CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDA
Conceptos básicos
¿Qué es?
• Es una técnica de separación en la que una muestra es separada en
sus componentes cuando se distribuye entre el líquido que fluye (fase
móvil-alcohol en la cubeta) y un material adsorbente (fase
estacionaria-tira de papel).
¿Por qué salen las bandas a tiempos
diferentes?
• Porque cada componente o banda tiene una afinidad diferente por el
papel (fase estacionaria) y por el líquido (fase móvil).
 Breve historia
El botánico ruso Mikhail Tswett en 1903, separó los pigmentos de las
plantas usando carbonato de calcio (CaCO3) y solvente en una columna
de vidrio.
Tipos de cromatografía líquida
Cromatografía en fase normal
Cromatografía en fase reversa
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de exclusión por tamaño
Cromatografía en fase normal
Es el modo tradicional de separación basado en la adsorción y desorción
de un compuesto sobre una fase estacionaria polar (normalmente sílica
o alúmina).
 Cromatografía en fase reversa

La separación de los compuestos se basa en la diferente afinidad que

existe por la fase móvil (polar) y la fase estacionaria (no polar o
hidrofóbica).
Cromatografía en
fase reversa 2

La fase estacionaria es
apolar (cadenas
hidrocarbonadas) y la
fase móvil es polar.
Los compuestos no
polares salen más
tarde que los
compuestos polares.
Interacciones con la
fase estacionaria para • Interacciones con la fase estacionaria
fase reversa

La doble flecha señala las

interacciones hidrofílicas (que
puede unirse temporalmente con el
agua por medio del hidrógeno). La
doble flecha inclinada indica
interacciones iónicas.
La flecha gruesa sencilla marca los
sitios de ataque: bajo condiciones
fuertemente ácidas el enlace
comienza a hidrolizarse (romperse).
 Cromatografía de intercambio iónico

Separación basada en el intercambio de los compuestos iónicos con los

grupos iónico pegados a la fase estacionaria. Acá las fases estacionarias son
sulfonatos o sales cuaternarias de amonio. Las fases móviles son búferes.
 Cromatografía de exclusión por tamaño

Modo de separación que se basa únicamente en el tamaño molecular

del compuesto, donde las moléculas grandes no entran en los poros y
salen rápidamente y, las moléculas pequeñas penetran los poros
desplazándose lentamente a través de la columna.
Otros modos de separación en
cromatografía líquida

Cromatografía de afinidad
Cromatografía quiral
HILIC (Hydrophilic interaction chromatography)
Hydrophobic interaction chromatography
Electrocromatografía (electroforesis capilar)
Cromatografía por fluídos supercríticos
 Términos básicos y conceptos

En cromatografía líquida cuando la fase estacionaria es menos polar que

la fase móvil el sistema se denomina fase reversa y, por tanto, los
analitos polares tienen menos afinidad por la fase estacionaria que los
apolares, eluyendo en primer lugar.
 Polaridad de moléculas
Una molécula es polar cuando el centro de carga negativa no coincide con el de la
positiva, formando así un dipolo (dos cargas iguales y opuestas) de tal manera que
los electrones no se comparten igualmente tendiendo a ser molécula asimétricas.
Moléculas como H2, O2, N2, Cl2 y Br2 tienen dipolos nulos, es decir, no son polares.
Ejemplos de moléculas
polares
Ejemplos de moléculas no
polares
Molécula de metano
Polaridad y enlaces
Relación entre ellos
Enlace covalente
Los átomos se pueden unir
formando lo que se llama un enlace
químico. Estos enlaces son las
fuerzas que mantienen unidos a los
átomos.
Cuando dos átomos se unen, ceden,
aceptan o comparten electrones,
pero solo los llamados "electrones
de valencia" pueden hacer esto. Los
electrones de valencia son los que
se encuentran en la última capa del
átomo y son los únicos que están
dispuestos a dejar compartirse con
otro átomo.
Cuando dos átomos se unen
siempre cumplen la llamada regla
del octeto.
Regla del octeto

La regla del octeto, también llamada

ley de Lewis, dice que todos los
átomos de los elementos del sistema
periódico, tienden a completar sus
últimos niveles de energía con una
cantidad de 8 electrones.

Son los electrones de la última

capa, los más alejados del núcleo, los
que tienden a completarse hasta ser
un total de 8 electrones y, para ello,
compartirán electrones con otro
átomo.
Electronegativida
d
Los átomos No metálicos suelen tener
muchos electrones girando en su última
órbita (electrones de valencia) por lo
que tienden a ganar electrones en lugar
de cederlos para tener los 8 electrones
de la regla del octeto y tener la
estabilidad de los gases nobles (que ya
tienen los 8 electrones de valencia).

Los no metales, como no quieren

desprenderse de electrones, al
encontrarse o unirse, lo que harán será
compartir electrones de su última capa.
Electronegativida
d2

"Los enlaces covalentes se forman

compartiendo electrones de
valencia“

Cuando se unen dos átomos no

metálicos los electrones que
comparten los mantienen unidos y
forman parte de los dos átomos,
formando así una molécula (varios
átomos unidos).
Formación de los enlaces
covalentes

El cloro en estado natural se presenta en

Cl2, es decir una molécula de cloro de 2
átomos. Los dos átomos de cloro están
unidos mediante un enlace covalente.
El cloro tiene 7 electrones en su última
capa, por lo tanto si comparten uno de
estos electrones cada uno , en la
molécula ya tendrían 8 electrones cada
uno.
Perfecto han formado una molécula con
dos átomos muy estables. Este enlace
solo necesita compartir un electrón cada
uno para formar el octeto.
 El pH
Es un indicador de acidez de una
sustancia.

Su importancia radica en que

determinados procesos químicos
pueden tener lugar a un determinado
pH.

Cuando el pH de una sustancia es

mayor de 7, es una sustancia básica.
Cuando el pH de una sustancia está por
debajo de 7, es una sustancia ácida
Importancia del pH • ÁCIDO BENZOICO

pKa= 4,08
La importancia del pH 2 • Ácido gálico

Varios pKa
 Tiempo de retención

Tiempo de retención, tR (min): es el tiempo transcurrido desde la

inyección hasta la detección de la molécula.
 Tiempo muerto
Tiempo muerto, tM (min) : es el tiempo requerido para que eluya un
compuesto no retenido por la columna. También se conoce como
tiempo cero o tiempo de retención del disolvente.
 Factor de capacidad
Factor de capacidad: es el grado de retención de una muestra en la
columna, es decir, la relación entre el tiempo que reside el compuesto
en la fase estacionaria y el tiempo que reside en la fase móvil
Factor de capacidad 2
Cómo modificarlo Medición
• En fase reversa cambiando la • Sirve para evaluar la retención y
fuerza de elución de la fase aumentar la separación. Para
móvil, es decir, al aumentar la mezclas de pocos componentes
proporción del componente el valor oscila entre 2 y 10. Para
orgánico, este valor disminuye. más picos entre 0,5 y 20.
 Selectividad
Selectividad, α (adimensional): determina la separación entre picos y
representa una relación de la retención relativa de dos compuestos que
eluyen uno a continuación del otro. Un valor de selectividad igual a 1
representa tiempos de retención iguales y por lo tanto no existe
separación. Un número más grande representa una columna más
selectiva. Cuanto más alejado de “1”, mayor separación.
Selectividad 2
La selectividad se
modifica utilizando fases
estacionarias y móviles
diferentes, modificando
gradualmente la
composición de la fase
móvil, o las cantidades
relativas de ambas fases.
Selectividad 3
Cómo mejorarla

• Cambiando la fuerza
del solvente
• Mezclar diferentes
solventes
• Cambiar el tipo de
columna
• Variar la temperatura
 Resolución

Resolución, Rs (adimensional). Es una medida cuantitativa del grado de

separación de dos picos. Un valor de 1,5 representa una separación
hasta la línea base de ambos picos y un valor de 1,0 representa una
resolución del 90%. En algunos casos esto essuficiente para los cálculos
del área de los picos (análisis cuantitativo). Valores de Rs < 1 indican
solapamiento; valores de Rs ≥ 1 indican separación.
Resolución 2
Uno de los principales inconvenientes que • Resolución de dos sustancias al pasar por la
se presenta cuando ocurre este fenómeno columna
de ensanchamiento de la banda es la
pobre resolución o la capacidad para
separar analitos que se mueven de forma
similar, tal como se indica en la figura
parte (a), aquí, las dos sustancias no se
pueden aislar completamente.

Para superar esto tipo de inconvenientes,

es posible, ya sea disminuyendo los anchos
de los pico (aumentando la eficiencia de la
separación) como en la figura parte (b) o
aumentando la separación entre los picos
(cambiando la selectividad de la columna)
tal como lo indica la figura parte (c).
Resolución 3
La eficiencia puede mejorarse aumentando la
longitud de la columna, disminuyendo el flujo
de la fase móvil o disminuyendo el tamaño de
partícula de la fase estacionaria.
Eficiencia o número de platos teóricos

Número de platos teóricos: es una medida de la eficiencia de la

columna.
 Cálculo del número de platos
teóricos

N= número de platos teóricos.

Wb= ancho del pico.
tR = tiempo de retención del
pico en minutos

Así,
N= 16(tR/Wb)²

El valor Wb corresponde al
ancho a la mitad de la altura.
Fase móvil
Algunas propiedades de los solventes más
comunes en hplc:
• Fase móvil: solvente que mueve
el compuesto a través de la
columna. En cromatografía
líquida la fase móvil interactúa
con el compuesto y con la fase
estacionaria y tiene gran
influencia en la retención y
separación.
Fase estacionaria

• Fase estacionaria: aquella donde

quedan retenidos los
compuestos y a través de la cual
fluye la fase móvil arrastrando
los mismos.
Absorción
Ocurre cuando una sustancia
se introduce en la estructura
de otra. Ejemplo: una esponja
absorbe agua, entonces si
cortamos la esponja en
pedazos vamos a encontrar
agua en todas partes de la
estructura de la esponja.
Adsorción
Fenómeno superficial
donde la sustancia
adsorbida no se
introduce en el
volumen del cuerpo,
sino que solo se
adhiere a la superficie.
Cromatografía en • Montaje
columna
La cromatografía de elusión en
columna es una técnica de
separación que consta, básicamente,
de un adsorbente ó fase estacionaria
que se encuentra empacada en un
tubo y sobre el cual fluye la fase
móvil ó eluyente, el cual puede ser un
líquido ó un gas (en nuestro caso solo
analizaremos el primero). La muestra
se ubica en la cabeza de la columna y
sobre ella se añade el disolvente.
Proceso de separación en cromatografía de
columna
El proceso de separación consta del transporte de los solutos A y B de la muestra a
través de la columna por la adición continua de fase móvil.
Una porción de muestra a separar se introduce en la parte superior de la columna
quedando adsorbida en la fase estacionaria, a continuación, se vierte la fase móvil
(eluyente) en la parte superior de la columna y se permite su paso a través de la
fase estacionaria; así los componentes de la muestra se distribuyen entre las dos
fases: durante el proceso cromatográfico los componentes de la muestra son
arrastrados por la fase móvil a distintas velocidades efectuándose la separación. La
velocidad de arrastre de cada componente depende de su grado de adsorción en la
fase estacionaria y de su afinidad por la fase móvil.
 Proceso de separación en cromatografía de columna

Si las fases en contacto son escogidas de forma adecuada, estos solutos

pueden ser separados en el transcurso de su viaje a través de la
columna (en los instantes t1 y t2, se observa como la zona
correspondiente al compuesto A se desplaza más rápido, es decir, este
interacciona más fuertemente con la fase móvil, mientras que B se
mueve más lentamente, o en otras palabras, permanece más tiempo en
la fase estacionaria).
 Representación del proceso de separación de
una muestra binaria:

• Elución y detección
Sílica gel
Es una forma granular y porosa de
dióxido de silicio, hecho a partir de
silicato sódico. Es un gel sólido y
duro, de aspecto cristalino, poroso,
inerte, no tóxico e inodoro. Su
fórmula molecular es SiO2.nH2O,
casi insoluble en agua y en
cualquier otro disolvente. Es
químicamente estable, sólo
reacciona con ácido fluorhídrico y
con álcali.
 Sílica gel 2

Es un producto absorbente que puede diferenciar la adsorción de

diferentes moléculas, actuando como un adsorbente selectivo en
procesos de cromatografía.
Cromatografía en papel
En esta técnica
la fase estacionaria está constituida
simplemente por una tira o circulo
de papel de filtro. La muestra se
deposita en un extremo colocando
pequeñas gotas de una solución de la
muestra y evaporando el
disolvente luego de cada aplicación.
Luego el disolvente o mezcla de
disolventes empleada como fase móvil
(eluente o eluyente) se hace
ascender por capilaridad. Para esto se
coloca una porción del papel en
contacto con la fase móvil dentro de un
recipiente que la contiene
(cámara de desarrollo).
Cromatografía en papel 2

El proceso de separación se
produce a causa de las
interacciones entre los
componentes de la mezcla
con la fase móvil y la fase
estacionaria, lo cual causa la
distribución de los
componentes de la mezcla
entre las dos fases.
Cromatografía en papel 3

Las interacciones mencionadas

pueden tener su origen en dos
fenómenos :
1. La adsorción, que es un
fenómeno de interacción
superficial por el cual átomos,
iones o moléculas son retenidas
en la superficie de un material.
2. La absorción, es un fenómeno
de retención que incluye la
penetración de una especie
química en todo el volumen del
material.
El puente de
hidrógeno

Es un enlace que se produce

a partir de la atracción entre
un átomo de hidrógeno y un
átomo de oxígeno, flúor o
nitrógeno con carga
negativa. Esta atracción une
el polo positivo de una
molécula con el polo
negativo de otra.
Solventes HPLC
UV cutoff:

Es la longitud de onda a la cual la

absorbancia del solvente en una
celda de un centímetro es igual a uno
comparado con el aire como
referencia.
Un solvente con impurezas suma
todas las absorbancias a la longitud
de onda indicada.
Crítico para la reproducibilidad
cromatográfica.
Cutoff solventes

Usar un solvente con una

longitud de onda de corte
superior a la del análisis
genera alto ruido y, con
esto límites detección
superiores y menor
sensibilidad.
Solventes fase reversa

Comúnmente son:
Metanol
Acetonitrilo
Agua
THF
Se puede deducir porqué el
acetonitrilo es preferido para
trabajar a bajas longitudes de
onda.
Solventes hplc
Desde el punto de vista
de la absorbancia
ultravioleta, el solvente
UV perfecto no debería
absorber a 195 nm (que
es el nivel más bajo típico
de operación para los
detectores).
Propiedades de los solventes para
HPLC
Propiedad Comentario

• Cutoff • En detección UV la longitud de

onda de detección obliga a
seleccionar correctamente el
• Índice de refracción solvente.
• Se prefieren valores bajos.
• Polaridad • Determina la fuerza del solvente.
• Determina las diferencias en
• Selectividad selectividad del solvente.
 Propiedades de los solventes para
HPLC
Propiedad Comentario

• Solubilidad de la muestra • Importante en análisis de trazas.

• Preferible valores bajos.

• Viscosidad
• Preferibles altos P.E.
• Punto de ebullición
• Importante en selección del solvente
para fase reversa y solvente de
• Miscibilidad muestra.
 Propiedades de los solventes para
HPLC
Propiedad Comentario

• Densidad • Cuando se preparan fases

móviles por peso.
• Estabilidad
• Generalmente poco importante.
• Seguridad
• Importante pero no crítico.
La elección del
solvente
adecuado
Lo básico:

• Compatibilidad con el
detector
• Polaridad
• Selectividad
• Seguridad
Compatibilidad con la
deteccción • Raramente se usan longitudes de onda <200 nm,
excepto en casos muy concretos de solutos con baja
Detección UV: la fase móvil absorbancia (carbohidratos, triglicéridos, ácidos
debería tener una absorbancia A grasos…)
< 0.2 AU en la longitud de onda
seleccionada para la detección
de la muestra: una menor
absorbancia permite una mayor
precisión del ensayo y mejores
resultados en condiciones de
elución por gradiente, aunque
una absorbancia mayor puede
resultar aceptable en algunas
separaciones isocráticas.
El solvente
desgasificado
La desgasificación contribuye a una
menor absorbancia (aproximadamente
un 30% menor) entre 200 y 240 nm en
función del menor contenido de
oxígeno disuelto, que es mayor cuanto
más polar sea el solvente: el efecto de
la desgasificación será más notable en
solventes más polares como el THF o el
IPA.
Se asume que el agua ha sido
purificada según ASTM D1139 y que
además, si se requieren niveles de
detección muy bajos, el valor de TOC
(Total Organic Carbon) ha de ser < 50
ppb y la resistividad alta.
El solvente desgasificado 2

En condiciones de gradiente es
necesario que la respuesta del
detector se mantenga constante,
y es necesario que el solvente A
(normalmente agua) y el
solvente B respondan de manera
similar y si se trabaja a bajas
longitudes de onda la elección
de solventes disponibles se
reduce considerablemente.
Viscosidad del solvente • Viscosidad de la fase móvil en función de la composición de
B y la temperatura

Valores de
viscosidad de
mezclas MeOH/Agua
y ACN/Agua en
función de la
temperatura.
Preparación de fases
móviles por peso

Densidad para algunos

solventes comunes, y
permite la
formulación de fases
inversas por pesada
de cada componente
en la mezcla.
Solventes y
filtración

Ya que :
- los diametros internos de los
capilares de conexión, y
-las particulas y tamaño de
poros de la columna son cada
vez más pequeños, la
filtración de las fases móviles
es una obligación ineludible.
Solventes y
filtración

Además, filtrar los solventes

previene la aparición de picos falsos
en el detector al eliminar los
contaminantes que puedan existir.
Filtrar siempre los disolventes con
filtros de 0.45 μm ó 0.20 μm ya que
las pequeñas partículas pueden
bloquear los capilares y válvulas.
Usar filtros que retengan algas.
Evitar disolventes corrosivos del
acero, y alargar así la vida de la
bomba.
Cuidados de la
fase móvil

Las partículas de los solventes no

filtrados , mal filtrados o los
solventes contaminados por el
crecimiento bacteriano ( algas)
pueden obstruir el filtro de entrada
de disolvente en la botella,
reduciendo el rendimiento de la
bomba, que se reflejará
moviéndose los tiempos de
retención.
Cuidados de la
fase móvil 2
Además, si el filtro se bloquea y la
bomba continúa trabajando pero no
puede aspirar disolvente, la bomba
comenzará a aspirar aire. Eso producirá
perturbaciones periódicas en la línea
base, flujo inestable y hasta fallo
completo en la bomba. Tener especial
cuidado con los disolventes acuosos o
tampones fosfato y acetato (pH 4-8).
Intentar limpiar o cambiar los filtros
regularmente (cada 3 meses).
Cuidados de la fase móvil 3

Si es posible, use botellas de disolventes estériles

o de color ámbar, para retardar aparición de algas.
-Evite exposición de la botella de disolvente
directamente a la luz del sol (use papel de
aluminio, proteja de las ventanas).
-Filtre los solventes con filtros de 0.4 o 0.2 μm o
membranas que retengan algas.
-Reemplace los solventes cada dos días (intente
no re-filtrar).
-Considere añadir 5-10% de orgánico a la fase
móvil acuosa para impedir el crecimiento
bacteriano, siempre que la aplicación lo permita.
-Comprobar si un filtro está bloqueado
desconectándolo del desgasificador y ver si sale ,
ya que un filtro bloqueado no afecta a la lectura
de presión en la bomba.
Filtros de entrada

Limpie o reemplace los filtros de entrada de

disolvente
1.Retire los filtros de entrada de disolvente.
2.Tenga a mano uno limpio para comparar
3.Reemplace los filtros de vidrio, ó limpiarlos
(sumérjalos en ácido nítrico concentrado
(35%) durante una hora).
4.Lávelos bien con agua , ya que podría
dañarse la columna.
5.Reinstale los filtro de entrada de solvente.
6.Use Filtros de Acero Inoxidable para el
Sistema 1200 RRLC
No usar NUNCA la bomba sin filtros de entrada
Puntos de filtración en la ruta hacia
el HPLC
Botellas de disolvente ( filtros botellas: cambio o limpieza si están bloqueados)
Bomba (Frita Válvula Purga: cambio si hay sobrepresión o aumento de Presión en el sistema.
Se forman capas negras o amarillas en la superficie de la frita )
Filtros en-línea
Normalmente colocados entre el automuestreador y la columna
Columna

La frita de entrada de la columna es difícil de reemplazar (no recomendado).

Se puede revertir el flujo de la columna y eliminar la obstrucción (flujo a desechos), pero
puede que no se restablezca totalmente la columna.
Muchos fabricantes usan fritas de 2 um para columnas con partículas de 3 a 5 um y fritas de
0.5 um para columnas con partículas sub 2 um . Elija la frita del filtro en-línea de acuerdo con
la frita de la columna.
Acetonitrilo

Propiedades físicas y
químicas:
• Baja absorbancia por
debajo de 200 nm (< 0,05
AU).
• Bajo nivel de ruido
cromatográfico.
• Excelente capacidad de
solubilizar.
Química del
acetonitrilo
Este compuesto es miscible en agua y
soluble en disolventes orgánicos.

Es un disolvente de polaridad media

que disuelve una gran cantidad de
compuestos iónicos así como
compuestos no polares.

Su reactividad es baja, lo que le hace

más útil para realizar las mezclas
necesarias para usar como eluyentes
de cromatografía.
Metanol
Propiedades físicas y químicas:

•Estructura química muy similar a la del agua.

•Tiene poca viscosidad.

•Miscible tanto en agua como en otros

solventes de tipo orgánico.

•Tendencia a formar puentes de hidrógeno.

•Cutoff de 205 nm.

Agua

Propiedades físicas y químicas:

• El oxígeno es un átomo
electronegativo o "amante" de los
electrones, a diferencia del
hidrógeno.
• El agua es una molécula polar.
• La alta polaridad le confiere a los
iones y otras moléculas la facilidad
para disolverse en el agua.
• Capacidad de formar enlaces por
puentes de hidrógeno.
Y FASES MÓVILES

Modificadores ácidos de
fases móviles como:

• Ácido fosfórico
• Ácido acético
• Ácido fórmico
• Ácido trifluoroacético.
Y FASES MÓVILES

Modificadores ácidos de
fases móviles como:

• Ácido fosfórico
• Ácido acético
• Ácido fórmico
• Ácido trifluoroacético.
Y FASES MÓVILES

Modificadores básicos de
fases móviles como:

• Trietilamina
• Trietanolamina
• Dietilamina
Y FASES MÓVILES

Buffer como fase móvil :

• Fosfato
• Acetato
• Mezcla de ácido
trifluoroacético y
trietilamina
Modificadores de fases
móviles

Características:

• Presentes en bajas
concentraciones (< 2%).
• Bajos niveles de
absorbancia con
excepciones (ácido acético
y trifluoroacético).
Lotes de
solventes
Variación:
• El cutoff de cada lote de solvente puede
variar.
• Un lote típico de metanol tiene cutoff de
202 nm y a 205 nm una absorbancia de
0.84 según la gráfica.
• Si el cutoff está definido como un valor
de 1……vemos una diferencia de aprox.
0,2 UA.
• El efecto:
 Cambios en la sensibilidad
 Cambios en el rango de trabajo
 Incremento en el nivel de ruido
Lotes de
solventes 2

Solución:
 Realizar los análisis con un
aumento de 20 nm por
encima de la longitud de
onda de corte del solvente.
 O…comunicarse con el
fabricante para que logre
cumplir con los
requerimientos del solvente.
Lotes de
solventes 3
Y porqué estos cambios en los lotes? • Gradientes de metanol:agua 20/80
 Por cambios en la composición de la
materia prima. hasta 100/0 a 254 nm
 Cambios en los procesos de manufactura.

Entonces…cómo sería un cromatograma

afectado:
 Hombros
 Mesetas
 Absorbancias máximas
 Anchos de banda muy grandes creados por
contaminantes aromáticos.
 Picos con baja absorbancia entre 250 nm-
280 nm.
 Picos inexplicables.
Lotes de solventes 3

Gradientes de metanol:agua 20/80

hasta 100/0 a 254 nm
a) Lote perfecto de metanol.
b) Lote con bajo nivel de
contaminación. Presencia de
material retenido.
c) Lote gravemente contaminado.

Nótese que no es posible determinar

quién está contaminado…el agua, el
metanol o ambos?
Solventes y viscosidad

Efectos:
 El incremento en la viscosidad de
la fase móvil disminuye la
eficiencia cromatográfica.
 Sistemas con muy baja viscosidad
pueden generar fallas en las
válvulas creando un flujo
errático. Solución: colocar un
restrictor de flujo después de la
bomba y antes del detector.
 Sistemas con alta viscosidad
disminuyen el tiempo de vida de
la columna.
Solventes: miscibilidad
y solubilidad

Miscible: cuando dos componentes

pueden mezclarse en todas las
proporciones sin la formación de
dos fases.
Solubilidad: cuando un
componente presente a cualquier
nivel en un solvente es soluble en
ese solvente. La máxima cantidad
de un soluto A que puede
disolverse en una cantidad de un
solvente B es la solubilidad.
Solventes y
combinaciones • Mezcla de solventes 50/50 v/v

Mezclas exotérmicas: metanol

y agua
Mezclas endotérmicas: agua y
acetonitrilo
Los cambios de temperatura
generan cambios en la
densidad y por tanto en el
volumen.
Buffer como fase
móvil

La función del buffer

consiste en mantener
una condición
constante…en este
caso mantener el pH
sin cambios.
Buffer como fase
móvil 2 • Componentes comunes usados para preparar bufferes

El pH del sistema se basa en un

“sistema acuoso” y, por tanto,
debe tenerse en cuenta:
 El pH actual de un sistema buffer
agua:orgánico no corresponde a
un buffer acuoso.
 El pH de un buffer agua:orgánico
obtenido con un electrodo para
pH no corresponde al que es
obtenido en un buffer acuoso.
Buffer
precipitando
Qué ocurre ?!!!!
 Fina capa de precipitado blanco en la
botella del solvente.
 Depósitos en la cabeza de la bomba.
 Pistón y sello del pistón rayados.
 Frita de la columna obstruida.
 Flujo restringido.
 Superficie del material de soporte de
la columna modificada.

 Lo peor: posiblemente el desempeño

original de la columna no se recupere.
Volatilidad
(solventes y
aditivos)

Mezcla
agua/metanol:TFA
a)Recién preparada.
b)Luego de tres horas.
c) Después de 8 horas.
La importancia de la
calidad del agua en
HPLC y LC-MS
Columnas para
HPLC
Material de soporte (fase
estacionaria):
 Polímeros inorgánicos
 Polímeros orgánicos
 Híbridos

El más usado es la sílica

(inorgánico).
Consiste en unidades tetraédricas
de SiO4 aleatoriamente unidas por
grupos siloxanos
Columnas -
sílica

Características:
 Resistencia mecánica (soporta
grandes presiones).
 Estabilidad química (es inerte).
 Estabilidad térmica
 Gran área superficial
 Concentración de grupos activos
en la superficie.
Preparación sílica

Se forman partículas esféricas

con varios angstroms de
diámetro.
a) Formación de las partículas
primarias.
b) Aumento del tamaño de
las partículas primarias.
c) Formación de hidrogel.
Preparación sílica
2
La red polimérica continúa
creciendo y las primeras partículas
aumentan de tamaño al unirse con
los grupos silanoles presentes en la
superficie.
Así las partículas primarias se
adhieren unas a otras formando un
proceso de gelificación.
Grupos silanoles: SiOH
Soporte
monolítico • a) partículas de sílice
• b) monolítica
Es una estructura:
 Sólida altamente porosa.
 Alta permeabilidad a la fase
móvil.
 De acuerdo al modo de
preparación se denominan
monolíticas de polímeros
orgánicos y monolíticas de
polímeros inorgánicos.
Obtención de fases
estacionarias
químicamente ligadas

Fases monoméricas con

grandes cantidades de grupos
silanoles residuales pueden
provocar alargamiento de los
picos.
El pH bajo lleva a la hidrólisis
de la fase estacionaria
perdiendo selectividad.
Fases estacionarias
químicamente ligadas

El efecto anterior puede

minimizarse usando
trimetilclorosilano (TMS)
o endcapping.
Así se disminuye entre
20% y 30 % los silanoles
residuales en las
partículas de sílica.
Bloqueo de grupos
silanoles

 Los grupos unidos al silicio son

cambiados por grupos más
voluminosos (propil o butil).
 Dificulta la hidrólisis de la fase
estacionaria.
 Más apropiadas para usar a pH
bajo.
 Esto se llama protección estérica.
 Llevan a menor retención.
Modificaciones de la
superficie de sílica

Características:
 Son fases más estables que
las monoméricas.
 Tienen menos retención y
selectividad por la
dificultad de controlar el
proceso de polimerización.
C30, C18, C8, C4,
fenil, ciclohexil,
fluoradas

Cada material tiene sus ventajas y

desventajas.
El conocimiento de cada soporte es
fundamental para la separación en
la aplicación seleccionada.
La tendencia tecnológica es la
disminución del tamaño de
partícula y la disminución en el
diámetro interno de las columnas.
Columna C18
Es el grupo funcional más
frecuentemente usado, octadecilo.
Es una cadena recta de 18 carbonos.
ODS: sílice de octadecilo.
Se llama silanol residual al espacio
que no ha sido modificado.
Para desactivar ese residuo silanol se
aplica un tapado de extremos
“endcapping”
Columna C8
 Es una cadena recta
de 8 carbonos
 Excelente
reproducibilidad
 Mayor rendimiento
 Más vida útil en el
rango de pH 1 a 12
Columna fenilo

Columna estable
Amplio rango de
pH
Reproducibilidad
mejorada
Columna ciano

 Equilibrado más rápido de la fase

móvil en comparación con las
columnas de sílice en fase normal.
 No desactivadas por trazas de agua
en fase normal.
 Una de las columnas de fase
reversa con menos retención y, por
consiguiente, útil para separar
compuestos polares.
 En fase reversa, ofrecen una
selectividad diferente en
comparación con las fases C18 o
C8.
 Estructuras más comunes unidas a la sílica en fase reversa

Obsérvese……

Siempre la base es
el silicio
Guía para la selección de la fase estacionaria

Soporte Comentario

C18 Fase estable, muy hidrofóbica,

retentiva.
Para sustancias más polares, menos
C8 retentiva.
Menos retentiva y diferente
selectividad comparada con la C8.
CIANO (CN)
Menos estable que la C18.
Polaridad media y selectiva para
FENIL aromáticos.
 EFECTO DE LA SELECTIVIDAD EN C8,
CIANO Y FENIL
 Pureza de la sílica para fase
reversa

Actualmente 99,995 % • Ver el efecto de la pureza de la sílica en la forma de los

picos. El cromatograma de la derecha muestra actividad
y <50 ppm en metales en los silanoles causando coleo debido al alto
lo que mejoró la contenido metálico.
reproducibildad de los
baches de sílica
producidos.
Mejoró la forma de los
picos de sustancias
básicas.
 Columna resistente a la hidrólisis

Dos grupos isopropilo

protegiendo el enlace
Si-O de la hidrólisis
ácida.
 Colapso de fase en columna C18

Cuando la fase móvil es

casi totalmente acuosa y
el flujo se detiene, la fase
estacionaria hidrofóbica
colapsa
“deshidratándose”
 Columnas
monolíticas

 Cama continua de sílica

polimérica porosa de gran
pureza.
 Superficie activa muy
grande.
 Baja presión, por lo que
pueden acoplarse sin
aumento significativo de
ella, mejorando la eficiencia.
 Vida útil más larga.
 Columna C18 versus C30
• Principales características de la columna C30:

Alta selectividad
Selectividad adicional a otras fases reversas
Compatible con fases móviles acuosas
Bajo sangrado, alta eficiencia
Rango de pH 2 a 8
Máxima temperatura de trabajo 60° Celsius
Guarda
columnas
Definición:
Columna pequeña colocada
antes de la columna analítica
para protegerla de partículas
o contaminantes de las
muestras.
 Guardacolumnas -
características

El material de empaque

es el mismo de la
columna analítica.
Mayor diámetro
interno.
Hay retraso con
respecto a un análisis
sin guardacolumna.
 Problemas del sistema y la
columna
 Uniones y protecciones de las fases
estacionarias

 La sílica es el material
de soporte dominante.
 Una limitación es el
rango de trabajo, entre
2 y 8.
 El tamaño de partícula
define la calidad del
soporte y determina la
eficiencia y presión de
la columna.
 Efecto de la longitud de la columna

Afecta:
Eficiencia
Resolución
Sensibilidad
 El tamaño de partícula
La disminución en el tamaño
de partícula…..con una
longitud constante en la
columna…….

 Incrementa la altura del pico

 Incrementa la sensibilidad
 Más eficiencia
 Mayor resolución
 Tamaño de partícula

 La disminución del tamaño

de partícula disminuye el
tiempo de análisis.
 Incremento en la
transferencia de masa.
 Guía para la selección del tamaño de
partícula

 Diámetro de partícula más • Incremento de la presión causado por la reducción en el

pequeño para mezclas tamaño de partícula
complejas con
componentes similares.
 Partículas más grandes para
análisis rutinarios donde
hay analitos con grandes
diferencias estructurales.
 Distribución de la masa según el tamaño de
partícula

SPS: superficially porous silica,

partículas con tamaño de
poro de 80 Å a 120 Å.
Disponibles también con 300
Å para el análisis de analitos
de alto peso molecular
 Longitud de la columna

 La EFICIENCIA es directamente
proporcional a la longitud de .la
columna.
 El incremento del doble en la
longitud de la columna aumenta la
resolución en 1.4.
 Columnas cortas dan corridos cortos
y baja presión, ideal en los
gradientes.
 Columnas largas dan mayor
resolución pero mayores tiempos de
análisis y mayores costos.
 Diámetro interno de la columna

 Una disminución en el diámetro

interno de la columna
incrementa la presión.
 Diámetros más grandes
requieren flujos más altos.
 Cuando el diámetro interno de la
columna disminuye, hay
incremento en la sensibilidad de
2 a 3 veces cuando se inyecta la
misma masa.
Efecto del aumento en el área superficial del soporte de
sílica
Aumenta la retención
Mayor resolución
 Integrando los picos en
cromatografía
La integración de la señal

• Integración de dos picos bien resueltos

• Pérdida de área por curvatura

• Exceso en el área del pico

La integración de la señal ¡¡¡

• Trazo correcto de una línea

perpendicular dividiendo dos picos

• Trazo correcto de una línea

perpendicular dividiendo dos picos
y el más grande tiene coleo
La integración de la señal ¡¡¡

• Integrando un pico pequeño que eluye

tarde sin alcanzar la línea base
y después de un pico que colea
 Integración incorrecta

La integración correcta

es la de la línea punteada.

La línea punteada indica la integración

correcta del pico más pequeño.
 Integración incorrecta

El final del pico es el que indica la línea punteada

 Integración picos
solapados
 Construcción de una línea base por
defecto
Penetración de la línea base
 Seguimiento clásico de la línea base (sin
penetraciones)
Anchura del pico
Anchura del pico
 Selección de la anchura del pico

El ancho del pico:

 Rechazo por altura y anchura
del pico
 Aplicando estos “eventos de
integración”
Integrando 5 picos de una señal:

Con frecuencia resulta

útil modificar los valores
de sensibilidad de
pendiente, ancho de pico,
rechazo por altura y
rechazo por área, para
personalizar la
integración.
 Aplicando estos “eventos de
integración” 2
Integrando 5 picos de una señal:
 Aplicando estos “eventos de
integración” 3
Valores de rechazo por área y altura:
Errores de integración por deficiencia en el trazado de la línea base
 Efecto memoria o carry over
Pico pequeño que aparece
cuando se inyecta un blanco.
Inadecuada elución de un
compuesto.
Ejemplo: en un gradiente el
tiempo es insuficiente para
los compuestos que
continúan en contacto con los
grupos silanol.
 Fuente del carry over

• El carry over clásico a menudo es una

pequeña cavidad en el sistema que actúa
como un depósito de muestra que va
diluyéndose con sucesivas inyecciones.
Origen del carry over en el HPLC
 Origen del carry over en el
HPLC 2
 Origen del carry over en el
HPLC 3
 Origen del carry over en el
HPLC 4
 Origen del carry over en el
HPLC 5
 Origen del carry over en el
HPLC 6
 Origen del carry over en el
HPLC 7
 Origen del carry over en el
HPLC 8
 Origen del carry over en el
HPLC 9
Eliminando el carry over
 Pasos para corregir los problemas de carry over

 Clasificar el carry over (determinar el comportamiento).

 Cambiar el blanco.
 Cambiar el tamaño de la inyección.
 Revisar los ajustes de las uniones.
 Revisar el solvente de lavado y:
• Usar solvente fresco.
• Incrementar el volumen de lavado.
• Usar más solvente orgánico en el lavado.
• Ajustar el pH del lavado.
 Revisar el mecanismo de lavado.
 Cambiar el solvente de inyección.
 Correr otra muestra.
 Realizar un cambio en el equipo:
• Cambiar el sello de la aguja.
• Cambiar el loop de inyección.
• Reemplazar la válvula.
• Cambiar el automuestreador.
 Dwell time
• Es un término usado en cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas y consiste en el tiempo en que demora una
señal en ser colectada.
 Necesidad de más de un detector -
Sensibilidad
 Necesidad de más de un detector -
Selectividad
Necesidad de más de un detector
Información cualitativa
Espectro de masas Atrazina
 Atrazina

Espectro de masas
Estructura atrazina
Atrazina espectro de masas
 Tipos de columnas basadas en el diámetro
interno
 Efecto del cambio en la longitud de la
columna
 Características de los empaques de las columnas para
las moléculas pequeñas
Enlaces típicos, endcapping y silanoles residuales
Efecto de la disminución del tamaño de partícula
manteniendo la longitud de la columna
Incremento en la retención y
resolución con el aumento del área
superficial de la sílica
Sistemas modulares
 Mejoras en el desempeño de la
bomba
 Inyectores

a. Diagrama de válvula
manual.
b.Posición de carga.
c. Posición de
inyección.
Automuestreador
Detectores HPLC
Detectores HPLC
Linealidad del detector
Ruido y deriva del detector
Factor de respuesta
 Detectores para HPLC y sus
atributos
 El detector UV-VISIBLE

a.La detección de la
absorbancia.
b.El detector de
arreglo de diodos.
 Estructuras químicas

Azúcares Triglicéridos
 Estructuras químicas

Esteroides Barbitúricos
 Estructuras químicas

Esteres metílicos Ácidos carboxílicos

 Estructuras químicas

Hidrocarburos Polímeros
UV-VIS características

• Sensibilidad especificada por el

ruido de la línea base.
• Incremento en la sensibilidad por
el diseño de la celda de flujo.
• Rango de trabajo lineal.
• Deriva baja.
Longitud de onda de absorción de
cromóforos
Arreglo de diodos
 La celda de flujo

a. Diagrama de la celda
de flujo.
b. Ruido de la línea base y
deriva.
c. Concentración vs.
respuesta.
 Interfase electrospray en LC-
MS
 Otro detectores
Diagrama esquemático
• Detector de fluorescencia
Alta selectividad.
Alta sensibilidad (picogramos a
femtogramos).
Limitado a compuestos con fuerte
fluorescencia.
 Detector de índice de refracción

Diagrama esquemático
• Baja sensibilidad (0,01 µg a 0,1 µg).
• Sensible a cambios de temperatura y
flujo.
• Para analitos con baja actividad
cromolítica (azúcares,triglicéridos,ácidos
orgánicos, polímeros).
• No sirve para hacer gradientes.
 Detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD)

Diagrama Esquemático
• Mayor sensibilidad que el detector
de índice de refracción (aprox 10
ng).
• Puede hacer gradientes.
• Para analitos con baja absorción
ultravioleta.
 Detector Corona
Detectores corona
• Sensibilidad en el rango de
nanogramos.
• Fácil operación.
• Amplio rango dinámico de trabajo.
• Para analitos no volátiles como el
ELSD.
 Detector de quimioluminiscencia de
nitrógeno
Detector de quimioluminiscencia
• Específico y sensible (< 0,1 ng de
nitrógeno).
• Los compuestos que contienen
nitrógeno son oxidados a óxido
nítrico. El óxido nítrico reacciona
con el ozono y emite luz a una
longitud de onda específica.
 Detector electroquímico

Detector electroquímico
• Sensibilidad al nivel de
picogramos.
• Selectivo.
 Detector de conductividad

 Mide la conductividad • Sensibilidad al nivel de

eléctrica de una corriente.
picogramos.
 Para análisis de iones,
ácidos orgánicos y • Selectivo.
surfactantes.
• Es el modo usado para la
cromatografía iónica.
 Sistemas micro LC

Características:

 El diámetro interno de las

columnas es de 75 µm.
 Este tamaño da alta
sensibilidad, carga y
robustez.
 Flujos alrededor de 300
nl/min.
 Volumen de inyección hasta
2 µl.
Desarrollo de métodos
Curva de calibración
 Ecuación de una línea recta

La ecuación general de una línea

recta tiene la forma:
y = mx + b
Otras notaciones diferentes son:
y = mx + c
Y = ax + b

Todas significan lo mismo, solo

cambian las letras.
Explorando las propiedades del gráfico de una línea recta
Efecto de los cambios en m
Efecto de los cambios en m
Efecto de los cambios en m
Efecto de los cambios en b
Efecto de los cambios en b
La pendiente
 La función lineal

 y….depende de los valores

de x.
 x….es la variable que puedo
controlar.
 m....indica el grado de
inclinación y sentido.
 b....indica el punto de
intersección con el eje
vertical.
Curva de calibración 2
 Curva de calibración 3
• Preparación de la recta de calibrado o curva de calibración
 Curva de calibración 4
• Obtención de la relación señal-concentración
 Curva de calibración 5
• Curva de calibración
 Curva de calibración 6
• Resultados
 Curva de calibración realizada por el equipo

El cero no debe
ser forzado sino
ignorado
Curva de calibración para ácido gálico y (+)-
catequina
Curva de calibración para (-)-catequina y estándar
interno