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/ Biotechnologies/ partie : Microbiologie Biologie / Chapitre 12 : Techniques de dénombrement 1/4

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Partie : Microbiologie et Biologie

Chapitre 12 : TECHNIQUES DE DÉNOMBREMENT DES MICROORGANISMES EN TP

1-Objectif du dénombrement

Le dénombrement ou numération des micro-organismes est la mesure du ____________ de

micro-organismes. Cette mesure se fait souvent par unité de volume, il s’agit donc d’une
______________________ en micro-organisme (vivants ou totaux). Les microorganismes
dénombrés sont des bactéries, des levures ou des moisissures. Les unités de mesure utilisées sont le
nombre ou le nombre d’UFC de micro-organisme par mL ou par g de produit étudié (on utilise les UFC =
__________________________ lors d’un dénombrement utilisant le comptage de colonies après culture).

2-Décrire et utiliser les différentes techniques de dénombrement en travaux pratiques

2.1- Le dénombrement direct par cytométrie : on compte les cellules

2,1,1- Matériel de cytométrie
- cellule de Malassez : la cellule de comptage - cellule de Malassez : le quadrillage

2,1,2- Principe de la cytométrie

La cytométrie est la mesure du nombre de cellules. En manipulations de TP, on peut la réaliser en
cellule de comptage comme la cellule de Malassez (voir FT « Dénombrement par numération directe
microscopique en cellule de Malassez). Le résultat est donné en NOMBRE de CELLULES·mL de
suspension-1. La cellule de Malassez contient un volume précis de suspension dans son quadrillage
composé de _________ rectangles soit _______.

Les cellules comptées sont le plus souvent des cellules eucaryotes, suffisamment grosses à
l’objectif ×40 pour être comptées facilement. On prend l’exemple de cellules eucaryotes comptées par
cytométrie directe en cellule de comptage : levures, cellules végétales (microalgues), globules rouges,
leucocyte. Mais on ne compte PAS de bactéries en cytométrie avec la cellule de comptage car les bactéries
sont trop petites vues à l’objectif ×40.

2,1,3- Calculs
On compte les levures d’une suspension « S » en hématimètre de Malassez, dilué avec Fd(échantillon)
= 5. On trouve 250 levures dans 5 rectangles. On calcule N(levures ; S) la concentration en levures de la
suspension S.

2.2- Techniques de numération de colonies en milieux gélosés après incubation

Ces techniques nécessitent un délai pour permettre la multiplication des bactéries. Chaque bactérie
(ou amas) donnera une colonie après incubation.
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Qu’est ce
Nom de la Schéma et principe de la Fiche technique Qu’est ce qu’on
Milieu utilisé qu’on en
technique technique de référence compte
déduit
* boite de Petri vue en coupe:
milieu gélosé colonies

*Dénombrement :
Techniques de UFCmL-1 dans
*On dépose en surface d’une gélose technique par Colonies
numération Géloses en boite de Petri déjà l’inoculum de
en boite de Petri un volume précis étalement en (en surface de la
en surface en coulées départ
de suspension : 0,1 mL. Ce volume surface sur milieu gélose)
milieu solide (ou UFCg-1)
est réparti de façon homogène à gélosé
l’aide billes de verre stériles ou d’une
pipette râteau stérile que l’on racle
sur la surface du milieu.
Géloses que l’on coule en - boite de Petri vue en coupe *Dénombrement :
boite de Petri sur l’échantillon avec la double couche de technique par
Techniques de Attention la gélose en gélose : gélose blanche (agar) incorporation dans Colonies
UFCmL-1 dans
numération par surfusion ne doit pas être la masse en milieu (incluses dans la
l’inoculum de
incorporation en trop chaude pour ne pas tuer gélosé et gélose). Elles ont
colonies départ
gélose = dans la les micro organismes dénombrement une forme de
*On dépose au fond d’une boite de (ou UFCg-1)
masse La gélose blanche évite flore totale milieu petite lentille.
l’envahissement par certaines Petri un volume précis de gélosé
bactéries suspension : 1 mL
Le milieu gélosé en surfusion *tube de gélose:
est coulé sur l’inoculum. On colonies milieu gélosé
régénère le milieu pour *Gélose viande Colonies
Technique de UFCmL-1 dans
enlever le O2 dissout puis on foie avec sulfites (incluses dans la
numération en l’inoculum de
refroidit rapidement pour *On dépose au fond d’un tube un et recherche des gélose). Elles ont
milieu gélosé en départ
figer la gélose pour éviter la volume précis de suspension : ANS une forme de
tube (ou UFCg-1)
dissolution du O2. Ainsi on est 1 mL par exemple sulfitoréducteurs petite lentille.
en anaérobiose pour les ANS
(les AAF cultivent aussi)
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Selon les types de géloses (sélectives ou non), les normes donnent des règles de comptage. En
général, les boîtes utilisables doivent contenir entre 15 et 300 colonies. On utilise alors la formule Afnor,
ou on peut utiliser un calcul plus simple quand on ne doit prendre qu’une seule dilution.

 Appliquer la formule littérale AFNOR pour calculer le nombre d’UFC de microorganismes par mL de
suspension de départ.
nombre( colonies comptées ; boites choisies )
N (UFC ; échantillon ) 
Vinoculum  (n1  0,1n2 )  d ( échantillon )
Avec :
N(UFC  ; échantillon) = nombre d’UFC de microorganismes par mL
nombre(colonies comptées  ; boites choisies) = nombre de colonies comptées sur toutes les boites retenues
Vinoculum = volume d’inoculum déposé sur la boite
n1 = nombre de boites retenues de la 1ère dilution (la moins diluée)
n2 = nombre de boites retenues de la 2ème dilution (la plus diluée)
d(échantillon) = taux de dilution de la 1ère dilution (la moins diluée)

 On peut utiliser une formule plus simple quand on utilise une seule dilution.
nombre( colonies comptées ; boites choisies )
N (UFC ; échantillon )   Fd ( échantillon )
Vinoculum  nombre( boites choisies )
UFC
UFC  mL1   SU
mL  SU
Cas particuliers :
o si on a plus de 300 colonies par boite alors on en déduit qu’on a plus de 300 UFC dans le
volume d’inoculum. (utiliser la boite la plus diluée)
o si on a moins de 15 colonies par boite, alors on en déduit qu’on a moins de 15 UFC dans le
volume d’inoculum.(utiliser la boite la moins diluée)

2.3- Technique de numération par dépôt d’une membrane sur gélose après filtration

C’est aussi une technique en milieu gélosé dans laquelle on compte les colonies après incubation.
L’intérêt est de dénombrer des bactéries en faible concentration (on filtre des grands volumes
d’échantillon).
- appareil à filtration : - membrane filtrante :

VOIR FT «Technique de FILTRATION de l’eau avec membrane filtrante et appareil de filtration

pour dénombrement»

Le résultat est donné en UFCmL-1. On filtre un volume précis de la suspension / échantillon d’eau à
travers une membrane filtrante avec des pores de diamètre 0,45 μm. Cela permet de retenir les bactéries
et autres micro-organismes tandis que l’eau traverse le filtre car les bactéries mesurent _____________.
On dépose ensuite la membrane à la surface d’une gélose en boite de Petri. Après incubation on compte
des colonies et on en déduit un
nombre d’UFC dans l’inoculum de
départ filtré (souvent quelques
dizaines de mL à 1 L).

-Schéma de manipulation de la
filtration sur membrane
utilisant un appareil à filtration
stérile (manipulation à réaliser en
zone d’asepsie)
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-Résultat après culture 24h à 37°C sur gélose nutritive additionnée de TTC :
(le TTC colore les colonies en rouge pour mieux les visualiser)

2.4- Technique de numération en milieu liquide

- tube après culture: trouble
milieu liquide

Cette technique en milieu liquide sera vue en terminale.

* Calcul et principe :
Après incubation, tout tube de bouillon trouble (donc culture) montre que le volume d’inoculum de
départ contenait _____________________. Après incubation, tout tube de bouillon sans trouble (donc
sans culture) montre que le volume d’inoculum de départ contenait _____________________________.
On utilise des tables statistiques pour obtenir des résultats de dénombrements plus précis
(nommées tables de Mac Grady). Ces tables nous donnent des valeurs statistiques selon les dilutions de
l’inoculum et le nombre de tubes de culture présentant un trouble après culture. Ces valeurs sont
nommées « NPP » = _____________________________________.

2.5- Technique indirecte par turbidimétrie (= absorbance des milieux troubles) en milieu
liquide
Les suspensions microbiennes forment un trouble en bouillon de culture. Ce trouble peut être
mesuré par l’absorbance à 600 nm ou à 650 nm.
On connaît une relation entre la concentration bactérienne et l’absorbance à 600 nm  : 1 unité
d’absorbance correspond à environ 5.108 bactériesmL-1.

3-Conclusion et viabilité des cellules dénombrées

 Les techniques de turbidimétrie et numération sans colorant permettent de dénombrer toutes

les cellules (mortes et vivantes sans distinction).
 Les techniques de viabilité (dénombrement avec colorant d’exclusion) permettent de
dénombrer d’un côté les cellules mortes et de l’autre les vivantes en même temps.
 Les techniques de dénombrement en milieu gélosé ne permettent de dénombrer que les
cellules vivantes dites « revivifiables ».
But de la technique de Nom des techniques de
dénombrement : dénombrement concernées :
 Cellule de Malassez
Dénombrer uniquement 
Cellule de Malassez avec colorant
les cellules vivantes 
bleu de méthylène
revivifiables
 Dans la masse en milieu gélosé
après incubation
Dénombrer uniquement  En surface d’un milieu gélosé après

les cellules vivantes incubation
 En bouillon de culture en tubes
après incubation
Dénombrer toutes les 
sur gélose avec une membrane
cellules (mortes et 
après filtration et incubation
vivantes)
 En tube de gélose après incubation
 Turbidimétrie (absorbance à 600
nm)