la línea celular Vero-76.
T-E + AE: Tween 80- etanol + Aceite esencial
T-E + MM: Tween 80- etanol + Medio de Mantenimiento
CV: Control viral
102
B. Prueba de reducción de placas del aceite esencial de Ophryosporus peruvianus
contra DENV-2 sobre la línea celular Vero-76.
103
T-E + AE: Tween 80- etanol + Aceite esencial
T-E + MM: Tween 80- etanol + Medio de Mantenimiento
CV: Control viral
CV-1: Dilución 10-1 del Control viral
CV-2: Dilución 10-2 del Control viral
104

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Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú. Decana de América

Actividad antiviral in vitro del aceite esencial de

Dra. Egma Marcelina MAYTA HUATUCO

Valdiviano, S. (2023). Actividad antiviral in vitro del aceite esencial de

Nombres y apellidos Stefanny Fiorella Valdiviano Toyco

Tipo de documento de identidad DNI

Número de documento de identidad 72838102

URL de ORCID https://orcid.org/0000-0001-7028-7375

Nombres y apellidos Egma Marcelina Mayta Huatuco

Tipo de documento de identidad DNI

Número de documento de identidad 06175080

URL de ORCID https://orcid.org/0000-0001-8471-1675

Datos del jurado

Presidente del jurado

Nombres y apellidos Enrique Walter Mamani Zapana

Tipo de documento DNI

Número de documento de identidad 02414092

Miembro del jurado 1

Nombres y apellidos Erasmo Honorio Colona Vallejos

Tipo de documento DNI

Número de documento de identidad 09438212

Miembro del jurado 2

Nombres y apellidos Miguel Angel Francisco Talledo Rivera

Tipo de documento DNI

Número de documento de identidad 25625144

Línea de investigación A.1.3.1. Salud Pública

incondicional en mis momentos más difíciles.

oportunidad de desarrollar el proyecto de investigación en su laboratorio, y confiar en

Al Blgo. Juan Sulca por su apoyo durante toda la realización de mi trabajo de

la parte experimental de mi trabajo.

mis muestras vegetales.

esencial en la primera etapa del trabajo experimental.

A mis compañeros del laboratorio de Virología Molecular y Clínica de la UNMSM, Kathy

ayuda en el laboratorio y especialmente a mis amigas Sandra Landazabal Castillo y Alys

Chávez Alvarado por su apoyo no solo en el ámbito académico, si no también emocional.

especialmente agradecer a mi abuelo Julián y mi tía Sonia, por alentarme a seguir

inspirarme profesionalmente y por nuestras reuniones virtuales en las que me brindaron

sus mejores consejos.

amigos del colegio por el tiempo compartido y los momentos vividos.

ÍNDICE DE TABLAS ………..……….…………………………………………………...… V

ÍNDICE DE FIGURAS …………….……………………………………………………...… VI

ÍNDICE DE ANEXOS …………………………………………………………………….... VII

ABREVIATURAS ………………………………………………………………………..… VIII

II. MARCO TEÓRICO ……………………………..……………………………..….…... 3

2.1. Antecedentes …………………………………………………………………….......... 3

2.1.1. Problemática de DENV y ZIKV ……………………………………………….….. 3

2.1.2. Importancia farmacológica de las plantas …………………………………….… 4

2.1.3. Estudios previos sobre Ophryosporus peruvianus ………………………...….. 5

2.2. Ophryosporus peruvianus ………………………….………………………………… 6

2.2.1. Clasificación taxonómica …………………………………………………………. 6

2.2.2. Sinónimos ………………………………………………………………………….. 6

2.2.3. Nombres comunes ………………………………………………………………... 6

2.2.4. Distribución geográfica …………………………………………………………… 6

2.3. Aceite Esencial ………………………………………………………………………… 7

2.3.1. Definición …………………………………………………………………………… 7

2.3.2. Usos de los aceites esenciales ………………………………………..………… 7

2.3.3. Hidrodestilación por arrastre de vapor ..………………………………………… 7