Biofertilizantes: Estudios Preliminares para El Potencial Uso Del Alga Undaria Pinnatifida

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VII CAIQ 2013 y 2das JASP

BIOFERTILIZANTES: ESTUDIOS PRELIMINARES PARA EL


POTENCIAL USO DEL ALGA UNDARIA PINNATIFIDA

A.B. Marchiaro*a, V. Pentreathb , F. Maldonadob y A.M. Berasteguib

a
Facultad de Ingeniería – bFacultad de Ciencias Naturales
(Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco)*
Ruta 1 -km. 4 - 9000 Comodoro Rivadavia - Argentina
E-mail: ([email protected])

Resumen. La aplicación de extractos líquidos de algas marinas a cultivos,


es hoy una práctica generalizada. El objetivo del presente trabajo fue evaluar
la potencialidad del extracto líquido algal de Undaria Pinnatifida,
reconocida invasora en Patagonia, como biofertilizante. El material
recolectado fue sometido a dos procesos de extracción: macerado de algas
en agua hirviendo (EAMH) y macerado de algas en solución ácida (EAMA).
El extracto obtenido fue utilizado en los bioensayos (germinación e
invernadero) al 5, 10, 20 y 40% y al 0,25, 0,5, 1% en in vitro, en la especie
aromática Salvia officinalis. El mejor resultado promedio de germinación
fue 77%±8,86 y tasa 1,99±0,24 con el 5% de concentración (p>0,05) con
EAMA. En in vitro después de 45 días de cultivo en medio MS
suplementado con extracto algal, el mejor registro logrado en longitud
óptima promedio 11,58±0,79cm, nº de nudos 16,74±3,07 y el peso fresco
(PF) y seco (PS) 0,55±0,02g y 0,13±0,01g respectivamente se alcanzó con
una concentración de 0,5% (p<0,05) con EAMA. El crecimiento de las
plantas después de 45 días en invernadero, con EAMA (p>0,05) muestran su
mejor registro con 93,33% de supervivencia. El mejor resultado fue con 5%
(p<0,01) 20,89±4,16cm y 1,17±0,35g de PF y con 0,10% en PS 0,72±0,09g.
Los registros con EAMH no superaron al testigo lo que sugiere un mejor

* A quien debe enviarse toda la correspondencia


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comportamiento de las plantas con EAMA en S. officinalis. La investigación


es promisoria para considerar nuevos ensayos con recolección estacional,
selección de nuevas especies y optimización del método de extracción.
Palabras clave: Biofertilizantes, Undaria, Extracto algal.

1. Introducción
En las últimas décadas se ha tratado de suplantar en su uso los fertilizantes químicos,
utilizando como sustituto los biofertilizantes. Dentro de ellos, la adición de algas al
suelo agrícola es una alternativa bien reconocida (Aitken et al., 1965; Button y Nayes,
1964; Senn, 1987; Verkleij, 1992). Las algas aportan al suelo iguales cantidades de N,
más K y menos P que el estiércol de granja (Kingman, 1982). Son pues adecuadas para
suelos pobres en K o para cultivos exigentes en este nutriente (López y Pazos, 1997).
Además han recuperado su respeto en muchas aplicaciones, dado que se trata de un
fertilizante orgánico renovable, aspecto importante al considerar las acciones de
recuperación de suelos empobrecidos así como a las actividades agrícolas sostenibles
con el medio ambiente.
En la utilización como fertilizantes, un sector de crecimiento actual es el de los
extractos líquidos de algas, que pueden producirse en forma concentrada para ser
diluidos en el uso. Pueden aplicarse directamente a las plantas (superficie foliar) o
pueden agregarse al suelo como riego.
Por otra parte, no son muchos los trabajos realizados acerca del poder fertilizante de
especies aisladas de algas y la mayoría de ellos analizan un aspecto muy concreto de sus
efectos, como su acción inhibidora o potenciadora del crecimiento de las plantas
(Francki, 1960; Myklestad, 1963; Hammel et al., 1998), la asimilación de determinado
nutriente por el cultivo (Zunino et al., 1971), el análisis de ciertas especies para evaluar
su contenido en algunos elementos y proponer su posible utilización como abono (Gero
y Varlet, 1959; Arévalo, 1965; Real Hardisson, 1987) o utilizar como enmienda
fertilizante, compost o diversos subproductos de determinadas especies (Hansen et al.,
1987, Goatley y Schmidt, 1990; Morand et al., 1990, Warman y Munro Warman, 1993;
Yvin, 1994). Por todo ello se considera de interés contribuir a completar la información
existente en este campo de la investigación sobre el aprovechamiento de las algas.

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El objetivo fundamental de este trabajo fue evaluar el potencial de Undaria


pinnatifida, como fertilizante. El motivo de selección de la especie además del propio:
alga parda, rápido crecimiento y porte mayor se debió a que U. pinnatifida, en muchos
lugares del mundo y en especial en las costas patagónicas presenta un crecimiento
exagerado, haciendo peligrar el equilibrio ecológico. Se trata de un alga invasora
procedente de Japón, capaz de acaparar casi toda la luz de la zona fótica (forma grandes
masas totalmente cerradas que cubren amplias extensiones), por lo que impide el
desarrollo de cualquier otra especie de algas (Martín y Bastida, 2008). Este
comportamiento generó en nuestras costas un fuerte impacto (Piriz et al., 2003; Martin
y Cuevas, 2006). La existencia de grandes cantidades de biomasa algal fue uno de los
principales motivos para evaluar su potencial uso como biofertilizante.
En relación al uso del extracto algal obtenido, se evaluaron los efectos como
fertilización localizada aplicada a la germinación de semillas, la emergencia de
plántulas in vitro, el crecimiento y desarrollo de plantas en tierra de Salvia officinalis.
La elección de la citada especie, aromática cultivada, se debió a la demanda regional
de intensificar la producción de su cultivo.

2. Materiales y Métodos

Recolección de las algas. U. pinnatífida fue recolectada en el área de la costa de la


Patagonia media (44º 02´ S y 67º 36´ O). Las muestras fueron cosechadas manualmente
a una profundidad entre tres a siete metros, posteriormente se lavaron con agua de mar
para eliminar las partículas extrañas, de arena y epífitas. Las algas se mantuvieron en
una caja con hielo granizado y se transportaron inmediatamente al laboratorio. A
continuación se lavaron con agua del grifo y se centrifugaron a 2800 rpm durante 5
minutos, para desechar la sal de la superficie de las muestras y eliminar el exceso de
agua respectivamente. A posteriori se secaron a temperatura ambiente durante diez días
y se utilizaron para obtener el extracto algal macerado ácido (EAMA). Por el contrario
el extracto algal macerado hervido (EAMH) se obtuvo a partir de alga fresca.
Obtención del extracto acuoso. La obtención del extracto acuoso se obtuvo por los
procesos de maceración en agua caliente y por hidrólisis ácida (Metting, et al., 1990).
En la obtención del extracto líquido macerado hervido (EAMH) se utilizó alga

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fresca, que fue fraccionada en pequeños trozos, se agregó agua destilada (1kg/1000mL)
se colocó a ebullición durante 1 hora (Sivasankari et al., 2006). Posteriormente se filtró
con malla multifilamento en caliente y se adicionó formaldehído (1/1000) como
conservante (Verkleij, 1992).
Con respecto a la preparación del extracto líquido macerado en medio ácido
(EAMA) se utilizó 100 g de alga seca trituradas e hidratadas con 900 mL de agua
destilada. A posteriori se maceró durante 1 hora en 1 litro de una solución 0,02 M de
ácido clorhídrico (Sridhar et al., 2010, 2011). Posteriormente se filtró con malla
multifilamento y se adicionó formaldehído (1/1000) como conservante (Verkleij, 1992).
Ambos extractos (EAMH y EAMA) se almacenaron en refrigeración hasta su uso y
fueron considerados como extracto de algas al 100%.
A partir de estos extractos concentrados se prepararon los extractos de partida, en
concentraciones de 5, 10, 20 y 40% utilizando agua destilada. (Sivasankari et al., 2006).
Obtención de explantos. Los ensayos para evaluar el efecto de los extractos algales
en las concentraciones de 5, 10, 20 y 40%, se realizaron a partir de semillas de Salvia
officinalis en los procesos de germinación, crecimiento de explantos in vitro e in vivo
(invernadero).
Las semillas de Salvia officinalis fueron obtenidas en el mercado comercial,
pertenecen a FLORENSA ARGENTINA S.A. (www.forensa.com.ar), corresponde a
semillas clase identificada, con pureza y germinación establecida por ley y curadas con
veneno. Número de Lote 84.11.09 y Lote 99.90.10.
Germinación. Las unidades experimentales fueron cajas de petri. Se colocaron 25
semillas por placa, con cuatro repeticiones por tratamiento para la especie seleccionada.
Un lote de semillas se consideró como el control y fueron embebidas en 10 mL de agua
corriente estéril. El resto de los lotes fueron tratados con 10 mL de extracto algal acuoso
de distintas concentraciones (5%, 10%, 20% y 40%). Las placas sembradas fueron
colocadas en cámara de germinación a 24 ± 1ºC, en oscuridad. El número de semillas
germinadas fue verificado cada dos días. Los datos obtenidos al final de los ensayos
fueron el porcentaje final de germinación (%); la tasa de germinación (Maguire, 1962;
Naylor, 1981) y el valor germinativo (VG). Se consideró como criterio de germinación
la emergencia de la radícula a través del tegumento de la semilla.

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Establecimiento in Vitro. Plántulas con raíces entre 2 y 50 mm de largo fueron


establecidas en medio MS (Murashige & Skoog, 1962), suplementado con vitaminas:
tiamina, piridoxina, ácido nicotínico, glicina, myoinositol y cisteína (Jordan et al., 1987;
Arce y Balboa, 1991), 87,6 mM de sacarosa y 0,7% de agar bacteriológico y diferentes
concentraciones de extracto algal acuoso (0; 0,25; 0,5; 1%). El pH se ajustó a 5,7. El
material se incubó por 30 días, en cámara de cultivo a una temperatura de 21 ± 1ºC;
fotoperíodo de 16 h y una intensidad lumínica de 120 mE.cm-2s-1. Los parámetros
registrados fueron número de plántulas, número de nudos por plántula, longitud de
vástago y raíz. (N=20, con tres repeticiones).
Establecimiento in vivo. Las plántulas fueron transferidas a condiciones de
invernadero con una temperatura de 21ºC y 78 % de humedad relativa. El sustrato
utilizado fue una mezcla 3:1:1: musgo:vermiculita:arena (suelo de campo) (Arce y
Balboa, 1991). Las macetas fueron regadas con el extracto algal acuoso en las siguientes
proporciones: control 0% ; 5%; 10% ; 20% y 40% . El pH se ajustó entre 5,5 y 6,5. Con
condiciones de humedad controladas y fotoperíodo de 16 h N=15 plántulas por
tratamiento. Los parámetros registrados a los 45 días de cultivo fueron: % de
supervivencia, número de nudos por plantas, longitud de vástago y raíz de las plantas.
Tratamiento estadístico de datos. Para determinar la eficacia de los distintos
tratamientos en el proceso de germinación y crecimiento de plántulas in vitro y de
plantas in vivo se procedió a analizar estadísticamente los resultados obtenidos. Se
utilizó para ello las funciones incluidas en la planilla de cálculo Excel y el programa
Biomstat, siguiendo las indicaciones de Sokal & Rohlf (1995) y Rohlf (1997).
Los datos sobre frecuencia en la germinación, se analizaron a través de una prueba de
G ajustada por corrección de Williams.
Para analizar la respuesta a los distintos tratamientos in vitro e in vivo, se chequearon
datos para normalidad y homogeneidad de las varianzas a través de los test de Bartlett, F
máxima y Log–anova y fueron tratados mediante un análisis de la varianza.
3. Resultados
Salvia officinalis es la especie seleccionada para probar el potencial efecto
fertilizante de Undaria pinnatifida, probándose ambos tipos de extractos (EAMH y
EAMA).

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Germinación. Las unidades experimentales de germinación (placas de petri) con


semillas previa asepsia fueron tratadas con 10mL en distintas concentraciones.
El porcentaje y la tasa de germinación son parámetros que pueden ser indicativos del
vigor, el primero demuestra la porción de semillas germinando en un tiempo dado, el
segundo la velocidad de germinación de las mismas.
Los resultados de este proceso donde se probaron las mismas concentraciones para
cada tipo de extracto oscilaron entre 31-77%.

Germinación

120
100
80
EAMA
%

60
EAMH
40
20
0
0 5 10 20 40
% Concentración extracto algal

Fig. 1: Proporción de semillas germinadas de S. officinalis en extracto algal acuoso


a distintas concentraciones

En la Fig. 1 se compara el comportamiento germinativo de las semillas bajo los


efectos de los dos tipos de extracto. Los resultados registraron bajo porcentaje de
germinación cuando se utilizó el 40% de la concentración, por debajo del 50%
(p<0,05), al igual que el testigo (50%). En contraste los resultados obtenidos con las
concentraciones de 5 ,10 y 20% con ambos extractos superaron al testigo. Con EAMH
y en esas concentraciones, se observaron las mejores respuestas. El mejor porcentaje
(94%) se obtuvo con el 5% de la concentración (p<0,05), al igual que la mejor tasa de
germinación (3,74±0,38).
Crecimiento de plántula in Vitro. Los bioensayos de partida se realizaron con
plántulas de entre 4 y 5 días de crecimiento y de tamaño uniforme, condición adecuada
para el establecimiento de las plántulas en cultivo in vitro.

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El establecimiento y crecimiento de las plántulas con ambos extractos, después de


45 días en cultivo, registró en general un alto porcentaje promedio de supervivencia
entre 95-98%.
Del análisis estadístico de los datos surge que en respuesta a las distintas
concentraciones con EAMA, las plántulas a los 45 días de crecimiento mostraron
diferencias significativas (p<0,05).
El correspondiente test a posteriori indicó que la longitud promedio de las plántulas
cultivadas en medio MS, fue significativamente (p<0,05) mayor con una concentración
de 0,5% del EAMA. Las diferencias con el resto de las concentraciones ensayadas no
fueron estadísticamente significativas (Fig. 2).
En general, los valores promedios obtenidos con las plántulas creciendo in vitro
llevan a sugerir una acción positiva del EAMA en la concentración 0,5%, con una
longitud y peso fresco promedio óptimo de 11,58±0,79 cm y 0,55±0,02 g, a diferencia
el mejor registro en peso seco (0,07±0,03 g) fue con 0,25% de concentración.

Cultivo in vitro

14
12
0%
10
0.25%
8
cm

6 0.50%
4 1%
2
0
EAMH EAMA
Fig. 2: S. officinalis , longitud promedio de las plántulas cultivadas en medio MS
suplementado con extracto algal, después de 45 días de cultivo.

En contraste el crecimiento de las plántulas en medio MS suplementado con EAMH,


a igual tiempo de cultivo, muestra que la longitud y peso promedio alcanzado con las
concentraciones 0,25. 0,5 y 1% no superó al testigo, lo que permite sugerir un mejor
comportamiento de las plántulas en el EAMA (Fig. 2).
En la Fig. 3 se puede observar comparativamente el promedio de peso fresco y seco
de las plántulas cultivadas en medio MS suplementado con 45 días de crecimiento.

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Al comparar el efecto de los extractos, la concentraciones de 0,5% con EAMA


presenta el mejor registro (p<0,05) (Fig. 2 y 3).

0,6

0,4 0%
0.25%
gramos

0.50%
1%
0,2

0
P/F-EAMH P/S-EAMH P/F-EAMA P/S-EAMA

Fig. 3: S. officinalis. Efecto de los dos tipos de extractos en el peso (g) de las plántulas cultivadas
in vitro (MS), a los 45 días con fotoperíodo de 16hs

Crecimiento de plantas in vivo. Los bioensayos in vivo fueron realizados con


plantas de S. officinalis de entre 4 y 5 días de crecimiento. Siguiendo la metodología
descripta se sembraron en macetas con arena: perlita y fueron cultivadas en
invernadero.
Las plantas creciendo in vivo con EAMH a los 45 días de cultivo registraron
respuestas que permiten correlacionar el incremento de cada concentración utilizada
(tratamientos 5, 10 y 20%) con la disminución en longitud y peso de las plantas. El
promedio mayor se obtuvo cuando las plantas fueron regadas con 5% de la
concentración (13,0 ± 3,8cm y 0,36±0,06g-peso fresco). Este registro fue superado por
plantas creciendo en ausencia del extracto algal (14,72 ± 4,10cm y 0,70± 0,08g-peso
fresco). Se deduce que a medida que aumenta la concentración del extracto, los
resultados de crecimiento obtenidos en el cultivo son menores.
En la Fig. 4 se puede observar comparativamente el promedio de longitud de las
plantas tratadas con los dos tipos de extracto algal.
Del análisis estadístico de los datos obtenidos a los 45 días de cultivo en invernadero
las mejores respuestas significativas (p>0,05) en relación al tipo de extracto se
obtuvieron cuando las plantas se regaron con EAMA.

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Cultivo in vivo

30
25 0%
20
5%
cm

15
10%
10
20%
5
0
EAMA EAMH

Fig. 4: S. officinalis , longitud promedio de las plántulas cultivadas en invernadero con


extracto algal acuoso después de 45 días de cultivo

En relación a las concentraciones utilizadas en cada extracto el tratamiento con


EAMA, presenta en longitud los mejores registros (p<0,01). Con la concentración de
5% el promedio óptimo observado fue de 20,89±4,16 cm (Fig. 4) y 1,17±0,35 g de peso
fresco y con 0,25% en peso seco (0,22±0,09g). En referencia a los pesos no se
registraron diferencias significativas en ninguno de los dos tipos de extractos
ensayados.
De los resultados generales obtenidos se desprende que el porcentaje de
supervivencia de las plantas tratadas con los dos extractos en la concentración del 40%,
fue muy bajo, sobrevivieron solamente entre 6,67-13,33% a los 45 días de cultivo. En
contraste, con el mismo tiempo de cultivo y con el 5% de la concentración del EAMA
el mejor registro fue de 93,33% de supervivencia.
4. Discusión
En función de los resultados obtenidos y con respecto a la concentración de los
extractos, especialmente en la menor concentración utilizada, para determinados
procesos, el presente trabajo indica que los principales macronutrientes podrían no
haber estado disponibles en cantidades suficientes para el crecimiento y desarrollo de
las plantas. En las mayores concentraciones utilizadas para el desarrollo de Salvia, se
observó una inhibición significativa en los parámetros de crecimiento, tanto en el
extracto obtenido por decocción (hervido) como por el método ácido. Esta disminución

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podría deberse a un efecto tóxico originado por la elevada concentración de sodio de los
extractos o a un efecto osmótico provocado por la presencia de polisacáridos complejos,
como los alginatos.
Por otra parte, el estado nutricional es un atributo fisiológico de las plantas que
afecta básicamente procesos como la regulación del crecimiento, el flujo de energía y la
síntesis de los complejos moleculares que componen las plantas (Quiroz et al., 2005).
En nuestros ensayos, en los procesos en general de germinación y crecimiento in vitro e
invernadero se ha obtenido como respuesta a los tratamientos, resultados interesantes
para proyectar y continuar evaluando a U. pinnatifida como un alga con potencial
fertilizante.
Por otra parte son características del alga U. pinnatifida, el gran porte y el rápido
crecimiento, que la registra como invasora en muchos lugares del mundo, y en especial
en las costas patagónicas; tanto que hace peligrar el equilibrio ecológico por su
supremacía sobre otras especie de algas (Martín y Bastida, 2008). Este dominio trae
aparejado la disponibilidad de grandes cantidades de biomasa, condición esencial en el
uso del recurso para la obtención del extracto como fertilizante.

5. Conclusiones

• Los ensayos realizados en esta investigación permiten comparar los dos tipos de
extractos (EAMH y EAMA) con Salvia officinalis, se puede concluir que con el extracto
macerado ácido, se registraron los mayores valores en todos los procesos. Estos
resultados permiten sugerir en general una mayor eficacia en la germinación y
crecimiento de las plantas cuando se usó EAMA.
• Salvia officinalis presentó valores óptimos de germinación con ambos extractos
EAMA y EAMH al 5% de la concentración. Para el desarrollo in vitro al 0,5% del
EAMA y con el mismo tipo de extracto al 5% en cultivo in vivo. Con la mayor
concentración ensayada (40%) se registró inhibición (100%) en el crecimiento de las
plantas, en los dos tipos de extracto ensayados en invernadero.
• El comportamiento de las plántulas en cultivo in vitro con un complemento de
sales mayor por el aporte que representó cultivarlas en MS, no reflejó en los resultados

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la suposición de una ventaja o desventaja, por el efecto suplementario en relación a los


macro y micro aportados por el medio de cultivo.

Reconocimientos

Este proyecto se llevó a cabo por los aportes de la UNPSJB- Programa CIPAMCO.

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AAIQ, Asociación Argentina de Ingenieros Químicos - CSPQ

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