FACULTAD DE CIENCIAS Y

FILOSOFÍA

PRÁCTICA: COLORACIONES

MORFOLOGÍA BACTERIANA

Las bacterias presentan formas básicas que son cocos, bacilos y espirales. La disposición o
arreglos que pueden tener cada una de ellas es variable como se muestra en el esquema a
continuación.

FORMAS BACTERIANAS Y ARREGLOS

COCOS BACILOS

Cocos Diplococos Diplobacilo

Bacilo

Estreptobacilo
Tétradas Sarcina Estafilococos

Estreptococos Empalizada Cocobacilo

ESPIRALES

Espirilos (formas helicoidales o de sacacorchos) Vibrio

Espiroquetas

Fuente: Microbe Notes https://microbenotes.com/bacterial -sizes-shapes-arrangement/

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Elaborado por Ruth Cristóbal
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Debido a que el índice de refracción de las bacterias (y otros microorganismos) es similar al

líquido de montaje, no son frecuentemente visibles en un campo brillante de iluminación; por
ello se hacen necesarias ciertas manipulaciones de luz, como por ejemplo puede ayudar a
bajar el condensador de tal manera que el foco de la luz transmitida no esté directamente
sobre el objeto, esto producirá el oscurecimiento del fondo y hará que los objetos
previamente invisibles puedan ser observados.

Generalmente se hace necesario el uso de colorantes biológicos para visualizar

adecuadamente las bacterias y demostrar su presencia en una muestra, su morfología, o
quizás el fino detalle de estructuras internas; esta información contribuye también a su
identificación taxonómica. La morfología de las bacterias se puede examinar de dos maneras,
(1) observando los microorganismos vivos en suspensión, empleando coloraciones
supravitales u (2) observando las células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes
procedimientos de coloración.

La introducción de los colorantes a mediados del siglo XIX fue, en gran parte, responsable de
los avances que han ocurrido en Microbiología clínica y en otros campos del diagnóstico
microscópico durante los pasados 100 años.

COLORANTES
Los colorantes son referidos como ácidos o básicos, no necesariamente indicando sus
reacciones de pH en solución, sino más bien si una parte significativa de su molécula es
aniónica o catiónica. Desde un punto de vista práctico, los colorantes básicos tiñen estructuras
que son ácidas, como por ejemplo la cromatina del núcleo de las células básicas, como las
estructuras citoplasmáticas. Las preparaciones utilizadas para colorear bacterias son siempre
soluciones acuosas. En muchos casos primero se realiza una solución alcohólica y luego se
diluye con agua. Estas soluciones generalmente contienen baja concentración del colorante,
hasta 1%, raramente mayor concentración.

COLORACIÓN SIMPLE

La coloración simple emplea un solo colorante para poner en evidencia la presencia de

bacterias en una muestra y la forma que presentan inclusive los arreglos o disposiciones. Es
útil por ejemplo para detectar bacterias en frotis de líquido cefalorraquídeo en casos de
sospecha de meningitis bacteriana. El colorante mayormente utilizado en este caso es el azul
de metileno.

COLORACIÓN DE GRAM
La coloración de Gram es el método de tinción más empleada en Bacteriología. Es una
coloración diferencial usada para demostrar las propiedades de tinción de las bacterias de
todos los tipos. Las bacterias Gram positivas retienen el colorante cristal violeta luego de la
decoloración y aparecen de color azul profundo o morado intenso. Las bacterias Gram
negativas no son capaces de retener el cristal violeta luego de la decoloración y son teñidas en
contraste de color rojo por el colorante safranina. Observaciones de dos bacterias en la Foto 1.

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Bacilo Gram negativo Bacilos en cadena Gram positivo. Obsérvese

la presencia de espora sin ser teñida

Foto 1. Observaciones de dos cultivos con coloración de Gram

COLORACIÓN NEGATIVA
Muchas bacterias están rodeadas por una capa gomosa de grosor variable, denominada
cápsula, la cual para ponerla en evidencia se emplea una tinción negativa. Está se podrá
observar no teñida sobre un fondo oscuro.

COLORACIÓN DE ESPORAS
Las especies de los géneros Bacillus y Clostridium producen estructuras llamadas endosporas.
La endospora es muy resistente y puede sobrevivir largos períodos de tiempo e incluso en
medios desfavorables, altas temperaturas o sustancias químicas.
Cuando se colorea con Gram y coloraciones simples, las esporas aparecen como huecos
no
teñidos dentro del cuerpo bacteriano. Para observar mejor esta estructura, se usan métodos
especiales de coloración.

OBJETIVOS
1. Describir y reconocer las formas bacterianas de los cultivos mediante el uso del
microscopio y coloración de Gram.
2. Clasificar a las bacterias proporcionadas de acuerdo con los resultados de la coloración
de Gram.

PROCEDIMIENTO PARA COLORACIÓN DE GRAM

Materiales
✓ 1 placa con cultivos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis
✓ Láminas portaobjetos
✓ Asa de siembra en aro

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✓ Gotero con solución salina

✓ Gotero con aceite de inmersión
✓ Microscopio

Procedimiento
Fijación de muestra para coloración Gram
1. Tomar una lámina portaobjetos limpia, y rotular colocando un código o identificación de
la bacteria a colorear. Tras la rotulación se voltea la lámina para colocar la muestra de
bacteria y proceder al frotis. Un ejemplo se muestra en la siguiente representación:

EC

2. Colocar una gota de solución salina en la lámina para hacer el frotis con una de las
bacterias proporcionadas.
3. Con el asa estéril tomar una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disolver en la
gota de solución salina y extender un poco. Cuando se trata de cultivos líquidos no se
requiere de solución salina para hacer el frotis. Los frotis que se obtengan no deben ser ni
muy gruesos ni muy finos.
4. Fijar con calor suavemente pasando por encima de la llama con cuidado hasta que se seque
completamente la muestra.

Coloración de Gram
1. En el lavadero, colocar su lámina fijada en la varilla y cubrir la preparación con cristal
violeta, dejando que el colorante actúe por un minuto.
2. Lavar la preparación con agua de caño colocando la lámina en forma inclinada de manera
que la caída de agua no sea directamente sobre la preparación.
3. Colocar nuevamente su lámina sobre la varilla y cubrir con solución de lugol, dejando
actuar el mordiente durante 1 minuto.
4. Lavar con agua de caño de la misma forma que en el punto 6 y decolorar la preparación
con alcohol acetona hasta que se retire el exceso de colorante. Esto es aproximadamente
10 segundos.
5. Lavar nuevamente con agua de caño y cubrir el frotis con solución de safranina, por 30
segundos, luego lavar y secar al mechero.
6. Para la observación al microscopio deberá retirarse los guantes.
7. Los enfoques deben realizarse con las lentes de menor aumento y la observación final
será con la lente objetiva de 100X utilizando aceite de inmersión.
8. Completar el formato de acuerdo con lo observado y solicitado.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Madigan M, Bender K, Buckely D, Satley W, Stahl D. Brock: biology of microorganisms. 12

ed. New Jersery: Pearson; 2018.

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PRÁCTICA: COLORACION DE GRAM

ALUMNOS:

GRUPO:

RESULTADOS (6 puntos)
EJERCICIO: COLORACIÓN DE GRAM

Dibujar sus resultados de las observaciones realizadas de los 3 cultivos y completar los
datos solicitados en la tabla.

Bacteria

Aumento total

Características (forma,
disposición, tipo de Gram,
si presenta alguna
estructura característica)

Bacteria

Aumento total

Características (forma,
disposición, tipo de Gram,
si presenta alguna
estructura característica)

Bacteria

Aumento total

Características (forma,
disposición, tipo de Gram,
si presenta alguna
estructura característica)

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CUESTIONARIO (8 puntos)

1. ¿Cuál es el fundamento teórico de la coloración de Gram? (NO PROCEDIMIENTO)

2. Mencionar 2 métodos de fijación para Microbiología relacionado con bacterias
diferentes a fijación por calor
3. ¿Qué diferencias hay entre coloración simple y coloración diferencial? Indicar mínimo 2
diferencias.
4. Mencionar un ejemplo de cada tipo de coloración (simple y diferencial). Los ejemplos
deben ser diferentes a los realizados en la práctica y relacionados con Microbiología.
CONCLUSIONES (deben estar relacionadas a sus resultados y los objetivos de la práctica) – 4
puntos.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS (citar de acuerdo con normas Vancouver, mínimo 2

referencias) – 2 puntos.

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