Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

TRABAJO PRÁCTICO 6: PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEINAS

OBJETIVOS
– Conocer la metodología de laboratorio para la purificación y análisis de proteínas y
otras biomoléculas.
– Valorar la importancia que poseen las técnicas de purificación de proteínas para poder
estudiar y explicar los procesos biológicos.

INTRODUCCIÓN

Para poder comprender los complejos procesos que ocurren en una célula es necesario
poder separar sus componentes, estudiarlos independientemente y volver a integrarlos. Una
cadena de reacciones metabólicas puede ser bien entendida solo sí las enzimas que intervienen
en la cadena de reacciones son aisladas y caracterizadas individualmente (conocer la cinética, la
estructura molecular, etc.). La purificación de biomoléculas es importante para múltiples estudios
en áreas de biología, medicina, agronomía, procesos industriales, estudios ambientales, etc. Se
considerarán algunas de las técnicas que se utilizan en la purificación y análisis de una proteína.
Métodos de separación de proteínas
Para separar y purificar proteínas de manera eficaz primero es necesario extraerla de la
célula; comúnmente se utiliza métodos de lisis mecánica (molienda, sonicación, ciclos de
congelación y descongelación), y luego el homogenado se filtra o se centrifuga con diversos
métodos. Cada método se basa en distintas características de la proteína (ej: solubilidad, tamaño,
carga, capacidad de unión):

– Métodos de Centrifugación: Se basa en los distintos tamaños de las proteínas a separar. La

centrifugación puede ser usada para remover los tejidos, otras partículas o precipitar
soluciones. Ejemplos: centrifugación diferencial y centrifugación zonal.
– Métodos de Precipitación: Se basa en los cambios de solubilidad de la proteína al cambiarle
el medio. Ejemplo: precipitación por sales inorgánicas (salting out).
– Métodos Cromatográficos: Se basan en distintas propiedades de las proteínas, como tamaño
(ej: cromatografía de exclusión por tamaño molecular, o filtración en gel), carga iónica (ej:
cromatografía de intercambio iónico), especificidad de unión (ej: cromatografía de afinidad),
polaridad (ej: cromatografía de adsorción).
– Métodos Electroforéticos: Se basa en la diferencia de carga iónica de las proteínas a separar.
La electroforesis utiliza las cargas de las proteínas haciéndolas migrar en una corriente
eléctrica. Ej: electroforesis en geles nativos y en geles desnaturalizantes, Isoelectroenfoque
(utiliza las diferencias en los puntos isoeléctricos de los polipéptidos y proteínas).

MÉTODOS POR CENTRIFUGACIÓN

Fundamento
Las técnicas de centrifugación permiten la separación de una mezcla compleja de
componentes celulares, y también se usan para separar y determinar las masas moleculares de
las biomoléculas. La velocidad de sedimentación de una partícula sometida a una fuerza
centrífuga (g) se calcula con el coeficiente de sedimentación (s), el cual depende de la masa de la
partícula, de la fuerza de flotación ejercida por el medio líquido (depende de la densidad de la
partícula y de la densidad del medio), y del coeficiente de fricción (medida de la forma de la
partícula). Se expresa en unidades Svedberg (S), equivalentes a 10-13s. Cuanto menor sea el valor
de S de una molécula sometida a la fuerza centrífuga, se moverá más lentamente.
Centrifugación diferencial
Una vez obtenido el homogenado celular, el primer paso para separar una proteína de

41
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

los restos celulares, es por centrifugación. Las partículas que difieren en densidad o tamaño
sedimentan a distintas velocidades por aplicación de una fuerza centrífuga g (campo
gravitacional). Una centrifugación diferencial permite la separación de un homogenado celular
en varias fracciones (Fig. 1). Al centrifugar el homogenado a velocidad baja (≈500 g), se obtiene
el primer precipitado con los restos celulares y núcleos quedando en el sobrenadante el extracto
libre de células. Una segunda centrifugación del sobrenadante a velocidad media (≈10.000 g) hará
precipitar organelos, mientras que en el sobrenadante quedaran enzimas solubles y microsomas,
ribosomas, retículos. Una tercera centrifugación a velocidad alta (≈ 100.000 g) hará precipitar los
microsomas, ribosomas, etc. quedado en el sobrenadante enzimas solubles.

Fracción soluble del

citoplasma

Células Organelos: Microsomas,

enteras, mitocondrias, ribosomas, retículos
núcleos lisosomas,
peroxisomas,
cloroplastos
Figura. 1. Centrifugación diferencial. Se utiliza para separar una mezcla de partículas
(macromoléculas, organelos celulares, y células) que difieren en su masa o densidad

Centrifugación zonal (o centrifugación en gradiente)

Se usa para separar proteínas con diferentes coeficientes de sedimentación (S). Primero
se forma un gradiente lineal de densidad en un tubo de centrífuga (de sacarosa o cloruro de cesio
ej: concentración de 20% en el fondo del tubo que va bajando hasta 5% en la parte superior),
luego se siembra la muestra a separar en la parte superior del tubo. Luego se centrifuga, las
proteínas se mueven a través del gradiente y se separan de acuerdo al coeficiente S. Las partículas
quedaran separadas de acuerdo a su densidad, formando zonas o bandas discretas, y podrán ser
fraccionando recolectarse perforando el fondo del tubo y por goteo (Fig. 2).

Aumenta
la
densidad

1 2 3 4 5 6 7 8 9
Fracciones
Figura. 2. Centrifugación zonal. Separa moléculas con distinto coeficiente de sedimentación

42
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

Ultracentrifugación analítica
La ultracentrífuga desarrolla fuerzas centrífugas superiores a 500.000 g (75.000 rpm).
Esta fuerza permite el fraccionamiento de orgánulos subcelulares y el análisis de los
constituyentes proteicos. Con técnicas de centrifugación analítica se puede determinar el
tamaño y la forma de la proteína proporcionando el conocimiento de las relaciones estructura-
función. Con este método se determina el coeficiente de sedimentación de cada partícula, y se
expresa en unidades Svedberg (S).

MÉTODOS DE PRECIPITACIÓN
Fundamento
Además de los enlaces covalentes fuertes que definen la estructura química de las
moléculas biológicas, las estructuras de estas macromoléculas están determinadas por la
influencia colectiva de muchas interacciones individuales débiles (no covalentes). Entre las
fuerzas electrostáticas débiles que mantienen estables en estado de mínima energía a las
proteínas tenemos: interacciones iónicas (—COO-…+H3N—), puentes de hidrógeno (—O—
H…O<), fuerzas de van der Waals (interacción débiles entre moléculas no polares, ej: dipolo-
dipolo >C=O…>C=O), interacciones hidrofóbicas (efecto hidrófobo).
El agua y otros iones del medio compiten por las uniones dipolares de la proteína, y las
sustancias hidrofóbicas buscan los centros hidrofóbicos de la proteína. Cuando la composición
del medio se mantiene constante y en equilibrio, la proteína se encuentra en estado estable. En
muchas proteínas el interior de la estructura es protegido del medio acuoso por una alta
concentración de aminoácidos hidrofóbicos (efecto hidrofóbo). El exterior de la proteína
interactúa con el medio a través de las cadenas laterales de aminoácidos polares distribuidos en
el polipéptido.
Cualquier perturbación entre las interacciones solvente-proteína puede disminuir la
solubilidad de las proteínas, su solubilidad dependerá básicamente de la fuerza ionica, del pH, y
la temperatura del medio. Por ejemplo el aumento de la temperatura del solvente, debilita las
interacciones hidrofílicas (ej: puente de hidrógeno) favoreciendo el efecto hidrofóbo y las
proteínas se desnaturalizan; el pH del medio influye en la solubilidad ya que las proteínas tienen
un pH específico en el cual la carga neta es cero (punto isoeléctrico: pI). A este pH la superficie
de la proteína estará menos solvatada, tendrá la menor solubilidad.

Precipitación salina
Las proteínas se mantienen en solución en los tejidos a determinada fuerza iónica (I) del
medio. La solubilidad de una proteína en concentración baja de iones aumenta a medida que se
agrega sal (efecto “salting in”), los iones adicionales debilitan las fuerzas de atracción entre
moléculas individuales de proteína. Pero si se sigue agregando sal la fuerza iónica del medio
aumenta demasiado y la solubilidad de la proteína disminuye. La precipitación ocurre por la
neutralización de las cargas en la superficie de la proteína debido a las sales y por disminución de
la concentración efectiva del agua, a este efecto en bioquímica se lo llama "salting-out". La
concentración de sal necesaria para precipitar una proteína depende del número y distribución
de cargas y grupos no-iónicos polares en la superficie de la proteína, y del número y distribución
de residuos hidrofóbicos expuestos cuando las cargas se neutralizan. Es decir que el tamaño y
forma de la proteína contribuyen a la precipitabilidad de la misma. La dependencia de la
solubilidad respecto a la concentración salina difiere de una proteína a otra. Por lo tanto el salado
puede utilizarse para el fraccionamiento secuencial de las proteínas. El salado también resulta
útil para concentrar soluciones diluidas de proteínas. El sulfato de amonio, (NH4)2SO4, es la sal
más usada en el "salting-out" de las proteínas. Sus ventajas son:
1. En saturación (4,04 M a 20° C) tiene la suficiente molaridad para causar la precipitación
de la mayoría de las proteínas.
2. Al diluirse genera poco calor, por lo que resulta fácil disiparlo con un baño de hielo.

43
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

3. La solución concentrada previene la contaminación bacteriana.

4. En solución, protege a las proteínas de la desnaturalización.

Luego para remover el sulfato de amonio de las proteínas precipitadas, se puede disolver el
material en buffer y dializarlo o pasarlo por una columna cromatográfica de filtración por gel.

Diálisis
Las proteínas pueden separarse de las moléculas pequeñas por medio de diálisis a través
de una membrana semipermeable (membrana porosa de celulosa). Las moléculas, con
dimensiones significativamente mayores que el diámetro del poro, quedan retenidas dentro de
la bolsa y las moléculas menores atraviesan los poros de la membrana pasando a la solución (Fig.
3). El principio químico que ocurre en este procedimiento es el de difusión.

Figura. 3. Diálisis de una proteína. La solución de macromoléculas se coloca en una membrana

semipermeable y se sumerge en una solución, las moléculas pequeñas difunden al medio.

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Cromatografía de filtración por gel (Tamiz molecular)
La separación se basa en el tamaño de las moléculas. La muestra se aplica en lo alto de
una columna rellena de bolitas porosas (0,1 mm de diámetro) hechas de un polímero de
carbohidratos o poliacrilamida, insolubles pero muy hidratado. Las moléculas pequeñas pueden
entrar en los poros de las bolitas pero las grandes no. El resultado es que las moléculas pequeñas
pasan por los poros y se distribuyen en la solución que está dentro y fuera de las esferas, en
cambio las moléculas grandes solo ocupan la solución que esta fuera de las esferas. En
consecuencia, las moléculas grandes fluyen con mayor rapidez a través de la columna y salen
antes porque disponen de un volumen de líquido menor. El eluido que va saliendo de la columna
se recolecta en tubos de ensayo, en fracciones de volumen constante (Figura 4 A). El volumen
total de la columna (Vt), es igual al volumen de liquido externo a las esferas (Vo), mas el volumen
de líquido interno a las esferas (Vi) (Vt = Vo + Vi). Los volúmenes de elución intermedios se designan
Ve (Figura 4 B). Luego se mide, para cada tubo, la concentración de proteínas y la actividad
enzimática (en caso de que se trate de una enzima); los datos se ilustran en un perfil de elución
(Figura 4 C).
Existen geles de distintos tamaños de poros que permiten separar macromoléculas en un
amplio margen de peso molecular. El Sephadex (dextrano), la Sepharosa (agarosa) y el Bio-gel
(poliacrilamida) son preparaciones comerciales de estas bolitas. Por ejemplo Sephadex G-50 tiene
un rango de fraccionamiento entre los 1.500 y 30.000 D.
Ventajas y desventajas: La ventaja, en relación a la filtración convencional, es que ninguna
de las proteínas queda retenida por la columna de filtración y las proteínas no se dañan por unirse
a algún soporte de la columna, pero la desventaja es que al no quedar retenida ninguna molécula

44
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

el poder resolutivo de la columna es relativamente menor. En este tipo de columnas pueden

resolverse menos de 10 proteínas, por lo que es conveniente no usarlas al comienzo de la
purificación, sino cuando el número de otras proteínas es menor. La cromatografía de filtración
por gel permite obtener mucha mayor cantidad de proteínas que la electroforesis pero a cambio
de un menor poder resolutivo.

A B

Figura 4. Cromatografía de filtración por gel. A, Columna rellena con esferas porosas y
fracciones de elución; B, distribución del líquido en la columna; C, perfil de elución

Cromatografía de intercambio iónico

Se basa en la separación de las proteínas por su carga neta. El intercambio iónico se
define como el intercambio reversible de iones entre un sólido (fase estacionaria) y un líquido
(fase móvil), sin que haya cambios en la estructura del sólido.
Las columnas de intercambio iónico tienen una fase estacionaria de celulosa o agarosa
unida covalentemente a grupos funcionales ionizables. Estos grupos siempre están balanceados
por un número equivalente de cargas opuestas presentes en la fase líquida (contraión), estos
iones pueden ser desplazados por otros iones de carga similar, es decir que pueden
intercambiarse. La proteína al adsorberse a la columna desplaza a los iones móviles, luego para
ser eluida debe ser reemplazada por algún ión que tenga mayor afinidad (mayor fuerza iónica)
por las cargas fijas que las que tienen las cargas de la proteína (Figura 5).
Estas columnas se nombran de acuerdo a las cargas desplazables, la columna aniónica,
tiene las cargas fijas positivas y sirve para separar proteínas aniónicas (negativas) ej.
dietilaminoetilcelulosa: DEAE-celulosa. Inversamente las columnas catiónicas, tienen las cargas
fijas negativas y sirve para separar proteínas positivas (catiónicas) ej. carboximetilcelulosa: CM-
celulosa.
Un protocolo de cromatografía de intercambio iónico consta de los siguientes pasos:
1. Equilibrar la columna con buffer de baja concentración salina (buffer 1)
2. Sembrar la muestra

45
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

3. Adsorber la proteína a las cargas fijas a la columna usando el buffer 1

4. Lavar componentes no adsorbidos a la columna con solución buffer 1
5. Eluir o desplazar la proteína fijada usando un gradiente salino (buffer eluyente), el cual
aumente linealmente la concentración salina

Buffer con alta

concentración salina

Buffer con baja concentración salina

Equilibrar Sembrar Lavar Eluir con gradiente

columna muestra componentes no salino de concentración
adsorbidos a la creciente
columna

Tiempo
Figura 5. Esquema de la columna de intercambio aniónico y perfil de elución

El fraccionamiento de una mezcla proteica por una columna de intercambio iónico,

depende de la afinidad que tenga una determinada proteína por las cargas fijas a la columna. Hay
que tener en cuenta que las proteínas poseen los dos tipos de carga (positivas y negativas). Es
decir que las moléculas, dependiendo del pH del buffer del medio, podrían unirse tanto a
intercambiadores aniónicos como catiónicos. La fuerza del enlace dependerá del pH del medio.
Si el pH de la disolución aumenta con respecto al pI de la proteína en estudio (Figura 6), la
molécula podrá ser más negativa (resultando una unión más fuerte con intercambiadores
aniónicos). Sin embargo, si el pH disminuye, la molécula será más positiva (resultando una unión
más fuerte con intercambiadores catiónicos). La naturaleza anfótera de las proteínas se
aprovecha ventajosamente para su purificación por intercambio iónico. Por ejemplo, si se utiliza
una columna de intercambio catiónico (cargas fijas -) el pH de una mezcla proteica puede
disminuirse hasta un punto en que la proteína deseada se comporte como catión, en estas
condiciones de pH, se eliminarán muchas de las especies proteicas aniónicas.

46
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

Figura 6. Efecto del pH sobre la carga neta de una proteína de pI=5.

Cromatografía de afinidad
Es una poderosa técnica de purificación de proteínas ya que explota la propiedad más
excepcional y específica de las macromoléculas: "su función biológica". La base de la técnica de
la cromatografía de afinidad es fijar covalentemente las moléculas a reconocer (ligando) a una
matriz sólida inmóvil tal como la agarosa. Una mezcla que tenga la molécula deseada se deja que
filtre a través de esta matriz. La gran mayoría de las moléculas no tiene afinidad por el ligando y
fluyen a través de la matriz sin retraso. La proteína deseada reconoce al ligando, se une y así se
retrasa (Figura 7). Una vez que todos los componentes no deseados han sido eliminados de la
columna (debido a que no se unen específicamente porque no son afines con la matriz), se alteran
las condiciones de la disolución de lavado causando la disociación de la macromolécula y el
ligando. La primera etapa se denomina lavado y la segunda elución (Figura 8). La proteína
deseada aparecerá entonces en el eluído mucho más purificada que en la mezcla original. Por
ejemplo para purificar las deshidrogenasas se puede usar como ligando el NAD+ o NADP+, y para
purificar adenosina desaminasa se utiliza como ligando la adenosina.

Figura 7. Esquema del interior de una columna de afinidad. Los círculos pequeños representa el
ligando que están unidos covalentemente a la matriz, los rectángulos representan la proteína
que será retenida y los círculos medianos las proteínas que no son retenida por el ligando

47
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

Figura 8. Esquema del procedimiento de la cromatografía de afinidad.

MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS
Fundamento
Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución que contiene iones y/o grupos
cargados se produce la migración de éstos hacia uno u otro electrodo, según sus cargas netas, los
aniones (-) migrarán hacia el ánodo (polo +), y los cationes (+) hacia el cátodo (polo -). Este
fenómeno llamado electroforesis ofrece un método poderoso para separar las proteínas y otras
macromoléculas, tales como ADN y ARN.
Los factores que influyen en la migración de los iones se pueden separar en tres tipos
según sean:
1. Características del ion mismo: carga (en signo y magnitud), forma, tamaño, tendencia a
disociarse, comportamiento anfotérico, etc.
2. Características del medio en que está el ion: concentración de electrolitos, fuerza iónica,
propiedades dieléctricas, propiedades químicas, pH, temperatura, viscosidad, etc.
3. Características del campo aplicado: su intensidad, pureza y distribución a lo largo del camino
de migración.
Las sustancias anfotéricas como los aminoácidos (R-CHNH3+COO-) pueden ser aniones o
cationes, dependiendo del pH del buffer; si el pH está por arriba del punto isoeléctrico (pI),
existirán como aniones, y si está por debajo como cationes:

RCHNH3+COOH RCHNH3+COO- RCHNH2COO-

pH < pI pH = pI pH > pI

Lo mismo ocurre con las proteínas; estas se componen de aminoácidos con sus diferentes
puntos isoeléctricos, que determinan el pI global de la proteína.
Hay que tener en cuenta que para que una partícula migre en un campo eléctrico, es
necesario que posea una carga (exceso o deficiencia de electrones que le otorgan una carga neta).
La velocidad de migración (v) de una proteína (o de cualquier macromolécula) en un campo
eléctrico depende de la fuerza del campo (E), de la carga neta de la proteína (z) y del coeficiente
de fricción (f), tal que:
v = E . z /f
La fuerza eléctrica (E .z) que conduce la molécula cargada hacia el electrodo con signo
opuesto sufre la resistencia f, debida a la fricción viscosa entre la molécula que se desplaza y el

48
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

medio de desplazamiento. El coeficiente de fricción (f) depende de la masa y la forma de la

molécula que migra, y de la viscosidad del medio.
"La movilidad electroforética de un ion es directamente proporcional a la carga neta e
inversamente proporcional al tamaño de la molécula y a la viscosidad de la solución". "La
distancia recorrida es proporcional al tiempo de electroforesis bajo condiciones controladas".
La función del buffer en electroforesis es la de mantener el pH, transportar la corriente,
y la de proveer iones que se combinen con los grupos -COOH (ácidos) y NH2 (alcalinos) libres de
las proteínas.
Los medios soportes pueden ser: papel, acetato de celulosa, gel de agar, de almidón, o
de poliacrilamida. El gel de poliacrilamida es un soporte ideal porque permite combinar el
fenómeno de migración electroforética con el de ultrafiltración molecular, potenciándose la
separación. Los geles de poliacrilamida son químicamente inertes y se forman con facilidad
mediante la polimerización de la acrilamida entrecruzada con la bisacrilamida (N,N'-dimetilen-bis
acrilamida). El tamaño de poro del gel puede ser ajustado en un rango muy amplio, permitiendo
muy buenas resoluciones.
Geles nativos
Son aquellos en los que la proteína se siembra y corre en forma "nativa", es decir sin
desnaturalizar (mantiene intactos todos sus niveles estructurales). Este tipo de geles es útil
cuando se quiere preservar a la proteína de la desnaturalización porque se la necesita en forma
activa (por ejemplo, para la visualización de enzimas). La proteína se protege de la oxidación con
el agregado de ß-mercaptoetanol (compuesto que protege los puentes disulfuros de las cadenas
peptídicas).
Geles desnaturalizantes
Son aquellos en los que la proteína se siembra y corre en forma desnaturalizada (Figura
9, A). Para desnaturalizar la proteína se usa agentes desnaturalizantes como el SDS, la urea, y/o
el calor. El gel se polimeriza en presencia de un detergente aniónico, SDS (dodecil sulfato de sodio
H3C-(CH2)10-CH2OSO3- Na+), que se une a las regiones hidrofóbicas de las proteínas y la separa en
sus subunidades componentes (en caso de que posea estructura cuaternaria). Cuando el gel se
corre con SDS, se separan las subunidades proteicas de acuerdo a su tamaño molecular y no a su
densidad de carga, dado que el detergente produce uniformidad de cargas, todas tienen exceso
de cargas negativas (Figura 9, B). Las proteínas migran como aniones, y en éstas condiciones se
establece una relación lineal inversa entre la distancia de migración (movilidad relativa = relación
de frente = Rf) y el logaritmo del peso molecular (Figura 10).
Una vez finalizada la corrida las proteínas se pueden visualizar tiñendo con azul de
Coomassie. En este tipo de geles se puede determinar el peso molecular de un polipéptido
desconocido siempre y cuando en el mismo gel se hayan corrido patrones estándar de PM
conocido. Luego se hace una gráfica de los logaritmos de los PM de los estándares en función de
sus Rf (dato que se obtiene midiendo directamente del gel). Se puede entrar luego por la abscisa
con el dato de Rf de la proteína incógnita y se obtendrá el Log PM aproximado de esa proteína
(Figura 10, B). La electroforesis sobre el gel de poliacrilamida SDS es rápida, sensible y de alto
poder de resolución.
Isoelectroenfoque
Es una variante de la electroforesis; se utiliza un gel que contiene anfolitos (sustancia
anfótera es la que tiene grupos ácidos y básicos en la misma molécula comportándose tanto
como ácido como base) que permiten generar un gradiente de pH. La solución de proteínas se
introduce en el gel y, las proteínas migran eléctricamente en el gel hasta alcanzar el pH de su
punto isoelétrico (pI: es el pH en el que la carga neta de una proteína o polipéptido es cero, es
decir que el número de cargas positivas es igual al de cargas negativas). Este método es eficaz
para la determinación de puntos isoeléctricos y permite una efectiva separación de proteínas
cuyos puntos isoeléctricos tienen una diferencia muy pequeña.

49
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

A B

Proteína
nativa

Proteína
desnaturalizada

Figura 9. A, Desnaturalización de la proteína con SDS, el anión del detergente se adsorbe

fuertemente a las proteínas. B, separación en el gel de electroforesis

A Electroforesis en gel de poliacrilamida

Gel
Siembra de proteínas

Cátodo (-)

Ánodo
(+)
Cuba de electroforesis Fuente de poder Gel

Proteína
X
Log PM

Marcador Proteína Migración relativa (Rf)

PM X

Figura 10. Electroforesis en gel de poliacrilamida. A, Esquema de los pasos a seguir; B, gel teñido
y gráfica para cálculo del peso molecular de la proteína x (gráficamente se expresa el log PM de
las proteínas del marcador vs la movilidad relativa, Rf).

50
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

PROBLEMAS
1) En una columna de filtración por gel de Sephadex G-25 (fracciona moléculas en el rango 1.000
- 5.000 D de PM) se siembran 4 oligopéptidos de PM 1.500, 3000, 5500 y 6000 D. Se obtiene
el siguiente gráfico de elución:

A280 nm

Ve (ml)
a) Indique los componentes de cada pico.
b) Se puede con este Sephadex aislar los 4 oligopéptidos? Porqué?

2) Se desea separar los componentes de una muestra que contiene 3 proteínas de PM 15.000,
30.000 y 70.000, y dos oligopéptidos de PM 2.000 y 3.000.
Se dispone de:
Sephadex Rango de fraccionamiento (D)
G-10 0-700
G-25 1.000-5.000
G-50 1.500-30.000
G-75 3.000-70.000
G-100 4.000-150.000
a) ¿Cuántas columnas son necesarias realizar para separar cada uno de los
componentes de la muestra?
b) ¿Qué gel o conjunto de geles utilizaría? (el mínimo posible)
c) Dibuje el o los diagramas de elución.

3) Se intentó separar de una mezcla de 4 proteínas la más aniónica. Se utilizó una columna
aniónica de DEAE-celulosa. En A) se usó como eluyente, un gradiente de NaCl de 0,1 a 1,5 M
y en B) de 0,1 a 0,8 M.
a) ¿Cuál de los dos gradientes usaría para separar la mezcla proteica? Justifique.
b) ¿Cuál de los picos sería el de la proteína de interés?

I-ii 1,5 M Iii 1,5 M

A280 nm ii
Gradiente
(------) I Iv ClNa (M)
0,8 M (............)
Iii

Iv

A B
Ve(ml)
c) Realice un gráfico sobre volúmenes de lavado y elución(((ml) vs. absorbancia, para los
siguientes casos:
I. Todas las proteínas son catiónicas.
II. Dos proteínas son aniónicas y dos son catiónicas.

4) En uno de los pasos de una purificación enzimática se desea realizar una cromatografía de

51
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

intercambio iónico. La enzima a purificar tiene pI=8, mientras que el resto de las proteínas en
la mezcla tienen pI menores que 6. Que columna usaría, catiónica ú aniónica?

5) Se desea separar por electroforesis una muestra de 3 proteínas con los siguientes puntos
isoeléctricos: pI A= 7, pI B= 8, pI C= 5
En un esquema de un gel de corrida horizontal, indique hacia donde migraría cada proteína,
y en qué lugar del gel sembraría la muestra (cátodo, ánodo, o al medio del gel) si se realizara
la corrida con:
a. un buffer de corrida a pH 8
b. un buffer de corrida a pH 6
c. un buffer de corrida a pH 9

6) Se tiene una proteína de PM 90.000 D, y se sabe que es un trímero de subunidades idénticas.

Esquematice y discuta como se resolverá al efectuar una electroforesis en gel de
poliacrilamida:
a) Gel nativo
b) Gel desnaturalizante (con SDS)
c) Como se resolverá en el caso de que las subunidades proteicas fueran distintas.

7) Se desea conocer el peso molecular (PM) de una proteína aislada a partir de un extracto
proteico. Luego de diversos pasos de purificación, finalmente mediante el uso de una
columna de afinidad se obtuvo la proteína X deseada. Se realizó un gel desnaturalizante con
SDS. La calle 1 representa la muestra del lavado, la calle 2, la muestra del eluido de la columna
de afinidad y la calle 3 el marcador de PM (mezcla de proteínas de PM conocido).

1 2 3
Línea de siembra
Proteínas del marcador
PM (Kilo Daltons)
795
224
32

14

Frente de la corrida
(colorante indicador del frente)

Responder:
a) ¿El lavado de la columna fue exitoso?
b) ¿Qué se puede deducir de la capacidad de adsorción de la columna?¿Fue efectiva?
c) Grafique para el marcador de PM el log PM en función de la movilidad relativa (Rf).
d) Calcule el PM de la proteína de interés a partir de la gráfica.

Sitios webs con animaciones

Cromatografía de filtración por gel:
https://youtu.be/PYOl7LEpO3Y
Cromatografía de afinidad:
http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/cromat/crom-afinidad.ogv

52
 Cátedra de Química Biológica—Facultad de Ciencias Naturales—UNSa

Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizante:

https://youtu.be/g_CH2iKectU
Electroforesis bidimensional e isoelectroenfoque y otras electroforésis:
https://youtu.be/aQ00nH0kPSk

BIBLIOGRAFÍA

– BERG J.M., TYMOCZKO J.L. y STRYER L. 2008. Bioquímica. Sexta edición. Ed. Reverté
– COOPER T. G. 1984. Instrumentos y Técnicas de bioquímica. Ed. Reverte, Buenos Aires.
– GARRETT R. and GRISHAM C. 1995. Biochemistry. Saunders College Publishing. Harcourt
Brace College Publishers. New York. USA.
– GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS DE QUÍMICA BIOLÓGICA. 1989. UBA
– LODISH H., BERK A., ZIPURSKY S., MATSUDAIRA P. y DARNELL J. 2002. Biología Celular y
Molecular. Editorial Médica Panamericana. Madrid. España.
– LODISH H., BALTIMORE D., BERK A., LAWRENCE ZIPURSKY S., MATSUDAIRA P. and DARNELL
J. 1995. Molecular Cell Biology. Scientific American Books. New York. USA.
– LUQUE J., HERRÁEZ A. 2001. Biología Molecular e Ingeniería Genética. Editorial Harcout.
Madrid. España.
– RAWN J. D. y LINDQUIST R. 1989. Bioquímica. Problemas. Mc. GRAW-Hill. Interamericana
de España. España.
– STRYER L. 1990. Bioquímica. Tercera Edición. Editorial Reverté, Barcelona.
– VAN BERKEL W.J.H. 1994. Biochemical Separation Methods. Second Edition. Wageningen
Agricultural University.
– VOET D., VOET J.G. y PRATT C.W. 2008. Fundamentos de Bioquímica. Segunda edición. Ed.
Médica Panamericana.

53