L'ELECTROPHORESE

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

PAR SI DOULBEAU

Antenne DRSTDM auprès du CEA Travail réalisé dans le cadre

CEN de Cadarache de la préparation du diplôme
du Conservatoire National des
Arts et Métiers

- 1984 -
 CENTRE REGIONAL ASSOCIE AU

CONSERVATOIRE NATIONAL DES ARTS ET METIERS

D'AIX EN PROVENCE

PREPARATION A L'ORAL PROBATOIRE

SPECIALITE ELECTROCHIMIE

L' E L E CT R0 P H0 RES E

PJté6en:té paJl SylvJ..e VOULBEAU le 31 maJt6 1984

PJt0ne..6.6eWl. : M. Jean GALEA

 1 - INTRODUCTION .............................................................................................................. 1

II - DEFINITION .............................................................................................................. 2

II 1 - CONCEPT DE MOBILITE ••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••• 3

1 - Généralités . 3
2 - Théorie . 3
a) modèle choisi pour représenter la particule migrante 3
b) rappels généraux su r l' él ectri ci té . 4
c) bilanl;des forces agissant sur la particule charaée . 7
d) fonction de distribution du potentiel . 8
ee) noti on de dou ble couche." . 10
) déf"j ni ti on de s mobi lité s effecti ves . 13
3 - Paramètres influant sur la mobilité . 15
a) paramètres extérieurs ................................................ 15
b) paramètres relatifs au solvant ................................................ 15
c) paramètres relatifs au soluté ................................................ 16

IV - QUELQUES RAPPELS SUR :

1 - Les protéïnes .. . . .. .. .. .. . . .. .. .. .. . .. .. .. . . .. . . .. . . . . .. . . . .. . 17
a) généralités 17
b) propriétés acido-basiques 18
c) les protéïnes - les peptides 21
2 - Les colloldes . 22
a) 9 é néra l ; té s . . ... . .. .... ..... . .. . .. ....... .. ... ... ... . . 22
b) caractères électriques 24
3 - L'électroo911ose 25
a) mise en évidence expérimentale 25
b) interprétat ion . . .. . .. . .. . . . . . . .. . . .. ... . . . .. . . . . . .. . 25
4 - Di a1y se ... .. . .. .. .. .. . ... .. . .. . ..... . . . .... .. . . . . . 27
a) lad i alyse
b) l'électrodialyse

V - APPLICATION DU PHENOMENE Dl ELECTROPHORESE DIFFERENTES METHODES ,

EXPERIMENTALES ET ANALYTIQUES.
1 - Classification des différentes méthodes 28
a) électrophorèse de zone
- électrophorèse libre
- électrophorèse sur support
b) électrofocalisation
2 - Objectifs de l'analyse êlectrophorétique 30
a) méthode préparative
b) méthode analytique
3 - Généralités sur les expérimentations d'électrophorèse 31
1
1 :
A) ELECTROPHORESE DE ZONE
1 - Electrophorèse libre
a) Electrophorèse à frontièremobile 35
a - 1 Généralités
a - 2 Descri pti on de l 1 apparei 11 age et mi se en œuvre
a - 3 : Principe 38
d - 4 : Applications · . 41
a - 5 : En conclusion 45
b) Isotachophorèse ....................................... 47
b - 1 : Principe
b - 2 : Dispositif expérimental 49
b - 3 : Applications, conculsions
2 - Electrophorèse dans des milieux anti-convection ............ 52
Généralités
Principe
Avantages et i nconvéni ents . 54
Apparei 11 ages . 60
Séparation à deux dimensions . 61
Choix du SlJpport . 63
Premi er groupe de support
a) Electrophorèse sur papier . 63
a - 1 : Appareillages, mode opératoire
a - 2 : Avantages et i nconvéni ents ..•.................... 20
a - 3 : Conclusions
b) Electrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose . II
b - 1 : Appareillage
b - 2 : Avantages et inconvénients ..................... 72
b - 3 : Conclusion · . 73
Deuxième groupe de support
a) Analyse immuno-électrophorétique ........................ 7~

a - 1 Généralités
a - 2 Principe
a - 3 Exemple · . 75
a - 4 Conclusion
b) Eletrophorèse sur gel d'amidon ........................ 76
b - 1 : Mi se en œuvre
b - 2 : Conclusion Tl
c) Electrophorèse sur gel de polyacrilamide 77
c - 1 Généralités
c - 2 Mise en œuvre
c - 3 Avantages T9
c - 4 Conclusion 80
B) ELECTROfOCALISATION
1 ,- Général i tés •••••••••••••••••••••••••• Il •••••••••••••••• 81
2 - Principe
3 - Réal i sation pratique 83
4 - Conclusion ........................................... 8~
 VI - ELECTROPHORESE PREPARATIVE
1 - Général i tés 84
2 - Electrophorèse de zone 85
a) régime continu
b) régime discontinu
c) conclusions
3 - Electrofocalisation 88
a) régime continu
b) régime discontinu
4 - Electrodécantation principe 89
5 - Electroconvection principe 90

VII - CONCLUSION <93

VIII - BIBLIOGRAPHIE 95
 · 1

ï - INTRODUCTION

Des particules chargées, placées dans un champ électrique,

vont migrer sous l'influence de ce dernier. Ce ph~n@mène de migration, en
solution, est connu depuis le milieu du XIX ème siëcle. FIELD et TEAGUE, en
1907 ont isolé la toxine et l'antitoxine diphtériques en mettant à profit
la différence de leur vitesse de migration sous l'influence d'un champ électri-
que. L'utilisation de ce phénomène de transport électrocinétique, à des fins
analytiques, date de 1935. TISELUS .en précise les conditions opératoires en
séparant les constituants du sérum en quatre fractions par la méthode des
déplacements de frontières détectées par des méthodes de réfraction.

D'une mise en œuvre très délicate à ces débuts, la

technique d'électrophorèse est maintenant très utilisée, en particulier
pour l'analyse de mélanges biologiques. Elle est appliquée à des électro-
lytes très divers (colloïdes, anions et cations minéraux ou organiques)
et les techniques dé séparation par électrophorèse sont devenues très
nombreuses.

Le développement de cette technique a permis d'obte-

nir, pour l'étude des composés macromoléculaires, des avantages comparables
à ceux obtenus, pour les particules de faible poids moléculaire, par les
méthodes de chromatographie.

L'intérêt de l'électrophorèse, hormis son étude théorique,

réside dans le fait qu'elle a permis la découverte et l'identification de
nombreux tissus animaux et végétaux. L'application analytique principale
est l'étude des sérums pathologiques.
 2

II - DEFINITION

A l'origine le tenne lI~l~s~!:QebQ!:~~gll désignait unique-

ment la migration des particules colloïdales chargées sous l'influence d'un
champ électrique continu (MICHAELIS 1909) ; l'anophorèse étant la migration
des colloïdes négatifs et la cataphorèse celle des colloïdes positifs. Dans
les ouvràges lés p11js anciens, une distinction est faitesquant à la nature
se la particule qui se déplace, et, pour tout autre élément qu'un colloïde,
on parle ~''!:iQnQebQ!:~~~II.

Actuellement, que les particules chargées soient:

- des macromolécules (pour lesquelles la frontière avec
les colloïdes est parfois difficile à définir)
- des petits ions: que certains appareils d'électropho-
rèse pennettent maintenant d'analyser (petits ions minéraux'~ ions provenant
de l'ionisation diacides aminés etc ... )
- des gouttelettes ou des bulles en suspension.
dé~ i gne, .de façon générale, 1a mi gra ti on de tou te
On
espèce ionisée dans un solvant par le tenne d'électrophorèse.

Il faut cependant prendre garde au fait qu'à ce tenne

d'électrophorèse il est toujours associée l'idée de séparation qui doit
s'effectuer au sein du solvant i ndépendanment des r€act~"Ol'TS électrochimiques
ayant lieu aux électrodes. Ainsi, l'é1ectrodéposition faisant intervenir
les réactions d'électrodes n'est pas à proprement parlé une méthode é1ec-
trophoré ti que .

L'électrophorèse consiste en fait en une migration

d1ions et conduit à la détennination d'une grandeur en tous points sembla-
ble à la mobilité ionique que l'on détennine pour des solutions vraies.
 3

III - CONCEPT DE MOBILITE

1 - Généralités:

Le concept de mobilité joue un rôle très important dans

les diverses techniques électrophorétiques.puisque c'est la différence des
mobilités effectives des espèces ioniques présentes qui va leur permettre
d'être séparées au sein de la solution.

De nombreuses théories mathématiques de l'électropho-

rèse sont proposées par différents auteurs. Nous ne les envisagerons pas
ici et nous nous contenterons d'établir, aussi simplement que possible,
les équations nécessaires à la compréhension du phénomène.

Après quelques rappels généraux sur le~ champ. électrique

et les lois de l'électrocinétique, nous ferons l'inventaire des forces qui
agissent sur l'ion puis, nous dégagerons les paramètres qui influent sur
sa mobilité.

a) modèle chois; pour représenté la particule chargée

Nous ferons l 'hypothése qu'il s'agit d'une sphére
- de rayon r
- de charge·électrique Q répartie uniformément
- ~ (x) sera le potentiel en un point situé à une
distance x à l'extérieur de la sphére.
Cette sphére étant plongée dans un liquide
- incompressible ,
- de constante diél ectrique S ~ Fao~ . (')'11 - .do .~
--cie-vi scosi té «[ (Po is')
- la densité de charges dans le liquide au contact
1 de l a sphère étant f .
 4

b) rappels généraux sur l'électricité

Le phénomène d'électrisation libère à la surface des

particules des charges électriques; ce n'est qu'une répartition nouvelle
des charges préexistantes ,et .il y a obligatoirement conservation de l'é1ec-
tri cité. Les seules charges mobiles sont les électrons ainsi: un défaut
d'électrons sera interprété conune une charge positive et un excès, comme une
charge négative. L'unité de mesure de charges étant le Coulomb.
Loi.. de Coulomb : Deux
é1ectri ques ponctue11 es
maSSl:!S

placées dans le vide exercen~ l'une sur l'autre une force proportionnelle
àux deux charges et inversement proportionnelle au carré de la distance qui
les Sépare.

q q'
6= flo
:r-
It.
avec q et q' exprimés en Coulomb
f en: Newton
r en mètres
1
ko dans le vide vaut avec 1 Ko = 9 10 9
41i~o

Champ électftique : Etat d'un espace tel qu'en chacun

de ces points toutes charge électrique soit soumise à une force.

E = flo -q-
Jt2

Champ E cree par une charge q à une distance r. La loi de Coulomb peut aussi
s'écrire :
6= E q1

Po~entiel êlectJtique:
V = flo ~ est la fonction potentiel, ou potentiel
Jt
à 1a dis tan ce r.
 5

L'électrophorèse se déroulant~ dans un conducteur t

ces loi s rendront compte des contrai ntes dues au courant é1 ectrique.
Si l'onréunit deux corps A et B de potentiels différents
par un conducteur t leurs potentiels vont devenir égaux par suite du passage
de charges électriques d'un corps à l'autre. Par convention t il s'agit du
passage de charges positives du corps de potentiel le plus élevé vers le
potentiel le plus faible. . dq
L'intensité sera par définition: i = dt

Un générateur sera un appareil dont la fonction sera

de maintenir la différence potentiel initia1e t il y aura ainsi circulation
de courant parmanente dans le système.

La loi d'ohm relie l'intensité et le potentiel

-<. = Ij (VA - VBI ou. (lA - VB = R -<-
Ij est la conductivité du conducteur AB. R sa résistance.

Si une quantité d'électricité Q passe d'un point de

potentiel VA à un point de potentiel VBt l'énergie électrique W= Q (VA - VB)
est dissipée dans le conducteur.

D'après la loi de Jou1e t cette énergie se transforme

intégralement en chaleur. La loi de Joule s'écrit:

Dans un conaucteur constitué par exemple par un ge1 t

il faudra vérifier l'intensité du courant pour éviter tout échauffement du
gel.
 8

,,-,;;-c::...,-.. . . .
1/ 1/ ""
\ \
-/~f.,
1- 3 \ \, -
I~ IF."" + 1 / f,
lI' ,If 1 II
'\, '\, / /
'-
'- "'--"""-""'---'
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---·f
la ''t'm'trI. d. c:.tl.'ge n6g'IN. iml.aale 1 .""our d. l'Ion poltul 1·••1 d'pj.d.
en Il IOUI l'.n•• du ch.mp 'leclnqu. t:
Foro "t .Mf'
une parUoul al8" po..Uv .
da... un ch.....p "_trfque.

(SANCHEZ V. et MANENC J., 1980)

Figure 1
 7

c) b"ilan des forces agissant sur la particule chargée

~
Si l'on applique un champ électrique E à une solu-
tion d'électrolyte, les particules chargées vont se déplacer et atteindre
une vitesse limite -: dans la direction du champ, constante dans le temps.
A ce stade, quatre forces différentes agissent sur la particule:

- Une force FI exercée par le champ électrique E sur la charge de la sphère

.-. -+
FI =Q E
Il

- Une force F2, de friction, due au frottement rencontré lors du déplacement

dans le liquide; elle nous est donnée par la loi de Stokes qui, pour un
ion sphérique s'écrit
~ .......--+
F2 = -6""1 r v =-f c v (f c , facteur de friction)*
- Les forces F3 et F4 sont dues à la présence d'une atmosphére ionique autour
de 1 ion, fonnée de particules de charge opposée, à celle de 1 ion.
l l

La force F3 : de retard é1ectrophorétique, est due au fait que les ions

de l'atmosphére ionique ~e déplacent dans une direction opposée à celle de
la particule ~entrà1e dans le cham~·é1ectrique.
Ces ions adsorbés vont entrai nés avec eux des molécules de solvant qui
vont freiner la progression de 1 ion central en cré8At un contre~courant.
1

Cet effet de freinage est fonction de la concentration de l'électrolyte et

tend à s'annuler lorsque la dilution devient infinie.
La force F4 : de relaxation, est due au fait que l'atmosphére ionique,
distribuée symétriquement autour de l'ion lorsqu'il est au repos et de ce
fait n'exerçant aucune force sur lui, lorsque la particule est en mouvement,
se déplace en sens inverse. De ce fait, il n'y a plus symétrie et le
centre des charges de 1'atmosphére ne coïncide plus avec celui de la
particule centrale et exerce ainsi une force cou10mbienne sur cette dernière
qui va venir s'ajouter à la force F3.

A l'état stationnaire, la somme de ces quatre forces

est n~lle,
-
et l'on a la relation:
.... -.
qE - fcv + F3 + F4
~
= a

t Lorsque les particules ne sont pas sphériques, f c est proportionnel à ~

mais un facteur de correction doilt être introduit pour tenir compte de

la fonne, ·la taille et l'orientation de la particule.
 8

.....
La vitesse électrophorétique v se met sous la forme

... =QE-- --F3- ----F4-

v
+ +

Cette relation nous permet de comprendre l'influence

de la force de retard électrophorétique, de la relaxation, la forme, la
taille, l'orientation de la particule (si le modèle choisi.n'est pas sphérique),
et l'influence du solvant sur la vitesse de migration électrophorétique.

.... Pour calculer V, il nous faudra donc connaître : Q, F3

et F4.
Dans des théories simplifiées, on rencontre souvent la
relation suivante

-
~

QE
v =
6T '1 r

--
qui négligent F3 et ~
F4.
La théorie de DEBYE et HUCKEL, lorsqu'elle est étendue
des solutions vraies aux solutions colloidales, néglige la force de relaxation.
Les forces de retard électrophorétique, sont déterminées en faisant appel
à des notions de distribution spaciale des ions adsorbées autour de la par-
ticule centrale et à des notions de distribution de potentiel.

d) fonction de distribution des ions autour d'une

particule notion de double couche.
Si une particule non chargée est introduite dans une
solution d'électrolyte, elle est susceptible d'acquérir une certaine charge
superfi cie lle. Cette charge peut avoi r pour ori gi ne di fférents phénomènes
- adsorption à la surface de la particule d'une partie des ions contenus
dans l'électrolyte.
- dissolution d'ions de la particule solide.
- ionisation de molécules à la surface de la particule.
Les ions de l'électrolyte dont la charge est opposée
à celle acquise par la particule vont être attirés tandis que ceux portant
une charge de même si gne seront reooussés.
 Q

+
+ + +
0+
0+

+ +

+
-: +

+
-
. Parti=Ze
de I!harge
~ 7.el!'t1'Onldgative

0+ i
-/
---
+

PotentieZ ZETA (ç)

~--!-----~Zectrique
PotentieZ

autour de Za
pœoticuZe

Couche rigide Zilde cl

Za parti=Ze
(couche de Ste-rn)
___ ~+-_ ..... ';" SoZutio71

Couche diffuse mobile

(couche de Gouy-Chapman)
~_"'- Concentratior.
à'ions pOBi~ifs

' - - - - - - - ConcerztTatio11
è. ' ions nf1ga!:i ~.:'3

[LUSETTI G., 1983]

Figure 2
 10

Il Y a ainsi formation dlune double couche dans la

phase liquide qui entoure immédiatement 1 l ion.
La couche interne est localisée en surface (couche
de STERN)
La couche externe, partie diffuse de la double couche,
forme une charge spatiale qui peut atteindre quelques angstroms du fait
du mouvement brownien.
Puisque la particule est liée à des ions adsorbés,
1lentité mobile susceptible de ce déplacer aura une dimension supérieure à
celle de l'ion, nous appe1erons R son rayon (supérieur au rayon r de la
particule initiale).
La concentration en ions autour de la particule
est représentée au bas de la figure 2 en fonction de la distance à la
parti cul e.
Ce mo~èle de représentation d'un ion est dû à STERN,
et si on lui adjoint la fonction de distribution du potentiel, clest celui
qui donne Tes résu1 tats les pl us proches de ceux obtenus de façon expérimen-
tale.

e) fonction de distribution du potentiel (GOUY et CHAPMAN).

La figure 2 représente les variations du

potentiel en fonction de l'éloignement de la particule en accord avec la
théorie de la double couche.
Le potentiel à la surface de la particule migrante ne
sera plus ~(Jl)mais lp(~)et, comme il est facile de le constater sur le graphique,
lui inférieur. Le potentie1.jtNcorrespond à la tension électrocinétique ou
potentiel Zéta il est noté ~. Il est possible de faire une analogie entre
cette tension ~ et la tension superficielle ou interfacia1e existant dans
un liquide. On appellera plan de glissement, la plan situé à la distance
R du centre de la particule. Certaines méthodes expérimentales permettent
la détermination de ce potentiel (LUSETTI). Il revêt une grande importance
lorsque 1Ion souhaite étudier la stabilité de suspensions colloïdales
puisqu'il gère toutes les interactions électrostatiques entre les particules.
 11

Le potentiel électrique de surface ~~)dans un milieu

isolant de constante diélectrique E:.d'une particule au repos de rayon r est
lié à la charge de la particule par la relation

(e-:t.)

Si l'on porte cette relation dans la formule simplifiée

nous donnant la vitesse de migration d'une particule (en négligeant F3 et F4)
et si le rayon de la particule est pris égal à Rs nous obtenons la relation

Cette relation permet de calculer ~à partir de la

vitesse de migration de petites particules sphériques dans un champ électri-
que.
Dans le cas de particules de dimensions superleures et/ou
de forme non sphérique; le calcul devient plus complexe: il faut faire
intervenir un facteur de corrèctton.

La fonction de distribution du potentiel peut se mettre

sous la forme (GOUY et CHAPMAN)

'fCx) :: ~ f't,) ~tf (- k ~) ~~)

~('\): poterti e 1 à 1a surface de la sphère

l~ :r paramètre de DEBYE-HUCKEL avec :

fi: force i~nique de la solution
A ~.11 2
fi =n{.. ~~~
Ci zi (Ci: concentra ti or
des ions)
e : charge élémentaire d'électricité
K -:. L_8_lf_e_2._x _t",--Â_#_ ~ (en Coulomb)

l- t ~ T
ë,.: constante diélectrique du milieu
(Farad.cm- 1)
k constante de Boltzmann
(8 s 32 J . mol e-1 )
T température en oK
 12

-1p(XI

G>
G>
e
Œ>
@
@ e Œ>
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_!l!1!Y_

~\-i
•
- @
+ \ 1
œ e
,'1/1<
JI
Représentation schématique de la théorie de la double couche

(MILAZZO G., 1969)

Figure 3
 13-

Dans la réalité, la particule se trouve dans un milieu

non isolant (électrolyte) . Q(R) : qui est la charge électrocinétique,
et ~~)peuvent être reliés par la relation:

Q(R) :: Ë lV eR) f\ ( A+- k ~) ( e 4)

La relation (e2) peut donc se me ttre sous la forme

Q?CR) --P
~
rtr -- E Ces)
CA +- K\\) 6 ïl1 ~
I/K : étant l'épaisseur de la couche diffuse. Elle est définie comme étant
"la distance l de la surface de la particule de potentiel ~Ji1à une surface
;
parallèle(x), dont le potentiel ~l\)est ~ie e étant la base des logarithmes
népériens; e = 2,7~

Les relations (e2) et (eS) deviennent égales lorsque

le produit KR devient voisin de zéro.
Nous avons tout au long de ce raisonnement conservée
l'hypothèse d'une particule sphérique. Bien d'autres modèles exi~tent, plus
complexes, pour relier la charge à la vitesse de migration, mais ils ,
rendent compte du même phénomène.

f) mobilité effective

Par définition, la mobilité est la vitesse moyenne

atteinte par un ion, lorsqu'il est soumis à un champ électrique de IV
par cm. On la désigne par)A~lorSqu'il s'agit d'un cation et par~ si
la particule migrante est un anion.

La mobilité ionique absolue est elle aussi la vitesse

limite atteinte par une particule chargée soumise à un champ électrique
de IV par cm mais à dil· ution infinie. C'est une constante caractéristique
de chaque espèce ionique, pour un solvant donné. Elle est proportionnelle
à la conductance équivalente limite et vaut:
 14

La mobilité effective dépend de nombreux facteurs.

En pratique, il est très rare de travailler à dilution infinie et l'influence
des autres espèces présentes ne peut être négligée. Des corrections
doivent être effectuées pour tenir compte de phénomènes tels que le
retard é1ectrophorétique et l'effet de *e1axation, d'autres auteurs proposent
de tenir compte des interactions ion-ion ainsi que de l'effet d'une dissocia-
tion partielle. TISELIUS considérait que la mobilité effective était la somme
de tous les produits des degrés de dissociation et des mobilités ioniques:

;c~M = 21 d.; ~~
où :}iest la mobilité effective
d.~ est 1e degré de di ssoci ati on
ft est la mobilité ionique.
En résumé, il est possible de constater que la mobilité
effective d'une espèce ionique donnée dépend de nombreux facteurs tels que:
la taille de l'ion, la solvatation, la constante diélectrique et la
vi scosi té du sol vant t 1a fonne, 1a charge de l' ion, le pH, 1e degré de
dissociation et la température. Il est très difficile de trouver une expres-
sion mathématique rendant compte de tous ces phénomènes. Lorsque nous
parlerons de mobilité effective, nous utiliserons l'expression

t<~ = ~; dt; ~; 1:
où :%iest un facteur de correcUon rendant compte de la relaxation et
du retard é1ectrophorétique.

La mobilité effective et la vitesse de migration

sont liées par la relation
--f> ....

ttr~ - /~~~ E
qui rend compte du déplacement de l'espèce ionique IIi" sous l'influence
-..
du champ é1ectrique E.

Les mobilités é1ectrophorétiques sont du même ordre

de grandeur que les mobilités ioniques. Elles sont comprises entre 2 10- 4
et 20 10-4 cm 2/s.V.
 15

a) Pa~amètres extérieurs

- Le champ électrique : clest le paramètre essentiel, il sera créé par une

di fférence de potenti el app1i quée aux bornes de 1a ce11 Ulle d' électrophorèse.
- ['intensité du courant électrique continu: le déplacement dbune particule
chargée croit avec l'intensité du courant. L'utilisation de cet effet est
limité par des considérations d'ordre pratique en particulier l'effet Joule
doit être combattu par un refroidissement très efficace de la cellule d'élec-
trophorèse si l'intensité du courant à utiliser est élevée.
- La température: la conductivité du solvant croit avec la température, il
faudra donc la maintenir constante tout au long de 1 lexpérimentation. Elle
joue également un rôle sur la viscosité du solvant. Cet effet est dû princi-
palement au passage du courant et si ce1à est possible, il faudra travailler
à des intensités faibles (quelques milliampères). Il peut également y avoir
évaporation du solvant, ce qui augmente encore la conductivité.
- Le temps: à l'état stationnaire, lors d'une manipulation d'électrophorèse,
la particule se déplace à vitesse constante. Plus le temps de manipulation
sera grand, et plus le ~~~lacement sera grand. Cette durée est cependant
limitée par des facteurs tels que la diffusion des substances étudiées sur
le support, la dégradation des produits ...
b) paramètres relatifs au solvant
- La constante dié1ectrigue du milieu: elle influe sur la valeur des forces
électrostatiques. La mobilité croit avec !.
- La viscosité: elle a une influence moins importante. Plus sa valeur est
faible et plus la vitesse de migration est importante, en contre partie,
apparaissent des courants de convection.
- La force ionigue : elle fixe la densité de charge autour de 1lion. Le dépla-
cement dlune particule augmente lorsque la force ionique diminue. Eh fait,
elle est inversement proportionnelle à la conductivité du sOlllvant utilisé,
et donc proportionnelle à sa résistance. Les forces ioniques des tampons
que 1'on a l'habitude d l uti1iser en électrophorèse, varient entre 0,05 et 0,10.
 16

- Le pH : il joue un rôle très important spécialement lorsque les substances

que l 'on désire séparer sont amphotères. Pour les protéines par exemple
qui, comme nous le verrons au chapitre suivant, ont, suivant le pH du
milieu une résultante de charges positives ou négatives. De plus, pour
un certain pH, elles deviennent neutres et de ce fait, ne migrent plus
sous l'influence d'un champ électrique (cette propriété est mise à profit
dans une des techniques d'électrophorèse).
- La nature des ions composant le solvant: elle joue un rôle important
pour les protéines et les colloides car elle peut modifier la charge
globale de ces particules et dans certaines conditions, entraîner une
floculation.

c) paramètres relatifs au soluté: .

- La charge Q : très liée comme nous venons de le voir au milieu dans lequel
se trouve la particule.
- La forme et la taille des ions: ont un rôle important principalement si
l'on couple l'électrophorèse à d'autre méthodes analytiques; filtration
sur un support à gradient de porosité par exemple. Dans certaines techniques
électrophorétiques, ce sont ces paramètres qui guideront le choix du support
de mi grati on.
IV - QUELQUES RAPPELS SUR

1 - LES PROTEINES
a) Généralités
Les protêîlles sont indispensables au maintien des
activités de la vie et beaucoup-dé' fonctions biologiques dépendent d'elles.
Toutes les enzi~es qui régissent les réactions du métabolisme et la plupart
des hormones qui régularisent des processus métaboliques sont des protéines.
Dans l'organisation moléculaire et structurale de la cellule, les protéines
seront donc les substances les plus importantes.

Elles résultent de la condensation d'un grand nombre

d'acides aminés. Un acide mniné est un composé dont la molécule comporte
une fonction amine et une fonction acide carboxylique.

~ NH 2 (amine)
CH 2 acide aminé le plus simple
~ COOH (acide) (acide amino-acétique)

Les acides amlnes jouant un rôle fondamental dans la constitution des tissus
vivants dérivent de celui'-ci par substitution d'un radical R à l'un des H
du groupement CH 2 • (Le radical R peut représènter des fonctions chimiques
très variées: alcool, acide, amine, phénol, ... )

:t
R - - CH - - COOH acide aminé (amine primaire)
1
NH 2

~~~2~g~~S::Si la structure comprend deux fonctions amine et une fonction acide,

T'acide aminé sera dit "basique", si par contre, elle comprend une fonction
amine et deux fonctions aciqe, l'acide aminé sera dit "acide".
Les acides aminés possèdent un certain nombre de propriétés com-
munes ; la nature du radical R leur donnera un assez grand nombre de propriétés
secondaires associées.
 18

b) Propriétés acido-basiques :

La présence dans la structure de leur molécule d'une

fonction acide et d'une fonction basique détermine la p~op~iété la plus
importante des acides aminés, leur caractère amphotère.

En milieu' aqueux, la fonction acide est dissociée

RCOOH ~ RCOO- + H+

Les ions H+ sont libérés par le groupe carboxyle puis, captés par le groupe
aminé

L'amino acide se trouvera sous la forme d'un ion dipolaire, résultant du

transfert de H+ entre les deux fonctions, soit une sorte de "neutralisation
interne". Cet ion dipolaire est appelé "zwitter-ion ou se l interne
ll
II
ll
•

En milieu acide, dans lequel les ions H+ prédominent,

le groupement négatif est saturé

H N+---ICH-----CoO- + H+ ----Oo~ H N+ ~H---COOH

3 1 3
1
R R

En milieu basique, où les ions OH prédominent, les

protons fixés sur le groupe aminé sont captés pour former de l'eau.

+
H3N _ CH - COO - + OH
1
R
 19

Les différents équilibres auxquels peuvent donner lieu

un acide aminé en solution peuvent se résumer ainsi :

mil i eu aci de H2N--- CH --- COOH milieu basique

1
R
OH
H3N~ CH -COOH ~
1 R+ t --
R +
H3N--- CH --- COO -
1
aci de(: conjugué R
base conjuguée

ion dipolaire
(neutre)

L1équilibre entre la molécule et llion dipolaire

est indépendant du oH DuisQue cette transformation, Durement; interne,
• • " . 1

ne fait pas appel aux ions H+ du miliéu. Par contre, les éq~ilibres
de l'acide aminé avec son acide ou sa base conjugués dépendent du pH
de la solution. Selon la valeur du pH, l'un ou l'autre est favorisé.

Pour une certaine valeur de pH, la concentration

en anions et cations est la même~ Cette valeur est définie comme étant
le eQi~~_i~Q~l~ç~rig~~ de l'aminoacide, ainsi nommé en raison du compor-
tement de l'acide anriné lors d'une életrolyse à ce pHi. En effet, si le
milieu est basique, la forme prépondérante est H2N-CHR-COO- et l'on
observe une migration vers l'anode; si le milieu est acide, la forme
prépondérante est H3N~CHR~COOH et la migration a lieu vers la cathode.
Au point isoélectrique, où les~.concentrations de ces deux ions sont
égales, et, à condition que leurs mobilités soient égales, aucune migration
pr~fêrentie11e.n'est observée vers l'une des électrode.

Ces remarques sont mises en application dans la

séparation analytique des aminoacides par ~l~ç~rQenQr~~~.
 20

La valeur de pH correspondant au point isoélectrique

dépendra des forces respectives des fonctions acides et basiques de la
molécule, elle sera variable selon la nature de la molécule. Pour les
acides aminés "neu tres" elle sera généralement comprise entre 5,02 et 6,3.
Les amino-acides "acides" auront un pHi nettement acide voisin de 3,00
les amino-acides Irbasiques auront, eux, un pHi faiblement basique 7,6 à
ll

fortement basique 10,8.

c) Les protéines, les pepti des :

Nous avons vu que les protéines étaient formées dlun

grand nombre diacides aminés. Leur condensation en chaines polypeptidiques
se fait par çondensation du groupement acide de l'une des molécules et du
groupement basique de la molécule voisine, et élimination d1une molécule
d1eau.

- -, H
1 1

Peuvent ainsi être condensées un grand nombre de molécules conduisant à des

cha~nes plus ou moins longues, linéaires ou cycliques.Dans notre exemple,

l,
la substance formée est un dipeptide. La liaison - C- NH porte le nom
~
de liaison peptidique.
 21

Seules les ~~2i~~~_12~~t21~~ des protéines, porteuses

de groupements COOH et NH 2 libres, donneront aux molécules leur caractère
acide ou basique.
 22

2 - LES COLLaI DES

Thomas GRAHAM, en 1861, subdivisa les substances chimiques

en deüx parties :
- substances se dissolvant facilement dans l'eau et
traversant les membranes semi-perméables'(sels, sucres) ou ~ri~~211Q!~~~,
la majorité d'entre elles possédant la propriété de cristalliser.
- substances formant des suspensions et ne traversant pas
les membranes semi-perméables (protéines, gommes, gélatine) ou ~QIIQ!~~~'
susceptibles de fournir, par concentration, des gelées solidifiées.
8~~~rg~~~ :-Colloide vient du grec: colla (colle).
- Une même substance peut, selon les conditions du milieu où
elle se trouve, se présenter à l'état cristalloïde ou bien à l'état c
colloïdal.

En fait, une solution colloïdale différera essentielle-

ment d'une solûtion cristalloïd~ par la taille des particules en suspension
dans le solvant.
DIAMÈTRE DES DIVERSES PARTICULES QUI DÉTERMINENT LES SOLUTIONS VRAIES.
LES SOLl1J10NS COLLOÏDALES ET LES SUSPENSIONS.
0.003 Jl représente la limite de visibilité à l'ultramicroscope
et 0,2 Jl celle d4 la visibilité au microscope photonique.

Solutions Solutions colloldales

ordinaires (micelles) Suspensions
1 1 1
Diamètre
des < 0,003 Jl de 0.003 Jl à 0.2 Jl 0,2 Jl et > 0,2 Jl
particules

Tableau l (NOlmAVEy.E A., 1969)

Dans une solution ordinaire, les molécules du corps ..
dissout, ont une dimension très voisine de celle du solvant.; par contre,
dans une solution colloïdale, le diamètre des molécules du corps dispersé
sera beaucoup plus grand que celui du milieu de dispersion.

Les principaux caractères qui vont nous permettre

de différencier les colloïdes des solutions ordinaires, seront: d'être
dialysables (ultra filtration à travers différents types de membranes),
de posséder une très faible vitesse de diffusion, de cristalliser diffici-
 23

HH +

~ l

2 3

émulsoïde : colloïde hydrophile.

1) dipôle constitué par une molécule d'eau et représentation schématique de ce
dipôle avec un pôle + et un pôle -. Les dipôles s'attirent mutuellement par
leurs charges opposées et construisent des • associations o.
2) organisation des dipôles en une assise liquide aux molécules orientées tout
autour d'une particule de charge positive, les dipôles s'appuient par leur pôle
négatif contre la particule chargée positivement. Au-delà de cette assise d'hydra-
tation très délimitée, les molécules d'eau se répartissent au hasard.
3) particule au point isoélectrique. charge minimale et enveloppe liquide bordante
plus diffuse et moins large (d'après PALLMANN. 1931).

(A. NOUGAVERE, 7969)

Figure 4
 24

1ement, de présenter fréquemment une hétérogénéïté optique (certaines subs-

tances colloïdales soumises à un éclairage' violent diffractent la 1umiére
dans toutes les directions et sont ainsi rendues visibles au microscope:
c'est l'effet TYNDALL. L'eau pure et les solutions ordinaires ne présentent
pas cette propriété, d'adsorber à leur surface des molécules ou bien des
ions libres présents dans le milieui.

Si 1Ion prend- en considération-; la gravité qui devrait,

normalement, faire précipiter les colloïdes ou bien leur énergie superficielle
très élevée qui.devrait avoir tendance à diminuer par la formation d~agrêgats;
la stabilité des colloïdes peut nous sembler surprenante.
La stabilité est assurée par les charges électriques
de même nature que portent les particules au sein d'une solution donnée.
Les charges identiques de ces particules vont donc se repousser, empêchant ainsi
la formation d'agrégats.
De telles particules placées dans un champ électrique
vont avoir tendance à se déplacer vers le pôle positif, si elles sont porteuses
de charges négatives et vers le pOle négatif si l'ensemble des particules col-
loïdales sont chargées positivement.

Plusieurs théories sont proposées par les différents

auteurs pour expliquer l'origine de la charge électrique des colloïdes. elles
dépendent de la nature du colloïde envisagé. Pour la majorité dlentre eux,
la charge est liée à des phénomènes d'adsorption de particules présentes
dans le milieu. rrLa particule colloïdale acquiert, ainsi, une certaine charge
et les autres espèces ioniques restant en solution dans le milieu de dispersion
lui .confèrent une charge de sighe opposé'~. (Théorie de la double couche mise
au point par He1mhotz et e~trapoJée aux particules colloïdales). Pauli, quant
à lui, propose d lextrapo1er les propriétés des solutions d ' é1ectroytes vra is
II
ll

aux solutions de particules colloïdales. Seule varie la taille de l'une (ou des
deux} pàrt1càle::qet augmente. Si maintenant, l'on considère des colloïdes
biologiques, (solutions de protéïnes par exemple), la charge dépend ~~ig~~~~~~
de la nature de la particule; ionisation des groupements COOH ou NH 2 ~iÏbws
 25

3 - L'ELECTROOSMOSE

C'est le déplacement d'un liquide le long d'une paroi

solide sous l'action d'un champ électrique parallèle à celle-ci.

Si l 'àn place un diaphragme dans un tube, de verre

rempli d'eau et que l'on applique une tension de part et d'autre, l'eau
s'élèvera dans le tube capillaire situé au dessus du tube expérimental,
jusqu'à ce qu'une certaine pression d'équilibre soit atteinte.

r ·
-,
5i
=~
~
•
•. Figure 5

électroosmose

UII U:û.O '.

J. , 1969)

Si, maintenant, lion remplace le diaphragme par un (ou plusieurs)tcapillaire

en verre, le même phénomène pourra être observé. La différence de potentiel
1I 0 blige donc l'eau à traverser le capillaire. Ce phénomène est d'autant plus
ll

marqué que le rapport entre la surface de contact 0.e la paroi f1x~ au volume
du liquia~est plus important.
(Figure 6)
Helmotz suppose l'existence d'une double couche due aux
ions compensateurs qui s'aligneraient parallèlement à la paroi solide à une
distance très faible, mais définie, de celle-ci.
Gouy propose un modèle selon lequel les contre.ions se
distribu'eraientenune couche diffus~ de faible épaisseur.
Stern, quant à lui, propose un modèle qui est la synthèse
des deux précédents.

t on aSS1m1 le alors ce réseau de cap1 Ilalres â un a1aphragme

 28

,[0116 c.onbte Couc.he <Ü.6 6M e

a.d6 Olt bé.6 de GOUY et CHAPMAN
•
,[0116

--@
~
e
- (±) ~ 1

el m <fi G ~
PaJLt.i.c.u.le e paJLt.i.c.u.te EJ (2)
e
Q
@
- ~ e
<:> G)
ModUed"HELMOTZ ModUe de STERN

F~gure 6 : Schéma des trois modèles cités précedemment

Pauli, en s'appuyant sur la théorie de dissociation ionique

qu'il a déjà utilisée pour les particules colloïdales, nous propose une
explication de la naissance de ces charges. A la surface des parois fixes,
existerai~nt des complexes susceptibles:de se.dissocier (dissociation favorisée
par le contact-avec le liquide), communiquant ainsi une charge à la paroi
et libérant dans la solution (au voisinage immédiat de la paroi), une charge
de signe opposé appelée contre-ion, ou ion compensateur. A titre d'exemple,
il est possible de clier la silice qui, au contact de lleau, se charge néga-
tivement en perdant un ion H+ et le verre qui, lui, perdra un ion Na+, les
ions libérés restant au voisinage immédiat de la paroi.

Ces phénomènes sont mis en évidence lorsque lion impose

un champ électrique parallèle à la surface du solide et que lion observe
le déplacement du liquide. Le champ électrique agit sur les contre-ions en
les forçant à migrer et entrainant avec eux, du fait de leur hydratation
et de la viscosité du liqùide, une partie de ce dernier; provoquant ainsi,
la phénomène d'électroosmose.

Ce phénomène sera gènant lors dlanalyses par électro-

phorèse puisqu'il s'opposera à la migration anodique des particules étudiées.
 27

4 - DIALYSE

Clest un procédé de purification des solutions col-

loïdales.
C'est une méthode de purification par ultrafiltration
àtravers des membranes à dialyse qui sont perméables aux cristalloïdes
mais, imperméables aux colloïdes. La maille de ces membranes est
inférieure au m~m ; d'où le terme d'ultrafiltration qui est utilisé.
Cette filtration a lieu à la pression atmosphérique.

Si l Ion place un coll~ïde dans un sac de collodion

(type de membrane ci-dessus décrite), le tout plongé dans de lleau
pure que l Ion renouvelle constament, les ions passent dans lleau.
Les colloïdes restent, eux, prisonniers du sac de collodion. On ob-
tient ainsi une solution colloïdale pratiquement pure.
Si l Ion réalise cette ultrafiltration sous pression,
le collodion est placé sur un disque poreux qui évite sa rupture.

C'est une dialyse accélérée par un champ électrique que

l 'on appliquera entre deux électrodes séparées de la solution de colloïdes
par une membrane. Les ions de llélectrolyte migrent au travers de la III dl
membrane et la purification est ainsi accélérée. Elle est plus rapide que
la précédente mais, elle peut provoquer la coagulation des colloïdes dont
la stabilité est souvent liée à la présence d'électrolytes même en faibles
quanti tés.
 28

v - APPLICATION DU PHENOMENE D'ELECTROPHORESE DIFFERENTES METHODES EXPERIMENTALES.

ET ANALYTIQUES.

1 - Classification des différentes méthodes

a) Comme nous l'avons vu précedemment, une différence dans

.
la mobilité effective des espèces ioniques contenues dans une solution,
entraine, lorsqu'elles sont soumises à un champ électrique E, une différence
dans leur vitesse de migration. Chaque espèce se déplacera avec une vitesse
propre et il sera possible de les séparer. Les types d'électrophorèse basés
sur ce principe sont appelés "électrophorèse de zone". Cette dénomination
provient du fait qu'à la fin de l'analyse, il sera possible de distinguer
(après révélation si nécessaire), des compartiments contenant chacun un type
d'espèce migrante.

L'électrophorèse de zone est divisée en

- électrophorèse libre ;
- ~1~ç~r~2gQ~~~~=~=fbQg~i~b~=ID~~il~ (la séparation a lieu dans un tube
2
en U d'environ 1 cm de section).
- ~~g~gçgQ~bgr~~~ (la séparation a lieu dans un tube capillaire).

- électrophorèse dans des milieux anti-convection ; électrophorèse sur support

- 1 er groupe : le tampon est fixé sur un support sol ide (él ectrophorèse
sur papier par exemple).
- 2 éme groupe: le tampon est mêlé à une substance à l'état de gel
(électrophorèse sur gel d'amidon) on ne distingue alors qu'une phase.

b) L'électrofocalisation présente un principe différent

c'est une méthode de séparation qui est fonction des points isoélectriques
des protéïnes, peptides et acides aminés,; en fait des substance amphotères
en\'général. Ces substances acquièrent une charge positive lorsqu'elles se
trouvent dans un milieu dont le pH est acide (en fait inférieur au pHi)
et une charge négative dans le cas inverse: pH basique (supérieur au pHi).

Placées dans un milieu 00 il existe un gradient de pH

et soumises à un champ électrique Ê, elles vont se déplacer jusqu'à une
zone de pH appelée "point isoélectrique". En effet comme nous l'avons vu
dans le chapitre de rappel sur les protéïnes, en ce point, la particule
est globalement neutre.
La séparation est donc fonction du point isoélectrique
pHi et non de la vitesse de migration.
 29

Cette méthode peut être considérée comme une technique

électrophorétique car, pour atteindre cette zone de pH où leur état est
stationnaire, les particules migrent électrophorétiquement.

Dans les deux cas envisagés (a) et (b), on essaye de

séparer un mélange en ses différents constituants. Il faudra se donner les
moyens, pour qu'il y ait méthode analytique, d'identifier et éventEiellement
quantifier, les différentes fractions obtenues.

Le dispositif expérimental sera fonction du type

d'électrophorèse et revetira, dans chacune des catégories, des formes très
diverses,spécifiques du problème envisagé.

De manière générale l'analyse sera effectuée

- en phase liquide ou· so~ide

- en régime continu ou discontinu

Le tableau suivant résume toutes les données de ce
paragraphe. :

Tableau II

SépalBlions pBI éIBt;..ltopholèsB.

T,pe d. l'par.cioft f:laC'trophor'" U\.li•• tlon MIIi.u d. "p.tltion Rtglma

.nalytique support solide ou gel discontinu

tlectrophorè.e de zone
proprement dite préparative support solide, gel ou continu ou discontinu
phase liquIde

suiv.nr la mobjfil~ t'ectrophorhe Il frontière enalylique phase liqUide l')

mobile

analytique phase liquide discontinu

Isotachophorè.e
préparative phase liquide 1')
analYlique support solide, gel ou discontinu
suivant la point phase liqUIde
iso~/actriqua tlactrofocali18tion
préparativa support solide, gel ou conlÎnu ou discontinu
phase liquide
(t) .....h_ pau U_L

(SANCHEZ V. et MANENC J., 1980)

 30

2 - Objectifs de l lanalyse électrophorétique.

Deux objectifs pourront être poursuivis lors d'une

analyse par électrophorèse :
- séparer ou purifier les constituants d'un mélange en vue d'une utilisation
ultérieure.: méthode préparative.
- identifier et/ou quantifier les différents constituants: méthode analytique.

a) méthode préparative :
- échantillons inférieurs au gramme électrophorèse
en régime discontinu.
- échantillons en guantité plus importante électrophorèse
en régime continu.

b) méthode analytique :
- séparation de groupes de substances.
On utilise dans ce cas l'électrophorèse de zone sur
acétate de cellulose qui est la technique la mieux adaptée (elle est automa-
tisée actuellement pour le sérum sanguin).
- séparation du plus grand nombre possible de produits
contenus dans une solution.
Il faut faire appel à l'électrophorèse de zone sur
gel ou llisofocalisation en veine liquide ou sur gel.

Ces méthodes sont beaucoup plus fines que la précédente

ma;s~ d'une mise en o~ vre plus délicate. Elles seront examinées en détail

dans le chapitre qui leur est consacré.

Il faudra prendre beaucoup de précautions lors de la

préparation des échantillons. La qualité du résultat obtenu dépendant pour
moitié de la méthode utilisée et pour moitié de la qualité de la manipulation.
 31

3 -Généralités sur les expérimentations d'électrophorèse.

Quelque soit la méthode d'électrophorèse utilisée,

donc quel que soit 11 apparei 11 age envi sagé ;

- le principe d1une analyse électrophorétique peut se résumer selon

Echontliion

Cellule Separalion de.

d'électrophorèse constItuante

Révcilation des zones

ou élution continue

IdentifICation
AnalVN quantitlltiw

Figure 7 :
(SANCHEZ V. et MANENC J., 1980)
- tous les instruments consistent en cinq parties principales:
- les compartiments anodiques et cathodiques
- la cellule ou chambre d'électrophorèse
- le système d'injection
- le détecteu r
et tout une gamme de produits: colorants, tampon, etc ...

- des précautions sont à prendre ~our obtenir les résultats les plus exploi-
tables et les plus reproductibles possibles. Chaque méthode a ses exigences
propres décrites dans des articles et ouvrages spécialisés mais, il est
possible de distinguer des généralités.
1°) quantité d'échantillon
quelques micro-grammes (sauf en électrophorèse '
préparative) .
2°) intensité du champ électrique;
doit être adapté à la nature de l'espèce ionique
que l'on souhaite séparer:
- un champ électrique de quelques volts par centi-
mètre sera suffisant pour les macro-molécules.
 32

- un champ plus important, 100 volts par centimètre,

sera nécessaire pour séparer les petites molécules.
30 ) intensité du courant;
doit être un compromis entre deux exigeances :
- une séparation rapide des éléments pour éviter
la dégradation des produits et/ou leur diffusion.
Pour satisfaire à cette exigence, il faut une
intensité suffisante.
- une limitation des phénomènes suivants induits
par une forte i ntensi té.
o apparition de courants de convection qui peuvent
limiter ou annuler les séparations.
o augmentation des phénomènes de diffusion qui
nuisent à une bonne séparation.
o risque de dégradation des produits sensibles
à la chaleur

Les phénomènes de.convection peuvent être limités

de différentes manières :
o ~n_éle~tro~hQrgs~ libr~ :
-----------------------
la chaleur sera dispersée radialement par conduction
depuis l'axe de la colonne jusqu'au milieu exté-
rieur à travers les parois de la cellule.
o ~~=~l~~~~QRbgr~~~-~~~-~~gegr~ :
grâce à des supports appropriés (gel d'amidon
par exemple). Ces milieux par contre, influent
de manière non négligeable, sur la migration
électrophorétique. Par exemple, le chemin parcouru
réè 11 ement par une parti cu l e es t bi en supéri eur
à la distance de migration observée. La véritable
distance sur laquelle s'effectue la chute de
potentiel est donc supérieure à la distance
mesurable.
 33

4°) limiter l'é1ectroosmose ;

cette migration du solvant, en sens inverse du dépla-
cement des ions ou dans le même sens selon leur charge
nette, est sensible surtout en isotachophorèse et
en électrophorèse sur support. En effet, la surface
de contact liquide/solide, est importante par rapport
au volume de liquide. Il faudra corriger les mobilités
en fonction de ce phénomène.

5°) identification des constituants par;

- <:...an~rai s~n avec un é1ectrophorégranme étê!J 0l!:
- mise en 08.1 vre de tests.spécifiques (en analyse
biochimique en particulier pour les protéines)
- avec des colorants spécifiques d'une
c~112.ratiQ.n
sub~tance donnée. Cette coloration pouvant inter-
venir avant le début de l'expérience ou bien lors-
que la séparation a eu lieu. (Noir de soudan pour
les glucides, Réactif de Schiff pour les fractions
glucidiques des protéines) .
- ~~uaJl~ de certaines substances par des éléments
radioactifs (59 Fe dans du sérum sanguin permettant
de voir dans quelle partie il va se fixer puis
comptage ou autoradiographie).

6°) ~omposition stable du tampon tout au long de 1'ana1yse

Ceci peut être obtenu par divers di~iJosi·~·jÎs :
- membranes destinées à freiner le passage des gros
ions du fait de llé1ectrolyse, par exemple.

70) normalisation des protocoles de mesure ;

Dans la mesure du possible, il faudra s'y attacher

afin de pouvoir effectuer des comparaisons entre
les analyses, dans de bonnes conditions.
 34

Pl ans de

J
-) glissement

Fif/ure 8 Cellule de Tisselius et ses vases d'électrodes

(MILAZZO G., 1969)

0
1 tc
~

(~ -(5) c c c
8. 8. 8-
E E E
~ I!! ~

(2)

- lavolume
de à 20 cm 3

2
Fi gu re 9. S,,,",,,a du divINI.vil'/ I",,,,,,,"alll Il'Oblrlli,. un. sur/",·,. de "I,a"allllll ,,,,lit "u,·,. ,.'
1/J"'IJOn
ft la BoluJ.iun de Ilrut~lIlf' 'lui .'Y,-,·a :fOltfflUf ail t:lIamp electriflut". La pa,.tit mrrlian,. dl' 1" ("uv,. tIn U
ptul 8e d'I'lnur /lIltr"I"",,,'.
1. La partie infi-fu'ure et 1•• partie médi.lne sont remplit'8 uvee la solution dl' proteine. ~, La partie
nloyenne a éti- dpp~ac~·.t· tic rn~lIl1èrc il pouvoir ren.,.lir la parite sup(ofleurn avec le lampon. :1, Ld l'ISpO·
silion inlllaJC" il ~të rétahl ...

(BOULANGER P. ~ POLONOVSKI J., 7959)

 35

A) ELECTROPHORESE DE ZONE

a) électrophorèse à frontière mobile

a - 1 Généralités
=-=-=-=-=-=
C'est une des méthodes les plus importantes d'électrophorèse libre
et c'est également la plus ancienne. Thèse de Doctorat d'Etat de TISELIUS
en 1930 ; ces travaux, dans ce domaine lui ont permis d'obtenir le prix
Nobel en 1948. Pour la première fois, il a été possible de séparer, en
plusieursfractionsles constituants du sérum sanguin.

Si les part' cules étudiées sont des coll oides, ell e est dési gnée
sous le nan de "méthode de TISELIUS".

L'appareillage consiste en :
•
- une .cellule en,IIU 00 sont mis le tampon 'ét la solution
II

à étudier.. Son volume est de 10 à 20 cm 3 .

Dans l'appareil de TISELIUS, le tube d'analyse comprend

ci nq tronçons. Les tronçons médi ans (2-;4) sol i dai res l'un de l'autre, pouvant
glisser, à la façon d'un tiroir~ par rapport au fond du tube (3) et aux
parties supérieures (1) et (5), et, ceci de façon parfaitement étanche.
La partie (3) peut glisser indépendament le long du tiroir médian.
Pour effectuer le remplissage, on procède de la manière
suivante :
- la fond du tube (3) est rempli de solution de particule dialysée en présence
d'un tampon T. La sol uti on macromol écul ai re consi stera, dans notre exemple,
en un mélange de trois particules A, B, C chargées négativement.
- l'on remplit llun des tronçons médians (4)de la même solution dialysée
qu'en (3), le second tronçon étant remplit de tampon T.
- les deux branches supérieures (1) et (5), ainsi que les vases d'électrodes
contenant le tampon T.
 36

On fait ensuite glisser les éléments de l'ensemble

llun par rapport à l'autre afin de reconstituer la cellule d'analyse.
On amènera, en déplaçant le liquide, les frontières
au ni veau du détecteur optique si tué, en général, au ni veau du tronçon
médi an.
La section de la cellule est rectangulaire (représentée
en coupe sur le schéma présentant le cellule de TISELIUS).

- un détecteur optique :

1[
Le plus utilisé est basé sur une application de l'effet
FOUCAULT~ TOPLER. Il

Son principe est le suivant: (Figure la)

Un rayon lumineux, lorsqu'il traverse un milieu où
existe un gradient d'indice de réfraction, voit sa trajectoire déviée.
A chacune des frontières apparue lors de l'analyse,
se produira, avec la variation de concentration, une variation d'indice
de réfracti on.

fampo,.,
x,

x""" \. Cm
-~={----':"'-""':";';""'-lr------+------------=~O
<\\

1.

profé In<~

Fi gu re 10 ; D~iallun d'un rayun lrav,.,.,sllllt la f14vt: li rle, '"uIJhw f!~" au. Il,w'a14 d'lUII' Irolltière.
La courbe pOintillée à l'intérieur ùe la cuve repré~t.·lIw Il~i concentrations (' (en ahbcÎsses) en fonction
de la Ilauleur r. La cour.bo pointillée en cloche repl'c!'tHnle le KI'3tiicnl de concent1'atiull (('11 A.hSClsge~)
en (onchon de r. LC9 ra) 0118 XaU el %s,0 ne 90nl pas lIÉ"Vlé9. L~ ra.\on l'mO~ o~l celUI Llui ~ul)llla plus
grande dé\'ullion. Le~ fu)'ons frappant la cuvo en1rt' f " , cl ,l', fot .c'"1 ol .L':! 9uhisscnt ùe-t déviatIOn! ùe
plUH en plus (81I,lc9. Ue9 cJihPOSllI(:li opllllut.'s ntlhb~nl CC~ Jt-\ tahon.. pour Jonnf~" une IIHUgO agrandie
de la courl,e en c1uche
(BOULANGER P. et POLONOVSKI J., 1959)
 37

Il sera possible par différents procédés (appareil

de photographie astigmatique par exemple qui permet de mesurer des
variations d'indice de réfraction) de suivre le plan où le gradient d'indice
dn/dx est maximal et d'obtenir un diagramme tel que: (Figure 11)
- en ordonnée y on ait une grandeur proportionnelle au gradient d'indice
dn/dx.
- en abscisse x la hauteur de la cuve à électrophorèse.

Fi gu re. Il,'': ['"",,,,,, d'lIn diaRra""',,, ""tl'l,,.hor~ti'l"e

«m"'''~'HJraJan' (l ""e Irolltlt,I'.

En ah:!lcIS:!Ir:!l, .r, hauteur .luu:!I la cu'"e. En ordon-

lIeC:!I,.'/, gralllll'illo propnrllOllillolltl .au ~rad Icnt d'indice
JCl'éfraclion. (BOULANGER P. et POLONOVSKI J., 1959)

Le déplacement du sommet de ces courbes nous donnera

la vitesse de déplacement de chaque frontière~x/(j t qui servira à calculer
la mobil i té
Note: pour des analyses en micro-électrophorèse,études sur quelques mg de
protéines, on utilise un interférométre utilisant la différence dans le
trajet de deux faisceaux lumineux pour produire des franges d'interférence
dont la densité, par millimétre, sera proportionnelle au gradient de concen-
tration.

- un bain de refroidissement
maintenu à une température telle que la densité du
tampon soit maximale (en règle général voisine de 1°C). Grace à la géométrie
de la cellule, le refroidissement s'effectue dans de bonnes conditions.
 •
38

Ce bain, introduit par TISELIUS, a permis d'obtenir des

résultats très précis.
Dans le paragraphe consacré aux précautions générales à
prendre lors dlune analyse par électrophorèse, nous avons vu que le passage
du courant électrique provoquait une, élévation de température. Cette hausse
de température au centre du tube provoque une différence de densité horizontale.
Un courant ascendant au milieu du tube et un courant descendant le long des
parois.ont lieu en 1 absence de refroidissement.
1

- un tampon :
permettant d'obtenir la séparation maximum.
Si le mélange nlest pas,comme dans notre exemp1e,un
composé de trois particules "idéales" mais, un mélange de protéïnes, il
pourra être judicieux de choisir le pH du tampon de telle sorte qu'il
ait une valeur intermédiaire entre le pHi de l'espèce que l'on souhaite séparer
et celui des autres protéïnes, les molécules de l'espèce à séparer migreront
alors en sens inverse des autres.

a - 3 erinçiQe_:
---------
Si lion applique, par l'intermédiaire des électrodes, un champ
électrique, aux bornes de la cellule de mesure. Au bout d'un certain temps
(1 heure par exemple), une séparation des constituants du mélange apparaît.

Si A, B, C sont des anions et si~A)}v&>I[,; on obtiendra la réparti-

tion suivante.

1 - état initial 2 - état final; après passage du

courant.
Figure 12 (BOULANGER P. et POLONOVSKI J., 1959]
 39

•
0 l
1 A

1.
'" 8 o
C

1 . 1
,, A

1. 1.
- A
- A.8
- A.8.C ,, 8
o
C
,;
1

1 ,1 1
1

+ J,' ùri bV:l~~,(l

1 CleS. ffor~ 1 (le~ :

r
C~ Ilce (l r('"6 ICi' ~

A A.8 A .8. C

- Jl

(EVEAREST M. 1 1916)

~':: ~(~)
cl x à cl x

c
1
fi
:1
E> /,

(\
. 1
1
1
: 1
,' i\..
/- 1 -,

Figure 13
 40

Sur ce schéma, il apparaît que seules la substance la

plus mobile et la moins mobile sont séparées. Des zones intennédiaires
apparaissent où sont présents des mélanges (B+C), (A+B) et entre ces deux
zones subsiste le mélange initial (A,B,C + T)

Selon le signe de leur charge, les molécules migreront vers le haut

dans l 'une des branches (branche ascendante - branche de gauche) et vers le
bas dans la seconde (branche descendante). La frontière ascendante (A- / T)
se meut dans le tampon pur. Dans l'autre branche, les molécules quittent le
tampon qui leur servait de solvant et fonnent la frontière descendante.

L'observation des frontières peut se faire directement si la par-

ticule est colorée (hémoglobine par exemple) ; en règle générale, il faut
avoir recours à un procédé optique. On obtient ainsi un électrophorégramme
nous donnant dn/dx (proportionnel à dC/dx : variation de la concentration)
en fonction de la situation de la frontière à l'intérieur du tube.

Une représentation schématique du cas étudié dans notre

exemple est présenté (Figure t3) , et un exemple obtenu lors d'une expérimen-
tation est donné ci-dessous.(Figure 14).

Alb. Alb.
Fi gu re"'''''';'i'l'I('
14 :: 0'011"'''''''' drd/'O'
IUr",,/o,,/ là gauchel
pl d'fll"l'Itdanl la th·oil .. ' d'uli
plasma normal humain dans
lm la""",n dr d,ahylbar/'ill<'
rate de lOdiuni. dl' I()rr~ IUIIÙlud
il, t li pli H,6.
La fronlièrfl 11 corre,poll,1 au
tilJl'lnugfolio !li'... prioi c\ 1.1"" KTY
('''Il.

(BOULANGER P. et POLONOVSKI J.
1959 J

Dans cette méthode, certaines anomalies apparaissent:

- la concentration des substances, calculée d'après le diagramme ci-contre,
ne correspond pas aux concentrations réelles.
- le déplacement de la frontière ascendante n'a pas la même valeur que celui
de la frontière descendante.
Il sera nécessaire de tenir compte de ces deux anomalies lors d'analyse de
hau te préci si on.
 ohé0riquement, les frontières ascendante et descendante
devraient être l'image l'une de l'autre. Ceci n'est jamais réalisé lors des
expérimentations.

Ci dessous, un exemple est donné, représentant les

différences.de vi tesse de mi grati on des fnonti ères ascendantes et descentantes.
Cette électrophorèse a été réalisée par L. G. LONGSWORTH en milieu tampon
aCétate de sodium 0,1 M à pH 3,93 et à diverses concentrations A d'une
protéine.
J ableau il 1- -: Va/eurs expérimenta/es du rapport des vitesses de migration
des frontières ascendante et descendante

-.
A vbc
% de protéine va- fJ -
~~.1

,.

0,64 1,09 .,
-i

1,36 1,18
2,74 1,33

(BOULANGER P. et PLONOVSKI J., 1959J

L'analyse des électrophorégrammes comprend:

- d'une part; la détermination des mobilités des éléments.
- d'autre part; la mesure de leur concentration relative.

- détermination de la mobilité d'une protéine pure.

Si tel est l'objectif que l'on s'est assigné, le calcul
s'effectuera d'après la vitesse Ax/ât de la frontière descendante. Les molé-
cules se déplacent alors dans un milieu' dont on connait la conductance
spécifique À ; c'est celle de la solution dialysée.
-+
On atteint la valeur du champ électrique E par la
.
mesure de l'intensité i du courant électrique circulant dans la cellule de
mesure. E et i sont reliés par:
 i
E =--- (YO 1ts . cm -1)
a t1

où a représente la section de la cuve en am 2

~ la conductance en ohm- 1 am- 1 .

La mobilité est donnée par la relation

E.At:

si la vitesse CA xl Ô t)est exprimée en cm.sec- 1 .

Pour les protéines, l •ordre de grandeur des mobilités,

dans un champ de 1 volt par centimètre est 10- 5 centimètre par seconde.

Tous les dispositifs nous permettant de suivre le déplacement des

frontière, pennettent, outre la détermination de la mobilité, celle de
la concentration de la protéine qui disparaît dans la frontière; clest
à dire celle qui en est responsable.

- détermination de la concentration.:
Si lion reprend le schéma suivant:
tempo"
'. C,

'. Cm
.::J.

0'.
~ C,
;:Jrolt:jO(!

La déviation y est proportionnelle au qradient d'indice

dn/dx, à l'épaisseur e de la cuve et au trajet optique 1. La relation liant
tous ces paramètre est :

dn
y = e l ---
dx
 43

Alb. Alb.
Figure1,llOr,;liqlu
15 :OItJ/lra""". ;/""0'
tUconJanl (il gauchel
là th·oil.,! li',,,.
", lif'lIrf'Iuiant
plasma normal humain dans
IIR lanopon dr tI,;l/lyll>arhilrc'
ra~ d. sodiuno, d, forr. IOniqrc.
0,\ ,i pli lI,6.
La frolltlère ;l corrpsponrl ail
lil... nog~lIe 1<.I'a"r~. ALRERTY
("'11.
€

1. ,,' 1 •

11:1-
.
1~r.
il>
>- 9X
1 ~%

"

ll,ngrn",,,,,. représentant la row'flltration ,le /lr"téi,l, (/alill un sérum en /o'U'tlOn tit' It(i1aut,ur %
dlUIJI la ('uy~ ti'ëiet·tr0I"lOrtllf'.
EII 2', Ilamponl la co"cr'nlrali,," rsl lIulie. Y cst proporlion""1 il la concenlral,oll. 1.... ligne.
hOl,izolllales séJuuent Jt':t dUluaules respt'cliftl de chatlue constituant.

(BOULANGER P. et POLONOVSKI J., 1959)

Concentralioll 1Hobilité m
en 9 p. 100 cm' cm" uoll-' sec- 1 " lOi

Albumine -t,U--t,5 -;",H

Globuline IX. 0,2-0,:3 -- ;),1
Globuline IX, 0,.1- 0';) -- 1,1
Globuline ~ 0,1) -- U,X ' - 2,N
Fibrino!!èn~ 0,3- - - 2,1
Globuline y 0,7 -- 1,2 ..- 1,0

(BOULANGER P. et POLONOVSKI J., 1959]

Tableau IV Concentrations et mobilités des divers ~constituants
du plasma humain
 44

,JI Entre les deux points xl et x2, la différence

d'indice a pour valeur:

1 "'1.-
n2 - n1 = -
e-.1 S
~i
y.dx

Si xl est situé en un point où la concentration de

la protéine est nulle et si x2 est dans une zone où cette concentration
ne varie plus (n2 - n1) est proportionnel à la concentration C de la
protéine. D'où

C
1
=---
A.e .1 S:: = _1__ . Y
A.e .1
Xi.

où A est une constante

y est l'intégrale de la surface comprise entre l'axe des abscisses
de 1a courbe en cloche représentant dn/dx en fonction du ni veau
des frontières dans la cuve.

En prenant comme exemple l'é1ectrophorégramme du

plasma sanguin, si l'onl,suppose que l'incrément d'indice de réfraction
(n solution - n solvant) / concentration est le même pour toutes
les protéines, le pourcentage d'un constituant s'obtient en divisant
la surface du pic par la surface totale de l'é1ectrophorégramme. (Figure 15)
Si l'on porte sur un graphique les intégrales
cumulées des surfaces à partir du point xl en fonction des abscisses
comptées elles aussi à partir de xl on obtient le diagramme ci-contre.
Le hauteurs de palier sont proportionnelles aux concentrations respec-
tives des constituants. (Figure 16)
On trouvera dans le tableau IV , les concentra-
tions et les mobilités des divers constituants du plasma humain (tampon
diéthy1barbiturate de sodium à pH=8,6).
 45

Le diagramme suivant représente les variations de

mobilités des différentes fractions du sérum humain séparées par électropho-
rèse en fonction du pH du tampon utilisé. Les expériences ont été réalisées
avec un tampon acétate ou phosphate de force ionique 0,1 .

.. z
0

-2
~ F-i a. l7 . ,Hobi/i/; <lu
)(
-t<:.../,/uanl. <l'lin I,/aoma
li -4 humain m la,"hon ./u
pli ("'''pr'.~TENK.. r.EN)
1"').
-6
(BOU LANGER P. u
-II
POLONùVSKI J., 1959)
4 8
pH
a - 5 En conclusion
=-=-=-=-=-=-=
Seuls les constituants les plus et les moins mobiles d'un mélange
peuvent être séparés par ce type d'électrophorèse. Il serait de toute
façon très délicat de les prélever sans créer de migrationd'autres substances.
Cette méthode ne sera pas utilisée à des fins préparatives.
Elle permet la détermination de la valeur absolue des mobilités
électrophorétiques.des différents composants. Elle sera de ce fait utili-
sée pri nci pal ementl'ors de recherches fondamental es concernant 1a charge
des particules; elle pourra pennettre de prévoir la stabilité de suspensions
collo;dales~ et, en corollaire, l'identification de particules à 1 laide de
leur mobilité-dans un tampon de pH donné:
La détermination des points isoélectriques est également possible
par ce procédé.
Le temps d" exécuti on assez long, 1a mi se en 1

oEllvredélicate et l'appareillage important qù"elle nécessite font de

l'électrophorèse à frontière mobile une technique de moins en moins
employée.
 46

• 1

A
o L L 8 T o
C
,,
1
1

, ,
,
1

,""'.""I0Il l'

,
1
,, 1

, ~ A 8 ,
o L L A 8 C T , T <:)
,B C C :
. [
'. COlftlal.lt' 1

c
1
. - 1

o L L A 8 C T T
:,
T
<:)

1 1

(EVEAREST M., 1916)

a état initial; il est décrit dans le 1°) de la page 47

b état intermédiaire; il est décrit dans le 2°) de la page 47
c état final ; il est décrit dans le 3°) de la page 48

Figure 18
 47.

b) Isotachophorèse

b - 1 : --------
~rinçi~e
Nous étudierons la séparation d'espèces anioniques A-, B-, C
dans un tube capillaire situé entre un compartiment anodique et un
canpartiment cathodique. Pour la séparation d'espèces anioniques ; le
tube capillaire et le canpartiment anodique seront remplit avec "un
électrolyte meneur" L ; dont l'anion devra avoir une mobilité supérieure
à celles de toutes les espèces à séparer. Les cations de l 'électrol~te
meneur devront avoir un pouvoir tampon suffisant au pH où l'analyse est
à effectuer. Le canpartiment cathodique devra être rempli avec un électro-
l~te terminal T dont l'anion aura une mobilité ~T inférieure à celle de

toutes les espèces présentes.

1°) l'échantillon sera introduit avec précaution entre les
électrolytes L et T en évitant tout mêlange par exemple avec une micro-
seringue. (figure H3 - a).
Nous aurons un gradient de mobilité tel que
~L > ~A- > ~B- > ~C- > ~T-

2°) Si nous imposons un courant électrique dans le système, un

champ électrique apparaît à travers celui-ci et chacun des ions migrera
avec une vitesse qui est fonction de sa mobilité. Derrière l'anion meneur
on trouvera l'anion le plus rapide, tandis ques le plus lent sera devant
l'électrolyte terminal. En début de séparation, on se retrouvera dans une
situation analogue à celle obtenue en électrophorèse libre (figure ~e, - b).
Dans les zones intermédiaires, les espèces ioniques sont arrangées dans
l'ordre de leurs mobilités effectives décroissantes.
Les espèces anioniques de L ne pourront jamais être dépacées, et
delles de T seront les dernières.
La zone d 'échanti 11 ons sera toujours canpri se entre ces deux zones.

3°) Lorsque la séparation est complète, après un certain temps,

des zones apparaissent ne contenant chacune qu'une seule espèce anioni-
que dans l'ordre des mobilités décroissantes (figure 18 - c).
 48

Après cette étape, un état stationnaire est atteint et tous les

anions se déplacent à la même vitesse. Pour assurer la continuité élec-
trique les espèces restent très près l'une de l'autre.

-
vL \ = -
Ce déplacement à vitesse constante de tous les ions implique que
vA- =
~-
IvB =
--0>_
vC
III ÊL = IlA- ÊA- = "IlB-oÊB- = IlC- Êc- = IlT
'0 0
=
~

vT
0 rT
C'est l'équation caractéristique d'une séparation par isotacho-
phorèse.
Entre chaque zone:; existera un gradient de champ électrique
qui sera fonction de la différence de mobilité effective des ions voisins.

~ ..
Si l'on travaille avec une densité de courant constante, le
produit E l (qui peut mesurer la variation de chaleur) variera d'une
zone à l'autre. Les ChOOlpS électriques et les températures en fonction
des zones sont représentées sur la figure ci-contre ainsi que les variations
du potentiel.
Cette différence de gradient de potentiel induit deux caractéris- li

tiques importantes de l'isotachophorèse

- ~a~tQ-so~r~c~iQrl~d~ frQn~i~r~ :
Au contraire des autres méthodes où la netteté des frontières est at-
teinte par la diffusion ou l'adsorption ; dans cette méthode le gradient
de champ électrique empèche ces phénomènes.
Si un ion passe dans une zone où règne un champ électrique plus important,
il va acquérir une plus grande vitesse et ainsi réintégrer sa zone. Si il
diffuse dans la zone précédant la sienne, où le champ électrique est plus
faible, sa vitesse diminuera et "il rattrapera sa propre zone.
- leJ}!:a~i~n~ <.!e_t~T1eé!:a~u~e

Par un détecteu~ thermique les différentes zones pouront ainsi être détectées.

b- 2 ~i~eg~~~~f=~~e~!:i~~~~~!.
- tube capillaire en verre ou en téflon, thermorégulé
o de diamètre oompris entre 0,4 et 0,6 mm.
o de longueur comprise entre 20 et 100 an selon les différences
de mobilité des constituants.
 4i

• 1
- 1
1

L _ :
r.
L A B C
.
T :
. ,
i
T
o
1 1
/

~.I

Figu:r.e 19 a - état final obtenu après une analyse par isotachopr.èse.

Représentations graphiques :(X représente la position de l'élément)
b - du potentiel V
c - du champ électrique E au stade terminal de l'analyse
d - de la température T
(EVEAREST M., 1916)
 50

- les deux compartiments à électrodes sont séparés du tube

capillaire par deux membranes semi-perméables.
~ intensité constante ~ 70 ~A

- potentiel : il varie entre 20 et 20 KV

- détecteurs :
o thermométrique; universel mais de preclslon moyenne

o dont le principe se fonde sur la mesure de conductivité, du

potentiel ou de l'absorption UV ; de mise en œuvre délicate

et souvent spécifique d'une expérience donnée.
- prise d'essais: de 1 à 5 ~l.

b- 3 çOQclu§iQn§.
~----------
L'analyse peut être qualitative ou quantitative. Dans ce dernier
cas, il existeunerelatiDn linéaire entre la longueur de la zone et la
quantité de l'espèce ionique isolée. Il faudra de toute façon procéder à
un étalonnage avec toutes les espèces présentes dans l'échantillon.
Les applications de l 'isotachophorèse sont nombreuses aussi bien
pour les ions minéraux, que pour les ions organiques. Pour les protéïnes
il conviendra d'inclure des substances ampholytes qui, en augmentant
la conductivité de l'électrolyte, diminueront l'échauffement.

La figurel0de la page 51 représente un exemple d'isotachophorésramme.

 51

...

Figure 20 Isotachophoregrarrme obtenu après la séparation de quelques cations.

le solvant était du méthanol. et l'on a utilisé un détecteur thermique.
. + + + +
l = H+ (lon meneur) ; 2 = (CH3)4N ; 3 = NH 4 ; 4 = K ; 5 = Na ;
2
6 = Li+ ; 7 = Mn 2+ ; 8 = Cu 2+ ; 9 = Cd + (ion terminal).

hl = information qualitative ion tétramethyl-ammonium

h2 = Il i on ammonium
hl et h2 sont rapportées à la Iltempérature" de l'ion meneur
xl et x2 sont une mesure des quantités des ions concernés
T = température
t = temps.
(EVEAREST M., 1976)
 52

Généralités
=-=-=-=-=-=
:

Ce sont les méthodes d'électrophorèse les plus utilisées.

Elles sont applicables aussi bien à la séparation des macro-molécules chargées,
qu'à la séparation de petits ions organiques et minéraux. En électrophorèse
préparative, certaines d'entre elles permettront la préparation de constituants
purs.

ErinçiQe :
--------
Pour la description du principe, nous considérerons,
que la chambre de séparation est un tube de diamètre étroit, connecté à une
anode et à une cathode. Le signe distinctif, de l'électrophorèse de zone
en général d1ailleurs,sera que les compartiments anodiques, cathodiques et
la chambre de séparation, sont rempliS avec un électrolyte appelé électrolyte
de fond ou électrolyte support. C'est lui qui transportera le courant élec-
trique et, généralement, il aura un pouvoir tampon assez important.

L1échantillon, mélange d'espèces positives et négatives,

est introduit dans le système dans l'électrolyte support. En règle générale,
la concentration de l'électrolyte de-fond est grande par rapport à celle de
la pri~e d'essai à analyser. Cette concentration importante permet le maintient
d'un champ électrique constant, et son pouvoir tampon, un pH constant dans
le système.

Ces conditions feront que l'espèce à étudier, migrera

avec une vitesse constante. Les variations de pH et de gradient de potentiel
qu'elle induit étant négligeable.
Si les vitesses de migration des différentes espèces
sont suffisamment différentes.on obtiendra une bonne séparation, chaque
zone étant séparée par une bande contenant la solution tampon.

A titre d'exemple, nous étudierons la migration de

trois espéces anioniques A, B, C et d'une espèce cationique D. L'électrolyte
de fond comprendra une espèce anionique Q et une espèce cationique P.
 53

Un champ électrique est ensuite appliqué et, au bout

d'un temps t suffisant, (il sera fonction de la différence qulil existe
entre les 'vitesses de migration des différentes particules), on observe
la séparation des différentes espèces.

La figures 21 a et b représentent, schématiquement,

une telle expérience.
1 s

1 ~ 1
p-
'0
-0 -0 -0 -0
o
1 1

~
- ....
p-
0
-0 -,
,A' -.c- D-
p-

-0
0
1 1 ,,
,, .1,
1 1 1
: • 1c 1 ID
1 Il
1
1.
,
1

'.
1 ,.
Figure 21 SépaJta.ti.orr. Uec..:tJr..ophoJr..U<.que d ' e..6pèc.e6 a.rU.oYliquu A, B e-t c e:t
d'urr.e e6pèc.e c.atioYlique V paJl. Uec..:tJr..ophoJr..è6e de zorr.e. TOM le6
c.ompaJr.timen.:t6 -6orr.:t Jr..empw avec. l'Uec..:tJr..olyt:.e P+Q.-._
a - irr.jectiorr. de l'échantillorr.
b - t:.out:.e6 le6 e6pèc.e6 iorr.ique6 -6orr.:t -6épaJl.ée6 : le6 dM.t.a.rr.c.e6
lA' lB, le e-t lV pOuMOnt:. ê:tJc.e t.L.tU.L6ée6 poUJr.. la dUe!llrU.rr.a;ûorr.
du e6pèc.e6 iorr.iquu A, B, C e-t V.
(EVEAREST M., 1916)
Pour corriger l'influence de différents facteurs
(que nous aborderons un peu plus en détail dans le chapitre suivant),
on rapporte la longueur de migration des espèces étudiées à celle d'une
espèce ionique standard, nous permettant ainsi d'identifier ~es éléments.
On détermine ainsi une grandeur RF'
(espèce ionique)
RF =- - - - - - - -
(espèce standard)
 54

Dans notre exemple, les valeurs seront prises relatives

à l'espèce anionique C.

lB
et RF(B) =- - -
lC

Très souvent la détection est effectuée par une

méthode spécifique, colorant propre à révéler chaque groupe d'espéces.
Par exemple; rouge ponceau ouamidoschwartz pour les protéines, rouge
de ciba pour les lipoprotéines. Une information quantitative sera obtenue
par mesure de l'intensité de la couleur due à la réaction produite, tandis
qu'une information qualitative (identification) sera obtenue à partir
des distances de migration.

1l?) Avantages

Certains avantages présentés par ces méthodes, par

rapport à l'électrophorèse libre, sont à noter fTISELIUS et FLODIN)
- la séparation des différentes espèces est complète, dans chacune des zones
se trouve une espèce de vi tesse de mi grati on donnée. On n'a -plus·oàffa'ir-e,
comme en électrophorèse libre, à une simple séparation de frontière. Il
pourra être possible, par découpage des différentes zones, d'isoler les
différentes fractions. Elles pourront soit être mise en solution, soit
. conservées -stlr-~eU.jl"·!iUpport, séchées, en vue d'analyse ou comparaison ultérieures
- les anomalies de frontière n1interfèrent pas.
- l'appareillage nécessaire est en règle générale de mise en œuvre simple
et peu coOteux. (spécialement ,lorsque le tampon est fixé sur un support
solide).
- la quantité d'échantillon peut être très faible. o:J.nS le cas du ::;érUI1
~nn~uin, nuclnu~s aouttes suffis~nt.
 55

Les avantages que nous venons d'énumérer sont cependant

obtenus le plus souvent aux dépens de la précision des résultats obtenus
par l'électrophorèse libre, en particulier si l'on veut employer ces
méthodes pour déterminer des mobilités absolues ou des points isoé1ectriques.
Nous allons examiner les paramètres induits par le milieu anti-convection.

2°) Inconvénients

- ~~~2re~!2Œ_~~r_!~_~~ee2r~': elle freine la migration de certaines particules.

- ~1~r!f!!~r~~!2Œ~ ~llejoue un rôle important pour les macro-molécules en
particulier lors de l'électrophorèse sur gels. S'il s'agit par exemple de
gel d'amidon, les dimensions des pores sont de l'ordre de grandeur de celles
ces protéines. Du fait de l'agitation thermique, les chaines de pQ1ysaccharides
présentent une variation continue dans la dimension de leurs pores. Les
molécules de grandes dimensions trouvent, mais rarement, des pores qu'elles
peuvent traverser. Leur migration dans le gel est ainsi nettement ralentie.
- ~Y~~Qr~~iQŒ_g~_1:~1~~~t21~~: particulièrement sensible en électrophorèse
sur papier.
- S2~t~Œ~ __~!~~~tQQ~~Q~!g~~ :
faible dans le cas d'électrolytes forts (KC1 lM)
relativement important s'il s'agit d'électrolytes faibles. Un flux é1ectro-
osmotique important est constaté en particulier lors d'électrophorèses sur
papier ou sur gel d'agar-agar. Son origine réside dans les charges négatives
contractées par le support au contact de la solution. Son effet pourra être
évalué de la manière suivante: à coté de la particule chargée -r
,on placera
une particule de même poids mais, non chargée, et l'on retranchera son
déplacement à celui de la particule chargée. Le Dextran est employé pour les
protéInes, la dextrine pour l'albumine ; ils servent de substance indicatrice.

Si d est la distanoe observée de déplacement

de la particule chargée

où~ dO est le déplacement dû à l'é1ectroosmose (positif sn la particule

est chargée négativement).
de est le déplacement da à la migration é1ectrophorétique.
 58

- fi!~~~!:_~~_~Q!:~~Q~i~~ : il est imputabl e au trajet souvent tortueux que

les particules chargées sont obligées de parcourir au travers du support.
KUNKEL et TISELIUS (1951) ont proposé un schéma
permettant de tenir compte de ce phénomène. Les équations sont établies
pour des systèmes où l évaporation est nulle et l'adsorption négligeable.
1

En électrophorèse libre nous avons liB relations':

(4.1 )

où ~: mobilité
,~ : distance parcourue par la particule
~ longueur sur laquelle la différence de potentiel est appliquée
"t' temps
\1 :·tension appliquée
Une autre expression peut être donnée en introduisant
comme paramètres l lintensité du courant i et la conductance spécifJiQue du
tampon X .
_ A' S
V 1)
l'
eL" _
---J-::x,
f t
4

-15 L

et l équation (1) devient

1

-- •
.,t;

où S: est la surface de la veine liquide

Cette équation nlest pas applicable au trajet à

travers un support poreux et il faudra apporter une correction.
 La figure 22 représente le mécanisme de la mi-
gration ionique â travers un support poreux: papier filtre d'après KUNKEL
et TISEL lUS.

Figure 22 : Mécanisme
,
de la migration ionique.
1
: (RIBEIRO L.P., 1961)
I - - - d - - - . /!
o
1
,
1

Les relations suivantes vont nous ammener â la détermi-

nation du facteur de correction dû â la tortuosité.
On a évidewment :

i (f)
f)
l

cl = cL (
La distance parcourue en électrophorèse libre peut être tirée de l'équation (2)
1)

Jv
",cL =
x
En électrophorèse sur papier nous avons donc

cl': Ab -;..,
Sr ~

où Sr: est 1a secti on principale du papier.

•
}-~
(~')
L
J --
Sr x
 58

(:)
Si l'on procède de même avec l'équation (1) on obtient

où : (~): est le facteur de tortuosité.

Ce facteur correctif peut être atteint expérimentalement

par la mesure de la résistance du papier en appliquant la relation:

l' = V-R-V-r -x.."""""

où : \Ir: est le volume occupé par le tampon selon le trajet

Nous avons en effet :

R -- .A- . -l' ( 5)
X Sr
vr
vp :. J. / • Sr Sr = -l'
Substituée dans la relation (5)

R ::. -.A -~
X
Ce coefficient a été calculé pour différentes sortes
de papier lors de l'étude de la sérumalbumine humaine. Tampon véronal
pH = 8,8, force ionique = 0,1.
 59
Calcul du facteur de correction 1/1 pour 1

différent~s sortes de papier,

Papier ,u. (+) fcorr.

Munktell n D 20/150 ....... 4,01 ± 0,09 ,0,77 ± 0,03 6,78

Ford, pupier filtre ....... 3,21.:1:.0,12 0,70 ± 0,04 6,53
Schleicher et Schlill n' .. 13 2.34 ± 0,21 O,58.:!: 0,06 6,85
~

Tableau V (WUNDERLY Ch., 1956)

où : J'a est la mobilité observée ~Il'/sec/vol t/cm)

)JeGf'r est la mobilité corrigée Cf'11'/ sec/volt/cm)
En observant ce tableau, il apparaît que quelque
soit le papier employé, les mobilités sont égales. (après cor-
rection avec le facteur -ft )
Dans le tableau ci-dessous, plusieurs répétitions
ont été effectuées (papier MHNKTELL N~20 150) et comparées à des
résultats obtenus en veine liquide (DOLE 1964).

Expérience
1 A1b.m;·'I--fJ-' a_~_IO_b.,....UI_in_e_;_--,--_~
1 fI.18 J,86 3,96 3,15 1,45
2 .. :.1 &,53 5,04 1.09 3,06 1,24

:~I-,
3 .. ".62 5.32 3,77 2,84 1,12
4 .. 6,60 5,38 4,OJ 3,05 1,25 1

.~-,-~~.r.r~
.. ' " .
r~~

l
l'Moyen ne
Mnyenne li après DOLE {6fT
6,48
5,'94
-
..
5,15
5,07
3,97
4,08
3,02
2,83
1,27
1,02

Tabl eau VI (Wl.JNVERLY Ch., 195é)

Il existe une très bonne correlation entre les
deux familles de valeurso
 eo

- <!iffl;!~iQ~ : un des inconvénients majeur des méthodes de détection 1iées

à ce type d'électrophorèse est que la détection intervient après que la
séparation ait eu lieu. Il s'en suit, (pu fait des interventions nécessaires
colorations par exemple qui requièrentun certain temps) des phénomènes de
diffusion. Cette diffusion a lieu également au cours de l'analyse en fonction
du temps et au faire ~t àmesure que la migration a 1ieu .diminuant ainsi la
concentration relative des constituants.

Dès 1950 différents supports ont été proposés pour

effectuer de l'électrophorèse sur un support stabilisant l'électrolyte.
Il peut être du papier filtre (DURRUM, GREMER et TISELIUS, GRASSMAN et
HANNING en 1950), de l'acétate de cellulose (KaHN 1957), du gel d'agar-agar
(GRABAR et WILLIAM 1953, WIENNE 1959).

D'un emploi très simple ces supports sont couramment

utilisés.

Quel que soit la nature du support utilisé, la cuve

à électrophorèse comprend essentiellement au moins deux bacs contenant le
tampon et. une· électrode. L'anode et 1a cathode sont rel i ées à un générateur
de courant continu. Les extrémités du support poreux trempent dans la
solution dl'é1ectro1yte ou lui sont reliées par du papier filtre. L'ensemble
peut être recouvert d'un couvercle. Il faut également prévoir un circuit
de refroidissement du support poreux.

C couvercle am.·6vaporallon P chicane

E d6pOi de ("échantillon R "Ungé,am
M membrane

Figure 23 I.lectrophort....., rnembr.n. en "'.e'. d. oellulo•• ;

dlapo.'tlf ••p'rimenUI.

(jfAIJENC J., SA..JCI-IEZ V., 1980)

 CH

Se~aration à deux dimensions :

=---=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=

A coté de la séparation unidimensionnelle des substances

chargées, il faut aussi noter la séparation à deux dimensions.
Par commodité, nous inclurons dans ce groupe les systèmes
dans lesquels l'électrophorèse est associée à la chromatographie sur
papier (Certains auteurs, cependant, pensent que l'on ne peut pas dire que
cette méthode soit réellement à deux dimensions) ; elle est parfois appe11ée
lé1ectrochromatographie".

C~est DURRUM en 1950 qui a décrit cette méthode.

Les séparations étaient basées sur le fait que certaines substances,
tels les amino acides, migraient avec des mobilités effectives différentes
selon la valeur du pH. Ainsi, la séparation a lieu dans une direction
à un pH donné, puis, à une autre valeur de pH (avec une relation de mobilité
différente) dans une direction perpendiculaire à la première.

Sur la figure ci-contre est représenté un tel é1ectrophorégramme.:

DURRUM a eu la confirmation expérimentale que, pour de tels composés,
la séparation était meilleure à basse température.

MEAD en 1954 propose, après électrophorèse selon une

direction, de changer le pH du tampon en l'exposant à des vapeurs d'am-
moniaque. Cette méthode a été très utilisée pour la séparation des princi-
paux acides aminés; acides glutamique et aspartique, de la cystine, glycine,
alanine etc ... Il n'est cependant pas possible -de séparer la leucine de 1

l'iso1eucine.

SMITHIES et POULIK en 1958 ont décrit une intéressante

méthode à deux dimensions. E1ectrophorèse sur papier suivie, à angle droit
par une séparation sur gel d'amidon. En utilisant cette méthode, environ
20 composants peuvent être séparés dans le sérum humain. PEETERS et al .
(1959) ont étudié la distribution des ions sur le papier durant une séparation
à deux dimensions. Ils en ont conclu qu'il y avait une distribution caracté-
ristique des ions en fonction de la conductivité.
 62

L'association de l'électrophorèse avec la chromatographie

sur papier est également utilisée fréquemment spécialement pour la
séparation des acides et des bases aminées. Ces procédés donnent de bons
résultats.

Les différences fondamentales entre ces méthodes

viennent du fait que certaines sont discontinues et d'autres ne le
sont pas.
 83

Choix du sunoort :
=-=-=-=-=-=~~-~-~

Papier filtre: actuellement principalement pour

la séparation des petits ions qui nécessite un champ électrique élevé
Acétate de celJulose : très utilisé en analyse de
routine.
Gels: permettent une grande résolution.

~=~k=~kgMg~=g~=~Mggg~~ :
a) Electrophorèse sur papier

Le papier filtre (bande ou feuille d'environ 30 cm de longueur) est

plongé dans la solution tampon, puis, laissé au repos quelques minutes pour
éliminer le surplus.entre deux feuilles de papier absorbant.
La solution à analyser est déposée, à 1laide d'une micropipette, au
centre de la feuille. (10 à 400 mm 3 selon la nature de la solution et sa
concentration).
Ainsi préparée la feuille est déposée dans l'appareil à électrophorèse
et l'on établit le courant.
basse tension 100 à 200 volts pour les protéines.
Durée d'électrophorèse environ 12 à 20 heures.
La mise en évidence a lieu ensuite: il faut d'abord
dénaturer la protéine afin qu'elle reste fixée sur le support puis la mettre
en évidence par un colorant si celà nia pas été fait avant l'analyse. Elle
pourra être isolée puis dissoute dans un solvant approprié et enfin soumise
à une analyse photométrique. Il est également possible, après trempage de
la bande dans une solution convenable, de procéder directement sur celle-ci
à une lecture photométrique directe.
haute tension 1000 à 3000 volts: elle est utilisée
pour de petites molécules (acides aminés, peptides, ions minéraux ... )
 84

Exemple d'une électrophorèse à une dimension sur papier du

s6run hunai n

Figure 24 Electrophorêgramme d'un sérum ~umain : la séparation

est faite dans un tampon barbital de pH = 8,6 et de
force ionique = 0,06. Les protéines sont colorées
au bleu de bromophénol. (RIBEIRO L.P., 1961)

Figure 25 Diagramme obtenu à partir d'un électrophorégramme de

sérum humain normal, montrant les différentes surfaces
correspondant aux différentes fractions. (RIBEIRO L.P., 7967J

Fraction Area %

Albumin 57. 8 ?z.9

oc1-Globulin 1.4 4·9
oc,-Globulin 3·5 8.z
,B-Globulin 8.1 13.8
y-Globulin 11.5 19·9

Tableau où sont regroupées les valeurs obtenues

à partir du diagramme de la figure 25.

Tableau VII (RIBEIRO L.P., 1961 J

 15

Dans ce cas le refroidissement doit être très efficace.

La révélation est, là encore, fonctton de la substance. Par exemple:
révélation par la ninhydrine qui donne une coloration pourpre avec le
plupart des acides aminés et jaune avec la pro1ine et l'hydroxypropi1ine.

Pour les ions minéraux, il faudra quelque fois, lorsque

leur mobilités ioniques ne sont pas suffisamment différentes, avoir recours
à la comp1exation de l'un d'entre eux pour accroître l'écart.

Quelques exemples schématiques d'appareils utilisés en électrophorèse

sur napier à une dimension :

• a) le papier est disposé horizontalement

• · -------..·.. ·iif ·
b) 1e papier est relevé en son milieu. Ce
dispositif a permis a MACHEBOEUF et al.
en 1953 de découvrir que, dans un tel
b système, l'évaporation était minimale
au niveau de l'arête. Combinée avec
+ l'étude de 1'é1ectroosmose, à l'aide
de glucose, il a été déterminé une
ligne de flux nul vers le compartiment
cathodique. Quel que soit leur point de
• départ, les particules de glucose se
~
c regroupent sur cette ligne au bout de
~ ~
7 heures.
)C~ Le papier est disposé entre deux plaques
de verre pour éviter l'évaporation.
··
4 -
~) Le papier est disposé dans un liquide
hJIr·
--::.

f1 i'gu·ré 26 :
,=-

Dispositifs diven pour

réfrigérant: chlorobenzène ou tétra-
chlorure de carbone.
électrophorèse sur papier.

(MILAZZO G., 1969)

Pour ces deux derniers systèmes il est possible d'employer des courants
pouvant atteindre 500 mA. Utilisation possible d'électrolytes forts 10 Msous
200 volts (dispositifs à basse tension) ou bien des électrolytes faibles
sousl1de hautes tensi ons.
 61

Sur les trois pages suivantes sont ~ésentés des

schémas d'appareils pour analyse à deux dimensions.

Pour ces analyses, on retrouve les mêmes types d'ap-

pareils que pour les études à une dimension. (Figures 27)

figure (a) : le papier est disposé horizontalement

figure (b) le papier:"est relevé

figure (c) le papier est supporté par un plateau.

 61

·é~
b
-- ~ ,'

~_·
~.,- - -, - - ' - -_.
rr..,--....

c
--------;/
--~-~--._------//

(RIBEIRO L. P., 7967 J

Figure 27 - a Différentes étapes de la mise en

place de l'appareillage en vue
d'une électrophorèse à deux dimensions
avec un appareil où le papier est
disposé horizontalement.
 68

[RIBEIRO L. P., 1961)

Fi gure 27 - b Différentes étapes de l a mi se en œuvre

de l'appareillage en vue d'une électro-
phorèse ~Jr papier à deux dimensions.
Le papier est ici relevé en son milieu.
 69

<~ "'l!f)
•.•••••.••.

(R,lBEIR,O L. P. , 1961
)
Fi gure 27 _c D iff ér en te s ét ap es de
1a mi se en pl ace
d' un di sp os iti f d' él ec
tro ph or ès e à
deux dimension. Le pa
pier es t ic i disposé
sur un pl at ea u.
a - 2 ~!~~~~~~_~1=~~~gBX~~~~B~~=:
Avantages ; ce type de support permet
- l'utilisation de champs électriques élevés.
- la stabilisation des constituants
- une grande simpiliicité dans la mise en oeuvre et une
rapidité d'exécution de l'analyse
Inconvénients ;
- l'importance du phénomène électroosmotique dû à la
charge électrique du papier
- l'adsorption spécifique de certains composés protéiques
par exemple.

a - 3 Conclusion
=-=-=-=-=-=
:
Ce milieu anticonvection a été largement utilisé pour
l'analyse des protéïnes dans un but clinique. Il reste utilisé
pour des analyses de routine en sciences du sol~
 71

b) Electrophorèse sur memèrane d'acétate de cellulose

b - 1

Les montages expérimentaux sont très simples. Ils sont

identiques à ceux utilisés en électrophorèse horizontale.
Un exemple est présenté ci-dessous :.

Figure 28 Schéma de l'appareil d'électrophorèse sur

mem~rane de SHANDON.
A - Bande de papier
B - Tampon
C - Supports de la membrane
D - Membrane
E - El ectrodes
F - Supports de la membrane
G - Il Eponge ll •
(RIBEIRO L.P., 1961 d'~p~~ KOHN J.]

- La prise d'essais dépendra du type d'appareillage et

sera comprise entre 0,1 et 5,Utg.
1
Le dépot peut avoir lieu: au centre, ou à proximité
d'une des ~trémités de la membrane.
- durée : de quelques minutes à plusieur heures.
- révélation des espèces par coloration spécifique
- analyse quantitative par densimétrie ; après que la
membrane ait été rendue transparente (méthanol~acide acétique-
diacétone-alcool).
 72

L'exemple ci-dessous représente un électrophorégramme

obtenu sur membrane en acétate de cellulose.

l 1r

1
1
1

i
li ---

.
1

1
H =Iilll=
5 4 J 2 ,

-------r
1

d
<1i1
m.mbr.ne .cétata de CIlUulo5IJ 6 llo 14 cm
'iJmpon berbllal· T... s (pH 8.f), lo,cl;I Ionique 0,076)
co/ollmt 10uge ponceau
'ell1iJS Ut] IJUprtH101l :'5 mm iii 200 V
~ù/lJfnd d dCtl.JllfIIlofl 1.5 Ililll l
l
i pl"',),ICJn 2lh.
1 albumine \j 'T"t globuline.
2 a globuline
~} .'rum bOVin
1 allJumlne
2 a 1 globuline
3 Q 2 globuline
4 lS glolJullna
5 y globuhne
l.Q, •• rum humain pr'••ntant un. "t pl••mocYtoma

d dlilancs
/ Inlen&nl§ de la COlo,allon
1 6lecErcphor'gremme
U IKlur. Da l'lnlunlné de CeNOriliOn
[MANENC J., SANCHEZ V., 7980)
Figure 29 - llectrophor'......, membrane en .06ta1. de .111'10•• ;
.6par.tion d•• proUln•• d• •6rum.w

b - ~

Avantages (par rapport au papier)

- le support est chimiquement pur ; il y a peu de contaminants
pour les protéines.
abscence, presque totale, de phénomènes d'absorption.
pouvoir de résolution meilleur : les bandes sont très nettes
et le temps d'analyse est plus court. Ceci est dû à une porosité
plus uniforme.
meilleure reproductibilité des résultats.
dissolution totale dans les solvants si analyse par élution.
transparence totale lors d'analyse par densitométrie .directe.
 73

lEnconvénients :
- faible résolution par rapport à d'autres techniques (électro-
phorèse sur gel par exemple). Dans le sér~~ humain, on dénombre
* 5 zones sur acétate de cellulose
*fS ZOD.J3S sur gel
- phénomène de diffusion important.

b - ~ : Conclusions
=-=-=-=-:-=
:

Cette technique est simple et facilement utilisable en

anal~se de routine; elle peut être automatisée.
Pour zemédier à son manque de résolution, il est possible
de l'associer à une séparation à deux dimensions:
- électrochromatographie
- électrophorèse bi-dimensio~~elle.
Les applications de l'électrophorèse sur acétate de cel-
lulose sont nombreuses en biochimie.

Les gels actuellement utilisés sont au nombre

de trois. Ils ont préparés extemporanément et coulés sur un
support.

- gel d'agar-agar (gélose) utilisé principalement lors d'analyse

immuno-électrophorétique.

- gel d'amidon et gel de polyacrylamide utilisé pour la

séparation des substances biochimiques si une résolution
très importante est souhaitée.

Avec chacun, il sera possible d'effectuer:

- une électrophorèse sur couche mince (gel déposé sur une plaque)
de mise en oeuvre délicate mais permettant l'analyse de très
petites quantités d'échantillon.
 74

- une électrophorèse en tube : plus facilement utilisable au

niveau d'un laboratoire d'anal~se

a) Analyse immuno-électrophorétique

a - 1 Généralités
=-=-=-=-=-=
:
GRABAR et WILLIMJ~ (1953) ont proposé une méthode combinant
- l'électrophorèse (en milieu gélosé : gel d'agar-agar à 1 %,
coulé à chaud sur plaque de verre et qui Rrésente l'avantage
de ne pas provoquer d'inter-action avec les protéines), dans
une direction.
- l'analyse immuno-chimique par diffusion.

C'est un per~ectionnement apporté par rapport aux autres

méthodes car, elle va permettre :
- l'identification de constituants différents ayant la même
mobilité.
- la mise en évidence de constituants très peu abondants.

a - 2
L'immuno-sérum (anti-sérum humain normal) est obtenu
en infectant à un animal la fraction protéique à étudier. Il
réagit en fabriquant des anti-corps. A chaque élément du mélange
de protéines correspond ~ anti-corps qui réagit avec lui
de façon spécifique.
On effectue tout d'abord une électrophorèse du mélange de
protéines; on obtient ainsi, au bout d'un certain temps, une
sŒparation des constituants selon un axe Ox·
Dans une gouttière latérale creusée parallèlement à la
direction de migration, est déposé l'antisérum (mélange d'anti-
corps).

Après double diffusion durant quelques heures à quelques

jo~rs, on obtient, au niveau des points de rencontres, une série
 75

de fines lignes de précipités dues à la formation de comp~exes

antigènes-antico~ps. Ces lignes ont le plus souvent la forme d'un
arc d'ellipse. "A chaque protéïne du mélange correspond ~ ligne
et une seule".

La figure ci-dessous représente schématiquement un tel

phénomène.

sérum
@
anti A, anti B
-
.~~
~
~
sérum
CD
~
~B~
d ~
/'~

anti B ®
Fi gu re 30 - Prlllâpe de l'analyse ImmulIOéieclropllOrél"lue cle GRAUAIl ct W'LL'A"S

EII 1 : électrophorèse en m.lieu gélifié d'un mélange de deux protéines A et B. Les hachures I1gurellt
l'emplaccment des protémes à la fin de l'expétlellce. d = gouttière de départ.
Era :! : Lorsque l'êleCltOphorès8 est terminée, on place en :2 un unmun::iérum tl'anunal antiprotéine
A et allt.protéllla B.
En 3 : on place en 3 un .mmunsérum d'animal antiprotéine B.
Apre. une diffuslOn de quelt(ua. JUU", la précipiultiou antigène-anticorps se tradu.t par l'apparition
<le tra,t. blancs à l'IIltétleur du m.lieu gélifié.

(BOULANGER P. et POLONOVSKI J., 1959)

Il est possible, lorsque la diffusion a eu lieu, d'ajouter

des colorants qui vont faciliter la caractérisation des dif-
férentes protéïnes.

a - ~

~- .AI b. ..., ~ ._ ... _...... :y • . ~

1 l i t 1
1 ,...------ .. cx.I--· I . . - - . . . . . ~- ~z._ ., 1

r";"" .: 1 p l i
: ~_ .. j__ .. J;:~~~- 1 1 1
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Fl.t :.pl
-:.\~.~'6
1
.....::;;;,;.:....<é:.~::::~::;:;:;:. ::::::~:5~.=;;:::;:,..:.:::.::;;;;;;;;;;;:==:;;;;
i 1 1 1 1
•..-
1
0,01 ml'
7 6 5 '+ 3 2 0
5
c m'l vol t 1 sec x 10-

Fi gu re 31 - Analyse iIllIllWLO'él"t'lropllOrét"lue d'ull suwn hUlllain ILOrmal.

E,. haut: 0,04 ml de sérum humain; cn ba. : 0,01 1111 du m';me ,érum. Le dé"eloppement a ét.; fait
avec un sérum de cheval (nO 2ll2) alltl-.érum hUllldl1l no,·mal. ElectropllO"èse en gel de gélose à 1,5
p.100, tampon véronal pH 8,2; 1'/2 = 0,03; ellviron ~ "'em; 4 heures. Coloration, aprés séchage, par
'aza-carmin.
(Cliché dû à l'obligeance du Pr P. GIIA"ARi.
(BOULANGER P. et POLONGVSKI J., 1959)

16 à 18 composants peuvent être identifiés dans l'ordre de leur

mobilité décroissante
 78

a - 4 Conclusion
=-=-=-=-=-=

Cette méthode utilise

- la grande spécificité des réactions immunochimiques
- le pouvoir de nésolution.. important de l'électrophorèse.
C'est donc une métliDde d'analyse qualitative extrèmement
fine permettant de révéler des éléments à l'état de trace.
Elle a permis la caractérisation de nombreuses protéines
plasmatiques.
Elle ne permet pas d'analyse quentitative.

b) Electrophorèse sur gel d'amidon

b - 1 Mise en oeuvre :
=-=-=-=-=-=-=-=
Technique décrite par S~ITHIES (1955).
On chauffe de l'amidon partiellement hydrolysé dans un
tampon approprié jusqu'à obtention d'une solution visqueuse,
que l'on coule dans un support (plaque de verre ou membrane)
sur une épaisseur de 1 mm. Par refroidissement, on obtient la
consistance d'un gel.

L'appareillage est très voisin de celui utilisé avec

les membranes en ~cétate de cellulose.

Conditions opératoires:
volume de l'échantillon: 0,1 à ) cm) , inséré dans une fente
pratiquée dans le gel.
- champ électrique: 5 à 6 V/cm
- durée de la séparation quelques heures
- force ionique du t&ilpOn 0,01 <~. <
0,0)
- le tampon qui sature le gel peut être le même que celui au
contact des électrodes ou bien être différent.
- diamètre des pores: diamètre des protéines si l'on ne souhaite
pas faire de "tri" en fonction de leurs tailles.

'Lorsque la séparation est terminée, on coupe le gel en

bandes dans le sens de le longueur

Pour chacune des bandes obtenues : les zones sont révélées

puis, on procède au dosage (élution ou densitométrie).
 77

Un exemple d'électrophorégramme est présenté ci-dessous

10 9 8 "'---7-- 6 5 11 3 3

en gel d amodon

1 p<éaltlum_. 8 tI.n~f .......ne

2 .lbum.... 7 "ap.oglol>tn.,. 2 2
3 postl'buml"es 8 bé(.-hpop'01~tn.
.4 Gccom........' 9 alpha 2 me..'fGg6obuh 11 e
5 ~fnOlIiobln. 10 hlptoglobltu . 1 1 et (t·,u~.am.ne

Figure 32 - . ..._ .___ _ (SA Ne HEV.

EIKt,opho". d'un . _ - Z et MANE"Ne J • , 1980)
La séparation àes constituants du sénurn permet d'obtenir 20 bandes
b 2 : Conclusion
~
=-=-=-=-=-=
Technique peututilisée en raison des diffic Ités rencon-
trées lors de l'élaboration du gel d'amidon.

c) Electrophorèse sur gel de polyacrllamide

c - 1 Généralités
=-=-=-=-=-=
:
Cette technique a été décrite par RAYMOND et WEINTRAUB
dès 1959. Une étude théorique en a été faite par ORNBTEIN en
1964.
C'est actuellement la technique la plus employée et
la plus fine en électrophorèse sur support.

c - 2 : Mise en oeuvre :
=-=-=-=-=-=-=-=

Etant la technique la plus utilisée, elœe sera décrite

un peu plus en détail.
- le gel: c'est un mélEl-nge d'acrylamide monomère et d'un
monomère divalent : la N N' méthylène bisacrylamide. La
polymérisation est induite par photochimie ou par adjonction
de peroxydes.
Le gel sera préparé
- soit directement dans la solution tampon
- soit dans de l'eau; la solution tampon pénétrant ensuite le
gel par diffusion.
 78

Deux paramètres influent sur la préparation

- la ·concentration T du gel

où a masse d' acrylamide

b masse de N N' méthylène bisacryla~ide

{1\ maf;se totale

et 3 % <T <30 >G
~ ~
gel mou gel dur

La concentration aura une influence sur les propriétés mécaniques

et sur la porosité
- le degré de réticulation R

b x. -{oo

Influe sur la taille des pores; donc sur l'effet de tamis du

gel.
Si R passe de 0 à S % ; la taille des pores diminue d'environ
as %. En général elle sera de SQ~.

'techniques :

- ~!~~~E~E~~E~~~_~~E_~~~~~~_~~~~~
Le protocoilie est le même que pour le gel d'amidon.

ct- . ~
-
--f--{
-' +-'-=.
-R
1
G- -

_,1
1

U
1
:-t
}-~- R
f-
Cf 1

...
CE camp.mm.1Tft d"61ectTodes G tubes de gel
E "'pOl CIe r6chllnllllon If f'fngé'an~

Fi gu re 33 - ,._.op.....,......::::rtd.:::.f.poly.oryl.mld.:d.•po.ltlf

(SANCHEZ V. et MANENC J., 1980)

 79

Conditions opératoires :
le gel, saturé de solution tampon rempl; t les tubes verticaux G
- les compartiments CE contiennent une solution de même pH.
l'échantillonE est déposé à une extrémité des petits tubes G.
le contact électriqu~ est assuré par G
intensité : 4 mA par colonne
durée de la séparation: 1 heure.

Lor8~ue l'on applique le champ électri~ue, les consti~

tuants se séparent sous forme de disques parallèles superposés
(d'où le nom de "disc electrophoresis" donné par les anglais à
cette méthode).
A la fin de l'opération (que l'on peut visualiser à
l'aide d'un produit coloré ajouté comme traceur) ; le gel
est sorti du tube, révélé par des colorants appropriés dont
on éliminera éventaellement ~excès_ En règle générale, cependant,
la po~yacrilamide ne donne aucune réaction avec les colorants
le gel reste ainsi transparent. La lecture par densitométrie
est aisée.

Ci-dessous ; un exemple d'électrophorégramme de

sérum humain obtenu par cette technique.

boudm ln gll dl polyac:lyllmldl • 7,.

lImpon' glycln. pH 8.3 d.ns ... compaltlmentl d'.ltCtlod••
Tn.-Hel pH 8,9 d.na 10 gol
~olum. d·~~h.ntJllon:3 ~I
inr.nlll~ du COuf,nl:2 • 6 mA par tube de gel
'.mpJ rh mlp,,,,on' 1/2 h • 1 h 'lion l'inlenlll'
r;oJol.nr: ImldO&Cl'lwaIU
Pour ~Iul de d'lllll. co"sull., [1 b. 18 Il 19]
l "eclropho"Qlamme
11 lecCul' da l'lnl1nlU6 d. co'or.uoo
d ch&l.nce
J mllnin' d. COIOI.llon
le m,n,f lu' la gluc:he dl la hgur. conespond • un In-
lenlble d'haptoglobln..

F,. 9u re 34 - aleavophar'" de Ion. aur gll d. poly.crylamlde: ,'p.,a'ion

d•• prot'.n•• du .'ru... humain. (SANCHEZ V. et MAN 'e J.,
1980)

c - J : ~y~g~~~~~ :
bonne résistance mécanique
porosité reproductible
pas de phénomène d'absorption ou d'électroosmose
peu de diffusion
stabilisation hydrodynamique excellente
 8Q

- très large éventail de solutions tampons utilisables

- prise d'essai très faible (0,1 ~g)
/
- transparBBce naturelle.

c - 4 Conclusions :
=-=-=-=-=-=
e'est une technique rapide, précise, sensible, repro-
ductible. Elle peut @tre employée. en recherche fondamentale.

Le choix de la porosité
- porosité constante et définie
- gradient de porosité
en fonction du type d'analyse permet une séparation associant

- la charges des macro-molécules (vitesse de migration)

- la taille des macro-molécules (filtration).

Il est également à noter que si l'électrophorèse sur

gel est réalisée en présence d'urée ou de dodécylsulfate de
sodium, la migration des protéines sera proportionnelle à
leur poids moléculaire.
 81

B) ELECTROFOCALISATlON

1 - Généra 1i tés
-----------
C'est SVENSSON en 1961 qui a introduit cette technique. Elle a
été ensuite développée par VERSTERBERG en 1969.
Elle est principalement utilisée pour la séparation des macro-
molécules amphotères.

2 - ~!:i!:!~ie,~
Cette méthode permet la séparation des protéïnes en fonction de
leur point isoélectrique; elle utilise un gradient de pH souvent cornbi-
né à un gradient de densité.
Le principe de base de 1 'isofocalisation (autre dénomination de
l'électrofocalisation) est que dans lat,chambre de séparation, le pH
varie d'une extrémité à l'autre. Le pH le plus bas vers l'anode et le
plus élevé vers la cathode. Quand un mélange d'ampholytes est introduit
dans un tel mi 1 ieu ; chacune des substances va acquérir une charge nette,
1

en fonction de son pHi propre, positive ou négative selon le pH de la

zone d'introduction. Par exemple, si l'on introduit une protéïne à un
pH supérieur à son pHi, elle gcquièrera une charge négative. Si un champ
électrique est appliqué, elle migrera vers l'anode jusqu'à la zone de
son pHi. Sa charge est alors nulle et sa vitesse tend vers zéro.

La figure de la page suivante représente la séparation de

trois substances dont les pHi sont 4, 6 et 8 respectivement pour
A, B et C. Elles sont introduites à)pH= 6
A possède une charge < 0, ; pH int .> pHi A la substance A migrera vers l'anode
jusqu'à ce qu'elle atteigne la .
zone de pH = 4.
B possède une cha~ge nette = 0 il n'y aura pas de migration.
. C possède une charge nette> 0 pH.ln.
t < pHi B ; la substance C migrera vers
la cathode, jusqu'à ce qu'elle
atteigne la zone de pH = 8.
 S

• 1 !
::;:,:.;;:.:
1
82

e
f~~fl 0

1 /. • C"- 1

pH INc"aAS,liO

~
1 1

e . c
, "
0

1 1

5 6 7 8

/iii 'NCII.AS/NQ

Figure 35 - Séparation de substances amphiprotoniques A"; B et C avec des valeurs

de pl respectivement égales à 4, 6 et 8 par isofocalisation.
a - introduction du tampon (s = position d'introduction).
b - séparation des espèces A, B et C. (EVEAREST M., 1961]

Par isofocalisation, les. constituants du mélange se trouveront

séparés, sous réserve qu'ils aient des points isoélectriques différents.
Chaque espèce se concentreradans une zone étroite; des différences de
0,02 unité pH permettent la séparation !

3 - ~~~!i~2EiQŒ_~r2!ig~~
L'analyse peut s'effectuer sur support en couche mince ou en
colonne en phase liquide.
a) sur support :
La mi se en œuvre est 1a même qu'en él ectrophorèse de zone sur
gel de polyacrylamide. On ajoute à ce support une solution d'électrolyte
permettant un gradient de pH.
A la fin de l'expérimentation, les protéïnes sont révélées par
coloration et le pH relevé. Le ternps de l'expérience sera plus court
qu'avec une colonne.

b) sur colonne
Conditions opératoires
- la colonne est entourée d'une IIjaquette ll permettant le réglage
de la température pendant l'expérience. La colonne est remplie de l'élec-
 83

tro1yte dans lequel est établi un gradient de pH et de densité.

- L'échantillon peut être déposé à un endroit quelconque de la
colonne. La position finale sera indépendante de la position de départ.
- L'utilisation de saccharose glycéro1 etc ... permet la création
d'un gradient de densité
- La durée de 1 'expé~imentation nécessite 24 à 72 heures.
-La tension estde 200 à 1200 volts sous 10 mA.
Lorsque l'expérimentation est terminée, la colonne est vidée par
le tube capillaire et l'on mesure le pH et la concentration des différentes
espèces recueillies par colorimétrie.

c) conditions diverses.

- ~~~g14~~;~M~~g~~·
Poun"créer un gradient de pH dans l'électrolyte, on mélange un
nombre important de substances amphotères ayant des pHi très voisins. Dans
un champ électrique continu, entre un compartiment anodique acide et un com-
partiment cathodique basique, il en résultera la formation d'un gradient de
pH.
Les ampholytes supports utilisés sont un mélange diacides po1y-
carboxyliques et de polyamides, la répartition des groupes aminés, dans la
molécule, et des groupes carboxyliques définit le pHi.
Deux groupes exi stent :.
o à large gamme : 7 unités de pH par exemple

o à gamme étroite : 2 unités de pH (6 - 8 par exemple)

Elle est évitée:

- en n'introduisant qu'un faible volume d'échantillon: de 0,1 à lOrl.
- en augmentant la solubil ité des proté'ines
o soit par une concentration plus élevée des ampholytes supports
o soit en ajoutant de llurée.
 84

61ect.rode .up4l...t.u....
d) Schéma d'une colonne

jeauet.t.e pour
"'IUI.tion t.h.rataue

61ect.rode lnf6rleur.
~....- - et. ••nn.

Figure 36 - - Il.pri••nt..t.i_ oi",,11fi'.

d-une colonna pour 'lectrofocali..tion

(SANCHEZ V. e:t A~ANENC J.,

19tO)
e) Exemple de séparation obtenue

gel d. polYlICryJdtnui. dlit 10 cm da long

I.mp. d. mrgl.uon: 9 h li 120 V
gradient de pH (pH 3 li 10) ,'.lIa' li f.llde d'un.
'Diu lion d'.mpholYtes li 2 ".
CO/OI.nt: bleu de coomUSI.
~Qlum. d. f4ch.nti/lon: qu.lqu.. mterohu••
POUf plus d. d'rlill. conlull., 1. "",onci (1. L 411

Fi gu re 37 -
tl.......fo...U••tlo.. , . , _••Ion dao ••_ do 1.
L-amlnoaddeo.,d... prov....nt - ....... COUMÛ aur pt I ..., .

1
au'.'•.
4 - Conclusion
(SANCHEZ V. et MANENC J.)
C'est une méthode très fine pour la séparation de constituants
ayant des pHi très proches.
Après élimination des ampholytes supports (par dialyse par
exemple) elle permet d'obtenir des produits purs.

VI - ELECTROPHORESE PREPARATIVE

1 - Général ités
-----------
Seules : l'électrophorèse de zone sur support et l'électrofocali-
sation, parmi les méthodes déjà décrites, permettent la préparation de
constituants purs.
 85

- En reglme continu: il suffira d'augmenter les dimensions

des appareils utilisés dans des proportions convenables.
- En régime discontinu: pour récupérer quelques grammes de
produit pur; on fera s ' écou1er le liquide sous forme d'un filet sur
un support poreux ou en phase liquide.

De 1'é1ectrodécantation et de 1'é1ectroconvection qui sont

davantage des procédés industriels, nous ne verrons que brièvement
le principe.

a) Régime continu

C'est GRASSMANN et HANNIE qui ont proposé cette technique

(1950), basée sur des travaux de SUENSSON (1949). Elle est depuis, largement
ut-i1isée.
On impose une tension électrique à une feu·ille de papier
(ou autre milieu poreux) perpendiculairement au sens d 'écou1ement de
l'é1ectroVyte.
Le mélange à étudier est introduit en un filet continu
et 1Ion récupère les échantillons au bas du support dans des collecteurs
de fractions.

Dans l'exemple ci-dessous, un dispositif expérimental,

est représenté schér,latiquenent.

T solution tampon
E champ électrique
appliqué perpen-
di cu 1ai ranent à
la direction
dl écou 1ement du
liquide.

P . p01n1 d'lnJec.tlon au mélange A +. S·, c·

S IUPPI)"
- . .em. de Ucoulemlnl
1
F; gu re 38 - lIKtrophor'•• pr'p.r.tlv. an HouA.ment nappe cantJnu.

(SANCHEZ V. et MANENC J., 1980)

 86

FllTER PAPER CUFHArN

COllECTING TUBES • ELECTRODE VESSEL

E. L. DURRUM • .J. A"m. (;lU"'. ;)OC., 73 (195 1) 48 75.)

Appareil de DURRUM il est décrit à la page 87

Figure 40 E. L. DURRUM, i Am. Chem. Soc., 73 (1951 ) 4~75·)

Un exemple d'utilisation de ce dispositif séparation du sérum.

 81

Les substances se déplacent suivant des directions qui

sont fonction

..... - de la vitesse de migration é1ectrophorétique v (donc

de ~i et E).
- de la vitesse d'écoulement du liquide vh
La tangente de l'angle de déviation a pour valeur
v
Tg CL =--
vh
Les séparations obtenues sont analogues à celles obtenues
par spectrométrie de masse.

Chaque constituant suit sa propre trajectoire.

Ci-contre, la figure du haut représente l'appareil de
DURRUM.
ÇQ~gi~iQ~~_Qe~r~~Qir~~ :
la différence de potentiel appliquée peut être comprise
entre 500 et 1500 V.
- l'intensité restant entre 100 et 300 mA.
- le débit du tampon est de 300 an 3 . h- 1 .
- le débit de 1 'échan~i11on est de 1 à 5 cm 3 .h-1 .
- la séparation dure de 5 minutes à 2 heures. (des substances
fragiles pourront ainsi être étudiées).
La figure du bas représente une séparation du sérum.

b) Régime discontinu.

La séparation peut être réalisée soit sur colonnes soit sur

support horizontal (couches ou plaques) et tubes.
o ~l!r_§l!eeQr~:
Constitué par l'un des éléments suivants: poudre de cellulose, poudre
de verre, verre fritté, gels granuleux (dextran, bioge1, sephadex) ou gel
d'amidon ou de po1yaarylamide.
Ils peuvent être disposés en couche mince (0,3 an) ou épaisse (1,5 cm).
Les manipulations sont les mêmes qu'en méthodes analytiques.
 88

o ~~_~'!e~ :
Si lion IJtilise des tubes; c'est le gel de polyacrylamide qui est le plus
utilisé. Les fractions sont récupérées en continu par élution.
Le gel, déposé sur une membrane semi -perméable, est di sposé dans une
cham'Dre où ci rcu 1e perpendi cu 1ai rement à l'axe du tu be une sol uti on tampon
(débit fiable: 1 cm 3 .h- 1). Les constituants se trouvent dilués mais le gel
est réutilisable.
70 à 90 %des protéïnes présentent initialement sont récupérées. On traite
ainsi une centaine de milligrames par tube.

o ~ili~~_liq'!i~~ :
Comme dans le domaine analytique, le liquide est stabilisé par un gradient
de densités et les fractions récupérées par élution. Le refroidissement est
là encore très important.

c) Conclusion
Quelques inconvénients
- En régime continu, il faut se limiter dans le nombre de constituants
à séparer.
- Il est difficile d'obtenir une granulométrie uniforme sur une
grande surface et celà nuit à l'écoulement.
- Les échantillons recueillis sont très dilués.

3 - Electrofocalisation
a) Régime continu
Le tampon de l'appareil de DURRUM est remplacé par des composés
ampholytes qui vont ainsi créer un gradient de pH qui sera perpendiculaire à
la direction d'écoulement.
De la même manière qu'en méthodes analytiques, les constituants
migreront jusqu'à leur pHi et la position du dépot initial est sans importance.
L'alimentation ne doit pas forcément être ponctuelle.

b) Régime discontinu
Seules les dimensions des appareils d'isofocalisation vont
très sensiblement changer.: colonnes de 150 à 500 cm3 , et les supports seront
d'épais gels granuleux. ~'

Par cette méthode, il est possible de traiter jusqu'à 7 g.

d'échantillon.
 89

4 - ~~:~:~~~~~~~:~:~~~ Principe
1" C'est une méthode qui peut se rapprocher de l'électrodialyse.
Pour la décrire nous nous servirons du schéma ci-dessous:
+

_- -
1 -- --- -
- ---
---.-
Figure 41
.

---
- --'-" -
"---~-
:---=-
--.

-=- .-- .:<

un LAllO G., 1969)

Lors d'une électrodialyse les ions, les colloides, ou de grosses

particules chargées: protéines, acides aminés .... que nous supposerons
chargés positivement, migrent sous l'action du champ électrique appliqué.
Les colloides vont venir s'accumuler le long de la membrane puisqu'ils
leur est impossible de la traverser.
Le long de cette paroi la densité va augmenter (zone en pointillé
sur le schéma) et il y aura un flux descendant de solution chargée de colloïdes
vers le fond du récipient d'analyse.
De l'autre côté par contre, la densité de la sêlution sera
beaucoup plus faible puisque les particules sont attirées vers la membrane
opposée. Le film de liquide, dont la densité devient inférieure à celle de
la solution, aura tendance à s'élever.
Si le poids spécifique des particules est inférieur à celui
de l'eau le phénomène est inversé: les particules à i soler (latex par exemple)
se retrouvent en surface.
Au bout d'un certai n temps, deux "couches" se forment dans la
solution :
- l'une contenant le colloïde concentré
- l'autre les impuretés.
Si l'on effectue plusieurs cycles d'électrodécantation en
remplaçant à chaque fois, dans le cas général, la partie de la solution
qui se trouve en surface par un solvant pur, on obtient une solution
co 11 oïda 1e prati quement exsnpte d'impuretés.
Par cette méthode, il est possible d'obtenir des solutions
de concentrations élevées ce qu'il est difficile de faire avec d'autres
méthodes.
 90

5 - Electroconvection
-----------------
A des fins préparatives, c'est un de$ moyens qui a été imaginé
pour séparer des fractions importantes d'un mélange de protéines par
électrophorèse.
On cloisonne la colonne de liquide au travers de laquelle passe
le courant; les séparations (membranes ou robinets) permettront dleffectuer
les prélèvements sans mélanges intempestifs!
On ajwste le tampon T au pHi de la protéine que lion souhaite
isoler, elle sera ainsi immobile dans le champ éle~trique et les autres
protéïnes pourront être éliminées.

La méthode combine :
- l'électrophorèse
- le transport par convection
Un schéma de l'appareil est présenté ci-dessous

· e\.''.
!;\ Ir
r .;.
T

• ,,'
· ...'.
··· .'...'..
'

- E ·· ..'...:... Fi gure 42
'.
'

· .·.....'..
'
(MILAZZO G. , 1969)

· .:.'.
·'.·.'..
. T
~ \!:
R'

- Srlt'''liJ dt' l'lljJ{Jilrt' 1 1 ti

,11'l'I'otYJnv'f,tiun dt! lùrA,,'U()(/.

L'appareil comprend deux réservoir R et RI remplis de solution

protéique et reliés par une cellule plate en cellophane: qui constitue
une membrane semi-perméable. L'e~senble est plongé dans la solution tampon T.
Un champ électrique E est établi par l'intermédiaire des électrodes e et el.
 91

Le long de la paroi vers laquelle les protéines se déplacent, il

y a accroissement de la densité, il en résulte un courant descendant et le
réservoir inférieur RI s'enrichit des protéines les plus mobiles. La solution
se trouve déplacée et r~lonte. Elle est soumise au champ électrique et le même
processus se renouvelle Au bout d'un certain temps, la protéine qui dans
ce milieu est au point isoélectrique, va s'accumuler dans le compartiment
supérieur R.
Cette méthode présente beaucoup d'analogies avec l'électro-
décantation.
 92

Possibilités analytiques d& l'électrophorès&.

, fteetrophor... de zOne
, 1
C.r.ct'riatIQu..
d. I·.n·'y·· 1-------- proprement dit.
1 --- -
IlectrofoCIII.ltlon
1 laotlchophor".
liqUide
,~ I Ac'Ute de cellula.. O.f 1 Viln. liqUide 0" get 1
i

,. Nature de. éléments ,--------1--------:--------'--------1

macromolécules ayent i macromolécules ayant
1

macromolécules ayant lous les Ions

do.able. des mob,ltlés électro- i des mobilités électro-
1
1 des pl dlftérents
phorétulues dlflérentes phoréllques d,fléreMas ! r

l g/l~t;::-i I~-r~r.
I-c-o-n-c-.-n-t-r-.-t,-·o-n-m-in-j-m-'-J-'-I de l'ordre de 10/hlr. i1 d. l'ordre de 0.1 --:;:- de O,t 0/111'. - -::vllon 0.1 9/htr:- ---
d., .olution • • nalv'~~': _ _ ' i • 1_ (10" moles/htre)

Durée totale de I-:~iron -; -; quelques heures 1 quelques heures à ! quelques heures à

l'analy.e 1 1 Jour 1 JOu,
---------j---------I---------,
1

1---------1
1

Utiliaotion da la analvse de roul,ne recherche en labo,alolle 1 recherche en laboralolle 1 recherche en laboratoire

l_~nclho~~ 1 \__________ 1 _

Cout de ,'appareillage ! environ 5000 F ! enVllon 5000 F ! supélleur à 10000 F 'i supérieur à 10000 F
1 • coût du + COÛl du .. coûl du
1
! spectrophotomèlre 1 spectrophotomètre : sl'eclIOpholomèlre i

Tableau VIII (SANCHEZ v,. et MANENC J., 1980)

Documentation
CONSTRUCTEURS

Fourni ..eurs de matériel d'électrophorèse

France MllhpOfe S A.
DRTEe_
ROLlc81rM (lu,).
Beckman 'nstrumanu Franc•.
Oelhomm. et CI. (Ih. R.J.
Sart 0 ru.... f rance.
a.lman S. iii r. 1. S.b,. (S•• )
Gillon M6dlcat Elecuonlc8 France. TtUIU frdnce S." 1 1.
Lallo MOdBrn•. Technllnl
L K B InaUumenli. Touun 81 Matlynon.
 93

VI l - CONCLUSION

Nous avons principalement décrit les méthodes électro-

phorétiques propres à l'analyse dont les possibilités sont regroupées dans
la tableau ci-contre. Certaines d'entre elles, nous l lavons vu, sont extra-
polables à l'analyse préparative et même à la séparation "industrielle" des
protéïnes dans les mélanges. Cependant; elles sont beaucoup moins résolutives
qu'à l'échelle analytique.

L'électrophorèse est une méthode très fine d'analyse

des macro-molécules ionisées.

L'analyse s'effectue en plusieurs étapes (contrairement

à la chromatographie, par exemple, où toutes les étapes se déroulent dans le
même apparei l ) .

- séparation des constituants du mélange

- révélation
- identification et/ou
- quan~ification
Le temps d'analyse varie de quelques heures à quelques jours.
Le- choix de la solution tampon dans laquelle s'effectue la séparation
est essentiel.

Selon que Je mélange à analyser est formé de substances

Ilconnues" ou "inconnues" ; la méthode à employer sera différente:

- l'analyse du sérum humain est par exemple automatisée et s'effectue

en électrophorèse de zone sur acétate de cellulose.
- pour les méla~ges dont les constituants sont inconnus, on pourra
avoir recours à l'électrophorèse sur gel ou à l'isofocalisation qui ; avec
son grand pouvoir de résolution, permet d'obtenir les constituants dans des
zones très étroites et sous forme concentrée
 94

A côté des méthodes envisagées, d'autres existent par

exemple

- l~~_~iS~Q~~~ŒQq~~: électrophorèse sur fil de cellulose,

électrophorèse en veine liquide : qui permettent d'analyser des constituants
en quantités de 1•ordre de 100 à 1000 picogrammes.
l:~l~s~~QeŒQ~~~~_~~_srQi~ : en
régime continu ou discontinu, qui
permet de tester les réactions éventuelles entre deux produits.
 95.

VIII - BIBLIOGRAPHIE

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Electrophoresis, Methods, Theory and Applications
(Academie Press - 1967) 2 volumes.

P. BOULANGER et J. POLONOVSKI
Trai té de Bi ochimi e Générale - tome l
(Masson - Pari s - 1959) 2 volumes.

G. LUSETTI
Méthodes expérimentales de détermination du potentiel Zéta (40 p.) 3-1 ~ 18
Oral probatoire CNAM Aix en Provence - 1983

G. MILAZZO
Electrochimie tome l (426 p.)
(Dunod - Paris - 1969) 2 volumes.

A. NOUGADERE
Biologie Végétale - Cytologie - tome l
(Masson - Paris - 1969) 2 volumes.

V. SANCHEZ et J. MANENC
Séparation éleetrochimiques Electrophorèse (17 p.)
(Techniques de l'Ingénieur (P - 1815) - 1980)

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 96

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(Elsevier - New York - 1955)

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Electrophorèse sur papier (180 p.)
(Vigot frères - Paris - 1956)

L. P. RIBEIRO
Paper electrophoresis (423 p.) 7-26, 126-127
(Elsevier - New York - 1961 )

M. EVEAREST
Isotachophoresis (Theory, instrumentation and applications)
Journal of Chromatography : volume 6 (418 p.) 7-40
(Elsevier - Scientific Publishing Company - New-York - 1976)