TEMA 11 IFD-IfI y Hemaglutinación
TEMA 11 IFD-IfI y Hemaglutinación
TEMA 11 IFD-IfI y Hemaglutinación
Principio
Fluorescencia. Es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a
radiaciones de baja longitud de onda y alta energía (UV – Rx). Las radiaciones absorbidas
(invisibles al ojo), son transformadas en luz visible, o sea de una longitud de onda mayor
a la incidente.
2.Permeabilización 4.Inmunodetección
• Albúmina
• Glutaraldehído bovina sérica
• Paraformaldehido • Triton X-100 • IFD
• Gelatina de
• NP40 pescado • IFI
1.Fijación
3.Bloqueo
3.Bloqueo.
Su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con
el material biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica
desconocido
INMUNOFLUORESCENCIA
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI).
conocido
INMUNOFLUORESCENCIA
Se utiliza por ejemplo para el diagnóstico de: Se utiliza por ejemplo para el diagnóstico de:
Bacterias patógenas en heces Treponema pallidum
Virus de la rabia en cortes histológicos Toxoplasma gondii
del cerebro Coxiella burnetii
Virus en secreciones respiratorias Rickettsia conorii
Leishmania
LES
HEMAGLUTINACIÓN
Reacciones de Aglutinación
Definición: Fenómeno que se observa cuando se mezclan ANTÍGENOS PARTICULADOS en
suspensión con suero que contenga Ac frente a ellos
El resultado de la unión Ag-Ac es la FORMACIÓN DE AGREGADOS Ó AGLUTINADO DE
PARTÍCULAS DETECTABLE (BACTERIAS, CÉLULAS, PARTÍCULAS INERTES)
Los antígenos más frecuentes implicados forman parte de bacterias, células como
hematíes (hemaglutinación) u otras partículas como en el caso de antígenos unidos a
partículas inertes.
Los Ac IgM son los más eficaces en la aglutinación.
HEMAGLUTINACIÓN
Clasificación de las reacciones de Aglutinación
Equipos:
Centrífuga refrigerada
Placas en fondo U desechables
Pipetas eppendorf de 25 y 50ul. Pipeta
multicanal de 25-250ul.
Cristalería
Reactivos
Solución de Alsever:
Dextrosa 20.5 g
NaCl 4.2 g
Ácido cítrico(C6H8O7.H2O) 0.55 g
Citrato de sodio(Na3C6H5O7.2H2O)
8.0 g
H2O destilada a completar 1000 Ml
HEMAGLUTINACIÓN
Hemaglutinación (HA)
Hidratar los antígenos liofilizados y mantenerlos a 4oC por al
menos 1 hora, pero preferiblemente toda la noche.
Preparar diluciones seriadas (al doble) en las placas
previamente rotuladas, a los diferentes pH de trabajo (el pH
óptimo para el antígeno, el valor superior de pH y el valor
inferior). De no conocer el pH óptimo de cada antígeno, debe
titularse a todos los pH.
Añadir 0,025 mL de BABS a cada pozuelo de la placa.
Añadir 0,025 mL del antígeno al primer pozuelo de cada hilera.
Hacer diluciones al doble comenzando por el primer pozuelo y
utilizando pipetas “multicanal”. 6. Agitar la placa.
Añadir 0,025 mL de la solución glóbulos rojos al 0.5%
preparados en cada uno de los diferentes pH.
Agitar y dejar reposar de 30-40 minutos a temperatura
ambiente.
Leer la hemaglutinación (una capa fina y bien distribuida de
glóbulos).
HEMAGLUTINACIÓN
Patrón de hemaglutinación:
No hemaglutinación: Los glóbulos rojos
sedimentan en el fondo del pozuelo
observándose como un botón.
Hemaglutinación parcial: Se observa un
anillo de células aglutinadas alrededor de
un botón en el centro. No se lee como
punto final de hemaglutinación.
Hemaglutinación completa: Los glóbulos
rojos dan una capa fina y bien distribuida
en el pozuelo. Se lee como punto final de
la hemaglutinación.
HEMAGLUTINACIÓN
Inhibición de la hemaglutinación (IH)
1. Rotular las placas con el número de los sueros a probar y el
antígeno a utilizar. Es recomendable usar una placa por antígeno. Los
sueros son probados utilizando 4, 8 ó 12 diluciones de los mismos
contra el antígeno; dependiendo esto del tipo de suero, del
propósito y de la experiencia del laboratorio en el diagnóstico o
encuestas serológicas. Los pares de suero de un paciente deben ser
tratados y probados en el mismo ensayo.
2. Añadir 0,025 mL de BABS a cada pozuelo.
3. Añadir 0,025 mL del suero a titular en el primer pozuelo de cada
hilera.
4. Diluir los sueros con pipeta “multicanal”.
5. Añadir a cada pozuelo 0,025 mL de la dilución de antígeno que
contiene 8 unidades hemaglutinantes.
6. Agitar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 45
minutos.
7. Añadir 0,05 ml de glóbulos rojos diluidos en el pH óptimo para el
virus.
8. Agitar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30
minutos.