CHROMATOGRAPHIE

LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE
(CLHP)
Pr. R. SLIMANI
Introduction
VERS 1970 EVOLUTION : Apparition de phase stationnaire constituée de
particules sphériques de plus fine granulométrie (2 et 5 µm).

Augmentation de la surface d’échange

ce qui conduit à de grandes efficacité et résolution..

Mais plus la phase stationnaire est fine, plus il est difficile de faire s’écouler le
solvant c.a.d. plus la phase mobile transite mal (temps d’analyse augment)

Utilisation des pompes spéciales qui poussent le solvant sous des pressions très
élevées.

Diminue la durée de l’analyse. 2

Chromatographie Liquide Haute Performance : CLHP
High Performance Liquid Chromatography : HPLC

Chromatographie liquide à haute pression (HPLC)

Peut séparer pratiquement tous les mélanges

Analyses très fines en des temps remarquablement

courts.

Seuil de détection par rapport à celui de la CPG

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Application de l’HPLC

Le domaine d’application de la technique (CLHP) est très vaste.

 Industries chimiques et para chimiques
 Agro-alimentaires
 Environnement
 Pharmacie
 Biochimie.
 ….

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COMPARAISON AVEC LA
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
GAZEUSE (CPG)

CPG CPL
-Substances volatiles (20% des -Masse moléculaire élevée ;
substances organiques) ; -Substances thermolabiles ;
-Interactions : soluté, phase -Substances ionisées ;
stationnaire ; -Interactions : phase mobile,
-On opère par chromatographie phase stationnaire ;
de partage ; -Adsorption, échange d’ions….
-Séparation à T élevées ; -Température moins élevée ;
-Détecteurs universels. -Absence de détecteurs
universels.

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http://www.chem.agilent.com/Library/slidepresentation/Public/HPLC%20Separation%20Fundamentals%20-%20011409.pdf

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Appareillage

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1- Réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase
mobile en quantité suffisante.

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2- Dégazeur : élimine l’air dissout dans le liquide

Le liquide soumis à de forte pression forme des

bulles à l’intérieur du système.

Il convient donc d’éliminer au maximum l’azote et

l’oxygène qui peuvent être présents. Le dégazage de la
phase mobile se fait par barbotage d’hélium, par
ultrasons ou par un dégazeur.

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3- Pompe d’un chromatographe a pour rôle d’assurer
l’écoulement de la phase mobile dans la colonne avec
un débit stable et réglable.

Les pompes doivent répondre aux exigences suivantes :

➢ fournir des pressions élevées jusqu'à 500 bars
➢ débit stable, non pulsé et réglable de 0,1 à 10 mL/min
avec un contrôle meilleur que 0,5 %
➢ résistance à la corrosion quelque soit le solvant utilisé

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 Deux modes de fonctionnement :

➢ Le mode isocratique pour lequel la composition de la phase mobile est fixe.

➢ Le mode gradient de solvant pour lequel on fait varier la composition du

solvant en cours d’analyse en vue d’améliorer les séparations et d’optimiser
les facteurs de capacité et de réduire les temps d’analyse.

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La variation de la composition du mélange éluant est programmable
On utilise principalement trois types de profil : linéaire – concave ou
convexe On peut aussi les combiner entre eux.

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 4- Injecteur : Permet d’apporter l’échantillon à la colonne
deux types :
* à seringue ;
* à boucle d’échantillonnage.

Injecteur à seringue
Il se rapproche des injecteurs utilisés en CPG.
On apporte l’échantillon par une seringue dont l’aiguille
traverse un septum en caoutchouc ou en matière
plastique, pour déposer l’échantillon au sommet de la
colonne qui est placée sous le septum

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 Injecteur à seringue
 Il se rapproche des injecteurs utilisés en CPG.
 On apporte l’échantillon par une seringue dont l’aiguille traverse un septum en
caoutchouc ou en matière plastique, pour déposer l’échantillon au sommet de la colonne
qui est placée sous le septum

Problème: Comme on est en HPLC, on a un solvant qui arrive sous pression,

l’éluant exercer une pression sur la seringue et rend difficile l’injection de l’échantillon,
remonte dans l’aiguille.
On stoppe donc l’arrivée du solvant par un système de Stop Flow, pendant l’injection. Puis
on ré ouvre pour que la prise d’essai soit entraînée par la phase mobile dans la colonne.
Cette interruption provoque en général des accidents de parcours sur le chromatogramme
(brosses, faux pics).

Seringue

Septum

● Avantage : On apporte
l’échantillon dans la colonne. éluant
● Inconvénient : Il est très
difficile de maîtriser le Stop
Flow
volume de la prise d’essai.
Colonne
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L’injection doit se faire de manière très rapide afin de perturber le moins
longtemps possible le régime de circulation du solvant.
On doit injecter rapidement un volume précis sans stopper l’écoulement du
solvant a un endroit ou règne une pression très élevée (P > 100 bars).
L’injecteur le plus répandu est l’injecteur a boucle :

Utilisation une vanne haute pression à plusieurs voies

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isoler la boucle du circuit pour la remplir puis de la remettre dans le circuit pour
l’injection, avec inversion du sens de circulation du solvant dans la boucle

Ce système permet une bonne reproductibilité à condition de remplir

entièrement la boucle.

N.B: Le remplissage de la boucle se fait grâce a une seringue, le volume de

la boucle est variable de 1 a 100 µL la seringue utilisée est de capacité plus
grande et le trop plein est évacué.

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5- colonne : C’est la partie active du système, c’est elle qui
joue le rôle prépondérant. La colonne est un cylindre calibré
généralement en acier inoxydable parfois doublé d’un matériaux
inerte (verre ou plastique spéciaux). Son diamètre varie de 0,5 à
5 mm et sa longueur de 0,5 à 30 cm.

A chaque extrémité, on a un fritté métallique : Plaque métallique percée de micro

trous pour laisser passer la phase liquide et retenir la phase solide stationnaire de la
colonne. (Parfois, fritté constitue de certains polymères, ou de matières plastiques).

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Protection de la colonne : La colonne est souvent précédée d’une
pré colonne remplie de la même phase stationnaire très courte (0,5
à 1 cm). Le rôle de la pré colonne est de fixer les composé dont
l’affinité avec la phase stationnaire est trop élevée et qui ne migrent
pas dans les conditions utilisée. La pré colonne est changée
périodiquement.

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 La phase stationnaire
La phase normale: La phase normale est constituée de gel de silice. Ce
matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi
lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans
la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête.

L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours

du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité
des séparations.

La phase inverse est majoritairement composée de silice greffées par

des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette
phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (ACN, MeOH,
H20). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en
premier. Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de
la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation
est donc maintenue constante.

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 Différentes phases stationnaires
Phase mobile
TP
TP
NP

NP
-
TP
P NP -
P
P
P -
NP
P
P - ++
NP TP
TP
- +
+
NP
TP - +
Normale Inverse Ionique
Exclusion de taille
(hydrophobe) (hydrophile)
TP : très polaire P: polaire NP: Non polaire
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Vieillissement des colonnes
Les colonnes si elles sont bien utilisées avec les précautions décrites
précédemment ont une grande durée de vie. Elle vieillissent néanmoins et
perdent de leur efficacité.
On constate souvent après plusieurs heures d’utilisation une dérive de la
ligne de base qui est souvent due à des composés fortement retenus qui
passent petit à petit.
On peut alors procéder à un lavage (ou purge) de la colonne avec un
éluant de grande force qui va entraîner tous les composés retenus.

Vérifier l’efficacité de la colonne part, on procède à l’enregistrement d’un

chromatogramme de référence le jour de la première mise en service
d’une colonne neuve, ce chromatogramme de référence est gardé et
quand on a un doute sur l’efficacité de sa colonne il suffit de procéder
dans les même conditions à l’enregistrement du chromatogramme du
même mélange pour vérifier le bon état de sa colonne.

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séquence de nettoyage les colonnes les plus courantes avec plusieurs
solvants :

Silices vierges :
Hexane 50 mL – Dichlorométhane 50 mL – Isopropanol 50 mL –
dichlorométhane 30 mL – solvant de stockage 50 mL (ou éluant si purge )

Phase inverse : C1, C2 , C6, C8, C18, phényle,

Eau distillée 50 mL – Méthanol 50 mL – Acétonitrile 50 mL –THF 50 mL –
Méthanol 50 mL – (Eluant si purge)

Phase normale : CN, NH2, Diol, PAC

Chloroforme 50 mL – Dichlorométhane 50 mL – Isopropanol 50 mL –
dichlorométhane 30 mL – solvant de stockage 50 mL (éluant si purge)

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Stockage des colonnes :
Les colonnes non utilisées doivent être hermétiquement bouchées
imprégnées avec un solvant approprié (très souvent le méthanol)
pour éviter un assèchement très néfaste. Selon le type de phase
stationnaire on utilisera un solvant de stockage différent comme le
précise le tableau suivant :

Type de colonne Solvant de stockage

C1, C2 , C6, C8, C18, phényle Méthanol

Silice, CN, NH2, PAC, Diol Héxane ou méthanol

DEAE, CM, SAX, SCX Méthanol

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6- Détecteur

Les détecteurs doivent répondre à certaines exigences:

 Signal proportionnel à la concentration (linéarité)
 Sensibilité (rapport signal/bruit)
 Réponse stable dans le temps (la dérive par rapport au temps)
 Faible temps de réponse
Faible volume mort (volume de la cellule)

Il n’existe pas de détecteur universel, mais il faut le choisir en

fonction des substances analysées.

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1- Détecteurs d’absorption en UV-Visible

Ce sont les plus utilisés. On distingue les appareils:

- à longueur d’onde fixe λ = 254 nm par exemple
- à longueurs d’ondes variable de 200 à 700 nm
- à barrette de diodes: analyse simultanée sur tout le spectre.

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 2- Réfractomètre différentiel

Il mesure en continu la différence de l’indice de réfraction entre la phase

mobile et l’effluent de la colonne. Il est peu sensible et nécessite une
température parfaitement réglée à 0,01 °C près, et de travailler à débit
constant.

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 3- Détecteurs de fluorescence

Détecteurs très sensibles et très sélectifs, mais il sont destinés uniquement

aux solutés fluorescents ou après formation post colonne de composés
fluorescents

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4- Détection électrochimique
Ils sont réservés aux solutés dits électroactifs (ampérometrie,
coulometrie, conductimétrie…) électrode indicatrice : platine, carbone
vitreux. La phase mobile contient des électrolytes pour assurer le passage
du courant.

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Technique expérimentale:
a) Préparation des échantillons :

 purification préliminaire des produits pour éliminer du

mélange les produits indésirables.
 Filtration des extraits sur une membrane jetable de type
Luer avant d’être injectés.

b) Ajustement des paramètres: débit d’éluant et pression,

nature de l’éluant, etc.…

c) Injection des échantillons inconnus et des standards.

d) Calculs pour l’analyse qualitative et quantitative.

e) Interprétation des résultats.

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