La RACE PCR
La RACE PCR
La RACE PCR
SCIENTIFIQUE
UNNIVERSITE MOULOUD MAMMERI, TIZI OUZOU
FACULTE DES SCIENCES BIOLOGIQUES ET AGRONOMIQUE
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE ET DE MICROBIOLOGIE
La RACE PCR
Réalisé par :
• Babaci Yasmina
• Harzi Kamilia
• Amaouz Leticia
• Hammaz Brahim
• Yesref Hani
Mr Ouelhadj
2023/2024
Sommaire :
I. Résumé : ........................................................................................................................................... 4
II. Introduction : .................................................................................................................................... 4
III. Principes de base de la RACE PCR : ........................................................................................... 5
IV. Méthodologie de la RACE PCR : ................................................................................................ 6
V. Applications de la RACE PCR : .................................................................................................... 12
VI. Avantages et limitations de la RACE PCR : .............................................................................. 13
VII. Technique et avancées récentes en RACE PCR : ....................................................................... 16
VIII. Perspectives et développement de la PCR dans les pays du Sud ............................................... 17
IX. Conclusion : ............................................................................................................................... 19
X. Les références :............................................................................................................................... 20
La RACE PCR
I. Résumé :
La technique de RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) est un outil puissant et polyvalent
en biologie moléculaire. Elle permet d’explorer les extrémités 5’ et 3’ des ARNm, ce qui permet de
caractériser les régions non codantes, les épissages alternatifs, les sites de polyadénylation, les
promoteurs et d’autres éléments régulateurs. La RACE PCR est particulièrement utile pour cloner des
gènes complets à partir de séquences partielles, détecter des variants d’épissage et des mutations, et
étudier l’expression génique différentielle. Malgré quelques limitations techniques, la RACE PCR
reste une méthode essentielle en recherche en biologie moléculaire et génomique fonctionnelle, offrant
des possibilités précieuses pour comprendre la complexité des processus biologiques.
Introduction :
La RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) est une technique d’amplification
enzymatique qui permet d’obtenir la séquence complète d’un ARN messager à partir d’une
partie connue. Elle a été développée dans les années 1990 par Frohman et al.1 et Loh et al.2
pour pallier les limites des méthodes classiques de clonage d’ADNc, qui nécessitent souvent
des sondes ou des amorces spécifiques à chaque extrémité de l’ARNm. La RACE PCR est utile
pour identifier et caractériser les régions non codantes, les épissages alternatifs, les sites de
polyadénylation, les promoteurs, les éléments régulateurs et les interactions ARN-protéines des
gènes d’intérêt.
Importance de la RACE PCR dans la recherche en biologie moléculaire et la génomique
fonctionnelle : La RACE PCR est importante pour la recherche en biologie moléculaire et la
génomique fonctionnelle, car elle permet d’identifier et de caractériser les régions non codantes,
les épissages alternatifs, les sites de polyadénylation, les promoteurs, les éléments régulateurs
et les interactions ARN-protéines des gènes d’intérêt. Ces informations sont essentielles pour
comprendre le fonctionnement, la régulation et l’évolution des gènes, ainsi que pour détecter et
diagnostiquer des maladies génétiques ou infectieuses. La RACE PCR est également utile pour
étudier l’expression différentielle des gènes, c’est-à-dire la variation du niveau d’ARNm
produit par un gène en fonction du contexte cellulaire ou environnemental. La RACE PCR est
donc un outil puissant et polyvalent pour explorer la diversité et la complexité des ARNm.
Le principe de base de la RACE PCR est d’utiliser la transcriptase inverse (RT) pour
synthétiser une copie d’ADNc à partir d’un ARNm cible, en utilisant une amorce spécifique au
gène (GSP) qui reconnaît une séquence connue dans le transcrit. Ensuite, on ajoute une queue
homopolymérique ou un adaptateur à l’une des extrémités de l’ADNc, ce qui permet de
l’amplifier par PCR en utilisant une amorce universelle (UP) qui s’apparie à la queue ou à
l’adaptateur, et une seconde amorce spécifique au gène (GSP2) qui s’apparie à une séquence en
aval de la première. On obtient ainsi un produit d’ADNc qui contient la séquence inconnue de
l’extrémité 5’ ou 3’ de l’ARNm.
La RACE PCR se distingue des autres méthodes d’amplification d’ADNc, telles que la RT-PCR
classique ou la RT-qPCR, par le fait qu’elle ne nécessite pas de connaître la séquence des deux
extrémités de l’ARNm, mais seulement d’une partie interne. Elle permet donc d’isoler et de
séquencer des régions d’ARNm qui seraient difficiles ou impossibles à cloner par d’autres
moyens.
L’amplification sélective des extrémités d’ADNc est le principe qui permet de réaliser la
RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends). Il s’agit de synthétiser et d’amplifier les
extrémités 5’ ou 3’ d’un ADNc à partir d’une séquence interne connue. Voici les étapes de ce
principe :
-On part d’un ARNm cible dont on connaît une partie de la séquence, par exemple grâce à un
EST (Expressed Sequence Tag) ou à une sonde nucléotidique.
-On utilise la transcriptase inverse (RT) pour copier l’ARNm en ADNc simple brin, en utilisant
une amorce spécifique au gène (GSP) qui s’hybride à la séquence connue.
-On ajoute une queue homopolymérique (par exemple des nucléotides A) ou un adaptateur (une
courte séquence d’ADN) à l’extrémité 3’ de l’ADNc, soit par l’action de la RT elle-même, soit
par une ligase ou une polymérase.
-On réalise une PCR en utilisant deux amorces : une amorce universelle (UP) qui reconnaît la
queue ou l’adaptateur, et une seconde amorce spécifique au gène (GSP2) qui s’hybride à une
séquence en aval de la première. On obtient ainsi un produit d’ADNc qui contient la séquence
inconnue de l’extrémité 5’ de l’ARNm.
-Pour obtenir l’extrémité 3’ de l’ARNm, on inverse le sens des amorces : on utilise une amorce
GSP qui s’hybride à l’extrémité 3’ de l’ARNm, et une amorce UP qui reconnaît la queue ou
l’adaptateur ajouté à l’extrémité 5’ de l’ADNc.
La RACE PCR présente l’avantage de ne pas nécessiter de connaître la séquence des deux
extrémités de l’ARNm, mais seulement d’une partie interne. Elle permet ainsi d’isoler et de
séquencer des régions d’ARNm qui seraient difficiles ou impossibles à cloner par d’autres
moyens.
La PCR, ou polymerase chain reaction, est une technique de biologie moléculaire largement
utilisée pour amplifier de petites quantités d’ADN ou d’ARN en quantités plus importantes,
permettant ainsi de détecter, de quantifier et d’analyser des séquences spécifiques de ces
molécules. Voici les différentes étapes de la PCR :
Isolation de l’ARN : Tout d’abord, vous devez isoler l’ARN à partir de votre échantillon
biologique. Cela peut être fait en utilisant diverses méthodes d’extraction d’ARN telles que la
méthode de phénol/chloroforme, les colonnes de purification d’ARN, ou les kits commerciaux
disponibles dans le commerce.
Traitement de l’ARN avec une enzyme inverse-transcriptase : Une fois que vous
avez isolé l’ARN, vous devez le traiter avec une enzyme appelée transcriptase inverse (ou
reverse transcriptase). Cette enzyme convertit l’ARN en ADNc, qui est complémentaire à
l’ARN d’origine.
Purification de l’ADNc : L’ADNc synthétisé peut contenir des contaminants tels que des
résidus d’ARN ou d’enzymes. Il est donc nécessaire de purifier l’ADNc pour éliminer ces
contaminants. Cela peut être réalisé par diverses techniques de purification telles que la
chromatographie, l’ultrafiltration ou la précipitation à l’éthanol.
Remarque : les détails spécifiques de chaque étape peuvent varier en fonction de vos besoins
expérimentaux et des caractéristiques de votre échantillon biologique.
La conception d’amorces spécifiques pour l’amplification des extrémités d’ADNc nécessite
une attention particulière pour assurer la spécificité et l’efficacité de l’amplification. On peut
les subdiviser en quelques étapes générales pour la conception d’amorces spécifiques :
Sélection de la région cible : Identifiez les séquences des extrémités de l’ADNc que vous
souhaitez amplifier. Ces régions peuvent être les régions 5’ (amorces d’amorçage) ou 3’
(amorces d’amplification) de l’ADNc.
Analyse de la séquence : Analysez les séquences des extrémités d’ADNc pour identifier
les régions conservées et spécifiques à votre gène d’intérêt. Vous pouvez utiliser des outils bio-
informatiques comme BLAST pour comparer vos séquences avec des bases de données
publiques et vérifier leur spécificité.
Détermination de la longueur des amorces : les amorces typiques pour PCR ont une
longueur d’environ 18 à 25 paires de bases. Assurez-vous que la longueur de vos amorces est
adaptée à vos besoins expérimentaux et respecte les paramètres recommandés pour la PCR.
Optimisation des conditions de PCR : Une fois que vous avez conçu vos amorces
spécifiques, optimisez les conditions de PCR pour maximiser la spécificité et l’efficacité de
l’amplification. Cela comprend la concentration d’amorces, la température d’hybridation et
d’extension, ainsi que le cycle de PCR lui-même.
• Les conditions :
La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une technique puissante utilisée pour amplifier de
l’ADN spécifique. La PCR en temps réel (ou qPCR) est une variante de la PCR qui permet la
quantification en temps réel de l’amplification de l’ADN pendant la réaction. Voici les
conditions optimales pour une PCR en temps réel (qPCR) :
Choix de la polymérase : Utilisez une polymérase thermorésistante, comme la Taq
polymérase ou une polymérase à haute-fidélité, adaptée à la sensibilité de votre amplification.
Amorces spécifiques : Utilisez des amorces spécifiques conçues pour la région cible de
l’ADN que vous souhaitez amplifier. Les amorces doivent être complémentaires à des régions
conservées de l’ADN et avoir une température de fusion similaire.
Sa sonde spécifique : Dans la qPCR, une sonde spécifique à la région amplifiée peut être
utilisée pour la détection et la quantification. Les sondes TaqMan, les sondes SYBR Green ou
d’autres sondes spécifiques peuvent être utilisées en fonction de votre application.
Nombre de cycles : Le nombre de cycles doit être optimisé pour permettre une
amplification suffisante tout en évitant la saturation.
• Réactifs :
Contrôles négatifs et positifs : Incluez des contrôles négatifs (sans ADN matrice) et des
contrôles positifs (avec de l’ADN matrice connu) pour vérifier la spécificité de l’amplification
et détecter toute contamination ou inhibition de réaction.
• Les types :
A. La RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) 5’ :
Une technique utilisée pour amplifier les extrémités 5’ des ARN messagers (ARNm). Voici ses
applications, avantages et limites :
• Applications :
➢ Identification des régions 5’ non traduites (5’ UTR) :
La RACE PCR 5’ permet d’identifier les régions 5’ non traduites des ARNm, qui contiennent
souvent des séquences régulatrices importantes telles que les sites de liaison aux facteurs de
transcription.
Caractérisation des promoteurs : Cette technique peut aider à caractériser les régions
promotrices en identifiant les sites d’initiation de la transcription et en déterminant la structure
du promoteur.
Identification des sites d’épissage alternatif : La RACE PCR 5’ peut être utilisée pour
détecter les sites d’épissage alternatif en comparant les extrémités 5’ des différents transcrits.
Clonage de gènes inconnus : Elle peut être utilisée pour cloner des gènes dont seule la
séquence partielle est connue, en amplifiant et en séquençant les régions 5’ des ARNm.
Étude de l’expression génique différentielle : La RACE PCR 5’ peut être utilisée pour
quantifier l’expression de gènes spécifiques en analysant les extrémités 5’ des ARNm dans
différents échantillons biologiques.
• Applications :
Identification des régions 3’ non traduites (3’ UTR) : La RACE PCR 3’ permet
d’identifier les régions 3’ non traduites des ARNm, qui peuvent contenir des séquences
régulatrices impliquées dans la stabilité de l’ARNm et la régulation de la traduction.
Identification des ARN non codants : La RACE PCR 3’ peut être utilisée pour identifier
les extrémités 3’ des ARN non codants, qui jouent un rôle important dans la régulation de
l’expression génique.
Analyse de l’expression génique différentielle : Elle peut être utilisée pour quantifier
l’expression de gènes spécifiques en analysant les extrémités 3’ des ARNm dans différents
échantillons biologiques.
Clonage de gènes inconnus : Elle peut être utilisée pour cloner des gènes dont seule la
séquence partielle est connue, en amplifiant et en séquençant les régions 3’ des ARNm .
• Limites :
Sensibilité aux contaminants : Comme pour toute technique PCR, il existe un risque de
contamination croisée, ce qui peut entraîner des résultats erronés.
Malgré ces limites, la RACE PCR 3’ reste une technique précieuse pour la caractérisation des
ARNm et l’identification de séquences inconnues dans le génome. Elle est largement utilisée
dans la recherche en biologie moléculaire et en génomique fonctionnelle.
Une technique qui combine la RACE PCR avec une deuxième PCR (appelée PCR « nichée »)
pour augmenter la spécificité et la sensibilité de l’amplification des extrémités d’ADNc. Voici
le principe et l’utilisation de la Nested RACE PCR :
• Principe :
Première PCR (RACE PCR) : Dans cette étape initiale, des amorces spécifiques sont
utilisées pour amplifier les extrémités 5’ ou 3’ des ARN messagers (ARNm) à partir d’une
population d’ARN total. Cette réaction permet d’obtenir des produits d’ADNc correspondant
aux extrémités recherchées, mais elle peut également générer des produits non spécifiques dus
à la présence d’autres ARN ou contaminants.
Deuxième PCR (PCR nichée) : Les produits de la première PCR sont ensuite utilisés
comme matrice pour une deuxième PCR, où des amorces internes spécifiques sont utilisées
pour amplifier spécifiquement les produits de la première réaction. Cette étape permet
d’augmenter la spécificité en ciblant uniquement les produits d’intérêt, tout en réduisant le bruit
de fond généré par la première PCR.
Clonage et séquençage : Les produits amplifiés par Nested RACE PCR peuvent être
clonés et séquencés pour obtenir des informations détaillées sur les extrémités d’ARNm, y
compris les régions 5’ et 3’ non traduites, ainsi que les sites de clivage polyadénylation.
La RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) est une technique de biologie moléculaire
puissante permettant d’amplifier et de séquencer les extrémités 5’ et 3’ des ARNm. Elle s’avère
utile dans de nombreux domaines de la recherche, notamment la caractérisation de gènes,
l’étude de l’expression génique et la détection de mutations.
La RACE PCR permet de déterminer la séquence complète des ARNm, y compris les régions
non traduites (UTR) 5’ et 3’. Ces régions peuvent jouer un rôle important dans la régulation de
la traduction et de la stabilité des ARNm. La RACE PCR est particulièrement utile pour l’étude
des ARNm dont les extrémités sont inconnues ou difficiles à séquencer par d’autres méthodes.
2. Clonage de gènes complets à partir de séquences partielles :
La RACE PCR peut être utilisée pour cloner des gènes complets à partir de séquences partielles
d’ADNc. Cette technique est particulièrement utile pour les gènes dont la séquence complète
n’est pas encore disponible.
La RACE PCR permet de détecter des variants d’épissage et des mutations dans les ARNm.
Cette technique est utile pour le diagnostic de maladies génétiques et pour l’étude des
mécanismes de régulation de l’expression génique.
La RACE PCR peut être utilisée pour comparer l’expression de gènes dans différentes
conditions ou tissus. Cette technique permet d’identifier des gènes dont l’expression est
différentiellement régulée et de mieux comprendre les mécanismes de régulation
transcriptionnelle.
Sensibilité : La RACE PCR est une technique très sensible qui permet d'amplifier des
séquences d'ADNc à partir de très petites quantités d'ARNm.
Fidélité : La RACE PCR est une technique très fiable qui permet d'obtenir des produits
d’amplification de haute qualité.
Polyvalence : La RACE PCR peut être utilisée pour amplifier les extrémités 5' et 3' des
ARNm de n'importe quelle source.
PCR inverse : La PCR inverse est une technique moins spécifique que la RACE PCR car
elle amplifie toutes les séquences d'ADNc présentes dans un échantillon, y compris celles qui
ne sont pas spécifiques à l'ARNm d'intérêt.
RT-PCR quantitative : La RT-PCR quantitative est une technique moins sensible que la
RACE PCR car elle ne permet pas d'amplifier des séquences d'ADNc à partir de très petites
quantités d'ARNm.
A / limitations :
Complexité : La RACE PCR est une technique complexe et son utilisation nécessite une
certaine expertise en biologie moléculaire.
Coût : La RACE PCR est une technique relativement coûteuse par rapport aux autres
techniques d'amplification d'ADNc.
Biais : La RACE PCR peut introduire des biais dans les résultats, car l'amplification des
extrémités 5' et 3' des ARNm n'est pas toujours uniforme.
Interprétation des résultats : L'interprétation des résultats de la RACE PCR peut être
difficile, car il est important de tenir compte des biais potentiels de la technique.
Utiliser des contrôles appropriés : Il est important d'utiliser des contrôles appropriés pour
garantir la spécificité et la sensibilité de la RACE PCR.
Analyser les résultats de manière critique : Il est important d'analyser les résultats de la RACE
PCR de manière critique et de tenir compte des biais potentiels de la technique
Donc La RACE PCR est une technique cruciale permettant d’obtenir des informations
précieuses sur la structure et la fonction des ARNm. Elle présente de nombreux avantages par
rapport aux autres techniques d’amplification d’ADNc, mais elle a également certaines
limitations. Il est important de connaître les avantages et les limitations de la RACE PCR avant
de l’utiliser dans une étude.
Technique et avancées récentes en RACE PCR :
La PCR d’Amplification Rapide d’Extrémités de cDNA, est utilisé dans divers domaines de
recherche en génétique moléculaire, culture cellulaire, bactériologie et autres domaines qui
nécessite une étude minutieuse des séquences de l’ADNc des développements récents dans ces
domaines en contribue à des avances en RACE PCR.
Des techniques développées récemment afin de rendre plus simple et rapide le processus
d’amplification de l’ADN ou de l’ARN. Contrairement à la PCR traditionnel qui nécessite des
cycles de chauffage et de refroidissement, ces techniques fonctionnes à une température
constante, les rendant ainsi plus rapide et adapté à l’utilisation sur terrain ou des conditions de
laboratoires moins sophistiqués. Parmi ces techniques on a :
Comme la PRA, Cette technique repose sur l’utilisation de la polymérase et des amorces
spécifique afin de former des boucles d’ADN. Cette technique nécessite une température de 60-
65°C (légèrement élevée). Le LAMP est extrêmement sensible et efficace pour la détection
d’ARN viraux ou bactériens aidant ainsi dans la détection de maladies infectieuse.
La RACE PCR est donc d’une importance cruciale dans la caractérisation et le séquençage des
extrémités des ARNm et dans le dépistage de nombreux variants grâce à sa sensibilité et sa
spécificité.
En plus de cette technique on a préalablement cité d’autre technique et il existe d’autres, elles
sont citées si dessous brièvement :
La PCR (Polymerase Chain Reaction) qui est utilisée en biologie moléculaire pour
amplifier de manière spécifique une région d’ADN cible. Elle est devenue un outil essentiel
dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale, de la microbiologie à la génétique en
passant par la virologie.
La PCR standard qui consiste en l’amplification spécifique d’une région d’ADN en utilisant
des amorces complémentaires à la séquence d’intérêt et une ADN polymérase. Cette technique
est fondamentale pour l’identification de gènes spécifiques, l’analyse de la diversité génétique
et la détection de mutations génétiques.
La PCR en temps réel, également connue sous le nom de qPCR (quantitative PCR), permet
non seulement l’amplification de l’ADN, mais aussi la mesure quantitative de la quantité de
produit amplifié à chaque cycle de PCR. Elle est largement utilisée pour quantifier l’expression
génique, détecter et quantifier des agents pathogènes et analyser la réplication virale.
La PCR RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) qui est une méthode utilisée pour
amplifier spécifiquement les extrémités 5’ ou 3’ d’un ARNc, permettant ainsi de déterminer la
séquence complète de l’ARNc. Cette technique est essentielle pour l’identification des
extrémités 5’ et 3’ des ARNm, le clonage de gènes complets à partir d’ARNc et l’étude de
l’expression génique différentielle.
Le développement de méthodes de PCR dans des laboratoires de référence tels que le Centre
Muraz au Burkina Faso et l’utilisation d’échantillons prélevés, transportés et conservés sur DBS
peuvent faciliter l’accès aux tests moléculaires pour les pays du Sud.
En effet, les tests moléculaires sont fréquemment demandés pour le diagnostic et le suivi des
maladies infectieuses dans les pays développés, mais leur disponibilité reste limitée dans les
pays à ressources limitées en raison de plusieurs contraintes :
• Coûts élevés
• Technologies complexes
• Ressources humaines insuffisantes
• Accès limité aux installations de laboratoire
Le développement de kits RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) rentables et adaptés aux
conditions locales permettra d’améliorer la fiabilité et le succès de l’identification de l’ADNc
complet d’un gène.
La qPCR (quantitative PCR) est une technique de diagnostic puissante et largement utilisée.
• Rapidité
• Fiabilité
• Sécurité
• Meilleure sensibilité
• Quantification précise de la charge virale
Le développement de la PCR dans les pays du Sud est crucial pour améliorer la santé publique
et lutter contre les maladies infectieuses.
Conclusion :