Chromatographie planaire :

applications

par Dominique PRADEAU

Pharmacien des hôpitaux
Docteur ès sciences pharmaceutiques
et Chantal DAUPHIN
Maître de conférences UFR Pharmacie-Université Paris-XI
Docteur ès sciences pharmaceutiques

1. Étude de substances naturelles ........................................................... P 1 476 - 2

1.1 La chromatographie en couche mince et les plantes ............................... — 2
1.2 La chromatographie en couche mince et les micro-organismes............. — 2
2. Interactions contenant/contenu .......................................................... — 3
3. Toxicologie d’urgence à l’hôpital ........................................................ — 4
3.1 Méthodologie analytique standard ............................................................ — 5
3.2 Apport de la chromatographie couche mince pressurisée ...................... — 6
4. Application à la recherche de traces d’explosifs après attentat — 6
4.1 Traitement des prélèvements ..................................................................... — 7
4.2 Étapes analytiques de caractérisation ....................................................... — 8
4.3 Systèmes chromatographiques utilisés en CCMHP ................................. — 8
4.4 Modes de détection ..................................................................................... — 8
4.5 Conclusion.................................................................................................... — 8
5. Produits pharmaceutiques .................................................................... — 9
Références bibliographiques ......................................................................... — 9

es applications de la chromatographie en couche mince (CCM) – thin layer

L chromatography TLC – sont multiples comme le montrent le nombre et la
diversité des publications internationales sur ce sujet. Récemment, une commis-
sion de la Société française des Sciences et Techniques pharmaceutiques, copré-
sidée par J. Rabiant et D. Pradeau, a publié les derniers développements en
chromatographie planaire en présentant de nombreux exemples dans des
domaines variés comme les substances naturelles, les interactions contenant-
contenu, la toxicologie d’urgence à l’hôpital, la recherche des traces d’explosifs
après attentat et les produits pharmaceutiques [1].
Les aspects théoriques de la chromatographie planaire sont traités dans l’article [P 1 475],
référence [13], dans ce même volume.

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1. Étude de substances Dans la recherche de nouvelles molécules bioactives ou origina-

les, la CCM est utilisée comme technique de routine, pour l’analyse
naturelles rapide de fractions obtenues à la suite d’une séparation initialement
basée sur le test d’activité. L’efficacité de la CCM comme technique
de séparation est souvent mise à profit dans la phase ultime de puri-
fication, au moins sur de faibles quantités, lorsque les autres techni-
La chromatographie en couche mince (CCM) s’est imposée
ques ont montré leurs limites. La chromatographie planaire sous
comme une des techniques de base dans la recherche sur les subs-
pression est utilisée dans le cas de séparations particulièrement dif-
tances naturelles, en raison de sa simplicité de mise en œuvre et de
ficiles [3].
sa capacité de séparation et d’analyse des mélanges complexes que
constituent les extraits bruts d’origine naturelle.
Elle permet de comparer rapidement et simultanément plusieurs
dizaines d’échantillons, dans des conditions peu onéreuses, et ce 1.2 La chromatographie en couche mince
avec une grande flexibilité par rapport aux autres techniques cou- et les micro-organismes
ramment pratiquées dans le domaine des produits naturels (chro-
matographie liquide haute pression, chromatographie en phase
gazeuse et chromatographie de partage centrifuge...). Dès son origine, la recherche sur les métabolites secondaires
Actuellement, dans l’environnement de criblage intensif visant à microbiens a largement utilisé les possibilités les plus diverses de la
découvrir de nouvelles molécules naturelles présentant des activi- chromatographie planaire soit comme méthode simple et rapide de
tés biologiques, la CCM est utilisée soit comme outil de criblage pri- suivi des différentes étapes de purification, soit comme étape finale
maire systématique (criblage chimique), soit comme méthode de de séparation à l’aide de plaques préparatives.
suivi de fractionnement d’extraits bruts initialement sélectionnés Pratiquement toutes les publications relatives à l’isolement de
pour leur activité dans un test déterminé. produits d’origine microbienne font état du rapport frontal Rf
La CCM est également pratiquée, en raison de son pouvoir de comme caractéristique de la molécule purifiée [13].
résolution, comme technique ultime de séparation de mélanges
La capacité unique de cette technique à se prêter à la réalisation
complexes lorsque les autres techniques ont échoué.
de bioautographies a grandement contribué à l’isolement de nou-
La recherche sur les métabolites secondaires produits par les veaux antimicrobiens, d’antifongiques voire d’anticancéreux. Après
plantes et les micro-organismes a ainsi grandement bénéficié des mise au point de bonnes conditions de résolution sur la couche
multiples possibilités de la CCM. mince, il est possible, par simple contact de la plaque de CCM avec
un plateau ensemencé à l’aide de germes cibles (bactéries, champi-
gnons...) suivi d’une incubation de durée choisie, de localiser la ou
les zones d’inhibition de croissance [4].
1.1 La chromatographie en couche mince
On établit ainsi une corrélation entre le Rf d’un produit et son effet
et les plantes inhibiteur, ce qui permet un suivi remarquablement efficace du frac-
tionnement jusqu’à l’isolement de la molécule active, sans avoir à
doser l’ensemble des fractions issues des essais de séparation. Il
Dans ce domaine, les applications ont été extrêmement nombreu- s’avère possible de tirer parti de cet avantage y compris dans la
ses et ont exploité, au cours du temps, les combinaisons les plus recherche de produits anticancéreux ; on coule alors directement
variées offertes par la CCM, tant pour des études qualitatives que sur la plaque de CCM une suspension gélosée de cellules de la
quantitatives. lignée KB.
On peut mentionner, à titre d’exemples non limitatifs, l’utilisation Nota : la lignée cellulaire KB est une lignée établie, d’origine humaine, dérivée d’un car-
de différents types de couches minces selon les familles chimiques cinome oral. Ces cellules contiennent des séquences du papillomavirus humain (HPV-18).
à étudier : Dans les années 1980, la chromatographie planaire a connu un
— couche mince de polyamides, dans le cas de dérivés phénoli- nouveau développement. Initialement limitée à la découverte de
ques, de tanins, de glucosides, de flavonoïdes ; nouvelles molécules présentant des activités biologiques essentiel-
— couche mince de silice, pour les stéroïdes, les dérivés lipidi- lement dans le domaine de la chimiothérapie antimicrobienne, anti-
ques (acides gras, dérivés mono, di et triglycérides, sapogénines, virale et anticancéreuse, la recherche de métabolites microbiens a
sphingolipides) ; été étendue à l’étude de produits intéressants pour leur originalité
— couche mince d’alumine, support plus rarement utilisé que le structurale sans préjuger de leur activité biologique potentielle [5]
gel de silice, mais convenant particulièrement à l’étude des terpènes [6]. Cette approche consiste à comparer au sein de groupes taxino-
et de certains alcaloïdes. miques les différents extraits de souches cultivées sur des milieux
variés. Les extraits sont déposés, à l’aide d’appareils automatiques,
La diversité des systèmes éluotropes utilisables, combinée à la
sur des plaques de silice à raison de 20 échantillons par plaque de
richesse des réactifs de révélation en CCM, a également conduit à
20 cm × 20 cm. Après migration à l’aide de différents systèmes de
l’élaboration d’« atlas » d’extraits de plantes d’intérêt thérapeutique
phase mobile, les plaques sont soumises à plusieurs modes de révé-
[2]. Les chromatogrammes correspondant à deux cent trente plantes
lation (visible, UV 254 nm, 366 nm) dont une batterie de révélateurs
médicinales ont été obtenus dans des conditions parfaitement
chimiques. Le ou les échantillons présentant une tache caractéristi-
définies (solvants de migration, méthodes de détection donnant des
que sont alors sélectionnés pour une culture à plus grande échelle,
taches colorées intenses et facilement exploitables).
afin d’isoler le produit correspondant à la tache détectée et de déter-
Ces chromatogrammes sont photographiés et enregistrés, consti- miner sa structure.
tuant ainsi de véritables empreintes archivées à partir desquelles il
On peut ainsi cribler simultanément, avec un coût réduit, des
est possible de vérifier la qualité des préparations végétales, notam-
dizaines d’échantillons.
ment dans le cas d’éventuelles falsifications souvent difficilement
décelables par d’autres méthodes analytiques. Cette application a fait ses preuves et a conduit à l’isolement de
En recherche, cet outil contribue aussi à l’étude taxinomique qua- nombreuses molécules originales.
litative de plantes non déterminées, par un criblage systématique Considérée comme une technique simple, mais difficilement
orienté des familles chimiques donnant des réactions colorées spé- automatisable et surtout peu compatible avec les méthodes de cou-
cifiques (anthrones, coumarines, alcaloïdes, flavonoïdes, sapo- plage UV, masse et RMN, la chromatographie planaire était en
nines). retrait par rapport à la chromatographie liquide sur colonne à haute

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performance (CLHP), qui pouvait bénéficier de l’existence de ban- Exemple : les additifs recherchés dépendent de la nature du maté-
ques de données et de moyens informatiques performants pour la riau plastique utilisé. Les composés sélectionnés dans cet article cor-
caractérisation quasi automatique des produits dans les extraits respondent aux grandes classes d’antioxydants :
naturels complexes. BHA : butylhydroxyanisol ;
BHT : butylhydroxytoluène ;
Les récentes percées, en particulier dans les domaines de l’auto- Irganox 1010 : tétrakis [(di-tert-butyl-3,5-hydroxy-4-phényl)-
matisation [7] et du couplage chromatographie en couche mince à 3-propionate] de pentaérythrityle ;
haute performance / spectrométrie de masse / spectrométrie de Irganox 1330 : hexa-tert-butyl-2,2’,2",6,6’,6"-(triméthyl-
masse (HPTLC/SM/SM) [8], montrent que la chromatographie pla- 2,4,6-benzènetriyle-1,3,5-trisméthylène)-4,4’,4"-
naire est, elle aussi, en pleine révolution technologique et que, dans triphénol.
un avenir proche, elle pourrait connaître des applications nouvelles Deux types d’extraction sont envisageables :
exploitant sa capacité unique d’analyser en parallèle et non — extraction liquide/liquide, par contact entre 50 mL de solution de
séquentiellement comme les autres techniques, de grandes quanti- 2 fois 5 mL de dichlorométhane ;
tés d’échantillons. — extraction liquide/solide, par passage de 50 mL de solution au tra-
vers d’une cartouche C18. L’élution de la cartouche est réalisée par
3 mL de chloroforme, avec filtration simultanée en présence de sulfate
de sodium anhydre préimbibé de chloroforme, suivi d’un rinçage du fil-
tre par 2 mL de chloroforme. L’utilisation d’une seringue en verre est
2. Interactions recommandée.
La récupération des solvants d’extraction ou d’élution est effectuée
contenant/contenu dans des tubes coniques en verre de 15 mL. L’évaporation de ces sol-
vants est réalisée à sec sous air comprimé (sans chauffage). Les
extraits secs sont repris par un volume de 50 µL de chloroforme, repré-
sentant ainsi une concentration d’un facteur 1 000 des échantillons
Les conditionnements en matériaux plastiques sont de plus en (passage de 50 mL à 50 µL).
plus utilisés dans l’industrie pharmaceutique, en remplacement du Deux méthodes de chromatographie en couche mince sont réali-
sées à partir des solutions chloroformiques d’extraction (tableau 1).
verre, lourd et cassant. Cependant, ces matériaux ne sont pas iner-
tes vis-à-vis des solutions contenues dans ces conditionnements. Deux détections sont effectuées, avant révélation à 280 nm et éven-
tuellement après révélation, par une solution d’acide phosphomolybdi-
Des phénomènes de migrations entre le contenant et le contenu que à 0,5 g % dans l’isopropanol. Des exemples de chromatogrammes
peuvent intervenir dans les deux « sens » : sont présentés figures 1 et 2.
— fixation des constituants de la solution sur le conditionnement, Les figures présentées ont été enregistrées avant révélation.
provoquant une baisse des concentrations et donc de l’efficacité La quantification est ainsi meilleure qu’après révélation. La
révélation par l’acide phosphomolybdique permet de rendre visibles les
thérapeutique du médicament ; taches correspondant aux composés suivants :
— relargage des additifs du matériau plastique dans la solution, — Irganox 1330
dont les teneurs sont limitées à cause de leurs caractères potentiel- — Irganox 1010
— BHT
lement toxiques.
Le BHA n’est pas révélé par ce réactif. L’intérêt de la révélation est
L’analyse des additifs présents en solution peut être réalisée par qu’elle confirme la nature des composés isolés à partir de l’extrait con-
tenu dans le récipient et permet d’éliminer les composés éventuelle-
chromatographie en couche mince (CCM) après un contact standar-
ment détectés à 280 nm qui ne seraient pas des additifs du matériau
disé entre la solution et le conditionnement selon les normes de plastique.
l’International Conference on Harmonization (ICH2) : Les chromatogrammes de la gamme d’étalonnage obtenus après
révélation à l’acide phosphomolybdique (détection à 520 nm) sont pré-
— conditions de conservation : 25 ˚C/60 % H R et 40 ˚C/75 % H R ; sentés figure 3.
— positionnement des flacons « tête-bêche » pour l’évaluation Les résultats de ces analyses apportent une garantie complé-
complète des matériaux du conditionnement (bouchon compris) ; mentaire de l’innocuité des matériaux plastiques vis-à-vis des solutions
médicamenteuses. La chromatographie couche mince, précédée
— analyse au temps t = 0 et t = 6 mois. d’une technique d’extraction, est une méthode simple et rapide d’iden-
tification et de quantification des additifs dans ce cadre d’études, et
L’originalité de l’approche est l’utilisation de la chromatographie elle est tout à fait reconnue au niveau des dossiers d’enregistrement
d’autorisation de mise sur le marché (AMM – partie II-F).
planaire, ou CCM instrumentale, couplée à la détection multimode :
UV et visible / avant et après révélation. L’intérêt que revêt cette (0)

méthode a été démontré et s’exprime essentiellement en termes de Tableau 1 – Exemple de recherche d’une interaction
sensibilité et de spécificité. En effet, contrairement à d’autres techni- contenant-contenu (1)
ques chromatographiques, tous les composants potentiellement Caractéristiques Méthode 1 Méthode 2
extraits sont retrouvés sur la plaque. Deux systèmes chromatogra-
phiques différents sont utilisés pour balayer un large domaine de Phase stationnaire HPTLC RP 18 à prélaver dans la phase mobile
classes chimiques de contaminants. Après chromatographie, les Méthanol 90 mL Acétonitrile 50 mL
plaques sont détectées à l’aide d’un photodensitomètre scanner, Phase mobile Eau 10 mL Méthanol 25 mL
d’une part en UV direct, et d’autre part dans le visible après THF 25 mL
révélation chimique. Le phénomène d’interaction contenant-con- Dépôts 10 µL de chaque 5 µL de chaque extrait
tenu peut revêtir différents aspects selon le type de matériau en pré- extrait
sence. La meilleure façon d’appréhender les différentes difficultés (1) HPTLC : high performance thin layer chromatography ;
est de présenter un exemple concret. THF : tétrahydrofurane

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Irganox 1 330

Irganox 1 010

Irganox 1 330

Irganox 1 010
BHA
BHT

BHA
BHT
Ajout 1 mL

Témoin AO 10 µL

Signal détecté (AU)

Ajout 0,5 mL
1 100

860
Témoin AO 5 µL

Signal détecté (AU)

Ajout 0,2 mL 500
620

380
380

260 Témoin AO 2 µL
140 Blanc

140 Artefact cartouche

– 100
10 19,4 28,8 38,1 47,5 56,9 66,2 85
Distance parcourue (mm) 20
Blanc
AU : unités arbitraires d'absorbance
– 100
10 19,4 28,8 38,1 47,5 56,9 66,2 85
Figure 1 – Chromatogrammes de la gamme d’étalonnage
après extraction. Méthode no 1 ; avant révélation ; Distance parcourue (mm)
lecture densitométrique à 280 nm AU : unités arbitraires d'absorbance

Le témoin AO est une solution d'antioxydants (AO) (0,25 mg/mL de

chaque composé) déposée à raison de 2 µL, 5 µL, et 10 µL sur la plaque
3. Toxicologie d’urgence
à l’hôpital
Figure 2 – Chromatogrammes de la gamme d’étalonnage
non extraite. Méthode no 2 ; avant révélation ;
Les recherches toxicologiques à l’hôpital s’effectuent dans un
lecture densitométrique à 280 mm
cadre d’urgence pour identifier le(s) toxique(s) et éventuellement
le(s) doser. Elles doivent, pour la réalisation des analyses, l’interpré-
tation des résultats et le rendu de ceux-ci, prendre en compte les
données cliniques, pharmacodynamiques et pharmacocinétiques. La confirmation de l’identification et/ou le dosage des toxiques
À l’hôpital, elles visent essentiellement à l’identification des médi- s’effectuent par d’autres techniques analytiques : la chromatogra-
caments à potentiel toxique (antidépresseurs, neuroleptiques, hyp- phie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse, la
notiques, anxiolytiques, antalgiques, antipaludéens...) lors de spectrophotométrie UV-visible ou la chromatographie liquide.
tentatives d’autolyse ou de prises accidentelles chez l’enfant. À cause de la nécessité du traitement de l’échantillon et du déve-
Leur spectre physico-chimique est très variable, car ce sont des loppement, le temps d’analyse en chromatographie planaire (CP)
molécules acides, neutres ou bases faibles, lipophiles ou hydrophi- est supérieur à celui de l’immunométrie.
les, de masse relative comprise entre 100 et 500 daltons. La diffi- Mais, si l’immunométrie permet d’identifier les médicaments
culté de ces analyses relève non seulement du fait que le dont le squelette chimique correspond à ceux des benzodiazépines,
comportement physico-chimique de ces médicaments est relative- des barbituriques et des antidépresseurs tricycliques, elle ne con-
ment homogène au sein d’une même classe chimique, mais que les vient pas à la recherche de l’ensemble des médicaments à potentiel
intoxications sont souvent polymédicamenteuses. Pour faire face à toxique, contrairement à la CP. D’autre part, en immunométrie, dans
cette difficulté, le laboratoire de toxicologie possède différentes une famille chimique certaines molécules ne sont pas détectées en
techniques de recherche : l’immunométrie (immunopolarisation de raison d’un taux de croisement insuffisant, alors qu’en CP, grâce aux
fluorescence et immunoenzymologie) et la chromatographie pla- différents réactifs de révélation et à la densitométrie, ce problème
naire. n’existe pratiquement pas. Enfin, l’immunométrie est une technique
Nota : l’immunométrie (dosage immunologique) repose sur la mise en œuvre d’une ou impossible à adapter à une recherche spécifique pour répondre rapi-
plusieurs réactions d’équilibre entre un antigène et un anticorps. Les méthodes de détec-
tion sont variées : méthodes utilisant un marqueur radioactif, méthodes immunoenzymati- dement au contexte d’une intoxication particulière ; la CP peut y
ques, méthodes utilisant un marqueur fluorescent. répondre en utilisant comme témoin le médicament suspecté.

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■ Traitement de l’échantillon

Irganox 1 330

Irganox 1 010
Le volume de l’échantillon varie entre 10 mL pour le plasma et
50 mL pour le liquide gastrique et les urines ; on lui fait subir les
opérations suivantes :

BHT
— centrifugation ;
— si besoin, filtration et/ou dilution ;
— acidification d’une partie et alcalinisation de l’autre.

■ Extraction :
— liquide-liquide ;
— liquide-solide (Amberlite ou silice greffée).

■ Concentration :
Ajout 3 µL
— évaporation sous azote, à sec vers 50 ˚C ;
— reprise par un solvant (méthanol en général).

■ Dépôt :
Il s’effectue sur 3 plaques CCM de silice avec indicateur de fluo-
rescence ayant des témoins prédéposés :
Signal détecté (AU)

— plaque des barbituriques, benzamides, carbamates, antipalu-

275 déens et antalgiques ;
Ajout 2 µL
— plaque des benzodiazépines ;
205 — plaque des antidépresseurs tricycliques et des phénothiazines.

■ Migration avec les phases mobiles respectives pour chaque

135 plaque :
— chloroforme/diéthylamine/acétone (50/10/40) ;
65
— hexane/diéthylamine/éthanol (75/8/16) ;
Ajout 1 µL
— toluène/acétone (80/12) avec becher d’ammoniaque.
–5
■ Révélation
– 75 ● D’abord observation sous lampe UV à 254 nm pour l’inhibition
10 19,4 28,8 38,1 47,5 56,9 66,2 85 de fluorescence et à 366 nm pour les molécules naturellement fluo-
Distance parcourue (mm) rescentes à cette longueur d’onde.
AU : unités arbitraires d'absorbance ● Ensuite, pulvérisation de réactifs.
– barbituriques, carbamates et benzamides : solution de diphényl-
Figure 3 – Chromatogrammes de la gamme d’étalonnage. carbazone avec du chlorure mercurique puis chauffage (tableau 2) ;
Méthode n°2 ; après révélation ; lecture densitométrique à 520 nm
– antipaludéens et antalgiques (tableau 3) ;
– benzodiazépines : solution d’acide phosphorique, puis solution
d’iodoplatinate de sodium (tableau 4) ;
3.1 Méthodologie analytique standard
– phénothiazines et antidépresseurs tricycliques : solution d’acide
perchlorique, puis solution de nitrite de sodium, puis solution
Pour plus de détails, le lecteur pourra consulter la référence [9]. d’iodoplatinate de sodium (tableau 5) ;
(0)

Tableau 2 – Méthode analytique de mise en évidence des barbituriques, carbamates et benzamides

Observation sous UV (1)

Solution
Témoin Rf Chauffage
de diphénylcarbazone/HgCl2
254 nm 366 nm

Phénobarbital 0,22 + − Violet Violet

Méprobamate 0,55 − − Rose Incolore

Sulpiride 0,50 + − Violet Rose

(1) Avant révélation + signifie une absorption à 254 nm,

– le composé n’absorbe pas à 254 nm ou 366 nm.

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(0)

Tableau 3 – Méthode analytique de mise en évidence des antipaludéens et des antalgiques

Observation sous UV
Rf Solution Solution
Témoin d’acide phosphorique d’iodoplatinate de sodium
254 nm 366 nm
Chloroquine 0,90 + Bleu fluo − +
Quinine 0,40 + − Bleu fluo +
Paracétamol 0,36 + − + +

(0)

Tableau 4 – Méthode analytique de mise en évidence des benzodiazépines

Observation sous UV
Rf Solution Solution
Témoin d’acide phosphorique d’iodoplatinate de sodium
254 nm 366 nm
Diazépam 0,78 + − Jaune fluo +
Bromazépam 0,69 + − Jaune fluo +
Zolpidem 0,64 − − Bleu fluo +

(0)

Tableau 5 – Méthode analytique de mise en évidence des phénothiazines et des antidépresseurs tricycliques
Observation sous UV Solution Solution Solution
Témoin Rf d’acide de nitrite d’iodoplatinate
254 nm 366 nm perchlorique de sodium de sodium

Chlorpromazine 0,55 + − Rose Rouge +

Levomépromazine 0,67 + − Violet Violet +
Alimémazine 0,71 + − Orange Orange +
Amitriptyline 0,51 + − Incolore Incolore +
Imipramine 0,42 + − Bleu Bleu +
Clomipramine 0,54 + − Bleu Bleu +

3.2 Apport de la chromatographie couche en plus standardisé. De plus, l’automatisation du dépôt, du dévelop-
pement et de la détection en chromatographie planaire s’est consi-
mince pressurisée dérablement améliorée ces dernières années.
Enfin, la chromatographie planaire reste une technique de mise
Qualitativement, la chromatographie couche mince pressurisée en œuvre simple qui permet une grande facilité d’adaptation aux
OPLC (Overpressured layer chromatography) ou CCMP en français problèmes d’analyses en recherche toxicologique d’urgence.
présente deux avantages par rapport à la CCM :
— diminution du temps de développement par un facteur 5 dans
la recherche de substances stupéfiantes (caféine, cocaïne, codéine,
codéthyline, héroïne, méthadone, morphine et pholcodine) [10] ; 4. Application à la recherche
— augmentation de la résolution, donc de la spécificité, pour la
recherche toxicologique des benzodiazépines passant de de traces d’explosifs
3 molécules séparées en recherche standard à 10 témoins en OPLC
[11].
après attentat
Quantitativement, seule l’OPLC semble permettre le dosage de
médicaments en milieux biologiques comme celui de la quinine La chromatographie sur couche mince haute performance
dans le plasma qui présente un seuil de détection et un temps d’ana- (CCMHP) – high performance thin layer chromatography HPTLC –
lyse identiques à celui de la CLHP [12]. est une méthode de choix concernant la séparation et l’identification
Si la chromatographie planaire est complémentaire des autres de traces de substances explosives récupérées sur des prélève-
techniques chromatographiques, telles que la chromatographie ments après attentat.
liquide, elle doit être aussi considérée comme complémentaire des Dans ce cas, les prélèvements transmis sont, en premier lieu, trai-
techniques immunométriques pour la recherche toxicologique, tés en surface afin de mettre en solution les substances (composés
même si elle nécessite le traitement de l’échantillon qui est de plus organiques et/ou minéraux) à rechercher et à identifier par différen-

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Analyse PRÉLÈVEMENTS Analyse

organique après attentat minérale

Examen physique,
tri, observation

Solvants organiques Eau permutée

TRAITEMENT
(acétone, méthanol …) chaude

Filtration Purification et Filtration

Extraction phase solide concentration Adsorption sur charbon actif
Traitement chimique

Analyses qualitatives Analyses qualitatives

et quantitatives et semi-quantitatives
Méthodes
physico-chimiques

Méthodes Chromatographie
CCMHP/CLHP/CPG
chromatographiques ionique

Dérivation, UV, Détection-Caractérisation Conductimétrie,

chimiluminescence Quantification réfractométrie
dérivation + UV-visible

Interprétation-Conclusions

Rapports techniques,
réquisitions, expertises

Figure 4 – Schéma d’ensemble des étapes de travail successives dans la recherche de traces d’explosifs après attentat

tes méthodes chromatographiques. Une solution acétonique ou 4.1 Traitement des prélèvements
méthanolique puis une solution aqueuse de traitement sont ainsi
préparées à partir de chaque prélèvement. La solution métha-
nolique ou acétonique est concentrée, purifiée, puis les constituants Le traitement peut se concevoir comme une série d’étapes, dont
organiques des substances explosives sont séparés et identifiés par la réussite conditionne les résultats de l’analyse et la validité des
CCMHP, chromatographie liquide haute performance (CLHP) et/ou conclusions qui en découlent.
chromatographie en phase gazeuse (CPG). Les composés minéraux
ionisés, ou organiques solubles dans l’eau, sont parallèlement sépa-
rés et identifiés dans la solution aqueuse de traitement par chroma- 4.1.1 Observation, tri, examen des prélèvements
tographie ionique haute performance (CIHP) ou par CLHP à polarité
de phases inverse. Dans tous les cas, il s’agit de mettre en évidence Les prélèvements sont d’abord observés attentivement, triés
la présence éventuelle de traces des constituants initiaux, car il est selon leur nature physique et leur degré de propreté, puis minutieu-
impossible d’identifier avec sûreté des produits de dégradation sement examinés, à la loupe si nécessaire, afin d’isoler et d’identi-
intermédiaires, qui constituent souvent des facteurs de gêne et/ou fier des éléments du dispositif d’amorçage ou de mise de feu de
d’interférence lors des séparations chromatographiques. l’engin explosif éventuellement recueillis (fils électriques,
mécanismes divers, minuterie, piles, emballages, mèche ou cor-
Les problèmes analytiques induits par la multitude des produits deau, etc.) et les éléments de l’enveloppe (le contenant) de la charge
gênants entraînés lors des traitements et le fait qu’une détonation explosive. Toutes les inscriptions déchiffrables sont soigneusement
notées (type et caractéristiques du prélèvement, marque et date de
pleinement « réussie » équivaut à une réaction complète, avec
fabrication, origine, numéro de lot, couleur, etc.). Pour chaque type
transformation totale des constituants initiaux, impliquent donc la
de prélèvement, la masse et les dimensions ou la surface sont éva-
mise en œuvre de méthodes d’analyse de traces très sensibles et luées, les formes et les déformations observées sont décrites, etc.
spécifiques. La CCMHP couplée à des modes de détection visuelle
des composés explosifs chromatographiés, transformés en colo-
rants par pulvérisation de réactifs de dérivation appropriés, est utile 4.1.2 Traitement
comme méthode de « screening » et convient pour mener à bonne
fin les analyses dans la plupart des cas. Par contre, s’il apparaît Le traitement des prélèvements est effectué en surface, par entraî-
indispensable d’atteindre des seuils de détection plus faibles que nement au moyen de tampons de coton, etc., exprimés ensuite dans
ceux accessibles par CCMHP, la mise en œuvre de méthodes de un solvant, ou par trempage ou lavage direct dans un solvant, afin
séparation et d’identification par CLHP et CPG permet alors de de recueillir et solubiliser les traces des constituants d’explosif(s)
résoudre, généralement, les difficultés analytiques rencontrées. Le projetés sur les prélèvements lors de l’explosion. Les prélèvements,
schéma d’ensemble des étapes de travail successives est présenté triés par catégorie, sont traités séparément, un par un, de façon à
figure 4. préparer successivement, pour chacun d’eux, une solution de traite-

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ment dans l’acétone, le méthanol ou, le cas échéant, un autre sol- 4.4 Modes de détection
vant, puis une solution aqueuse de traitement.
Les principaux modes de traitement sont les suivants :
— lavage par jets de solvant, nettoyage au moyen de tampons de En CCMHP, la détection peut être densitométrique (domaine UV)
coton imbibés de solvant ou trempage du prélèvement ; ou visuelle par dérivation (révélation), en pulvérisant sur la plaque
— frottement avec des tampons de coton sec (entraînement des réactifs appropriés. Pour ce qui concerne les molécules d’explo-
mécanique) ; sifs secondaires courants (esters nitriques, nitramines, dérivés
— brossage avec des pinceaux à poils durs (entraînement nitrés aromatiques), les détections par dérivation sont les plus spé-
mécanique). cifiques à l’aide des réactifs suivants.
Le mode de traitement est fonction : ■ Le réactif de Griess permet de révéler les esters nitriques et nitra-
— de la nature du prélèvement (bois, métal, terre, tissu, verre, mines, après imprégnation de potasse alcoolique à 3 % et chauffage
matière plastique...) ; en étuve à 110 ˚C pendant 10 à 15 min. À noter que, lors de la pulvé-
— de la propreté apparente : présence de liquides d’imprégna- risation de potasse, la tolite (2,4,6-TNT) est révélée en rouge brique
tion (huiles, essence, eau, etc.) ou présence de cambouis, de grais- et le tétryl en orange. Avec le réactif de Griess, les esters nitriques et
ses, de sang, de poudres d’extincteurs, de produits divers en nitramines donnent des colorants azoïques rouges.
surface, etc. ; ■ Le réactif de Bratton-Marshall permet de révéler les dérivés nitrés
— du revêtement (peinture, vernis, etc.) et de l’aspect extérieur aromatiques, notamment DNT et TNT en violet-parme.
(lisse, poreux, plan, tordu, etc.).

4.2 Étapes analytiques de caractérisation 4.5 Conclusion

La CCMHP est très performante pour mener à bien la plupart des

Ce qui est très difficile à estimer, ce sont les rendements des pro-
analyses complexes que nous avons à conduire, en particulier
cédés de nettoyage des solutions du fait qu’on ne maîtrise pas tous
lorsqu’il s’agit de séparer des isomères ou des molécules de struc-
les paramètres déterminants, liés à des effets de « matrice » com-
tures voisines (exemple : nitroglycérine et pentrite). Les seuils de
plexes et difficiles à prévoir précisément. C’est pourquoi, on préfère
détection sont satisfaisants dans la majorité des cas (10 à 20 ng).
les éviter autant que possible et réaliser plutôt des séparations par
CCMHP bidirectionnelle, avec une phase mobile nettoyante dans le La CCMHP est, enfin, une méthode économique, rapide, évolutive
premier sens et une phase mobile de caractérisation des composés et souple, dont les seuils de détection sont souvent compétitifs avec
recherchés dans le deuxième sens de migration. Ces phases mobi- ceux obtenus parallèlement en CLHP. La possibilité de réaliser des
les sont choisies en fonction de leurs propriétés et des chromatographies bidirectionnelles est, par ailleurs, un grand avan-
« empreintes » observées sur les premières chromatoplaques tage dans le cas de solutions sales ; ces chromatographies bidirec-
d’orientation, effectuées à partir de l’extrait brut. tionnelles permettent, s’agissant de solutions « sales » contenant
souvent des traces d’explosif(s) en très faibles concentrations
mélangées à des substances gênantes majoritaires :
— d’utiliser les propriétés « nettoyantes » de certains éluants
4.3 Systèmes chromatographiques dans le premier sens de migration et d’éviter, ainsi, de mettre en
utilisés en CCMHP œuvre systématiquement des procédés de purification aux rende-
ments souvent aléatoires dans des milieux complexes ;
— de combiner les actions de phases mobiles aux propriétés dif-
Ils sont résumés dans le tableau 6. férentes, afin d’assurer la fiabilité du résultat obtenu.
(0)

Tableau 6 – Systèmes chromatographiques utilisés en CCMHP

Phase mobile Composés séparés
Pouvoir nettoyant dans le cas de solutions sales :
Trichloréthylène / acétone (90/10) hexogène (RDX), nitroglycérine (NG), pentrite (PETN),
dinitrotoluène (DNT), trinitrotoluène (TNT)
Éther de pétrole / acétate d’éthyle (90/10) Bonne deuxième phase de confirmation de la pentrite
Esters nitriques et nitramines
Hexane / tétrahydrofurane (82/8) Deux développements successifs
Excellent pouvoir nettoyant dans le cas de solutions sales
Trichloréthylène saturé d’eau Permet de séparer nettement TNT, DNT et MNT
Leurs isomères ne sont pas séparés
Acétate d’éthyle saturé d’eau Nitrocellulose
Dichlorométhane / acétonitrile (90/10) Hexogène (RDX) et octogène (HMX)
Éther de pétrole / acétate d’éthyle / acide acétique (70/35/2) Isomères de DNT (dinitrotoluènes), de TNT, de DNN (dinitronaphtalènes),
(1) du TNP (trinitrophénol), du tétryl, du TNB (trinitrobenzaldéhyde)
1) Tétrachlorure de carbone / dichlorométhane (80/20) Phases associées en chromatographie bidirectionnelle
2) hexane / acétate d’éthyle (70/30) Isolent les isomères de DNT et TNT
(1) Il est en effet possible qu’un mélange de phase mobile amène à une somme supérieure à 100 dans certains cas.

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5. Produits pharmaceutiques découle, d’une matière première destinée à être utilisée comme
médicament.
Exemple : dans la Pharmacopée américaine (USP), la monographie
du dichlorhydrate de triéthylamine décrit une recherche d’impuretés de
Dans l’industrie pharmaceutique, la chromatographie en couche synthèse (diéthylènetriamine, 1-(2 aminoéthyl)pipérazine et tris (2-ami-
mince est utilisée au laboratoire de contrôle de qualité pour analy- noéthyl)amine par CCM.
ser des matières premières et des produits finis.
● Produits de dégradation
En effet, cette méthode répond naturellement aux objectifs de
réduction des coûts de contrôle car elle est facile à mettre en œuvre, Les études de stabilité conduites sur les médicaments nécessitent
nécessite des volumes de solvant beaucoup plus faibles que la chro- l’identification voire le dosage des produits de dégradation.
matographie en phase liquide tout en conservant des caractéristi- Exemple : un cardioplégique contenant de la procaïne génère par
ques analytiques proches de celles-ci. hydrolyse l’acide p-aminobenzoïque (PABA) et le diéthylaminoéthanol.
Le PABA a été dosé dans des échantillons d’un même lot de cardioplé-
Afin de profiter pleinement des performances de cette technique, gique ayant subi quatre cycles différents de stérilisation ainsi que dans
plus particulièrement dans le domaine de la quantification, il est plusieurs lots de ce même cardioplégique fabriqués sur cinq ans et
nécessaire d’investir dans un matériel adapté : le déposeur automa- stockés à température ambiante à l’abri de la lumière.
tique est indispensable pour la reproductibilité du dépôt, le densito- Ce produit de dégradation a été quantifié par densitométrie scanner
mètre scanner pour la quantification du résultat, la vidéo- après une chromatographie sur couche mince horizontale.
documentation pour l’archivage (assurance qualité). Au-delà de
l’achat d’un tel matériel, la motivation des techniciens est un atout La méthode a été validée, sa sensibilité est égale à 29 ng, elle est
essentiel car il faut bien admettre que la CCM garde une image de linéaire entre 30 et 510 ng, elle a une bonne répétabilité et reproducti-
technique désuète, peu fiable et approximative par rapport, en par- bilité de l’ordre de 3 %.
ticulier, à la chromatographie en phase liquide. ● Dosage de produit fini
La mise en œuvre de cette méthode a considérablement évolué Exemple : la fabrication de gélules décontaminantes contenant plu-
ces dernières années. Une instrumentation particulière a été déve- sieurs antibiotiques (vancomycine, tobramycine, colistine) nécessite
loppée. Elle nécessite donc une formation pour le personnel techni- une quantification de ces trois principes actifs. Or, ce mélange ne peut
que. être analysé par les méthodes microbiologiques ni par chromatogra-
phie en phase liquide, ce qui est classique avec des mélanges d’antibio-
■ Identification de composés connus tiques.
Après développement et révélation, la concentration de chacun des
Dans les diverses pharmacopées, l’identification de nombreux trois antibiotiques est déduite des droites d’étalonnage correspondan-
composés (stéroïdes, antibiotiques, acides aminés, sucres, barbitu- tes reliant la concentration des étalons à la surface. Les coefficients de
riques, huiles essentielles, etc.) et la recherche de substances appa- corrélation sont satisfaisants (0,997 à 0,999).
rentées (vitamines, barbituriques, antioxydants, etc.) se font par
chromatographie en couche mince. En conclusion, cette méthode a tout à fait sa place dans le
domaine de l’analyse du médicament en contrôle de qualité ou dans
■ Essai de pureté le cadre de l’établissement d’un dossier d’AMM.

● Impuretés de synthèse
Pour de plus amples renseignements sur cette technique et
La recherche des impuretés de synthèse dans les matières pre- sur ses applications, le lecteur pourra consulter les références
mières a pour but d’assurer la qualité, et la sécurité sanitaire qui en bibliographiques [14] à [27].

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