Práctica 14

DEPARTAMENTO DE SANIDAD
BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA 14
DIGESTIÓN DEL FAGO LAMBDA CON ENZIMAS DE

RESTRICCIÓN
Introducción
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción son nucleasas que cortan el ADN de doble cadena cuando reconocen
un patrón de secuencia específico. Generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos
de restricción. La secuencia diana es de tamaño variable, la mayoría de 4 y 6 nucleótidos, y con
frecuencia es palindrómica. Algunas enzimas de restricción cortan generando extremos romos
mientras que otras cortan generando extremos cohesivos o pegajosos.
BACTERIÓFAGO LAMBDA
Un bacteriófago es un virus que infecta exclusivamente bacterias. La mayoría de los fagos

poseen ADN de longitud variable como material genético. El fago más conocido es el fago
lambda. Este fago posee una estructura típica: una cápside icosaédrica que encierra el material
genético, una cola contráctil y una serie de espículas que sirven para su contacto con la célula a
infectar.
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PRÁCTICA 14
El acoplamiento a la bacteria se realiza mediante la unión a receptores específicos en la

superficie bacteriana, lo cual determina la especificidad de infección del virus por una especie
bacteriana concreta.
Los fagos pueden seguir dos posibles ciclos infectivos: el ciclo lítico y el ciclo lisogénico. En el
ciclo lítico, la infección del fago produce la lisis de la bacteria hospedadora y la liberación de
nuevas partículas de fagos. En cambio, en el ciclo lisogénico el fago inserta su material genético
en el genoma bacteriano, o bien queda como plásmido independiente, replicándose en cualquier
caso al mismo tiempo que el genoma de la bacteria, pero sin producir la lisis bacteriana. Podría
considerarse la lisogenia como una especie de latencia aplicada a los fagos. En general, muy
pocos fagos son capaces de realizar ambos ciclos. Los que lo hacen entran en una u otra versión
dependiendo de las condiciones externas.
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MAPA DE RESTRICCIÓN BACTERIÓFAGO LAMBDA
En la secuencia de nucleótidos del fago lambda, que tiene 48502 pares de bases, podemos
encontrar diferentes lugares donde las enzimas de restricción cortan. En esta práctica se va a
utilizar las enzimas Eco RI y Hind III para ver qué patrón de bandas proporciona al digerir el
fago lambda. Estas digestiones se preparan comercialmente (marcadores de peso molecular
estándar) y se utilizan para determinar el tamaño de fragmentos de ADN en una electroforesis
en gel de agarosa.
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Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa 1% del ADN del fago lambda digerido con las
enzimas Eco RI y Hind III
Objetivos
• Conocer el bacteriófago lambda.
• Entender los principios de la digestión del ADN con enzimas de restricción.
• Realizar correctamente una electroforesis en gel de agarosa.
Material
• Cubeta de electroforesis, moldes y peine.
• Fuente de alimentación
• Micropipetas con puntas.
• Papel de filtro.
• Microondas.
• Baño termostático.
• Termómetro.
• Vidrio de reloj.
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• Balanza.
• Espátula.
• Vaso de precipitados o matraz Erlenmeyer.
• Probeta.
• Eppendorf.
• Lámpara de UV.
Reactivos
• Tampón de electroforesis 10X
• Agarosa.
• Agua (tapón amarillo).
• Fastgreen (tapón verde).
• Gelsafe.
Muestras
• Marcador Eco RI y Hind III (tapón negro).
• Lambda ADN con tampón de carga (tapón lila).
• Lambda ADN (tapón blanco).
• Eco RI (tapón rojo).
• Hind III (tapón azul).
Procedimiento
Preparación gel de agarosa 1%
1. Preparar el molde colocando los topes y el peine.
2. Preparar el gel de agarosa: 42ml de tampón 1x + 0,40g de agarosa
• Calentar la mezcla.
• Enfriar a 55ºC
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• Añadir 2,5μl de Gelsafe.
• Mezclar.
• Echar en el molde y dejar solidificar.
Preparación de las reacciones de restricción
1. Sacar las muestras del congelador y dejar que se descongelen.
NOTA: Las enzimas de restricción siempre están en estado líquido y se deben mantener
siempre en el congelador, sólo sacar al utilizarlas y devolverlas rápidamente al congelador.
2. Preparar las siguientes reacciones (volumen total 25μl):
3. Incubar en el baño termostático a 37 ºC durante 15-30 minutos.
4. Colocar el gel en la cubeta de electroforesis con 300ml de tampón de electroforesis (cubrir el

gel completamente).
5. Quitar peine.
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Siembra de las muestras en el gel de agarosa
NOTA: Previamente mezclar bien Eppendorf (spin en vórtex).
2. Conectar electrodos y correr el gel a 150V durante 20 minutos.
3. Visualizar los fragmentos obtenidos en la lámpara de UV.
4. Interpretar los resultados.

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DIGESTIÓN DEL FAGO LAMBDA CON ENZIMAS DE

Un bacteriófago es un virus que infecta exclusivamente bacterias. La mayoría de los fagos

El acoplamiento a la bacteria se realiza mediante la unión a receptores específicos en la

MAPA DE RESTRICCIÓN BACTERIÓFAGO LAMBDA

• Conocer el bacteriófago lambda.

• Entender los principios de la digestión del ADN con enzimas de restricción.

• Realizar correctamente una electroforesis en gel de agarosa.

• Cubeta de electroforesis, moldes y peine.

• Micropipetas con puntas.

• Vaso de precipitados o matraz Erlenmeyer.

• Tampón de electroforesis 10X

• Agua (tapón amarillo).

• Fastgreen (tapón verde).

• Marcador Eco RI y Hind III (tapón negro).

• Lambda ADN con tampón de carga (tapón lila).

• Lambda ADN (tapón blanco).

• Eco RI (tapón rojo).

• Hind III (tapón azul).

Preparación gel de agarosa 1%

1. Preparar el molde colocando los topes y el peine.

2. Preparar el gel de agarosa: 42ml de tampón 1x + 0,40g de agarosa

• Añadir 2,5μl de Gelsafe.

• Echar en el molde y dejar solidificar.

Preparación de las reacciones de restricción

1. Sacar las muestras del congelador y dejar que se descongelen.

2. Preparar las siguientes reacciones (volumen total 25μl):

3. Incubar en el baño termostático a 37 ºC durante 15-30 minutos.

4. Colocar el gel en la cubeta de electroforesis con 300ml de tampón de electroforesis (cubrir el

Siembra de las muestras en el gel de agarosa

NOTA: Previamente mezclar bien Eppendorf (spin en vórtex).

2. Conectar electrodos y correr el gel a 150V durante 20 minutos.

3. Visualizar los fragmentos obtenidos en la lámpara de UV.

4. Interpretar los resultados.

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