DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE DE LA TUBERCULOSE - DR Yala
DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE DE LA TUBERCULOSE - DR Yala
DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE DE LA TUBERCULOSE - DR Yala
D’ALGERIE
LABORATOIRE CENTRAL DE LA
TUBERCULOSE
DIAGNOSTIC
BACTERIOLOGIQUE DE LA
TUBERCULOSE
ET DES MYCOBACTERIOSES
D. YALA
M. TAZIR.
Mars 2009
PREFACE
Ce guide du diagnostic bactériologique de la tuberculose se veut un
manuel à l’intention des étudiants en médecine et aux autres professionnels de
santé : Agents de laboratoire de bactériologie ( microscopiste ),
Paramédicaux ....
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SOMMAIRE
- Annexes
GENERALITES :
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aptitude à conserver la coloration par la fushine et de ne pas être décolorées par
les acides dilués et l’alcool. Elles sont dites Acido-Alcoolo-Résistantes (AAR).
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germes banals , ce caractère est utilisé pour décontaminer les prélèvements avant
leur mise en culture.
A/ Caractères morphologiques :
B/ Caractères culturaux :
C/ Caractères biochimiques :
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2 - Viabilité de M. tuberculosis :
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Les prélèvements d’origine pulmonaire
Les prélèvements d’origine extra-pulmonaire.
1/ Les crachats :
Sont les prélèvements les plus fréquemment reçus au laboratoire. Chez un
malade suspect de tuberculose pulmonaire il convient , chaque fois que possible,
de faire trois ( 3 ) prélèvements selon les modalités suivantes :
Après la consultation , le premier échantillon ( appelé “ échantillon sur place ”
) est recueilli sous la supervision de l’infirmier ; celui-ci doit lui expliquer
que l’expectoration doit se faire après un effort de toux profond et vigoureux
afin de ramener des mucosités bronchiques.
L’infirmier doit confier un deuxième pot “ crachoir ” , et demander au malade de
recueillir un deuxième prélèvement le lendemain matin très tôt (appelé
échantillon matinal ) . L’échantillon est ramené le plus rapidement possible au
laboratoire .
Quand le malade revient avec l’échantillon matinal , un troisième prélèvement
est fait sur place .
2/ Tubage gastrique :
Un certain nombre de malades ne peut pas ou ne sait pas cracher (femmes et
enfants). Cette technique est pratiquée en milieu hospitalier. Elle permet de
recueillir les mucosités bronchiques dégluties pendant le sommeil, donc il doit
être fait le matin au réveil avant que les contractions de l’estomac n’en aient
chassé le contenu.
4/ Ecouvillonnage laryngé :
Le but de l’écouvillonnage laryngé est de recueillir les mucosités d’origine
pulmonaire présentes dans le larynx. Cette technique peut être appliquée chez
les malades qui ne savent pas ou ne peuvent pas cracher, où l’aspiration
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bronchique ou le tubage gastrique ne peut être fait (faute de moyens). Il est à
noter que l’écouvillon laryngé ne ramène qu’une faible quantité de matériel, et
de ce fait il ne peut être utilisé que pour la recherche du BK en culture et non à
l’examen microscopique direct.
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Tous les prélèvements sont enregistrés sur le registre du laboratoire réservé au
dépistage de la tuberculose. Les cas positifs seront reportés sur un registre
spécial de déclaration des cas de tuberculose ( voir annexe 1 ).
Les prélèvements d’origine pulmonaire sont contaminés, quel que soit les
précautions prises pour les recueillir aseptiquement, par les germes qui pullulent
normalement dans le rhino-pharynx et la bouche. S’il n’est pas possible
d’examiner sur place les prélèvements le jour même et pour éviter la
multiplication de ces germes qui risquent de nuire à la vitalité des BK. les
prélèvements peuvent être conservés :
Le transport doit être fait dans une boite reservée à cet effet (une glacière
contenant des “ Ice Box ” et des portoirs dans lesquels s’adapteraient les
crachoirs). Les crachoirs opaques hermétiquement fermés et soigneusement
étiquetés . L’étiquette doit porter le nom et prénom du malade, le numéro du
dossier et le nom du service demandeur. Elle doit être collée sur le corps et
jamais sur le couvercle du crachoir . Les pots de prélèvements sont placés
dans la boite qui sert de transport .
Les fiches de renseignements de chaque prélèvement sont mises dans une
enveloppe à part.
1/ Techniques Microscopiques:
Sur une lame neuve préablement dégraissée (24 heures dans un mélange
acide-alcool - voir annexe -) et séchée . Le numéro attribué au malade sur le
registre du laboratoire doit être inscrit sur l’extrémité de la lame.
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A partir du prélèvement; on choisit une parcelle muco-purulente voire
hémorragique à l’aide d’ une anse de platine qu’on étale sur la lame
L’étalement se fait par mouvements circulaires sur environ 2 cm de
long et 1 cm de large. Le frottis doit être séché à l’air, à l’abri des mouches .
1-3 / La coloration :
a/ Temps de coloration :
Porte lame
Lame
Frottis
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Tige métallique
Flamme
- Lecture au microscope :
Mise au point :
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immersion sur la préparation , éviter de toucher la lame pour ne pas transporter
des bacilles sur des préparations suivantes .
La mise au point est faite, lorsqu’on voit une image nette.
Toute la surface observée représente un (1) champ microscopique.
Lecture en créneau
Lame douteuse :
1 à 9 bacilles sur 300 champs;
Exemple : 4 BAAR/300 champs (+/-) Refaire l’examen
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Coloration à l’auramine
Technique :
a/ Coloration :
Recouvrir la lame d’auramine phéniquée et laisser agir pendant 10
minutes. Laver à l’eau de robinet.
b/ Décoloration :
Recouvrir la lame de mélange acide-alcool et laisser agir 4 minutes :
Laver.
c/ Contre coloration :
Recouvrir la lame avec une solution de permanganate de potassium à 1%.
Laisser agir une (1) minute. Laver puis sécher.
- Lecture :
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- Tubage gastrique et aspiration bronchique :
INTERPRETATIONS:
2/ Culture:
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colonies, un résultat quantitatif est donné, par comptage de leur nombre par
tube de L.J.. Si la culture est négative la réponse sera :
“ culture négative au 28eme jour, attendre 42eme jour ” et les tubes
sont remis à l’étuve.
Au 42eme jour une deuxième lecture est faite selon les mêmes
modalités qu’au 28eme jour . Si au 42eme jour la culture est toujours négative,
une troisième et dernière lecture se fera au 72eme jour , car certaines
mycobactéries mettent beaucoup plus de temps à pousser telles que
Mycobacterium bovis et quelques mycobactéries atypiques à croissance
lentes.
-Intérêt de la culture:
A/ Rappels :
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le génome bactérien :
Le genome bactérien est une molécule d’ADN
bicaténaire (deux brins) de structure hélicoïdale. Chaque brin est constituée
d’un axe sucre-desoxyribose auquel sont fixées quatre bases puriques (Adenine
(A), et Guanine (G) ) et pyrimidiques ( Cytosine (C) , et Thymine (T)).
L’adenine se trouve en interaction avec la thymine de l’autre brin, et la guanine
avec la cytosine par l’intermédiaire de liaisons hydrogènes. Les deux chaines ont
une polarité opposée dans le sens 3’-5’ et 5 - 3’.
Sonde :
Une sonde est un fragment d’acide nucléique monocaténaire, marquée,
soit par une enzyme (sonde froide), soit par un élèment radio-actif. Elle peut
s’apparier à des portions d’ADN complémentaires, préalablement dénaturées
(donc simple brin). Cette sonde d’ADN peut également se lier à un ARN.
Les deux brins doivent pouvoir entrer en contact l’un avec l’autre et avoir
suffisamment de bases complémentaires contiguës, donc posséder suffisamment
d’homologie pour qu’une molécule bicaténaire stable soit formée.
Cette liaison entre molécules complémentaires s’appélle “ Réaction
d’hybridation ”.
1/ Principe :
a/ La dénaturation :
b/ L’hybridation :
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En abaissant la température, on va provoquer
l’hybridation sur les brins de deux amorces qui sont des oligonucléotides
simples brins. Elles sont choisies de façon à être complémentaires d’une
séquence de la matrice et apportées en excés afin de favoriser leur liaison aux
brins d’ADN dénaturés. C’est l’étape d’hybridation des amorces. Les séquences
de ces amorces vont délimiter la longueur du segment d’ADN à amplifier.
C/ Application au B.K.:
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INSTITUT PASTEUR D’ALGERIE
Laboratoire Central de la Tuberculose
Oued Kniss.
FICHE DE RENSEIGNEMENTS
STRUCTURE
Hopital ou CCTMR...................................................N° de dossier.....................
Service................................................................Médecin....................................
______________________________________________________________
MALADE
Nom......................................................................................Age.......................
Prénom.................................................................................Sexe.......................
Adresse.............................................................................................................
Adresse Professionnelle .....................................................................................
______________________________________________________________
MALADIE
- Début de la maladie remonte:..............................................................................
- Malade a été déjà traite par les antituberculeux avant l’épisode actuel
(ancien malade) :
Oui /__/ Non /__/
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b/ Extra-Pulmonaire /__/
Si oui : quel est la localisation ..........................................................................
______________________________________________________________
PRELEVEMENT:
Nature :...................................................Date de Réception:................................
______________________________________________________________
RESULTATS BACTERIOLOGIQUES:
Microscopie :......................................................
Culture N°:........................Nombre de col................par .............tube (s) de L. J.
_______________________________________________________________
A N N E X E ( 2)
TECHNIQUES DE DECONTAMINATION:
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- Placer 2 ml de crachat dans un tube à centrifuger
- Ajouter 4 ml de NaOH à 4% .
- Agiter sur un agitateur de Khan pendant 15 mn .
- Centrifuger à 3000 tours/ mn pendant 15 mn.
- Jeter le surnageant .
- Laver à l’eau distillée stérile ( 10 à 15 ml ).
- Recentrifuger 3000 tr/mn pendant 15 mn.
- Jeter le surnageant .
- Ensemencer le culot sur 2 tubes de L.J.
3’ 5’
ADN Cible
5’ 3’
3’ 5’
Dénaturation
Hybridation
5’ 3’
( amorces)
5’ 3’
3’ 5’
Dénaturation
Hybridation
20
5’ 3’
amorce1
Synthèse des néobrins
amorce 2
SCHEMA N° 1
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